本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及表達(dá)鴨RIG-I蛋白的轉(zhuǎn)基因雞培育方法。

背景技術(shù)：

禽流感(Bird Flu或Avian Influenza)是禽流行性感冒的簡(jiǎn)稱(chēng)，它是由甲型流感病毒的一種亞型(也稱(chēng)禽流感病毒)引起的一種急性傳染病，也能感染人類(lèi)，被國(guó)際獸疫局定為甲類(lèi)傳染病，又稱(chēng)真性雞瘟或歐洲雞瘟。人感染后的癥狀主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數(shù)伴有嚴(yán)重的肺炎，嚴(yán)重者心、腎等多種臟器衰竭導(dǎo)致死亡，病死率很高，通常人感染禽流感死亡率約為33％。禽流感不僅給禽類(lèi)養(yǎng)殖帶來(lái)了巨大威脅，而且大規(guī)模爆發(fā)會(huì)嚴(yán)重影響人的生命安全。

先天性免疫是機(jī)體抵抗病原微生物的第一道防線，免疫系統(tǒng)的進(jìn)化使得禽類(lèi)與哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)具有不同的特點(diǎn)，與人類(lèi)相比，禽類(lèi)缺少9種干擾素、13種白介素、7種腫瘤壞死因子。因此，研究有利于提高禽先天性免疫的抗病毒因子具有重要的意義。因此，為了有效地、有針對(duì)性的抵抗禽流感，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)對(duì)禽流感具有抗性的家禽品種。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種表達(dá)鴨RIG-I蛋白的轉(zhuǎn)基因雞培育方法。

本發(fā)明的第一方面，提供了一種載體，所述載體以pGV205慢病毒載體為骨架，并且所述載體中含有鴨RIG-I基因編碼序列。

在另一優(yōu)選例中，所述鴨RIG-I基因編碼序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一優(yōu)選例中，所述載體中還含有抗生素篩選標(biāo)記。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有本發(fā)明第一方面所述的的載體。

在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞為分離的。

在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞為家禽受精卵，所述家禽包括但限于：雞、鴨、鵝、火雞、鴕鳥(niǎo)。

本發(fā)明的第三方面，提供了一種轉(zhuǎn)基因雞的培育方法，包括步驟：

(i)提供本發(fā)明第一方面所述的載體，并將所述載體包裝成重組慢病毒；

(ii)將上一步驟所述的重組慢病毒轉(zhuǎn)入雞的受精卵中，獲得經(jīng)轉(zhuǎn)染的受精卵；

(iii)孵化上一步驟獲得的經(jīng)轉(zhuǎn)染的受精卵，從而獲得所述轉(zhuǎn)基因雞。

在另一優(yōu)選例中，所述轉(zhuǎn)基因雞具有抗流感病毒的能力。

在另一優(yōu)選例中，所述流感病毒為H5N1、H1N1流感病毒。

在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟：

(iv)將步驟(iii)中獲得的轉(zhuǎn)基因雞作為F0代，與野生型雞雜交，繁育F1代，從而獲得F1代轉(zhuǎn)基因雞。

在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟：

(v)利用步驟(iv)獲得的F1代轉(zhuǎn)基因雞繁育獲得F2代轉(zhuǎn)基因雞。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(ii)采用赤道開(kāi)窗法，將所述重組慢病毒通過(guò)顯微注射針注射到受精卵胚盤(pán)下腔，獲得經(jīng)轉(zhuǎn)染的受精卵。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(i)中所述載體的制備方法包括步驟：

(i-1)以鴨cDNA為模板擴(kuò)增RIG-I基因，獲得RIG-I基因擴(kuò)增產(chǎn)物。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(i-1)擴(kuò)增RIG-I基因的引物對(duì)序列如SEQ ID NO.:2和SEQ ID NO.:3所示。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(i)中所述載體的制備方法還包括步驟：

