技術領域

本發(fā)明涉及化合物領域，涉及光可斷裂的熒光標記化合物及用途，特別涉及一種光可斷裂的熒光標記可逆終端化合物及其在DNA或RNA測序中的用途，尤其涉及一種光可斷裂的熒光標記化合物及用途。

背景技術：

為滿足第三代測序的技術的需求，需采用循環(huán)可逆終結(cyclic reversible termination,CRT)的辦法來實現(xiàn)單個堿基的延伸以提高測序速度。即當某一個帶有抑制基團的堿基加到DNA鏈上之后，可以阻止下一個堿基的延伸。在溫和條件下該抑制基團可以被除去從而使該DNA鏈得以繼續(xù)延伸。每增加一個堿基，可以通過對其所帶熒光的檢測實現(xiàn)對該DNA鏈的實時測序。這樣一個帶抑制基團的堿基被稱作終止子(terminator)。

目前可逆的終止子大體有兩種結構：一是3’-OH基團被其他基團取代，從而使3’-OH喪失進攻磷酸基團的能力而阻止下一個堿基的延伸；第二種結構雖然沒有取代3’-OH，但是在核苷位置增加了一個抑制分子，由于空間位阻等作用使得3’-OH無法進攻磷酸基團。值得一提的是，3’-OH取代的堿基往往不易被DNA聚合酶識別，從而影響測序長度。

因此，研發(fā)可適用于二代測序、單分子測序技術(三代測序技術)平臺的測序試劑仍有很大提升空間。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于至少提供一種光可斷裂的熒光標記可逆終端化合物及其在DNA或RNA測序中的用途。

值得說明的是，下述中的“光可斷裂的熒光標記化合物”與“光可斷裂的熒光標記可逆終端化合物”可以互換。

第一方面，本發(fā)明提供了一種光可斷裂的熒光標記化合物，其結構式如式(I)所示：

其中，

R1選自H、單磷酸鹽、二磷酸鹽和三磷酸鹽中的至少一種；

R2為H或者OH；

堿基選自胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤和其衍生物中的至少一種；

連接單元選自中的至少一種。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述本發(fā)明第一方面的光可斷裂的熒光標記化合物還可以具有以下附加技術特征中的至少一種：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，式(I)中的光可斷裂基團選自2-硝基甲苯基、芐氧羰基、硝基苯基、苯甲酰甲酯基酯、芐胺、芐醚、氨基甲酸2-(鄰硝基苯基)乙酯和碳酸2-(鄰硝基苯基)乙酯中的至少一種。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，式(I)中的熒光基團選自氟硼熒染料、熒光素、羅丹明、香豆素、呫噸、花青、芘、酞菁、alexa系列染料、squarene染料及其衍生物中的一種或多種。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述化合物為結構式如式(1)～(10)所示的化合物中的至少一種：

式(1)-(10)中，R1為H、單磷酸鹽、二磷酸鹽或三磷酸鹽；R2為H或者OH；Dye為熒光基團。

本發(fā)明第一方面選擇光可斷裂基團作為抑制基團。在一定波長的照射下，抑制基團與堿基斷開；該離去過程不需要特殊的催化劑或還原劑等的輔助，不會存在輔助試劑與DNA聚合酶、堿基的副反應，從而在溫和的條件下實現(xiàn)可逆終止；該離去過程對測序過程本身沒有任何干擾，有利于長片段單分子測序。本發(fā)明提供的光可斷裂的熒光標記核苷酸，在單個熒光分子超靈敏光學檢測技術和三代測序平臺具有重要應用價值。

第二方面，本發(fā)明提供了一種制備光可斷裂的熒光標記化合物的方法，該方法能夠用以制備上述本發(fā)明一方面或者任一實施例中的光可斷裂的熒光標記化合物，該方法包括以下A和/或B步驟：

步驟A：

將化合物a和反應，以獲得所述光可斷裂的熒光標記化合物I，所述化合物a為：

步驟B：

將化合物b和反應，以獲得所述光可斷裂的熒光標記化合物I，所述化合物b為：

本發(fā)明第二方面采用馬來亞酰胺與巰基的特異性反應對核苷酸進行熒光標記。該反應反應條件溫和、反應效率高，降低了實驗難度，提高了整個反應的產(chǎn)率。此外，市場上已有銷售數(shù)種與熒光分子相連接的馬來亞酰胺，價格低廉，節(jié)約成本。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，步驟A中，化合物a與的摩爾比為1:2～4。由此，能夠提高合成目標化合物的效率。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，步驟B，化合物b與的摩爾比為1:2～4。由此，能夠提高合成目標化合物的效率。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，當合成方法采用包括步驟A的合成方法時，連接單元為

根據(jù)本發(fā)明的實施例，當合成方法采用包括步驟B的合成方法時，連接單元為

根據(jù)本發(fā)明的實施例，步驟A中，所述化合物a選自下述化合物(11)-(15)中的至少一種：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，化合物(11)-(15)中的任一種由相應的核苷酸經(jīng)羥基保護，氨基保護后，與反應獲得的化合物，再經(jīng)脫保護獲得，其中，所述與所述的摩爾比為1:1～2。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，步驟B中，所述化合物b選自下述化合物(16)-(20)中的至少一種：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述化合物(16)-(20)中的任一種由如下步驟制備：

1)核苷酸經(jīng)羥基保護，氨基保護，獲得第一產(chǎn)物；

2)有機溶劑(優(yōu)選為DMF)及NaH存在的條件下，第一產(chǎn)物與反應獲得第二產(chǎn)物，其中，所述第一產(chǎn)物與所述的摩爾比為2～4；

3)第二產(chǎn)物在有機溶劑(優(yōu)選為DMSO)以及CuI、L-脯氨酸、NaOH存在的條件下，與NaN₃反應，獲得第三產(chǎn)物，其中，所述第二產(chǎn)物與NaN₃的摩爾比為1:2～6；

第三產(chǎn)物再經(jīng)脫保護獲得化合物(16)-(20)中的任一種。

第三方面，本發(fā)明提供了一種對核酸的測序方法，包括如下步驟：

(i)利用芯片對第一核酸進行捕獲，所述芯片為表面帶有第二核酸的固體基底，以獲得第一核酸-第二核酸復合物；

(ii)混合所述第一核酸-第二核酸復合物、聚合酶以及一種或多種類型的標記的底物，以獲得核酸聚合產(chǎn)物，所述標記的底物為權利要求1-4任一光可斷裂的熒光標記化合物，不同類型的標記的底物帶有不同的堿基；

