本發(fā)明屬于畢赤酵母高密度發(fā)酵表達(dá)重組蛋白領(lǐng)域，涉及一種適用于規(guī)?；a(chǎn)重組人源膠原蛋白的畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基，更具體地，涉及一種適用于工業(yè)化規(guī)模高密度發(fā)酵表達(dá)重組人源膠原蛋白的畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)階段的發(fā)酵培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種新型酵母表達(dá)系統(tǒng)，既有原核微生物的特點(diǎn)，又有真核生物的特性，可以對目的蛋白進(jìn)行糖基化、二硫鍵形成等翻譯后修飾，越來越普遍地用于替代大腸桿菌實(shí)現(xiàn)基因操作，表達(dá)具有功效性的活性蛋白。迄今為止，已有1000多種外源蛋白在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了成功表達(dá)(武婕等，畢赤酵母工程菌高密度發(fā)酵研究與進(jìn)展，《中國生物工程雜志》，2016，第36卷(第1期)，108-114)，一部分已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化規(guī)模的生產(chǎn)，廣泛應(yīng)用于眾多行業(yè)。

畢赤酵母高密度發(fā)酵表達(dá)目的蛋白時(shí)，所用培養(yǎng)基及調(diào)控策略通常都采用Invitrogen公司的操作手冊中的方案，基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基主要包括硫酸鈣、硫酸鉀、硫酸鎂和甘油等(高敏杰等，重組畢赤酵母生產(chǎn)外源蛋白的過程控制與生理分析的研究進(jìn)展，《食品工業(yè)科技》，2014，第35卷(第24期)，389-395)，調(diào)控策略包括甘油長菌體、甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)目的蛋白。甲醇誘導(dǎo)階段是表達(dá)目的蛋白的最關(guān)鍵階段，通常以甲醇為碳源，少數(shù)使用葡萄糖、甘油和甲醇雙碳源、山梨醇和甲醇雙碳源等(Celik E,et.al,Fed batch methanol feeding strategy for recombinant protein production by Pichia Pastoris in the presence of co-substrate sorbitol.Yeast,2009,26(9):473-484.)，因?yàn)樵诩状颊T導(dǎo)階段，即高密度狀態(tài)下，酵母部分或完全喪失了活力，備用碳源有利于保持酵母的活性，促進(jìn)酵母增殖。

甲醇誘導(dǎo)階段也是工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵控制點(diǎn)，是規(guī)模化放大的瓶頸?，F(xiàn)有工藝為了獲得較高的目的蛋白表達(dá)量，甲醇誘導(dǎo)階段周期較長，常需要持續(xù)5天以上(中國專利201110327865.5)，該階段耗時(shí)長，能耗大，操作難度和工作強(qiáng)度大，對工人技能要求高，很難形成穩(wěn)定的工藝。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決畢赤酵母高密度發(fā)酵表達(dá)重組蛋白的規(guī)?；a(chǎn)中存在的耗時(shí)長，能耗大，操作難度大，工作強(qiáng)度大，對工人技能要求高等實(shí)際生產(chǎn)問題，本發(fā)明提供了一種適用于規(guī)模化生產(chǎn)重組人源膠原蛋白的畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基，該發(fā)酵培養(yǎng)基含有代謝調(diào)節(jié)劑，能夠有效調(diào)節(jié)畢赤酵母的新陳代謝，加快重組蛋白的表達(dá)，適用于工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)畢赤酵母，實(shí)現(xiàn)重組人源膠原蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種適用于規(guī)?；a(chǎn)重組人源膠原蛋白的畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基，由以下組分組成：

所述的代謝調(diào)節(jié)劑選自檸檬酸、琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸、丙酮酸中的一種或一種以上，也可以是上述酸的鈉、鉀鹽等簡單衍生物，優(yōu)選為丙酮酸或丙酮酸鈉。