(i-2)回收RIG-I基因擴(kuò)增產(chǎn)物，并克隆至質(zhì)粒中構(gòu)建含RIG-I基因的重組質(zhì)粒；

(i-3)用限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切所述重組質(zhì)粒和慢病毒毒載體pGV205，通過(guò)連接、轉(zhuǎn)化、克隆從而構(gòu)建重組慢病毒載體pGV205-RIG-I；

(i-4)將構(gòu)建的重組慢病毒載體pGV205-RIG-I，包裝成重組慢病毒。

本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的載體、或本發(fā)明第二方面所述的宿主細(xì)胞，在制備試劑或試劑盒中的用途，所述試劑用于制備轉(zhuǎn)基因雞。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了pGV205慢病毒載體圖譜；

圖2顯示了pGV205-RIG-I重組質(zhì)粒以及AgeI和NheI雙酶切鑒定結(jié)果；

圖3顯示了F0代RIG-I轉(zhuǎn)基因雞PCR結(jié)果；注：M為DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；1-15為F0代樣品；16為陰性對(duì)照；17為陽(yáng)性對(duì)照。

圖4顯示了F0代RIG-I轉(zhuǎn)基因雞的Southern blot結(jié)果；P：質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；N：野生型陰性對(duì)照；1-6分別F0代雞的組織樣品；

圖5顯示了F0代RIG-I轉(zhuǎn)基因雞RT-PCR結(jié)果；M：DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量，1-15為F0代雞冠樣品；16為陰性對(duì)照；17為陽(yáng)性對(duì)照；

圖6顯示了F0代RIG-I轉(zhuǎn)基因雞Western blot結(jié)果，M：170KDa蛋白marker，1-6：F0代雞雞冠蛋白；7：WT雞冠蛋白；

圖7顯示了Tail-PCR第三輪PCR擴(kuò)增的核酸電泳結(jié)果，M：DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量，1-12為特異性引物與簡(jiǎn)并引物組合，依次順序?yàn)镕3-AD1、F3-AD2、F3-AD3、F3-AD4、F3-AD5、F3-AD6、R3-AD1、R3-AD2、R3-AD3、R3-AD4、R3-AD5、R3-AD6；

圖8顯示了RIG-I轉(zhuǎn)基因雞F1代雞胚PCR結(jié)果，M：DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；1-9為RIG-I轉(zhuǎn)基因雞F1代的胚胎組織樣品；10為陰性對(duì)照；11為陽(yáng)性對(duì)照；

圖9顯示了RIG-I轉(zhuǎn)基因雞F1代雞胚Southern blot結(jié)果，P：質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；N：野生型陰性對(duì)照；1-4為RIG-I轉(zhuǎn)基因雞F1代的胚胎組織樣品；

圖10顯示了RIG-I轉(zhuǎn)基因雞F1代雞胚RT-PCR結(jié)果，M：DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量，1-9為RIG-I轉(zhuǎn)基因雞F1代的胚胎樣品；10為陰性對(duì)照；11為陽(yáng)性對(duì)照；

圖11顯示了RIG-I轉(zhuǎn)基因雞F1代雞胚Western blot結(jié)果，M：170KDa蛋白marker，1-4：RIG-I轉(zhuǎn)基因雞F1代的胚胎樣品；5：野生型雞胚組織蛋白；

圖12顯示了熒光定量PCR分析TG組(轉(zhuǎn)基因組)CEF細(xì)胞中RIG-I基因mRNA含量；

圖13顯示了間接免疫熒光(IFA)分析F1代CEF細(xì)胞中禽流感病毒的復(fù)制，其中A圖顯示了WT(野生型)組CEF細(xì)胞、B圖顯示了NTG(未轉(zhuǎn)基因組)組CEF細(xì)胞、C圖顯示了TG組CEF細(xì)胞、D圖顯示了未感染組CEF細(xì)胞；