(iii)對所述核酸聚合產(chǎn)物進行成像，以確定所述核酸聚合產(chǎn)物中引入的標記的底物的類型；

(iv)使所述核酸聚合物暴露于光源下，以使所述核酸聚合物中的引入的標記的底物中的下式部分發(fā)生斷裂：

獲得延伸產(chǎn)物；和

(v)以所述延伸產(chǎn)物替代所述第一核酸-第二核酸復合物重復進行步驟ii至iv一次或多次以確定所述核酸中的多個堿基序列。

上述本發(fā)明的測序方法，依據(jù)對芯片上的核苷酸序列(第二核酸，也稱為探針)的設計，能夠?qū)δ繕藚^(qū)域進行測序，或者對基因組隨機區(qū)域進行測序。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述的聚合酶選自逆轉(zhuǎn)錄酶、末端轉(zhuǎn)移酶和DNA聚合中的至少一種。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，在步驟ii后，清洗所述核酸聚合產(chǎn)物。由此，能夠提高反應效率。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，在步驟iv后，清洗所述延伸產(chǎn)物。由此，能夠消除部分成像干擾。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，在步驟iii前，對所述第一核酸-第二核酸加帽。由此，利于聚合反應的進行。

如本發(fā)明所述的，“第一核酸”、“第二核酸”中，“第一”和“第二”并不特指順序或具體的核苷酸鏈；在本發(fā)明的實施例中，“第一核酸”和“第二核酸”能夠完全或者部分互補。

在本發(fā)明一實施方式中，“第一核酸”和“第二核酸”完全互補。

在本發(fā)明另一實施方式中，“第一核酸”和/或“第二核酸”帶有生物素、鏈霉素。

在本發(fā)明另一實施方式中，“第一核酸”和/或“第二核酸”分別為引物和待測靶核酸。

如本發(fā)明所述的，對所述第一核酸-第二核酸加帽為常規(guī)加帽修飾，比如，RNA“5’端修飾的m7G-PPNmN結構。

在基因測序領域來說，實現(xiàn)對于單個活體細胞的實時測序是本發(fā)明要解決的技術問題之一；本發(fā)明第四方面采用生物正交反應(bioorthogonal chemistry)將熒光分子加到光可斷裂的可逆終端化合物上；該過程對細胞基本沒有危害，也不會帶入對細胞有害的物質(zhì)或副反應產(chǎn)物；同時，本發(fā)明所采用的辦法避免了使用對細胞有害的金屬催化劑或其他有害化合物，對細胞內(nèi)的生化過程沒有影響，且反應十分高效，有利于更簡單、更高效率地實現(xiàn)單個活體細胞的實時測序。此外，市面存在有多種環(huán)辛炔標記的熒光分子，價格低廉，能夠大大節(jié)約成本。

如本發(fā)明所述的，“生物正交化學反應”指可發(fā)生在活體內(nèi)，對活體本身生物化學過程沒有任何干擾的化學反應。生物正交反應正日益成為在活體內(nèi)對生物大分子以及活性小分子進行特異標記的一種有效方法；對細胞內(nèi)的生物分子實時可視化的標記方法對于理解生命的分子基礎有著重要的意義。

第四方面，本發(fā)明提供了一種測序試劑盒，包括一種或多種上述本發(fā)明一方面或者任一實施例中的光可斷裂的熒光標記化合物。

第五方面，本發(fā)明提供一種上述本發(fā)明一方面或者任一實施例中的光可斷裂的熒光標記可逆終端化合物在作為終止核苷酸類似物中的用途。

第六方面，一種如第一方面所述的光可斷裂的熒光標記可逆終端化合物在DNA或RNA測序中的用途。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明選擇光可斷裂基團作為抑制基團。在一定波長的照射下，抑制基團與堿基斷開；該離去過程不需要特殊的催化劑或還原劑等的輔助，不會存在輔助試劑與DNA聚合酶、堿基的副反應，從而在溫和的條件下實現(xiàn)可逆終止；該離去過程對測序過程本身沒有任何干擾。本發(fā)明提供的光可斷裂的熒光標記可逆終端可高效率的服務于第三代基因測序技術。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例中的光可斷裂的熒光標記化合物的化學結構式；

圖2是本發(fā)明實施例中的光可斷裂的熒光標記化合物A.8的核磁共振H譜及C譜模擬結果；

圖3是本發(fā)明實施例中的光可斷裂的熒光標記化合物A.14的核磁共振H譜及C譜模擬結果。

具體實施方式

現(xiàn)通過以下實施例來進一步描述本發(fā)明，實施例僅用于例證的目的，不限制本發(fā)明的范圍，同時本領域普通技術人員根據(jù)本發(fā)明所做的顯而易見的改變和修飾也包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。

圖1是本發(fā)明實施例中的光可斷裂的熒光標記化合物的化學結構式；結合圖1，本發(fā)明實施例提供了一種光可斷裂的熒光標記可逆終端化合物的合成方法。

實施例1

一種光可斷裂的熒光標記可逆終端化合物的合成方法，包括如下路線1-5的任一種：

合成路線1：

其中，步驟(i)的反應條件為：化合物10mmol 2.5g A.1在叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)4.82g 32mmol、咪唑(imidazole)4.5g 66mmol以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml存在的條件下，室溫，過夜，然后反應液在二碳酸二叔丁基甲酯((Boc)₂O)20mmol 4.36g、4-二甲氨基吡啶(DMAP)10mmol 1.22g以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml存在的條件下，室溫，過夜，真空濃縮后，將殘留物用飽和的氯化銨溶液清洗兩次(每次50ml)，利用CH₂Cl₂萃取合并水層，采用硫酸鈉干燥合并有機層，在真空下濃縮，通過硅膠柱色譜純化，得化合物A.2 5.6g 8mmol(80％)；

上述合成步驟(i)中，加入的TBSCl可以為30～40mmol中的任意值；加入的(Boc)₂O可以為10～30mmol中的任意值；

步驟(ii)的反應條件為：步驟(i)所得的化合物A.2在Mg(ClO₄)₂ 10mmol 2.23g、以及四氫呋喃THF 50ml,存在的條件下反應2h，在真空下除去溶劑，通過硅膠柱色譜純化粗產(chǎn)物得化合物A.3 2.3g(90％)；

上述合成步驟(ii)中，加入的Mg(ClO₄)₂可以為8～12mmol中的任意值；

步驟(iii)的反應條件為：步驟(ii)所得的化合物A.3在NaH 20mg、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml以及4-巰基-2-硝基苯甲溴(4-sulfo-2-nitrobenzyl bromide)10mmol 2.16g存在的條件下反應4h，在真空環(huán)境中除去DMF，將殘留物溶解在乙酸乙酯40ml中，采用飽和的氯化銨溶液清洗2次，再采用20ml水清洗1次，利用乙酸乙酯20ml萃取合并的水層，再用硫酸鈉干燥合并的有機層，真空濃縮后，通過硅膠柱色譜純化得化合物A.4 3.26g(90％)；

上述合成步驟(iii)中，加入的4-巰基-2-硝基苯甲溴可以為7.5～15mmol中的任意值；

步驟(iv)的反應條件為：步驟(iii)所得的化合物A.4在SiO₂ 20mg存在的條件下反應2h，將混合物在真空下蒸干，用甲醇清洗2次(每次40ml)，過濾、真空濃縮合并的濾液，通過硅膠柱色譜純化，得化合物A.5 3.2g(90％)；

