新穎方法、多肽以及其用途與流程

文檔序號：12486561閱讀：來源：國知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)>新穎方法、多肽以及其用途與流程

技術(shù)特征：

1.一種產(chǎn)生具有絲氨酸蛋白酶活性的重組多肽的方法，其包括

(a)用編碼包含融合至具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽的N端的活化肽的酶原多肽的核酸分子轉(zhuǎn)化微生物宿主細胞或其群體，

其中所述酶原多肽缺乏信號序列；

(b)將所述酶原多肽在所述宿主細胞中表達為包涵體；

(c)從所述宿主細胞純化所述酶原多肽；以及

(d)通過暴露于蛋白酶，諸如胰蛋白酶活化所述酶原多肽，

其中步驟(c)包括從所述包涵體溶解所述酶原多肽并且將所述多肽再折疊成生物活性形式。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽展現(xiàn)胰蛋白酶活性。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:1的氨基酸序列共享至少70％序列一致性，例如至少80％、85％、90％、95％、95％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列

IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEG

TEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSG

141

WGNTMSSVADGDKLQCLSLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPV

200

VCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY

[SEQ ID NO:1]

或其展現(xiàn)抗微生物活性的片段。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽在位置25處不包含組氨酸。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下組成：SEQ ID NO:3的氨基酸序列

IVGGYECTKSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEG

TEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSG

141

WGNTMSSVADGDKLQCLSLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPV

200

VCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY

[SEQ ID NO:3]

或其展現(xiàn)抗微生物活性的片段。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽在位置160處不包含賴氨酸。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多

肽包含以下或由以下組成：SEQ ID NO:4的氨基酸序列

IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEG

TEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSG

141

WGNTMSSVADGDKLQCLSPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPV

200

VCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY

[SEQ ID NO:4]

或其展現(xiàn)抗微生物活性的片段。

8.根據(jù)權(quán)利要求3至7中任一項所述的方法，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:1的變體，其包含一個或多個選自由以下氨基酸位置組成的群組的突變氨基酸：

E21、H25、H29、V47、K49、D50、L63、H71、H72、R74、N76、T79、Y82、S85、S87、N98、I99、V121、M135、V138、M145、V148、D150、K154、L160、M175、S179、A183、L185、V212、Y217、P225、A229、V233、L234、V238、M242、N244和/或Y245，

或其展現(xiàn)抗微生物活性的片段，

其中所述氨基酸編號是根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[PDB]條目‘2EEK！’。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:1的變體，其包含一個或多個選自由以下組成的群組的突變氨基酸：

E21T、H25Y、H29(Y/N)、V47I、K49E、D50Q、L63I、H71D、H72N、R74(K/E)、N76(T/L)、T79(S/N)、Y82F、S85A、S87(K/R)、S89R、N98T、I99L、V121I、M135Q、V138I、M145(T/L/V/E/K)、V148G、D150S、K154(T/V)、L160(I/A)、M175(K/Q)、S179N、A183V、L185G、V212I、Y217(D/H/S)、P225Y、A229V、V233N、L234Y、V238I、M242I、N244S和/或Y245N，

或其展現(xiàn)抗微生物活性的片段，

其中所述氨基酸編號是根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[PDB]條目‘2EEK！’。

10.根據(jù)權(quán)利要求3至7中任一項所述的方法，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:2的變體，其包含一個或多個選自由以下氨基酸位置組成的群組的突變氨基酸：

E25、H29、H33、V49、K51、D52、L65、H72、H73、R75、N77、T80、Y83、S86、S88、N99、I100、V122、M134、V137、M144、V147、D149、K152、L158、M173、S177、A181、L184、V208、Y213、P221、A225、V229、L230、V234、M238、N240和/或Y241。

11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:2的變體，其包含一個或多個選自由以下組成的群組的突變氨基酸：

E25T、H29Y、H33(Y/N)、V49I、K51E、D52Q、L65I、H72D、H73N、R75(K/E)、N77(T/L)、T80(S/N)、Y83F、S86A、S88(K/R)、N99T、I100L、V122I、M134Q、V137I、M144(T/L/V/E/K)、V147G、D149S、K152(T/V)、L158(I/A)、M173(K/Q)、S177N、A181V、L184G、V208I、Y213(D/H/S)、P221Y、A225V、V229N、L230Y、V234I、M238I、N240S和/或Y241N。