圖14顯示了TCID₅₀測(cè)定CEF細(xì)胞中禽流感病毒的病毒滴度；

圖15顯示了熒光定量PCR檢測(cè)雞IFNβ基因mRNA含量結(jié)果；

圖16顯示了熒光定量PCR檢測(cè)PB2基因mRNA含量；

圖17顯示了熒光定量PCR檢測(cè)RIG-I下游細(xì)胞因子mRNA含量結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人通過(guò)廣泛而深入的研究，獲得一種具有禽流感抗性的轉(zhuǎn)基因雞的培育方法，克隆鴨RIG-I基因，利用慢病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體，通過(guò)赤道開(kāi)窗法將慢病毒注入授精蛋胚盤(pán)下腔，獲得表達(dá)鴨RIG-I的轉(zhuǎn)基因雞，經(jīng)遺傳繁育，證明外源基因可穩(wěn)定遺傳，F(xiàn)1代雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)具有顯著的抑制禽流感病毒復(fù)制的活性。

在描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的具體方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@類(lèi)方法和條件可以變動(dòng)。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語(yǔ)其目的僅在于描述具體實(shí)施方案，并且不意圖是限制性的，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書(shū)限制。

除非另外定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。如本文所用，在提到具體列舉的數(shù)值中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“約”意指該值可以從列舉的值變動(dòng)不多于1％。例如，如本文所用，表述“約100”包括99和101和之間的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

雖然在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價(jià)的任何方法和材料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。

本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)慢病毒載體獲得的表達(dá)鴨RIG-I轉(zhuǎn)基因雞的方法，該轉(zhuǎn)基因雞是將鴨RIG-I基因克隆到pGV205慢病毒載體中，構(gòu)建重組慢病毒載體pGV205-RIG-I，并包裝重組慢病毒；采用赤道開(kāi)窗法，將重組慢病毒通過(guò)顯微注射針注射到新生受精蛋胚盤(pán)下腔，經(jīng)遺傳操作的授精蛋正常條件孵化至出殼，成功制備了轉(zhuǎn)入鴨RIG-I基因的轉(zhuǎn)基因雞。運(yùn)用分子生物學(xué)和免疫學(xué)的方法鑒定，在獲得的F0代RIG-I轉(zhuǎn)基因雞體內(nèi)有鴨RIG-I基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；通過(guò)遺傳繁育，表達(dá)鴨RIG-I的F0代轉(zhuǎn)基因雞攜帶的外源基因能夠穩(wěn)定遺傳至F1代；分離與培養(yǎng)F1代的CEF細(xì)胞，在表達(dá)RIG-I的F1代CEF細(xì)胞中重新建立了RIG-I信號(hào)通路，并具有抑制流感病毒復(fù)制的作用。本發(fā)明為研究 RIG-I在雞體內(nèi)參與家禽天然免疫發(fā)揮抑制禽流感病毒作用及其機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，克隆鴨RIG-I基因連接到pGV205慢病毒載體中，構(gòu)建含有CMV啟動(dòng)子的重組慢病毒載體pGV205-RIG-I；

