本發(fā)明屬于于生物分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一類具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)的熒光化合物及其在細(xì)胞熒光成像領(lǐng)域中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

熒光分析具有實(shí)時快速報告信號的性質(zhì)。熒光信號發(fā)射的時長通常短于10ns，因此該信號可實(shí)時迅速反映系統(tǒng)狀態(tài)。熒光分析可在不對樣品進(jìn)行物理損傷的情況下進(jìn)行信號采集，因此保證了樣品的完整性。熒光信號的采集方便、直觀，可快速進(jìn)行定性分析。然而常見熒光基團(tuán)由于存在自淬滅現(xiàn)象，因此在高濃度情況下其熒光強(qiáng)度與濃度存在非線性關(guān)系。這一性質(zhì)使得以熒光為輸出信號的檢測分析手段受到制約。同時，常見熒光染料要求溶液狀態(tài)下進(jìn)行熒光信號的輸出，此狀態(tài)下的熒光分子較易受到光漂白效應(yīng)的影響。

聚集誘導(dǎo)發(fā)光現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得一類具有aie性質(zhì)的染料分子有效克服了上述缺點(diǎn)。具有aie性質(zhì)的發(fā)光體系避免了常見熒光分子在高濃度條件下的熒光淬滅，從而極大地拓展了熒光技術(shù)在分析、檢測、成像等領(lǐng)域的應(yīng)用。在具有aie性質(zhì)的發(fā)光體系中，分子以聚集的狀態(tài)進(jìn)行熒光發(fā)射，該狀態(tài)下激發(fā)態(tài)的分子有效地與外界環(huán)境隔離開來，因此發(fā)生在激發(fā)態(tài)與溶劑分子之間的光漂白化學(xué)反應(yīng)有效得到抑制，其光穩(wěn)定性得到提高。

由于aie體系不存在熒光染料的濃度過高而導(dǎo)致的自淬滅現(xiàn)象，因此該體系可通過增加染料濃度以獲得更高的熒光發(fā)射強(qiáng)度。處于聚集態(tài)的熒光分子也降低了細(xì)胞毒性，同時抗生物體內(nèi)酶解的性質(zhì)得到提高，因此更適于應(yīng)用在生物活體的熒光成像領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一類具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)的熒光化合物。

本發(fā)明另一目的在于提供上述具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)的熒光化合物在細(xì)胞熒光成像領(lǐng)域中的應(yīng)用，可用于進(jìn)行實(shí)時熒光成像。

本發(fā)明的目的通過下述方案實(shí)現(xiàn)：

一類具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)的熒光化合物，具有式1至式4所示結(jié)構(gòu)中的一種：

其中，r1選自中的一種；

r2選自氫原子、溴原子、氯原子、甲基、乙基、甲氧基和氰基中的一種；

r3、r4、r5各自獨(dú)立地選自碳原子和氮原子中的一種，且r3、r4、r5不同時為碳原子；

r6和r7各自獨(dú)立地選自h或中的一種；

r8各自獨(dú)立地選自中的一種；

r9各自獨(dú)立地選自氫原子、甲基、乙基、甲氧基、二甲基氨基和二乙基氨基中的一種。

本發(fā)明上述具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)的熒光化合物，具有在溶液狀態(tài)下幾乎不發(fā)光或發(fā)射弱熒光，但在固態(tài)及聚集狀態(tài)下可獲得強(qiáng)熒光發(fā)射的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)；其中包括納米顆粒聚集體、固態(tài)粉末和固態(tài)薄膜狀態(tài)下，均有高效率的光致發(fā)射性質(zhì)；在結(jié)晶狀態(tài)下，具有室溫磷光發(fā)射性質(zhì)。

根據(jù)需要及目標(biāo)結(jié)構(gòu)化合物，通過簡單的合成步驟，即可獲得上述本發(fā)明具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)的熒光化合物，發(fā)光顏色從黃綠色至近紅外的熒光發(fā)射，可作為系列熒光染料。

在其中一個實(shí)施例中，式1所示結(jié)構(gòu)化合物可采用炔酮中間體與蒽在二苯醚中進(jìn)行d-a反應(yīng)，高效制得。

在其中一個實(shí)施例中，式2所示結(jié)構(gòu)化合物可利用溴代氮雜蒽酮中間體與二芳基胺通過經(jīng)典烏爾曼反應(yīng)制得。

在其中一個實(shí)施例中，式3或式4所示結(jié)構(gòu)化合物可通過含醛基的中間體與可形成碳負(fù)離子的缺電子中心在堿催化條件下進(jìn)行經(jīng)典克腦文蓋爾反應(yīng)高效制得。