12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下組成：如表1或2中所定義的氨基酸序列。

13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下組成：具有下列定義的突變之一的SEQID NO:1的氨基酸：

(a)N244S、Y245N、S87K(“EZA-002”)；

(b)K154T(“EZA-003”)；

(c)K154L(“EZA-004”)；

(d)K154V(“EZA-005”)；

(e)K154E(“EZA-006”)；

(f)N98T(“EZA-007”)；

(g)I99L(“EZA-008”)；

(h)L185G、P225Y(“EZA-009”)；

(i)V212I(“EZA-0010”)；

(j)Y217D、M175K(“EZA-011”)；

(k)Y217H(“EZA-012”)；

(l)Y217S(“EZA-013”)；

(m)A229V(“EZA-014”)；

(n)H25Y(“EZA-015”)；

(o)H25N(“EZA-016”)；

(p)H29Y(“EZA-017”)；

(q)H71D(“EZA-018”)；

(r)H72N(“EZA-019”)；

(s)R74K(“EZA-020”)；

(t)R74E(“EZA-021”)；

(u)N76T(“EZA-022”)；

(v)N76L、Y82F(“EZA-023”)；

(w)T79S(“EZA-0024”)；

(x)T79N(“EZA-025”)；

(y)K49E、D50Q(“EZA-026”)；

(z)S87R(“EZA-027”)；

(aa)E21T、H71D、D150S、K154V(“EZA-028”)；

(bb)S179N、V233N(“EZA-029”)；

(cc)M135Q(“EZA-030”)；

(dd)M145K、V148G(“EZA-031”)；

(ee)M175Q(“EZA-032”)；

(ff)L63I、S85A(“EZA-033”)；

(gg)L160I(“EZA-034”)；

(hh)V138I、L160A、A183V(“EZA-035”)；

(ii)V121I(“EZA-036”)；

(jj)V47I、V238I、M242I(“EZA-037”)；

(kk)V238I(“EZA-038”)；以及

(ll)L234Y(“EZA-039”)

或其展現(xiàn)抗微生物活性的片段，

其中所述氨基酸編號是根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[PDB]條目‘2EEK！’。

14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下組成：具有下列定義的突變之一的SEQID NO:1的氨基酸：

(a)H25N、N76T

(b)H25N、H29Y

(c)H25N、M135Q

(d)H29Y、T79N、M135Q

(e)I99L、V121I、L160I、Y217H

(f)V121I、L160I

(g)H72N、R74E、S87K

(h)H25N、M135Q、Y217H

(i)T79N、V121I、V212I

(j)H29Y、N76T、I99L、M135Q

(k)K49E、D50Q、N76L、Y82F、S179N、V233N

(l)M145K、V148G、N76L、Y82F、S179N、V233N

(m)H25N、N76T、S87K、K154T

(n)H25Q

(o)H25D

(p)H25S

(q)K24E、H25N

(r)Y97N

(s)N100D

(t)A120S、A122S

(u)M135E

(v)V204Q、A122S

(w)T79D

(x)R74D

(y)K49E

(z)K49S、D50Q

(aa)D50Q

(bb)Q178D

(cc)S87R

或其展現(xiàn)抗微生物活性的片段，

其中所述氨基酸編號是根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[PDB]條目‘2EEK！’。

15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下組成：天然存在的絲氨酸蛋白酶的氨基酸。

16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下組成：SEQ ID NO:1的氨基酸。

17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述活化肽包含以下或由以下組成：選自下列群組的氨基酸序列：

(a)MEEDK [SEQ ID NO:5]；

(b)MTEEDK [SEQ ID NO:6]；

(c)MFAEEDK [SEQ ID NO:7]；

(d)MVFAEEDK [SEQ ID NO:8]；

(e)MAFAEEDK [SEQ ID NO:9]；以及

(f)MGAVFAEEDK [SEQ ID NO:10]。

18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中在步驟(a)中所述編碼胰蛋白酶原多肽的核酸分子處于適合于在大腸桿菌中使用的表達載體中。

19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述表達載體是E3。

20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中在步驟(a)中所述宿主細胞是細菌宿主細胞(諸如大腸桿菌和假交替單胞菌)。