優(yōu)選地，鴨RIG-I基因多核苷酸序列如下：

ATGACGGCGGACGAGAAGCGGAGCCTGCAGTGCTACCGCCGCTACATCGAGCGGAGCCTCAACCCGGTCTACGTGCTGGGCAACATGACGGACTGGCTGCCCGACGAGCTGCGGGAGAGGATCCGCAAGGAGGAGGAGAGGGGGGTGAGCGGCGCCGCCGCGCTCTTCCTGGACGCCGTGCTGCAGCTGGAGGCCCGGGGGTGGTTCCGAGGGATGCTGGACGCGATGCTGGCCGCAGGTTACACAGGACTGGCAGAAGCAATTGAGAACTGGGACTTCAGCAAACTGGAAAAACTGGAGTTACACAGACAGCTGTTGAAGCGGATAGAGGCAACAATGTTAGAAGTCGACCCAGTAGCGCTCATTCCCTATATAAGCACATGCCTGATAGACAGGGAGTGTGAAGAGATTCAGCAGATTAGTGAAAACAGAAGCAAAGCAGCAGGCATAACTAAACTCATTGAATGTCTCTGTCGGTCGGATAAGGAGCACTGGCCAAAAAGCCTTCAGCTGGCACTAGATACCACAGGATATTACCGTGCAAGTGAACTGTGGGATATAAGAGAAGATAATGCCAAAGATGTTGACAGTGAAATGACAGATGCCTCTGAGGACTGCCTTGAAGCCAGTATGACATATTCTGAAGAAGCAGAACCTGATGATAATCTCAGTGAAAATCTTGGTTCAGCTGCAGAAGGAATTGGCAAACCTCCACCTGTCTATGAAACAAAGAAGGCTCGGAGCTACCAGATTGAACTTGCACAGCCTGCTATCAATGGGAAAAATGCCTTAATATGTGCCCCTACTGGATCTGGAAAAACTTTCGTCTCAATTCTGATTTGCGAACACCATTTCCAAAACATGCCTGCAGGACGAAAGGCGAAAGTTGTCTTTCTTGCAACTAAAGTCCCAGTGTATGAACAGCAGAAAAATGTCTTCAAGCATCATTTTGAAAGACAAGGATACTCTGTTCAAGGAATTAGTGGTGAAAATTTTTCAAATGTCTCTGTAGAAAAAGTTATAGAGGATAGTGACATCATCGTAGTGACACCCCAGATCCTGGTGAATAGCTTCGAGGATGGGACCCTTACCTCGCTCTCCATTTTCACTCTGATGATATTCGATGAGTGCCACAACACTACAGGCAACCACCCTTACAATGTGTTAATGACCAGGTATCTGGAGCAGAAATTTAACTCTGCAAGTCAGCTGCCACAGATTTTAGGTTTGACTGCTTCTGTTGGAGTTGGTAATGCCAAGAACATTGAGGAAACAATAGAGCACATCTGTAGTCTCTGCTCCTACCTTGACATACAGGCCATATCCACTGTCAGAGAGAACATACAAGAACTGCAAAGGTTCATGAACAAGCCAGAAATAGATGTCAGATTGGTTAAGAGGCGAATTCACAATCCCTTTGCAGCCATTATCTCAAATTTGATGTCCGAGACAGAGGCACTGATGAGGACAATTTACTCAGTGGATACTCTCTCCCAAAACAGCAAGAAAGATTTCGGAACACAGAACTATGAACACTGGATAGTTGTCACTCAGAGGAAATGCAGACTGCTGCAACTAGAAGACAAAGAGGAGGAGAGCAGGATATGTAGAGCCCTTTTCATTTGCACTGAACACCTGCGGAAATACAATGATGCCCTCATCATCAGTGAAGATGCCCGCATCATAGATGCTTTATCCTACCTGACCGAGTTTTTCACAAATGTCAAGAATGGACCATACACAGAATTAGAGCAGCACCTGACGGCCAAATTTCAAGAGAAAGAACCAGAACTGATTGCCCTTTCAAAAGACGAAACAAATGAGAATCCTAAACTGGAAGAGCTTGTCTGCATCCTGGATGATGCGTACCGCTATAACCCACAGACTCGCACTCTTCTCTTTGCTAAGACAAGAGCTTTAGTATCCGCTTTGAAGAAGTGTATGGAGGAAAACCCTATTCTTAACTACATAAAGCCAGGTGTTTTGATGGGGCGCGGAAGAAGAGATCAAACAACAGGTATGACCCTCCCAAGCCAGAAGGGTGTGCTGGATGCGTTCAAAACCAGCAAGGACAACAGGCTGCTCATTGCTACATCTGTTGCTGATGAAGGCATTGATATTGTCCAGTGCAACCTTGTTGTGCTCTATGAATACTCCGGTAACGTGACCAAAATGATCCAAGTCAGAGGTCGTGGAAGGGCAGCAGGCAGCAAGTGCATCCTTGTGACAAGCAAAACAGAAGTGGTTGAGAATGAAAAATGCAACCGTTATAAGGAAGAAATGATGAATAAAGCTGTTGAAAAGATCCAGAAATGGGATGAAGAAACATTTGCAAAAAAGATACATAATCTGCAAATGAAGGAAAGGGTGTTACGAGATTCCAGGAGGAAAGAAATAAAACCTAAAGTAGTGGAAGGCCAAAAGAACCTCCTGTGTGGAAAATGCAAAGCATATGCCTGCAGTACAGATGACATCAGGATTATAAAGGACTCCCATCACATTGTCCTAGGAGAAGCATTCAAGGAGCGTTATACAACAAAGCCTCATAAGAAACCAATGCAGTTTGATGGTTTTGAGAAAAAAAGCAAGATGTATTGCCGAAATAATAATTGCCAGCATGATTGGGGAATCACAGTGAAGTACCTGACATTTGACAATCTACCAGTGATCAAAATCAAAAGCTTCGTAATGGAGAGTACTGCAACTGGAACACAAATGGACTTTCAGAAATGGAAAAGCATTAATTCTTCTTTGAAGAATTTTGATGTTGAAGAAATGTCCAACTTGTACCCACCATTTTAG(SEQ ID NO.:1)