上述合成步驟(iv)中，加入的SiO₂可以為15～30mg中的任意值；

步驟(v)的反應條件為：步驟(iv)所得的化合物A.5在n-氟化四丁銨(n-Bu₄NF)10mmol 2.61g、THF30ml存在的條件下反應3h，將混合物在真空下蒸干，將殘留物通過硅膠柱色譜純化，得化合物A.6 3.1g(93％)；

上述合成步驟(v)中，加入的n-氟化四丁銨可以為5～15mmol中的任意值；

步驟(vi)的反應條件為：將步驟(v)所得的化合物A.6在三氯氧磷(POCl₃)20mmol 3.1g、1,8-雙二甲氨基萘(proton sponge)10mmol 2.14g、磷酸三甲酯((MeO)₃PO)20mmol 2.8g存在的條件下低溫(-20～30℃)反應5h，然后在3.5g 10mmol(n-Bu₃NH)₂H₂P₂O₇、n-Bu₃N 10ml、以及DMF30ml存在的條件下室溫攪拌反應3h；再加入HNEt₃HCO₃ 10mmol 1.6g反應1h，然后冷干，將殘留物溶解在40ml水中，過濾，通過陰離子交換色譜進行純化，冷凍干燥得化合物A.7 3.5g(85％)；

上述合成步驟(vi)中，加入的三氯氧磷可以為15～25mmol中的任意值；加入的1,8-雙二甲氨基萘可以為8～12mmol中的任意值；加入的磷酸三甲酯可以為15～25mmol中的任意值；加入的(n-Bu₃NH)₂H₂P₂O₇可以為15～25mmol中的任意值；

步驟(vii)的反應條件為：將步驟(vi)所得的化合物A.7和6.5g 10mmol反應2h 60℃，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過反相HPLC將反應純化，獲得所述光可斷裂的熒光標記可逆終端化合物A.8 3.7g(78％)，其中，為Dye-Cy5maleimide(合成路線2-5同此處):

上述合成步驟(vii)中，加入的可以為8～12mmol中的任意值。

為進一步說明本發(fā)明有益效果，本發(fā)明對產(chǎn)物A.8進行了核磁共振模擬分析，1HNMR模擬結果如下式(A)所示：

C13NMR模擬結果如下式(B)所示：

式(A)、式(B)分別對應的H譜和C譜圖分別為圖2中a圖和b圖所示。

經(jīng)核磁共振檢測，所得化合物A.8的結構式與核磁共振模擬結果一致，步驟(vii)所得的化合物A.8的結構式如dATP-Cy5所示：

合成路線2：

其中，步驟(i)的反應條件為：化合物10mmol 2.7g G.1在叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)4.82g 32mmol、咪唑(imidGzole)4.5g 66mmol以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml存在的條件下，室溫，過夜，然后反應液在二碳酸二叔丁基甲酯((Boc)₂O)20mmol 4.36g、4-二甲氨基吡啶(DMGP)10mmol 1.22g以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml存在的條件下，室溫，過夜，真空濃縮后，將殘留物用飽和的氯化銨溶液清洗兩次(每次50ml)，利用CH₂Cl₂萃取合并水層，采用硫酸鈉干燥合并有機層，在真空下濃縮，通過硅膠柱色譜純化，得化合物5.9g 8.5mmol(85％)；

上述合成步驟(i)中，加入的TBSCl可以為30～40mmol中的任意值；加入的(Boc)₂O可以為10～30mmol中的任意值；

步驟(ii)的反應條件為：步驟(i)所得的化合物G.2在Mg(ClO₄)₂ 10mmol 2.23g、以及四氫呋喃THF 50ml,存在的條件下反應2h，在真空下除去溶劑，通過硅膠柱色譜純化粗產(chǎn)物得化合物G.3 4.6g(92％)；

上述合成步驟(ii)中，加入的Mg(ClO₄)₂可以為8～12mmol中的任意值；

步驟(iii)的反應條件為：步驟(ii)所得的化合物G.3在NAH 20mg、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml以及4-巰基-2-硝基苯甲溴(4-sulfo-2-nitrobenzyl bromide)10mmol 2.16g存在的條件下反應4h，在真空環(huán)境中除去DMF，將殘留物溶解在乙酸乙酯40ml中，采用飽和的氯化銨溶液清洗2次，再采用20ml水清洗1次，利用乙酸乙酯20ml萃取合并的水層，再用硫酸鈉干燥合并的有機層，真空濃縮后，通過硅膠柱色譜純化得化合物G.4 5.6g(93％)；

上述合成步驟(iii)中，加入的4-巰基-2-硝基苯甲溴可以為7.5～15mmol中的任意值；

步驟(iv)的反應條件為：步驟(iii)所得的化合物G.4在SiO₂ 20mg存在的條件下反應2h，將混合物在真空下蒸干，用甲醇清洗2次(每次40ml)，過濾、真空濃縮合并的濾液，通過硅膠柱色譜純化，得化合物G.5 4.3g(89％)；

上述合成步驟(iv)中，加入的SiO₂可以為15～30mg中的任意值；

步驟(v)的反應條件為：步驟(iv)所得的化合物G.5在n-氟化四丁銨(n-Bu₄NF)10mmol 2.61g、THF30ml存在的條件下反應3h，將混合物在真空下蒸干，將殘留物通過硅膠柱色譜純化，得化合物G.6 2.5g(90％)；

上述合成步驟(v)中，加入的n-氟化四丁銨可以為5～15mmol中的任意值；

步驟(vi)的反應條件為：將步驟(v)所得的化合物G.6在三氯氧磷(POCl₃)20mmol 3.1g、1,8-雙二甲氨基萘(proton sponge)10mmol 2.14g、磷酸三甲酯((MeO)₃PO)20mmol 2.8g存在的條件下低溫(-20～30℃)反應5h，然后在3.5g 10mmol(n-Bu₃NH)₂H₂P₂O₇、n-Bu₃N 10ml、以及DMF30ml存在的條件下室溫攪拌反應3h；再加入HNEt₃HCO₃ 10mmol 1.6g反應1h，然后冷干，將殘留物溶解在40ml水中，過濾，通過陰離子交換色譜進行純化，冷凍干燥得化合物G.7 3.6g(91％)；

上述合成步驟(vi)中，加入的三氯氧磷可以為15～25mmol中的任意值；加入的1,8-雙二甲氨基萘可以為8～12mmol中的任意值；加入的磷酸三甲酯可以為15～25mmol中的任意值；加入的(n-Bu₃NH)₂H₂P₂O₇可以為15～25mmol中的任意值；

步驟(vii)的反應條件為：將步驟(vi)所得的化合物G.7和6.5g 10mmol反應2h 60℃，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過反相HPLC將反應純化，獲得所述光可斷裂的熒光標記可逆終端化合物G.8 5.1g(80％)。經(jīng)核磁共振檢測，所得化合物G.8的結構式與核磁共振模擬結果一致。