21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中在步驟(a)中所述宿主細胞是大腸桿菌宿主細胞(諸如BL21(E3)、BL21(DE3)、BL21Star(DE3)、ArcticExpress(DE3)以及HMS174細胞)。

22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中在步驟(a)中所述宿主細胞是菌株ArcticExpress(DE3)的大腸桿菌宿主細胞。

23.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的方法，其中在步驟(a)中所述宿主細胞是酵母宿主細胞(諸如巴斯德畢赤酵母)。

24.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中在步驟(c)中將所述多肽再折疊成生物活性形式包括使所述多肽與PBS/甘油緩沖液接觸。

25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述PBS/甘油緩沖液是1xPBS，10％甘油，pH 7.4。

26.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中在步驟(c)中無自體蛋白水解抑制劑存在(諸如苯甲脒)。

27.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中在步驟(d)中大西洋鱈魚胰蛋白酶用于活化所述酶原多肽。

28.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中在步驟(d)中產(chǎn)生的所述活化多肽的比活性是至少20U/mg，例如至少30U/mg、40U/mg、50U/mg或至少60U/mg。

29.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中在步驟(d)中產(chǎn)生的所述活化多肽的數(shù)量是至少0.1mg，例如至少0.5mg、1mg、2mg、3mg、5mg或10mg。

30.一種具有絲氨酸蛋白酶活性的分離多肽，其通過根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法可獲得。

31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的分離多肽，其中所述多肽展現(xiàn)胰蛋白酶活性。

32.根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的分離多肽，其中所述多肽包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:1的氨基酸序列共享至少70％序列一致性，例如至少80％、85％、90％、95％、95％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或其展現(xiàn)抗微生物活性的片段。

33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的分離多肽，其中所述多肽在位置25處不包含組氨酸。

34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的分離多肽，其包含以下或由以下組成：SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或其展現(xiàn)抗微生物活性的片段。

35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的分離多肽，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽在位置160處不包含賴氨酸。

36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的分離多肽，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下組成：SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或其展現(xiàn)抗微生物活性的片段。

37.根據(jù)權(quán)利要求30至36中任一項所述的分離多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO:1的變體，其包含一個或多個選自由以下氨基酸位置組成的群組的突變氨基酸：

E21、H25、H29、V47、K49、D50、L63、H71、H72、R74、N76、T79、Y82、S85、S87、S89、N98、I99、V121、M135、V138、M145、V148、D150、K154、L160、M175、S179、A183、L185、V212、Y217、P225、A229、V233、L234、V238、M242、N244和/或Y245，

或其展現(xiàn)抗微生物活性的片段，

其中所述氨基酸編號是根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[PDB]條目‘2EEK！’。

38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的分離多肽，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:1的變體，其包含一個或多個選自由以下組成的群組的突變氨基酸：

或其展現(xiàn)抗微生物活性的片段，

其中所述氨基酸編號是根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[PDB]條目‘2EEK！’。

39.根據(jù)權(quán)利要求30至37中任一項所述的分離多肽，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:2的變體，其包含一個或多個選自由以下氨基酸位置組成的群組的突變氨基酸：

40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的分離多肽，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:2的變體，其包含一個或多個選自由以下組成的群組的突變氨基酸：

41.根據(jù)權(quán)利要求30至40中任一項所述的分離多肽，其中所述具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下組成：如表1或2中所定義的氨基酸序列。