將本發(fā)明上述具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)的熒光化合物應(yīng)用于細(xì)胞熒光成像領(lǐng)域中，可用于進(jìn)行實(shí)時熒光成像，包括用于活細(xì)胞的染色及活細(xì)胞的實(shí)時熒光成像。具體為對細(xì)胞染色并進(jìn)行熒光成像。

更具體地可通過下述方法實(shí)現(xiàn)：利用水溶性有機(jī)溶劑將所述熒光化合物溶解后加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，與待測細(xì)胞共培養(yǎng)，再進(jìn)行熒光顯微觀察。

將本發(fā)明熒光化合物溶解后加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中后，即可得到含有染料膠體的染色液。

與待測細(xì)胞共培養(yǎng)的時間可為0.5～24h。

本發(fā)明上述具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)的熒光化合物，具有制備簡單，發(fā)光光譜范圍寬，對細(xì)胞染色靈敏快速，抗光漂白效果好的特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于細(xì)胞成像、生物分析等領(lǐng)域。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

本發(fā)明涉及的具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)的熒光分子具有制備方法操作簡單，原料易得，反應(yīng)條件溫和的特點(diǎn)。

本發(fā)明提供的具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)的熒光化合物在細(xì)胞熒光成像領(lǐng)域中的應(yīng)用，具體為對細(xì)胞進(jìn)行熒光成像的方法，具有操作簡便、迅速、對活體細(xì)胞進(jìn)行染色，細(xì)胞毒性小、熒光信號抗光漂白性質(zhì)優(yōu)異、可原位實(shí)時進(jìn)行監(jiān)控的特點(diǎn)。該方法在細(xì)胞成像研究領(lǐng)域具有實(shí)際的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為實(shí)施例2中，化合物c3ndpa的細(xì)胞毒性的mtt測試方法，所得hela細(xì)胞存活率圖。

圖2為實(shí)施例2中，化合物c3ndpa的活細(xì)胞熒光成像圖，其中500-540nm信號通道為商品化染料dnd26熒光信號，620-740nm信號通道為c3ndpa染料熒光信號。

圖3為實(shí)施例3中，化合物c3ndpa與商品化染料dnd26的抗光漂白性能測試圖。

圖4為實(shí)施例4中，化合物c3ndpa的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)測試結(jié)果。

圖5為實(shí)施例6中，化合物tpa-s-btz染料的活細(xì)胞熒光成像圖。

圖6～圖7為實(shí)施例7中，化合物tpa-s-btz的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)測試結(jié)果。

圖8為實(shí)施例9中，化合物h-o的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)測試結(jié)果。

圖9為實(shí)施例10中，化合物h-o的室溫磷光發(fā)射性質(zhì)測試結(jié)果。

圖10為實(shí)施例12中，化合物tpeome的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)測試結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

下列實(shí)施例中涉及的物料均可從商業(yè)渠道獲得。

實(shí)施例1

c3ndpa分子的制備：稱取0.2g化合物1，0.142g化合物2，0.015g醋酸鈀，0.5g碳酸銫，0.04g叔丁基膦，加入20ml甲苯，氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流反應(yīng)24小時，冷卻后，采用200～300目硅膠粉以二氯甲烷作為展開劑進(jìn)行柱色譜分離，得紅色固體粉末c3ndpa，產(chǎn)量0.168g，產(chǎn)率65％。

¹h-nmr(500mhz,cdcl3)δ9.09(d,j＝8.0hz,1h),8.96(dd,j＝4.6,1.9hz,1h),8.73(dd,j＝7.9,1.9hz,1h),8.69(d,j＝8.4hz,1h),8.18(dd,j＝8.5,1.1hz,1h),7.54(t,j＝8.0,1h),7.50(dd,j＝7.9,4.6hz,1h),7.45(d,j＝8.1hz,1h),7.30-7.23(m,4h),7.12-7.01(m,6h).

¹³c-nmr(125mhz,cdcl3)δ182.71,153.43,153.32,152.27,148.70,135.64,131.14,130.58,129.53,129.00,128.92,127.57,126.51,126.47,125.48,124.72,123.87,123.51,123.28.

hrms(tofld⁺)：m/z＝398.1429(c28h18n2o⁺,calcd＝398.1414).