上述合成步驟(vii)中，加入的可以為8～12mmol中的任意值。

合成路線3：

其中，步驟(i)的反應條件為：化合物10mmol 2.3g C.1在叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)4.82g 32mmol、咪唑(imidGzole)4.5g 66mmol以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml存在的條件下，室溫，過夜，然后反應液在二碳酸二叔丁基甲酯((Boc)₂O)20mmol 4.36g、4-二甲氨基吡啶(DMGP)10mmol 1.22g以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml存在的條件下，室溫，過夜，真空濃縮后，將殘留物用飽和的氯化銨溶液清洗兩次(每次50ml)，利用CH₂Cl₂萃取合并水層，采用硫酸鈉干燥合并有機層，在真空下濃縮，通過硅膠柱色譜純化，得化合物C.2 5.8g(88％)；

上述合成步驟(i)中，加入的TBSCl可以為30～40mmol中的任意值；加入的(Boc)₂O可以為10～30mmol中的任意值；

步驟(ii)的反應條件為：步驟(i)所得的化合物C.2在Mg(ClO₄)₂ 10mmol 2.23g、以及四氫呋喃THF 50ml,存在的條件下反應2h，在真空下除去溶劑，通過硅膠柱色譜純化粗產(chǎn)物得化合物C.3 4.3g(88％)；

上述合成步驟(ii)中，加入的Mg(ClO₄)₂可以為8～12mmol中的任意值；

步驟(iii)的反應條件為：步驟(ii)所得的化合物C.3在NaH 20mg、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml以及4-巰基-2-硝基苯甲溴(4-sulfo-2-nitrobenzyl bromide)10mmol 2.16g存在的條件下反應4h，在真空環(huán)境中除去DMF，將殘留物溶解在乙酸乙酯40ml中，采用飽和的氯化銨溶液清洗2次，再采用20ml水清洗1次，利用乙酸乙酯20ml萃取合并的水層，再用硫酸鈉干燥合并的有機層，真空濃縮后，通過硅膠柱色譜純化得化合物C.4 5.1g(90％)；

上述合成步驟(iii)中，加入的4-巰基-2-硝基苯甲溴可以為7.5～15mmol中的任意值；

步驟(iv)的反應條件為：步驟(iii)所得的化合物C.4在SiO₂ 20mg存在的條件下反應2h，將混合物在真空下蒸干，用甲醇清洗2次(每次40ml)，過濾、真空濃縮合并的濾液，通過硅膠柱色譜純化，得化合物C.5 4.0g(91％)；

上述合成步驟(iv)中，加入的SiO₂可以為15～30mg中的任意值；

步驟(v)的反應條件為：步驟(iv)所得的化合物C.5在n-氟化四丁銨(n-Bu₄NF)10mmol 2.61g、THF30ml存在的條件下反應3h，將混合物在真空下蒸干，將殘留物通過硅膠柱色譜純化，得化合物C.6 2.3g(92％)；

上述合成步驟(v)中，加入的n-氟化四丁銨可以為5～15mmol中的任意值；

步驟(vi)的反應條件為：將步驟(v)所得的化合物C.6在三氯氧磷(POCl₃)20mmol 3.1g、1,8-雙二甲氨基萘(proton sponge)10mmol 2.14g、磷酸三甲酯((MeO)₃PO)20mmol 2.8g存在的條件下低溫(-20～30℃)反應5h，然后在3.5g 10mmol(n-Bu₃NH)₂H₂P₂O₇、n-Bu₃N 10ml、以及DMF30ml存在的條件下室溫攪拌反應3h；再加入HNEt₃HCO₃ 10mmol 1.6g反應1h，然后冷干，將殘留物溶解在40ml水中，過濾，通過陰離子交換色譜進行純化，冷凍干燥得化合物C.7 3.3g(87％)；

上述合成步驟(vi)中，加入的三氯氧磷可以為15～25mmol中的任意值；加入的1,8-雙二甲氨基萘可以為8～12mmol中的任意值；加入的磷酸三甲酯可以為15～25mmol中的任意值；加入的(n-Bu₃NH)₂H₂P₂O₇可以為15～25mmol中的任意值；

步驟(vii)的反應條件為：將步驟(vi)所得的化合物C.7和6.5g 10mmol反應2h 60℃，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過反相HPLC將反應純化，獲得所述光可斷裂的熒光標記可逆終端化合物C.8 4.5g(83％)。經(jīng)核磁共振檢測，所得化合物C.8的結構式與核磁共振模擬結果一致。

上述合成步驟(vii)中，加入的可以為8～12mmol中的任意值。

合成路線4：

其中，步驟(i)的反應條件為：化合物10mmol 2.4g T.1在叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)4.82g 32mmol、咪唑(imidGzole)4.5g 66mmol以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml存在的條件下，室溫，過夜，然后反應液在二碳酸二叔丁基甲酯((Boc)₂O)20mmol 4.36g、4-二甲氨基吡啶(DMGP)10mmol 1.22g以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml存在的條件下，室溫，過夜，真空濃縮后，將殘留物用飽和的氯化銨溶液清洗兩次(每次50ml)，利用CH₂Cl₂萃取合并水層，采用硫酸鈉干燥合并有機層，在真空下濃縮，通過硅膠柱色譜純化，得化合物T.2 5.0g(83％)；

上述合成步驟(i)中，加入的TBSCl可以為30～40mmol中的任意值；加入的(Boc)₂O可以為10～30mmol中的任意值；

步驟(ii)的反應條件為：步驟(i)所得的化合物T.2在NaH 20mg、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml以及4-巰基-2-硝基苯甲溴(4-sulfo-2-nitrobenzyl bromide)10mmol 2.16g存在的條件下反應4h，在真空環(huán)境中除去DMF，將殘留物溶解在乙酸乙酯40ml中，采用飽和的氯化銨溶液清洗2次，再采用20ml水清洗1次，利用乙酸乙酯20ml萃取合并的水層，再用硫酸鈉干燥合并的有機層，真空濃縮后，通過硅膠柱色譜純化得化合物T.3 6.0g(93％)；

上述合成步驟(ii)中，加入的4-巰基-2-硝基苯甲溴可以為7.5～15mmol中的任意值；

步驟(iii)的反應條件為：步驟(ii)所得的化合物T.3在n-氟化四丁銨(n-Bu₄NF)10mmol 2.61g、THF30ml存在的條件下反應3h，將混合物在真空下蒸干，將殘留物通過硅膠柱色譜純化，得化合物T.4 3.9g(94％)；