42.根據(jù)權(quán)利要求30至41中任一項所述的分離多肽，其包含以下或由以下組成：具有下列定義的突變之一的SEQ ID NO:1的氨基酸：

(a)N244S、Y245N、S87K(“EZA-002”)；

(b)K154T(“EZA-003”)；

(c)K154L(“EZA-004”)；

(d)K154V(“EZA-005”)；

(e)K154E(“EZA-006”)；

(f)N98T(“EZA-007”)；

(g)I99L(“EZA-008”)；

(h)L185G、P225Y(“EZA-009”)；

(i)V212I(“EZA-0010”)；

(j)Y217D、M175K(“EZA-011”)；

(k)Y217H(“EZA-012”)；

(l)Y217S(“EZA-013”)；

(m)A229V(“EZA-014”)；

(n)H25Y(“EZA-015”)；

(o)H25N(“EZA-016”)；

(p)H29Y(“EZA-017”)；

(q)H71D(“EZA-018”)；

(r)H72N(“EZA-019”)；

(s)R74K(“EZA-020”)；

(t)R74E(“EZA-021”)；

(u)N76T(“EZA-022”)；

(v)N76L、Y82F(“EZA-023”)；

(w)T79S(“EZA-0024”)；

(x)T79N(“EZA-025”)；

(y)K49E、D50Q(“EZA-026”)；

(z)S87R(“EZA-027”)；

(aa)E21T、H71D、D150S、K154V(“EZA-028”)；

(bb)S179N、V233N(“EZA-029”)；

(cc)M135Q(“EZA-030”)；

(dd)M145K、V148G(“EZA-031”)；

(ee)M175Q(“EZA-032”)；

(ff)L63I、S85A(“EZA-033”)；

(gg)L160I(“EZA-034”)；

(hh)V138I、L160A、A183V(“EZA-035”)；

(ii)V121I(“EZA-036”)；

(jj)V47I、V238I、M242I(“EZA-037”)；

(kk)V238I(“EZA-038”)；以及

(ll)L234Y(“EZA-039”)

或其展現(xiàn)抗微生物活性的片段，

其中所述氨基酸編號是根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[PDB]條目‘2EEK！’。

43.根據(jù)權(quán)利要求30至42中任一項所述的分離多肽，其包含以下或由以下組成：具有下列定義的突變之一的SEQ ID NO:1的氨基酸：

(a)H25N、N76T

(b)H25N、H29Y

(c)H25N、M135Q

(d)H29Y、T79N、M135Q

(e)I99L、V121I、L160I、Y217H

(f)V121I、L160I

(g)H72N、R74E、S87K

(h)H25N、M135Q、Y217H

(i)T79N、V121I、V212I

(j)H29Y、N76T、I99L、M135Q

(k)K49E、D50Q、N76L、Y82F、S179N、V233N

(l)M145K、V148G、N76L、Y82F、S179N、V233N

(m)H25N、N76T、S87K、K154T

(n)H25Q

(o)H25D

(p)H25S

(q)K24E、H25N

(r)Y97N

(s)N100D

(t)A120S、A122S

(u)M135E

(v)V204Q、A122S

(w)T79D

(x)R74D

(y)K49E

(z)K49S、D50Q

(aa)D50Q

(bb)Q178D

(cc)S87R

或其展現(xiàn)抗微生物活性的片段，

其中所述氨基酸編號是根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[PDB]條目‘2EEK！’。

44.根據(jù)權(quán)利要求30所述的分離多肽，其中所述多肽包含以下或由以下組成：天然存在的絲氨酸蛋白酶的氨基酸。

45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的分離多肽，其中所述多肽包含以下或由以下組成：SEQ ID NO:1的氨基酸。

46.根據(jù)權(quán)利要求30至45中任一項所述的分離多肽，其相對于從大西洋鱈魚(大西洋真鱈)分離的胰蛋白酶I展現(xiàn)改善的穩(wěn)定性。

47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的分離多肽，其中所述從大西洋鱈魚分離的胰蛋白酶I具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

48.根據(jù)權(quán)利要求46或47所述的分離多肽，其相對于從大西洋鱈魚分離的胰蛋白酶I的胰蛋白酶多肽展現(xiàn)改善的熱穩(wěn)定性。

49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的分離多肽，其包含以下或由以下組成：具有下列定義的突變之一的SEQ ID NO:1的氨基酸：

(a)K154E(“EZA-006”)；

(b)N98T(“EZA-007”)；

(c)I99L(“EZA-008”)；

(d)V212I(“EZA-0010”)；

(e)Y217D、M175K(“EZA-011”)；

(f)Y217H(“EZA-012”)；

(g)A229V(“EZA-014”)；

(h)H25Y(“EZA-015”)；

(i)H25N(“EZA-016”)；

(j)H72N(“EZA-019”)；

(k)R74E(“EZA-021”)；

(l)N76L、Y82F(“EZA-023”)；

(m)T79N(“EZA-025”)；

(n)K49E、D50Q(“EZA-026”)；

(o)S87R(“EZA-027”)；

(p)E21T、H71D、D150S、K154V(“EZA-028”)；

(q)S179N、V233N(“EZA-029”)；

(r)M135Q(“EZA-030”)；

(s)M145K、V148G(“EZA-031”)；

(t)L63I、S85A(“EZA-033”)；

(u)L160I(“EZA-034”)；

(v)V138I、L160A、A183V(“EZA-035”)；

(w)V121I(“EZA-036”)；

(x)V47I、V238I、M242I(“EZA-037”)；以及

(y)L234Y(“EZA-039”)