實(shí)施例2

將c3ndpa熒光染料溶于dmso中，得探針溶液(0.001mol/l)，以0.22μm濾膜過濾除菌后，加入到含15％fbs及1％雙抗的dmem/f12培養(yǎng)基中，搖勻，即得細(xì)胞染色用工作液。以該工作液與貼壁細(xì)胞共培養(yǎng)一定時間后，于激光共聚焦顯微鏡下觀察染色情況。圖1表明，該染料的細(xì)胞毒性很小，在15μmol/l濃度以內(nèi)，培養(yǎng)48h后，hela細(xì)胞的存活率均在95％以上。通過染色實(shí)驗(yàn)證明(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2)，該染料可在1h，快速進(jìn)入活的hela細(xì)胞內(nèi)部，并主要富集于細(xì)胞溶酶體內(nèi)部。

實(shí)施例3

將c3ndpa熒光染料溶于dmso中，得探針溶液(0.001mol/l)，以0.22μm濾膜過濾除菌后，加入到含15％fbs及1％雙抗的dmem/f12培養(yǎng)基中，搖勻，即得細(xì)胞染色用工作液。以該工作液與商品化染料dnd26等濃度下對貼壁細(xì)胞進(jìn)行共染，培養(yǎng)一定時間后，于激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行激光掃描，測試兩個染料發(fā)射的熒光信號強(qiáng)度，所得結(jié)果見圖3。圖3結(jié)果表明該染料具有優(yōu)良的抗光漂白特性：與商品化染料dnd26相比較，該染料在250s的激發(fā)光照射后，其信號衰減小于5％，而dnd26染料信號衰減達(dá)50％以上。

實(shí)施例4

將c3ndpa熒光染料溶于thf中，得探針溶液(0.001mol/l)，隨后加入不同比例的水與thf混合溶劑，得到tpa-s-btz的不同極性溶劑分散液。隨后，測試這些分散液的熒光發(fā)射強(qiáng)度，將熒光發(fā)射強(qiáng)度與水含量作為變量，繪制曲線見圖4。由圖4可知，隨水含量增加，c3ndpa熒光染料溶解度降低，當(dāng)水含量升高至80％以上時，染料分子發(fā)生聚集，從溶劑體系中析出，從而熒光發(fā)射強(qiáng)度顯著增高，證明該染料的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)。

實(shí)施例5

tpa-s-btz分子的制備：稱取0.71g化合物3，0.39g化合物4，加入12ml二氯甲烷，6ml無水乙醇，0.5ml哌啶，室溫反應(yīng)24小時后，得到黑色晶體沉淀，過濾收集沉淀，以乙醇洗滌后，在二氯甲烷和石油醚混合溶劑中重結(jié)晶，得黑色晶體tpa-s-btz，產(chǎn)量0.85g，產(chǎn)率82％。

¹h-nmr(500mhz,cdcl3)δ8.35(s,1h),8.04(d,j＝7.9hz,1h),7.89(dd,j＝8.0,0.5hz,1h),7.72(dd,j＝4.1,0.5hz,1h),7.55(d,j＝8.8hz,2h),7.51(td,j＝8.3,1.2hz,1h),7.40(td,j＝8.3,1.2hz,1h),7.35-7.27(m,5h),7.19-7.12(m,4h),7.10(t,j＝7.4hz,2h),7.06(d,j＝8.8hz,2h).

¹³c-nmr(125mhz,cdcl3)δ162.92,153.69,153.15,149.07,146.95,138.82,137.82,134.90,134.87,129.50,127.25,126.87,126.09,125.57,125.19,123.90,123.14,123.10,122.38,121.64,117.12,99.97.

hrms(tofld⁺)：m/z＝511.1141(c32h21n3s2⁺,calcd＝511.1171).

實(shí)施例6

將tpa-s-btz熒光染料溶于dmso中，得探針溶液(0.001mol/l)，以0.22μm濾膜過濾除菌后，加入到含15％fbs及1％雙抗的dmem/f12培養(yǎng)基中，搖勻，即得細(xì)胞染色用工作液。以該工作液與貼壁細(xì)胞共培養(yǎng)一定時間后，于激光共聚焦顯微鏡下觀察染色情況。圖5表明，該染料可在1h，快速進(jìn)入活的hela細(xì)胞內(nèi)部，并可通過熒成像顯微鏡對染料進(jìn)行激發(fā)，從而實(shí)現(xiàn)對活體細(xì)胞的熒光顯微成像。