上述合成步驟(iii)中，加入的n-氟化四丁銨可以為5～15mmol中的任意值；

步驟(ⅳ)的反應條件為：將步驟(iii)所得的化合物T.4在三氯氧磷(POCl₃)20mmol 3.1g、1,8-雙二甲氨基萘(proton sponge)10mmol 2.14g、磷酸三甲酯((MeO)₃PO)20mmol 2.8g存在的條件下低溫(-20～30℃)反應5h，然后在3.5g 10mmol(n-Bu₃NH)₂H₂P₂O₇、n-Bu₃N 10ml、以及DMF30ml存在的條件下室溫攪拌反應3h；再加入HNEt₃HCO₃ 10mmol 1.6g反應1h，然后冷干，將殘留物溶解在40ml水中，過濾，通過陰離子交換色譜進行純化，冷凍干燥得化合物T.5 4.3g(87％)；

上述合成步驟(ⅳ)中，加入的三氯氧磷可以為15～25mmol中的任意值；加入的1,8-雙二甲氨基萘可以為8～12mmol中的任意值；加入的磷酸三甲酯可以為15～25mmol中的任意值；加入的(n-Bu₃NH)₂H₂P₂O₇可以為15～25mmol中的任意值；

步驟(v)的反應條件為：將步驟(ⅳ)所得的化合物T.5和6.5g 10mmol反應2h 60℃，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過反相HPLC將反應純化，獲得所述光可斷裂的熒光標記可逆終端化合物T.6 6.0g(84％)。經(jīng)核磁共振檢測，所得化合物T.6的結構式與核磁共振模擬結果一致。

上述合成步驟(v)中，加入的可以為8～12mmol中的任意值。

合成路線5：

其中，步驟(i)的反應條件為：化合物10mmol 2.3g U.1在叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)4.82g 32mmol、咪唑(imidGzole)4.5g 66mmol以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml存在的條件下，室溫，過夜，然后反應液在二碳酸二叔丁基甲酯((Boc)₂O)20mmol 4.36g、4-二甲氨基吡啶(DMGP)10mmol 1.22g以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml存在的條件下，室溫，過夜，真空濃縮后，將殘留物用飽和的氯化銨溶液清洗兩次(每次50ml)，利用CH₂Cl₂萃取合并水層，采用硫酸鈉干燥合并有機層，在真空下濃縮，通過硅膠柱色譜純化，得化合物U.2 4.6(82％)；

上述合成步驟(i)中，加入的TBSCl可以為30～40mmol中的任意值；加入的(Boc)₂O可以為10～30mmol中的任意值；

步驟(ii)的反應條件為：步驟(i)所得的化合物U.2在NaH 20mg、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)30ml以及4-巰基-2-硝基苯甲溴(4-sulfo-2-nitrobenzyl bromide)10mmol 2.16g存在的條件下反應4h，在真空環(huán)境中除去DMF，將殘留物溶解在乙酸乙酯40ml中，采用飽和的氯化銨溶液清洗2次，再采用20ml水清洗1次，利用乙酸乙酯20ml萃取合并的水層，再用硫酸鈉干燥合并的有機層，真空濃縮后，通過硅膠柱色譜純化得化合物U.3 5.4g(92％)；

上述合成步驟(ii)中，加入的4-巰基-2-硝基苯甲溴可以為7.5～15mmol中的任意值；

步驟(iii)的反應條件為：步驟(ii)所得的化合物U.3在n-氟化四丁銨(n-Bu₄NF)10mmol 2.61g、THF30ml存在的條件下反應3h，將混合物在真空下蒸干，將殘留物通過硅膠柱色譜純化，得化合物U.4 3.4g(92％)；

上述合成步驟(iii)中，加入的n-氟化四丁銨可以為5～15mmol中的任意值；

步驟(ⅳ)的反應條件為：將步驟(iii)所得的化合物U.4在三氯氧磷(POCl₃)20mmol 3.1g、1,8-雙二甲氨基萘(proton sponge)10mmol 2.14g、磷酸三甲酯((MeO)₃PO)20mmol 2.8g存在的條件下低溫(-20～30℃)反應5h，然后在3.5g 10mmol(n-Bu₃NH)₂H₂P₂O₇、n-Bu₃N 10ml、以及DMF30ml存在的條件下室溫攪拌反應3h；再加入HNEt₃HCO₃ 10mmol 1.6g反應1h，然后冷干，將殘留物溶解在40ml水中，過濾，通過陰離子交換色譜進行純化，冷凍干燥得化合物U.5 3.8g(86％)；

上述合成步驟(ⅳ)中，加入的三氯氧磷可以為15～25mmol中的任意值；加入的1,8-雙二甲氨基萘可以為8～12mmol中的任意值；加入的磷酸三甲酯可以為15～25mmol中的任意值；加入的(n-Bu₃NH)₂H₂P₂O₇可以為15～25mmol中的任意值；

步驟(v)的反應條件為：將步驟(ⅳ)所得的化合物U.5和6.5g 10mmol反應2h 60℃，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過反相HPLC將反應純化，獲得所述光可斷裂的熒光標記可逆終端化合物U.6 6.2g(89％)。經(jīng)核磁共振檢測，所得化合物U.8的結構式與核磁共振模擬結果一致。

上述合成步驟(v)中，加入的可以為8～12mmol中的任意值。

實施例2

一種光可斷裂的熒光標記可逆終端化合物的合成方法，包括如下路線1-5的任一種：

合成路線1：

其中，步驟(i)的反應條件為：2.9g 5mmol化合物A.3在5.1g 15mmol4-碘-2-硝基溴化芐(4-iodo-2-nitrobenzyl bromide)、20mgNaH以及50mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的條件下室溫攪拌反應4h，用硫酸鈉干燥后，真空濃縮，通過硅膠柱色譜純化得化合物A.9 3.5g(84％)；

上述步驟(i)中，加入的4-碘-2-硝基溴化芐可以為10～20mmol中的任意值；

步驟(ii)的反應條件為：步驟(i)所得的化合物A.9在NaN₃、CuI、L-脯氨酸、NaOH以及DMSO存在的條件下反應2h，真空濃縮后，通過硅膠柱色譜純化，得化合物A.10 2.9g(91％)；

上述步驟(ii)中，加入的NaN₃可以為10～20mmol中的任意值；步驟(iii)的反應條件為：步驟(ii)所得的化合物A.10在10mgSiO₂存在的條件下反應2h，將混合物在真空下蒸干，用甲醇清洗2次(每次20ml)，過濾、真空濃縮合并的濾液，通過硅膠柱色譜純化，得化合物A.11 2.1g(84％)；

上述合成步驟(iii)中，加入的SiO₂可以為7.5～15mg中的任意值；

步驟(iv)的反應條件為：步驟(iii)所得的化合物A.11在5mmol 2.3g n-氟化四丁銨(n-Bu₄NF)、15ml THF存在的條件下反應3h，將混合物在真空下蒸干，將殘留物通過硅膠柱色譜純化，得化合物A.12 1.2g 91％；