所述的代謝調(diào)節(jié)劑添加量優(yōu)選為0.1～1g/L。

本發(fā)明所述的畢赤酵母為巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris，已于2011年6月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.5021，并在中國專利201110327865.5中充分公開。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的代謝調(diào)節(jié)劑，能調(diào)節(jié)畢赤酵母的新陳代謝，加快重組蛋白的表達(dá)，目的蛋白表達(dá)量提高了16.5％，同時(shí)縮短了甲醇誘導(dǎo)周期，誘導(dǎo)周期可縮短20％，并且降低能耗，減少出錯(cuò)風(fēng)險(xiǎn)，保證穩(wěn)定的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基特別適用于工業(yè)化高密度發(fā)酵表達(dá)重組蛋白的畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)階段，能夠有效降低生產(chǎn)成本，產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟(jì)效益，對于人源膠原蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)具有十分重要的實(shí)際意義。

附圖說明

圖1為實(shí)施例5與對比例的發(fā)酵過程中菌體濕重的對比圖。

圖2為實(shí)施例5與對比例的發(fā)酵過程中目的蛋白表達(dá)量的對比圖。

具體實(shí)施方式

在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，采用的菌株為表達(dá)重組人源膠原蛋白的巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris，保藏編號為CGMCC NO.5021，保藏日期為2011年6月29日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，并在中國專利201110327865.5中充分公開。

所述的PTM1溶液參照Invitrogen公司的操作手冊，具體配方為：CuSO₄·5H₂O 6.0g/L；NaI 0.08g/L；MnSO₄·H₂O 3.0g/L；NaMoO₄·2H₂O 0.2g/L；H₃BO₃ 0.02g/L；CoCl₂0.5g/L；ZnCl₂ 20.0g/L；FeSO₄·7H₂O 65.0g/L；生物素0.2g/L；H₂SO₄ 5.0mL/L，用0.22μm的濾膜過濾除菌，室溫保存。

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。

實(shí)施例1

發(fā)酵培養(yǎng)基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L；丙酮酸0.01g/L。

將菌種液按10％接種量加到含有500L發(fā)酵培養(yǎng)基的1000L發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速200-600rpm、罐壓0.2-1.0bar、調(diào)節(jié)空氣流量使溶氧(DO)＞30％。當(dāng)碳源耗盡后，溶氧陡然上升，開始流加50％甘油，補(bǔ)充碳源，至菌體濕重為215g/L，停止補(bǔ)加50％甘油。甘油耗盡后開始流加甲醇，作為新的碳源，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、罐壓、空氣流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，每8小時(shí)進(jìn)行取樣，測定菌體濕重和重組人源膠原蛋白表達(dá)量，誘導(dǎo)發(fā)酵96h后，結(jié)束發(fā)酵，收集發(fā)酵液，離心獲得發(fā)酵液上清，經(jīng)HPLC檢測，最終重組人源膠原蛋白濃度為16.5g/L。

實(shí)施例2

發(fā)酵培養(yǎng)基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L；丙酮酸10g/L。

將菌種液按10％接種量加到含有500L發(fā)酵培養(yǎng)基的1000L發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速200-600rpm、罐壓0.2-1.0bar、調(diào)節(jié)空氣流量使溶氧(DO)＞30％。當(dāng)碳源耗盡后，溶氧陡然上升，開始流加50％甘油，補(bǔ)充碳源，至菌體濕重為216g/L，停止補(bǔ)加50％甘油。甘油耗盡后開始流加甲醇，作為新的碳源，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、罐壓、空氣流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，每8小時(shí)進(jìn)行取樣，測定菌體濕重和重組人源膠原蛋白表達(dá)量，誘導(dǎo)發(fā)酵96h后，結(jié)束發(fā)酵，收集發(fā)酵液，離心獲得發(fā)酵液上清，經(jīng)HPLC檢測，最終重組人源膠原蛋白濃度為16.1g/L。