或其展現(xiàn)抗微生物活性的片段，

其中所述氨基酸編號是根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[PDB]條目‘2EEK！’。

50.根據(jù)權(quán)利要求30至49中任一項所述的分離多肽，其相對于從大西洋鱈魚分離的胰蛋白酶I展現(xiàn)改善的自體蛋白水解穩(wěn)定性。

51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的分離多肽，其包含以下或由以下組成：具有下列定義的突變之一的SEQ ID NO:1的氨基酸：

(a)I99L(“EZA-008”)；

(b)V212I(“EZA-0010”)；

(c)Y217D、M175K(“EZA-011”)；

(d)Y217H(“EZA-012”)；

(e)A229V(“EZA-014”)；

(f)H25Y(“EZA-015”)；

(g)H25N(“EZA-016”)；

(h)H29Y(“EZA-017”)；

(i)H72N(“EZA-019”)；

(j)R74E(“EZA-021”)；

(k)N76T(“EZA-022”)；

(l)N76L、Y82F(“EZA-023”)；

(m)T79S(“EZA-0024”)；

(n)T79N(“EZA-025”)；

(o)K49E、D50Q(“EZA-026”)；

(p)S87R(“EZA-027”)；

(q)E21T、H71D、D150S、K154V(“EZA-028”)；

(r)S179N、V233N(“EZA-029”)；

(s)M135Q(“EZA-030”)；

(t)M145K、V148G(“EZA-031”)；

(u)L63I、S85A(“EZA-033”)；

(v)L160I(“EZA-034”)；

(w)V138I、L160A、A183V(“EZA-035”)；

(x)V121I(“EZA-036”)；以及

(y)V47I、V238I、M242I(“EZA-037”)

或其展現(xiàn)抗微生物活性的片段，

其中所述氨基酸編號是根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[PDB]條目‘2EEK！’。

52.根據(jù)權(quán)利要求30至51中任一項所述的分離多肽，其相對于從大西洋鱈魚分離的胰蛋白酶I展現(xiàn)改善的Kcat。

53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離多肽，其包含以下或由以下組成：具有下列定義的突變之一的SEQ ID NO:1的氨基酸：

(a)H25N(“EZA-016”)；

(b)H29Y(“EZA-017”)；

(c)H71D(“EZA-018”)；

(d)H72N(“EZA-019”)；

(e)N76T(“EZA-022”)；

(f)N76L、Y82F(“EZA-023”)；

(g)M145K、V148G(“EZA-031”)；

(h)M175Q(“EZA-032”)；

(i)L63I、S85A(“EZA-033”)；

(j)L160I(“EZA-034”)；

(k)V138I、L160A、A183V(“EZA-035”)；

(l)V47I、V238I、M242I(“EZA-037”)；以及

(m)V238I(“EZA-038”)，

或其展現(xiàn)抗微生物活性的片段，

其中所述氨基酸編號是根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[PDB]條目‘2EEK！’。

54.根據(jù)權(quán)利要求30至53中任一項所述的分離多肽，其相對于從大西洋鱈魚分離的胰蛋白酶I展現(xiàn)改善的Km。

55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的分離多肽，其包含以下或由以下組成：具有下列定義的突變之一的SEQ ID NO:1的氨基酸：

(a)K154T(“EZA-003”)；

(b)I99L(“EZA-008”)；

(c)V212I(“EZA-0010”)；

(d)Y217D、M175K(“EZA-011”)；

(e)Y217S(“EZA-013”)；

(f)A229V(“EZA-014”)；

(g)H25Y(“EZA-015”)；

(h)K49E、D50Q(“EZA-026”)；

(i)E21T、H71D、D150S、K154V(“EZA-028”)；以及

(j)M135Q(“EZA-030”)，

或其展現(xiàn)抗微生物活性的片段，

其中所述氨基酸編號是根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[PDB]條目‘2EEK！’。

56.根據(jù)權(quán)利要求30至55中任一項所述的分離多肽，其相對于從大西洋鱈魚分離的胰蛋白酶I展現(xiàn)改善的特異性常數(shù)(Kcat/Km)。