上述合成步驟(v)中，加入的n-氟化四丁銨可以為2.5～7.5mmol中的任意值；

步驟(v)的反應條件為：步驟(iv)所得的化合物A.12在10mmol 1.5g三氯氧磷(POCl₃)、5mmol 1.1g 1,8-雙二甲氨基萘(proton sponge)、10mmol 1.4g磷酸三甲酯((MeO)₃PO)存在的條件下低溫(-20～30℃)反應5h，然后在1.8g 5mmol(n-Bu₃NH)₂H₂P₂O₇、5ml n-Bu₃N、以及15ml DMF存在的條件下反應3h；再加入0.8g HNEt₃HCO₃反應1h，然后冷干，將殘留物溶解在40ml水中，過濾，通過陰離子交換色譜進行純化，冷凍干燥得化合物A.13 1.8g 90％；

上述合成步驟(v)中，加入的三氯氧磷可以為7.5～12.5mmol中的任意值；加入的1,8-雙二甲氨基萘可以為4～8mmol中的任意值；加入的磷酸三甲酯可以為7.5～12.5mmol中的任意值；加入的(n-Bu₃NH)₂H₂P₂O₇可以為7.5～12.5mmol中的任意值；步驟(vi)的反應條件為：將3.3g 5mmol熒光分子標記的環(huán)辛炔與步驟(v)所得的化合物A.13在60℃條件下進行生物正交反應(bioorthogonal chemistry)反應2h，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過反相HPLC將反應純化，獲得所述光可斷裂的熒光標記可逆終端化合物A.14 2.9g 85％，其中，為Cyclooctyne labeled Cy5(合成路線2-5同此處)：

上述合成步驟(vi)中，加入的熒光分子標記的環(huán)辛炔可以為4～6mmol中的任意值。

為進一步說明本發(fā)明有益效果，本發(fā)明對產(chǎn)物A.14進行了核磁共振模擬分析，1HNMR模擬結果如下式(C)所示：

C13NMR模擬結果如下式(D)所示：

式(C)、式(D)分別對應的H譜和C譜圖分別為圖3中a圖和b圖所示。

經(jīng)核磁共振檢測，所得化合物A.14的結構式與核磁共振模擬結果一致。步驟(vii)所得的化合物A.14的結構式如下所示：

合成路線2：

其中，步驟(i)的反應條件為：5mmol 2.8g化合物C.3在5.1g 15mmol4-碘-2-硝基溴化芐(4-iodo-2-nitrobenzyl bromide)、20mgNaH以及50mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的條件下室溫攪拌反應4h，用硫酸鈉干燥后，真空濃縮，通過硅膠柱色譜純化得化合物C.9 3.3g 82％；

上述步驟(i)中，加入的4-碘-2-硝基溴化芐可以為10～20mmol中的任意值；

步驟(ii)的反應條件為：步驟(i)所得的化合物C.9在NaN₃、CuI、L-脯氨酸、NaOH以及DMSO存在的條件下反應2h，真空濃縮后，通過硅膠柱色譜純化，得化合物C.10 2.8g 93％；

上述步驟(ii)中，加入的NaN₃可以為10～20mmol中的任意值；

步驟(iii)的反應條件為：步驟(ii)所得的化合物C.10在10mgSiO₂存在的條件下反應2h，將混合物在真空下蒸干，用甲醇清洗2次(每次20ml)，過濾、真空濃縮合并的濾液，通過硅膠柱色譜純化，得化合物C.11 2.0g 84％；

上述合成步驟(iii)中，加入的SiO₂可以為7.5～15mg中的任意值；

步驟(iv)的反應條件為：步驟(iii)所得的化合物C.11在5mmol 1.3g n-氟化四丁銨(n-Bu₄NF)、15ml THF存在的條件下反應3h，將混合物在真空下蒸干，將殘留物通過硅膠柱色譜純化，得化合物C.12 1.2g91％；

上述合成步驟(v)中，加入的n-氟化四丁銨可以為3～6mmol中的任意值；

步驟(v)的反應條件為：步驟(iv)所得的化合物C.12在10mmol 1.5g三氯氧磷(POCl₃)、5mmol 1.1g 1,8-雙二甲氨基萘(proton sponge)、10mmol 1.4g磷酸三甲酯((MeO)₃PO)存在的條件下低溫(-20～30℃)反應5h，然后在1.8g 5mmol(n-Bu₃NH)₂H₂P₂O₇、5ml n-Bu₃N、以及15ml DMF存在的條件下反應3h；再加入0.8g HNEt₃HCO₃反應1h，然后冷干，將殘留物溶解在40ml水中，過濾，通過陰離子交換色譜進行純化，冷凍干燥得化合物C.13 1.7g 89％；

上述合成步驟(v)中，加入的三氯氧磷可以為7.5～12.5mmol中的任意值；加入的1,8-雙二甲氨基萘可以為4～6mmol中的任意值；加入的磷酸三甲酯可以為7.5～12.5mmol中的任意值；加入的(n-Bu₃NH)₂H₂P₂O₇可以為7.5～12.5mmol中的任意值；

步驟(vi)的反應條件為：將3.3g5mmol熒光分子標記的環(huán)辛炔與步驟(v)所得的化合物C.13在60℃條件下進行生物正交反應(bioorthogonal chemistry)反應2h，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過反相HPLC將反應純化，獲得所述光可斷裂的熒光標記可逆終端化合物C.14 2.8g 84％。經(jīng)核磁共振檢測，所得化合物C.14的結構式與核磁共振模擬結果一致。

上述合成步驟(vi)中，加入的熒光分子標記的環(huán)辛炔可以為3～6mmol中的任意值。

合成路線3：

其中，步驟(i)的反應條件為：5mmol 3.0g化合物G.3在5.1g 15mmol4-碘-2-硝基溴化芐(4-iodo-2-nitrobenzyl bromide)、20mgNaH以及50mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的條件下室溫攪拌反應4h，用硫酸鈉干燥后，真空濃縮，通過硅膠柱色譜純化得化合物G.9 3.7g 86％；

上述步驟(i)中，加入的4-碘-2-硝基溴化芐可以為10～20mmol中的任意值；

步驟(ii)的反應條件為：步驟(i)所得的化合物G.9在NaN₃、CuI、L-脯氨酸、NaOH以及DMSO存在的條件下反應2h，真空濃縮后，通過硅膠柱色譜純化，得化合物G.10 3g 91％；

上述步驟(ii)中，加入的NaN₃可以為10～20mmol中的任意值；

步驟(iii)的反應條件為：步驟(ii)所得的化合物G.10在10mgSiO₂存在的條件下反應2h，將混合物在真空下蒸干，用甲醇清洗2次(每次20ml)，過濾、真空濃縮合并的濾液，通過硅膠柱色譜純化，得化合物G.11 2.2g 84％；

上述合成步驟(iii)中，加入的SiO₂可以為7.5～15mg中的任意值；

步驟(iv)的反應條件為：步驟(iii)所得的化合物G.11在5mmol 1.3g n-氟化四丁銨(n-Bu₄NF)、15ml THF存在的條件下反應3h，將混合物在真空下蒸干，將殘留物通過硅膠柱色譜純化，得化合物G.12 1.3g 88％；