實(shí)施例3

發(fā)酵培養(yǎng)基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L；丙酮酸0.1g/L。

將菌種液按10％接種量加到含有500L發(fā)酵培養(yǎng)基的1000L發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速200-600rpm、罐壓0.2-1.0bar、調(diào)節(jié)空氣流量使溶氧(DO)＞30％。當(dāng)碳源耗盡后，溶氧陡然上升，開始流加50％甘油，補(bǔ)充碳源，至菌體濕重為218g/L，停止補(bǔ)加50％甘油。甘油耗盡后開始流加甲醇，作為新的碳源，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、罐壓、空氣流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，每8小時(shí)進(jìn)行取樣，測定菌體濕重和重組人源膠原蛋白表達(dá)量，誘導(dǎo)發(fā)酵96h后，結(jié)束發(fā)酵，收集發(fā)酵液，離心獲得發(fā)酵液上清，經(jīng)HPLC檢測，最終重組人源膠原蛋白濃度為17.7g/L。

實(shí)施例4

發(fā)酵培養(yǎng)基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L；丙酮酸1g/L。

將菌種液按10％接種量加到含有500L發(fā)酵培養(yǎng)基的1000L發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速200-600rpm、罐壓0.2-1.0bar、調(diào)節(jié)空氣流量使溶氧(DO)＞30％。當(dāng)碳源耗盡后，溶氧陡然上升，開始流加50％甘油，補(bǔ)充碳源，至菌體濕重為215g/L，停止補(bǔ)加50％甘油。甘油耗盡后開始流加甲醇，作為新的碳源，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、罐壓、空氣流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，每8小時(shí)進(jìn)行取樣，測定菌體濕重和重組人源膠原蛋白表達(dá)量，誘導(dǎo)發(fā)酵96h后，結(jié)束發(fā)酵，收集發(fā)酵液，離心獲得發(fā)酵液上清，經(jīng)HPLC檢測，最終重組人源膠原蛋白濃度為18.0g/L。

實(shí)施例5

發(fā)酵培養(yǎng)基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L；丙酮酸鈉0.5g/L。

將菌種液按10％接種量加到含有500L發(fā)酵培養(yǎng)基的1000L發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速200-600rpm、罐壓0.2-1.0bar、調(diào)節(jié)空氣流量使溶氧(DO)＞30％。當(dāng)碳源耗盡后，溶氧陡然上升，開始流加50％甘油，補(bǔ)充碳源，至菌體濕重為216g/L，停止補(bǔ)加50％甘油。甘油耗盡后開始流加甲醇，作為新的碳源，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、罐壓、空氣流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，每8小時(shí)進(jìn)行取樣，測定菌體濕重和重組人源膠原蛋白表達(dá)量，誘導(dǎo)發(fā)酵96h后，結(jié)束發(fā)酵，收集發(fā)酵液，離心獲得發(fā)酵液上清，經(jīng)HPLC檢測，最終重組人源膠原蛋白濃度為18.4g/L。

本實(shí)施例及對比例的取樣檢測結(jié)果見圖1和圖2。圖1為實(shí)施例5與對比例的發(fā)酵過程中菌體濕重的對比圖，從圖中可以看出，本實(shí)施例誘導(dǎo)時(shí)間縮短了20％，即由對比例的120h縮短到了96h；同時(shí)本實(shí)施例菌體的生長情況優(yōu)于對比例，新陳代謝更加旺盛，達(dá)到相同菌體濕重所需時(shí)間減少，最終達(dá)到的菌體濕重也更高。圖2為實(shí)施例5與對比例的發(fā)酵過程中目的蛋白表達(dá)量的對比圖，比較圖中數(shù)據(jù)可知經(jīng)本實(shí)施例的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后，目的蛋白的表達(dá)量較對比例提高了16.5％，由對比例的15.8g/L提高到了18.4g/L。