57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的分離多肽，其包含以下或由以下組成：具有下列定義的突變之一的SEQ ID NO:1的氨基酸：

(a)K154T(“EZA-003”)；

(b)Y217D、M175K(“EZA-011”)；

(c)Y217S(“EZA-013”)；

(d)A229V(“EZA-014”)；以及

(e)M135Q(“EZA-030”)；

或其展現(xiàn)抗微生物活性的片段，

其中所述氨基酸編號是根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[PDB]條目‘2EEK！’。

58.根據(jù)權(quán)利要求30至57中任一項所述的分離多肽，其是非糖基化的。

59.根據(jù)權(quán)利要求30至58中任一項所述的分離多肽，其包含L-氨基酸或由L-氨基酸組成。

60.根據(jù)權(quán)利要求30至59中任一項所述的分離多肽，其包含一個或多個經(jīng)過修飾或衍生的氨基酸。

61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的分離多肽，其中所述一個或多個氨基酸通過聚乙二醇化、酰胺化、酯化、?；⒁阴；?或烷基化修飾或衍生。

62.一種分離的核酸分子，其編碼根據(jù)權(quán)利要求30至61中任一項所述的多肽。

63.一種表達載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求62所述的核酸分子。

64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的表達載體，其適合于在大腸桿菌中使用。

65.一種微生物宿主細胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求62所述的核酸分子或根據(jù)權(quán)利要求63或64所述的表達載體。

66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是細菌宿主細胞(諸如大腸桿菌和假交替單胞菌)。

67.根據(jù)權(quán)利要求59所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是大腸桿菌宿主細胞(諸如BL21(E3)、BL21(DE3)、BL21Star(DE3)、ArcticExpress(DE3)以及HMS174細胞)。

68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的宿主細胞，其中在步驟(a)中所述宿主細胞是菌株ArcticExpress(DE3)的大腸桿菌宿主細胞。

69.根據(jù)權(quán)利要求65所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是酵母宿主細胞(諸如巴斯德畢赤酵母)。

70.一種治療性組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求30至61中任一項所述的多肽連同醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑、載劑、緩沖劑或佐劑。

71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的治療性組合物，其適合于經(jīng)由選自由以下組成的群組的途徑施用：經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)肺、經(jīng)頰、局部、經(jīng)眼、腸道外(靜脈內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)以及肌肉內(nèi))、經(jīng)陰道以及經(jīng)直腸。

72.根據(jù)權(quán)利要求70或71所述的治療性組合物，其中所述多肽以適合于遞送至口腔和/或口咽的粘膜的形式提供。

73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的治療性組合物，其中所述多肽在口腔噴霧、糖錠、香錠、口香糖或液體中提供。

74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的治療性組合物，其中所述多肽在口腔噴霧中提供。

75.根據(jù)權(quán)利要求30至61中任一項所述的多肽，其用于醫(yī)學(xué)中。

76.根據(jù)權(quán)利要求30至61中任一項所述的多肽，其用于在受試者中治療或預(yù)防選自由微生物感染、發(fā)炎以及創(chuàng)傷組成的群組的病癥或病狀。

77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的供使用的多肽，其中所述病癥或病狀是微生物感染。

78.根據(jù)權(quán)利要求77所述的供使用的多肽，其中所述微生物感染選自由細菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生蟲感染以及酵母感染組成的群組。