上述合成步驟(v)中，加入的n-氟化四丁銨可以為3～6mmol中的任意值；

步驟(v)的反應條件為：步驟(iv)所得的化合物G.12在10mmol 1.5g三氯氧磷(POCl₃)、5mmol 1.1g 1,8-雙二甲氨基萘(proton sponge)、10mmol 1.4g磷酸三甲酯((MeO)₃PO)存在的條件下低溫(-20～30℃)反應5h，然后在1.8g 5mmol(n-Bu₃NH)₂H₂P₂O₇、5ml n-Bu₃N、以及15ml DMF存在的條件下反應3h；再加入0.8g HNEt₃HCO₃反應1h，然后冷干，將殘留物溶解在40ml水中，過濾，通過陰離子交換色譜進行純化，冷凍干燥得化合物G.13 1.8g 90％；

上述合成步驟(v)中，加入的三氯氧磷可以為7.5～12.5mmol中的任意值；加入的1,8-雙二甲氨基萘可以為4～6mmol中的任意值；加入的磷酸三甲酯可以為7.5～12.5mmol中的任意值；加入的(n-Bu₃NH)₂H₂P₂O₇可以為7.5～12.5mmol中的任意值；

步驟(vi)的反應條件為：將3.3g 5mmol熒光分子標記的環(huán)辛炔與步驟(v)所得的化合物G.13在60℃條件下進行生物正交反應(bioorthogonal chemistry)反應2h，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過反相HPLC將反應純化，獲得所述光可斷裂的熒光標記可逆終端化合物G.14 2.8g 83％。經(jīng)核磁共振檢測，所得化合物G.14的結構式與核磁共振模擬結果一致。

上述合成步驟(vi)中，加入的熒光分子標記的環(huán)辛炔可以為3～6mmol中的任意值。

合成路線4：

其中，步驟(i)的反應條件為：2.9g 5mmol化合物T.2在5.1g 15mmol4-碘-2-硝基溴化芐(4-iodo-2-nitrobenzyl bromide)、20mgNaH以及50mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的條件下室溫攪拌反應4h，用硫酸鈉干燥后，真空濃縮，通過硅膠柱色譜純化得化合物T.7 3.1g 84％；

上述步驟(i)中，加入的4-碘-2-硝基溴化芐可以為10～20mmol中的任意值；

步驟(ii)的反應條件為：步驟(i)所得的化合物T.7在NaN₃、CuI、L-脯氨酸、NaOH以及DMSO存在的條件下反應2h，真空濃縮后，通過硅膠柱色譜純化，得化合物T.8 2.5g 91％；

上述步驟(ii)中，加入的NaN₃可以為10～20mmol中的任意值；

步驟(iii)的反應條件為：步驟(ii)所得的化合物T.8的化合物T.8在5mmol 1.3g n-氟化四丁銨(n-Bu₄NF)、15ml THF存在的條件下反應3h，將混合物在真空下蒸干，將殘留物通過硅膠柱色譜純化，得化合物T.9 1.4g 89％；

上述合成步驟(iii)中，加入的n-氟化四丁銨可以為3～6mmol中的任意值；

步驟(iv)的反應條件為：步驟(iii)所得的化合物T.9在10mmol 1.5g三氯氧磷(POCl₃)、5mmol 1.1g 1,8-雙二甲氨基萘(proton sponge)、10mmol 1.4g磷酸三甲酯((MeO)₃PO)存在的條件下低溫(-20～30℃)反應5h，然后在1.8g 5mmol(n-Bu₃NH)₂H₂P₂O₇、5ml n-Bu₃N、以及15ml DMF存在的條件下反應3h；再加入0.8g HNEt₃HCO₃反應1h，然后冷干，將殘留物溶解在40ml水中，過濾，通過陰離子交換色譜進行純化，冷凍干燥得化合物T.10 1.9g 87％；

上述合成步驟(iv)中，加入的三氯氧磷可以為7.5～12.5mmol中的任意值；加入的1,8-雙二甲氨基萘可以為4～6mmol中的任意值；加入的磷酸三甲酯可以為7.5～12.5mmol中的任意值；加入的(n-Bu₃NH)₂H₂P₂O₇可以為7.5～12.5mmol中的任意值；

步驟(v)的反應條件為：將3.3g 5mmol熒光分子標記的環(huán)辛炔與步驟(iv)所得的化合物T.10在60℃條件下進行生物正交反應(bioorthogonal chemistry)反應2h，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過反相HPLC將反應純化，獲得所述光可斷裂的熒光標記可逆終端化合物T.11 3.1g 82％。經(jīng)核磁共振檢測，所得化合物T.11的結構式與核磁共振模擬結果一致。

上述合成步驟(vi)中，加入的熒光分子標記的環(huán)辛炔可以為3～6mmol中的任意值。

合成路線5：

其中，步驟(i)的反應條件為：5mmol 2.8g化合物U.2在5.1g 15mmol4-碘-2-硝基溴化芐(4-iodo-2-nitrobenzyl bromide)、20mgNaH以及50mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的條件下室溫攪拌反應4h，用硫酸鈉干燥后，真空濃縮，通過硅膠柱色譜純化得化合物U.7 3.1g 86％；

上述步驟(i)中，加入的4-碘-2-硝基溴化芐可以為10～20mmol中的任意值；

步驟(ii)的反應條件為：步驟(i)所得的化合物U.7在NaN₃、CuI、L-脯氨酸、NaOH以及DMSO存在的條件下反應2h，真空濃縮后，通過硅膠柱色譜純化，得化合物U.8 2.8g 88％；

上述步驟(ii)中，加入的NaN₃可以為10～20mmol中的任意值；

步驟(iii)的反應條件為：步驟(ii)所得的化合物T.8的化合物T.8在5mmol 1.3g n-氟化四丁銨(n-Bu₄NF)、15ml THF存在的條件下反應3h，將混合物在真空下蒸干，將殘留物通過硅膠柱色譜純化，得化合物U.9 1.4g 92％；

上述合成步驟(iii)中，加入的n-氟化四丁銨可以為3～6mmol中的任意值；

步驟(iv)的反應條件為：步驟(iii)所得的化合物U.9在10mmol 1.5g三氯氧磷(POCl₃)、5mmol 1.1g 1,8-雙二甲氨基萘(proton sponge)、10mmol 1.4g磷酸三甲酯((MeO)₃PO)存在的條件下低溫(-20～30℃)反應5h，然后在1.8g 5mmol(n-Bu₃NH)₂H₂P₂O₇、5ml n-Bu₃N、以及15ml DMF存在的條件下反應3h；再加入0.8g HNEt₃HCO₃反應1h，然后冷干，將殘留物溶解在40ml水中，過濾，通過陰離子交換色譜進行純化，冷凍干燥得化合物U.10 1.9g 85％；