實(shí)施例7

將tpa-s-btz熒光染料溶于thf中，得探針溶液(0.001mol/l)，隨后加入不同比例的水與thf混合溶劑，得到tpa-s-btz的不同極性溶劑分散液。隨后，測試這些分散液的熒光發(fā)射強(qiáng)度，將熒光發(fā)射強(qiáng)度與水含量作為變量，繪制曲線見圖6和圖7。由圖6和圖7可知，隨水含量增加，tpa-s-btz熒光染料溶解度降低，當(dāng)水含量升高至80％以上時，染料分子發(fā)生聚集，從溶劑體系中析出，從而熒光發(fā)射強(qiáng)度急劇增高，證明該染料的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)。

實(shí)施例8

h-o分子的制備：稱取1.0g化合物5，1.0g化合物6和5.0g二苯醚，氮?dú)獗Ｗo(hù)下270℃反應(yīng)6小時，冷卻后，采用200～300目硅膠粉以石油醚：二氯甲烷＝1:2(vol/vol)作為展開劑進(jìn)行柱色譜分離，在二氯甲烷/石油醚混合溶劑中重結(jié)晶，得淺黃色針狀晶體h-o，產(chǎn)量1.6g，產(chǎn)率91％。

¹h-nmr(500mhz,cdcl3)δ7.48–7.37(m,4h),7.36-7.30(m,2h),7.30–7.24(m,1h),7.10(t,j＝7.0,2h),7.08-7.00(m,6h),6.65-6.56(m,2h),5.56(s,1h),5.46(s,1h),3.67(s,3h).

¹³c-nmr(125mhz,cdcl3)δ196.55,159.58,156.38,145.17,144.67,142.59,137.23,132.28,129.45,129.26,129.23,127.93,125.32,124.94,123.60,123.28,113.49,58.33,55.19,53.92.

hrms(tofld⁺)：m/z＝414.1646(c30h22o2⁺,calcd＝414.1614).

實(shí)施例9

將h-o熒光染料溶于thf中，得探針溶液(0.001mol/l)，隨后加入不同比例的水與thf混合溶劑，得到h-o的不同極性溶劑分散液。隨后，測試這些分散液的熒光發(fā)射強(qiáng)度，將熒光發(fā)射強(qiáng)度與水含量作為變量，繪制曲線見圖8。由圖8可知，隨水含量增加，h-o熒光染料溶解度降低，當(dāng)水含量升高至80％以上時，染料分子發(fā)生聚集，從溶劑體系中析出，從而熒光發(fā)射強(qiáng)度急劇增高，證明該染料的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)。

實(shí)施例10

將h-o熒光染料在石油醚/二氯甲烷的混合溶液中緩慢揮發(fā)溶劑重結(jié)晶，得淺黃色h-o晶體，隨后對晶體樣品進(jìn)行延遲發(fā)光光譜測試。對h-o測試得到的實(shí)時熒光發(fā)射光譜，及激發(fā)后延遲0.05ms后的光致發(fā)光光譜數(shù)據(jù)，共同繪制得圖9。由圖9可知，h-o化合物具有室溫磷光發(fā)射性質(zhì)。

實(shí)施例11

tpeome分子的制備：稱取0.21g化合物7，0.11g化合物8，溶于10ml二氯甲烷，加入10ml無水乙醇，0.05ml吡啶，室溫反應(yīng)5小時，采用200～300目硅膠粉以石油醚：乙酸乙酯＝4:1(vol/vol)作為展開劑進(jìn)行柱色譜分離，在二氯甲烷/石油醚混合溶劑中重結(jié)晶，得紅棕色固體tpeome，產(chǎn)量0.1g，產(chǎn)率33％。

¹h-nmr(500mhz,cdcl³)δ8.69(dd,j＝4.7,3.8hz,1h),8.49(s,1h),8.0(d,j＝7.5hz,2h),7.95-7.89(m,1h),7.78(dtd,j＝21.4,7.4,1.2hz,2h),7.18-7.09(m,5h),7.05-6.91(m,6h),6.72-6.61(m,4h).

實(shí)施例12

將tpeome熒光染料溶于thf中，得探針溶液(0.001mol/l)，隨后加入不同比例的水與thf混合溶劑，得到tpeome的不同極性溶劑分散液。隨后，測試這些分散液的熒光發(fā)射強(qiáng)度，將熒光發(fā)射強(qiáng)度與水含量作為變量，繪制曲線見圖10。由圖10可知，隨水含量增加，tpeome熒光染料溶解度降低，當(dāng)水含量升高至70％以上時，染料分子發(fā)生聚集，從溶劑體系中析出，從而熒光發(fā)射強(qiáng)度急劇增高，證明該染料的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。