79.根據(jù)權(quán)利要求78所述的供使用的多肽，其中所述微生物感染是細菌感染。

80.根據(jù)權(quán)利要求79所述的供使用的多肽，其中所述微生物感染包含生物膜的形成。

81.根據(jù)權(quán)利要求79或80所述的供使用的多肽，其中所述微生物感染是牙周病。

82.根據(jù)權(quán)利要求77所述的供使用的多肽，其中所述微生物感染是病毒感染。

83.根據(jù)權(quán)利要求82所述的供使用的多肽，其中所述病毒感染選自由普通感冒和流感組成的群組。

84.根據(jù)權(quán)利要求82所述的供使用的多肽，其中所述病毒感染由腸病毒(諸如人鼻病毒或柯薩奇A病毒)引起。

85.根據(jù)權(quán)利要求82所述的供使用的多肽，其中所述病毒感染由單純皰疹病毒引起。

86.根據(jù)權(quán)利要求77所述的供使用的多肽，其中所述微生物感染是真菌感染。

87.根據(jù)權(quán)利要求86所述的供使用的多肽，其中所述真菌感染選自由腳癬(香港腳)和念珠菌病(鵝口瘡)組成的群組。

88.根據(jù)權(quán)利要求76至87中任一項所述的供使用的多肽，其中所述受試者具有或易感免疫缺陷。

89.根據(jù)權(quán)利要求88所述的供使用的多肽，其中所述免疫缺陷是繼發(fā)性或獲得性免疫缺陷，例如，受試者正在接受免疫抑制劑療法的治療。

90.根據(jù)權(quán)利要求89所述的供使用的多肽，其中所述免疫缺陷是天然存在的，例如，所述免疫缺陷歸因于原發(fā)性免疫缺陷、癌癥(諸如白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤)、慢性感染(諸如獲得性免疫缺陷綜合癥或AIDS)、營養(yǎng)不良和/或老齡化。

91.根據(jù)權(quán)利要求76至90中任一項所述的供使用的多肽，其中所述微生物感染是口腔和/或口咽的微生物感染。

92.根據(jù)權(quán)利要求76至87中任一項所述的供使用的多肽，其中所述受試者是運動員(例如，馬拉松選手)。

93.根據(jù)權(quán)利要求76所述的供使用的多肽，其中所述病癥或病狀是發(fā)炎性病癥或病狀。

94.根據(jù)權(quán)利要求93所述的供使用的多肽，其中所述發(fā)炎性病癥或病狀選自由以下組成的群組：疼痛、急性發(fā)炎、慢性發(fā)炎、關(guān)節(jié)炎、發(fā)炎關(guān)節(jié)、滑囊炎、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、敗血性關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、全身性紅斑狼瘡、靜脈炎、腱炎、皮疹、牛皮癬、痤瘡、濕疹、面部脂溢性濕疹，以及手部、面部或頸部濕疹。

95.根據(jù)權(quán)利要求76所述的供使用的多肽，其中所述病癥或病狀是創(chuàng)傷。

96.根據(jù)權(quán)利要求95所述的供使用的多肽，其中所述創(chuàng)傷選自急性外傷(包括燒傷)、局部潰瘍、疤痕、瘢痕瘤、癤以及疣。

97.根據(jù)權(quán)利要求95或96所述的供使用的多肽，其中所述多肽用于清創(chuàng)(即，從其它方面健康的皮膚去除受感染、死亡或剝落的皮膚)和/或纖維蛋白凝塊的去除。

98.根據(jù)權(quán)利要求76至97中任一項所述的供使用的多肽，其中所述多肽與一種或多種額外活性劑組合使用。

99.根據(jù)權(quán)利要求98所述的供使用的多肽，其中所述額外活性劑選自由以下組成的群組：抗微生物劑(包括抗生素、抗病毒劑以及抗真菌劑)、消炎劑(包括類固醇和非類固醇消炎劑)以及抗敗血劑。

100.一種根據(jù)權(quán)利要求30至61中任一項所述的多肽的用途，其用于制備用以在受試者中治療或預(yù)防選自由微生物感染、發(fā)炎以及創(chuàng)傷組成的群組的病癥或病狀的藥物。

101.一種在受試者中治療或預(yù)防選自由微生物感染、發(fā)炎以及創(chuàng)傷組成的群組的病癥或病狀的方法，所述方法包括將有效量的根據(jù)權(quán)利要求30至61中任一項所述的多肽施用于有需要的受試者。

102.一種根據(jù)權(quán)利要求30至61中任一項所述的多肽的用途，其在受試者中作為美容療法。

103.根據(jù)權(quán)利要求102所述的用途，其中所述美容療法將以下作用中的一者或多者提供給所述受試者：

(a)皮膚去角質(zhì)(去除死亡和/或剝落的皮膚細胞)；

(b)保護免于皮膚中的膠原蛋白和彈性蛋白分解；

(c)粉刺溶解作用；