上述合成步驟(iv)中，加入的三氯氧磷可以為7.5～12.5mmol中的任意值；加入的1,8-雙二甲氨基萘可以為4～6mmol中的任意值；加入的磷酸三甲酯可以為7.5～12.5mmol中的任意值；加入的(n-Bu₃NH)₂H₂P₂O₇可以為7.5～12.5mmol中的任意值；

步驟(v)的反應條件為：將3.3g 5mmol熒光分子標記的環(huán)辛炔與步驟(iv)所得的化合物U.10在60℃條件下進行生物正交反應(bioorthogonal chemistry)反應2h，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過反相HPLC將反應純化，獲得所述光可斷裂的熒光標記可逆終端化合物U.11 3.2g 84％。經(jīng)核磁共振檢測，所得化合物U.11的結構式與核磁共振模擬結果一致。

上述合成步驟(vi)中，加入的熒光分子標記的環(huán)辛炔可以為3～6mmol中的任意值。

實施例3

為了檢測本發(fā)明所合成的可逆終端是否可以應用于DNA/RNA測序，本實施例進一步檢測了實施例1-2所制備的A.8、G.8、C.8、T.8、U.8、A.14、G.14、C.14、T.14、U.14的可逆終端化合物兩個方面的特性：

1)是否可以被DNA聚合酶所識別，作為DNA聚合酶的底物參與DNA的延伸反應；

2)參與DNA鏈延伸后能否去掉該可逆終端所攜帶的熒光基團，以便下一輪的延伸反應。

這兩方面是單分子高通量合成測序(SMTS)的核心。具體如下：

1)配制DNA延伸反應體系：依次將不同的可逆終端與DNA模板(序列信息已知，質(zhì)量已知)、Klenow(exo-)DNA聚合酶、Klenow緩沖液充分混合，30℃靜置15分鐘，75℃處理10分鐘以滅活klenow DNA聚合酶活性；采用MALDI-TOF-MS(基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜法)檢測延伸產(chǎn)物質(zhì)荷比(m/z)，得到質(zhì)譜圖，計算DNA模板的延伸效率。

延伸效率計算公式：假如理論上100條DNA模板將在延伸反應中加上1個核苷酸，實際在延伸反應中加上1個核苷酸的DNA模板鏈只有96條，則延伸效率記為96％。

在本發(fā)明重復多次實驗中，引入本發(fā)明化合物時，核酸延伸的延伸效率為約90％至約100％。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供的A.8、G.8、C.8、T.8、U.8、A.14、G.14、C.14、T.14、U.14的可逆終端化合物的延伸效率為至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％。

2)步驟1)質(zhì)譜檢測延伸效率后，采用LED燈或UV燈照射反應溶液體系，采用MALDI-TOF-MS(基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜法)檢測光敏感可逆終端化合物所攜帶的熒光基團斷裂的產(chǎn)物的質(zhì)荷比(m/z)，得到質(zhì)譜圖，計算本發(fā)明提供的可逆終端化合物的熒光切除效率。

在本發(fā)明重復多次實驗中，當采用LED燈或UV燈照射反應溶液體系后，延伸核酸鏈上可逆終端化合物的熒光切除效率為約90％至約100％。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供的A.8、G.8、C.8、T.8、U.8、A.14、G.14、C.14、T.14、U.14的可逆終端化合物的熒光切除效率為至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％。

為進一步說明本發(fā)明提供的可逆終端化合物的有益效果，本發(fā)明采用現(xiàn)有的單分子測序平臺驗證本發(fā)明提供的可逆終端化合物在延伸反應中的反應效率，其中，采用本申請人自主研發(fā)的全內(nèi)反射熒光成像系統(tǒng)(申請?zhí)枮?01510562591.6)采集熒光。延伸成功則全內(nèi)反射熒光成像系統(tǒng)能檢測到熒光信號，檢測到熒光信號的點的比例代表延伸效率。熒光基團被切除后，熒光消失的點的比例代表切除效率。

每次延伸反應中均共進行5輪反應，連續(xù)延伸5個堿基。延伸反應共進行2次5輪反應(第一次依次延伸5個堿基A.8、G.8、C.8、T.8、U.8；第二次依次延伸5個堿基A.14、G.14、C.14、T.14、U.14)的平均延伸效率，結果表明，本發(fā)明提供的可逆終端化合物延伸及切割效果很好，延伸效率及熒光切除效率均不低于90％。

綜上，本發(fā)明提供的A.8、G.8、C.8、T.8、U.8、A.14、G.14、C.14、T.14、U.14的可逆終端化合物可用于單分子高通量合成測序(SMTS)，優(yōu)選地，本發(fā)明提供的A.8、G.8、C.8、T.8、U.8、A.14、G.14、C.14、T.14、U.14的可逆終端化合物同樣適用于本申請人在申請?zhí)枮?01510501300.2的發(fā)明專利中要求保護的一種單分子靶向測序方法、裝置、系統(tǒng)。具體地，本發(fā)明還提供了如下一種單分子靶向測序方法，包括：

測序反應：測序前需要首先將待測序列打斷成小片段，并在其末端標記熒光；同時在基底上隨機固定多個靶向設計的引物；將小片段DNA模板與固定好的引物進行雜交并精確定位，通過全內(nèi)反射顯微鏡(TIRF)采集光學圖像來精確定位雜交后模板所處的位置；逐次加入帶有可切除熒光標記的A.8、G.8、C.8、T.8、U.8、A.14、G.14、C.14、T.14、U.14末端終止子中的任一種及聚合酶的混合液孵育，洗滌，進行光學成像，記錄本次反應的點位；之后再加入試劑以切除延伸點位的熒光分子，洗滌，加帽，準備好下一個核苷酸的延伸反應。通過延伸反應、成像檢測和切除熒光分子的反復循環(huán)。

本發(fā)明測序反應中采用的是全內(nèi)反射顯微系統(tǒng)(TIRF)采集光學圖像，因為單分子信號非常弱，TIRF系統(tǒng)能夠顯著降低背景噪音，從而提升信噪比。這個系統(tǒng)為雙色激光光路系統(tǒng)，每次采集圖像之前，需要按照化學沖洗流程對封裝在微流控系統(tǒng)的樣品進行處理，然后進行拍照，為了防止樣品漂移，定位信息需要每次延伸反應之前進行拍照，然后堿基延伸后再拍照以獲得測序信號。

本發(fā)明依據(jù)所需測序要求進行成像，每次堿基延伸反應所獲的圖像可能有幾十或者上千個視野。對于圖像的處理，需要精準計算出每個反應的坐標位置并記錄；再之后的每次堿基延伸過程中所獲的圖像，要經(jīng)過圖像處理軟件進行位置糾偏，校對所經(jīng)歷的化學沖洗過程以及樣品移動造成的位置漂移。然后再進行圖像重疊，對有測序反應的位置進行逐次疊加以獲得每個位置的堿基序列。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。