實(shí)施例6

發(fā)酵培養(yǎng)基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L；檸檬酸0.5g/L。

將菌種液按10％接種量加到含有500L發(fā)酵培養(yǎng)基的1000L發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速200-600rpm、罐壓0.2-1.0bar、調(diào)節(jié)空氣流量使溶氧(DO)＞30％。當(dāng)碳源耗盡后，溶氧陡然上升，開始流加50％甘油，補(bǔ)充碳源，至菌體濕重為219g/L，停止補(bǔ)加50％甘油。甘油耗盡后開始流加甲醇，作為新的碳源，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、罐壓、空氣流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，每8小時(shí)進(jìn)行取樣，測定菌體濕重和重組人源膠原蛋白表達(dá)量，誘導(dǎo)發(fā)酵96h后，結(jié)束發(fā)酵，收集發(fā)酵液，離心獲得發(fā)酵液上清，經(jīng)HPLC檢測，最終重組人源膠原蛋白濃度為17.4g/L。

實(shí)施例7

發(fā)酵培養(yǎng)基：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM1 4.35mL/L；蘋果酸0.5g/L。

將菌種液按10％接種量加到含有500L發(fā)酵培養(yǎng)基的1000L發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速200-600rpm、罐壓0.2-1.0bar、調(diào)節(jié)空氣流量使溶氧(DO)＞30％。當(dāng)碳源耗盡后，溶氧陡然上升，開始流加50％甘油，補(bǔ)充碳源，至菌體濕重為216g/L，停止補(bǔ)加50％甘油。甘油耗盡后開始流加甲醇，作為新的碳源，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、罐壓、空氣流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，每8小時(shí)進(jìn)行取樣，測定菌體濕重和重組人源膠原蛋白表達(dá)量，誘導(dǎo)發(fā)酵96h后，結(jié)束發(fā)酵，收集發(fā)酵液，離心獲得發(fā)酵液上清，經(jīng)HPLC檢測，最終重組人源膠原蛋白濃度為17.2g/L。

實(shí)施例8

發(fā)酵培養(yǎng)基：85％H₃PO₄ 6.6mL/L；CaSO₄·2H₂O 0.3g/L；K₂SO₄ 4.5g/L；MgSO₄·7H₂O 3.7g/L；KOH 1.0g/L；甘油10.0g/L；PTM1 0.435mL/L；丙酮酸鈉0.5g/L。

將菌種液按10％接種量加到含有500L發(fā)酵培養(yǎng)基的1000L發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速200-600rpm、罐壓0.2-1.0bar、調(diào)節(jié)空氣流量使溶氧(DO)＞30％。當(dāng)碳源耗盡后，溶氧陡然上升，開始流加50％甘油，補(bǔ)充碳源，至菌體濕重為216g/L，停止補(bǔ)加50％甘油。甘油耗盡后開始流加甲醇，作為新的碳源，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、罐壓、空氣流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，每8小時(shí)進(jìn)行取樣，測定菌體濕重和重組人源膠原蛋白表達(dá)量，誘導(dǎo)發(fā)酵96h后，結(jié)束發(fā)酵，收集發(fā)酵液，離心獲得發(fā)酵液上清，經(jīng)HPLC檢測，最終重組人源膠原蛋白濃度為16.4g/L。

對比例

發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(BSM，參考CN102443057B)：85％H₃PO₄ 26.7mL/L；CaSO₄·2H₂O 1.175g/L；K₂SO₄ 18.2g/L；MgSO₄·7H₂O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；PTM14.35mL/L；甘油40.0g/L。

將菌種液按10％接種量加到含有500L發(fā)酵培養(yǎng)基的1000L發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速200-600rpm、罐壓0.2-1.0bar、調(diào)節(jié)空氣流量使溶氧(DO)＞30％。當(dāng)碳源耗盡后，溶氧陡然上升，開始流加50％甘油，補(bǔ)充碳源，至菌體濕重為218g/L，停止補(bǔ)加50％甘油。甘油耗盡后開始流加甲醇，作為新的碳源，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、罐壓、空氣流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，每8小時(shí)進(jìn)行取樣，測定菌體濕重和重組人源膠原蛋白表達(dá)量，誘導(dǎo)發(fā)酵120h后，結(jié)束發(fā)酵，收集發(fā)酵液，離心獲得發(fā)酵液上清，經(jīng)HPLC檢測，最終重組人源膠原蛋白濃度為15.8g/L。