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，將上述重組慢病毒載體，包裝成重組慢病毒；采用赤道開(kāi)窗法，將符合注射標(biāo)準(zhǔn)滴度的重組慢病毒通過(guò)顯微注射針注射到受精蛋胚盤(pán)下腔，制備F0代轉(zhuǎn)基因雞。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，利用分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因雞進(jìn)行鑒定，篩選出表達(dá)鴨RIG-I的轉(zhuǎn)基因雞。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，對(duì)上述能夠穩(wěn)定表達(dá)外源基因RIG-I 的轉(zhuǎn)基因雞；通過(guò)與同品種野生型母雞雜交繁育F1代轉(zhuǎn)基因雞，并分離培養(yǎng)RIG-I轉(zhuǎn)基因雞的F1代CEF細(xì)胞。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，對(duì)F1代轉(zhuǎn)基因雞和F1代CEF細(xì)胞進(jìn)行鑒定，從而獲得了表達(dá)RIG-I的F1代轉(zhuǎn)基因雞和F1代CEF細(xì)胞。

經(jīng)檢測(cè)，對(duì)于表達(dá)RIG-I的F1代CEF細(xì)胞，能夠穩(wěn)定表達(dá)外源基因RIG-I，流感病毒感染后，在表達(dá)RIG-I的F1代CEF細(xì)胞中重新建立了RIG-I信號(hào)通路，并具有抑制流感病毒復(fù)制的作用。

RIG-I基因

視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白1(RIG-1)是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)識(shí)別病毒雙鏈RNA的一種受體，是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，它由N端的兩個(gè)串聯(lián)重復(fù)的半胱天冬酶激活招募區(qū)(Caspase activation and recruitmentdomain，CARD)、中間的DExD/H解旋酶區(qū)和C端的抑制區(qū)(CTD)組成。

RIG-1基因于2000年首次發(fā)現(xiàn)，隨后的研究證明RIG-1能夠識(shí)別細(xì)胞質(zhì)中的病毒RNA，并誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)的產(chǎn)生。但是，現(xiàn)有技術(shù)表明，雞體內(nèi)不含有RIG-1。

模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRR)是宿主重要的天然免疫系統(tǒng)，可識(shí)別多種微生物成分，如病毒的核酸等，迅速啟動(dòng)多種信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，合成一系列的細(xì)胞因子，包括I型干擾素和炎性細(xì)胞因子，在抗病毒先天性免疫中發(fā)揮重要的作用。其中，RIG-I樣受體(RIG-I like receptor，RLR)為一類(lèi)存在與胞內(nèi)的PRR(包括RIG-I，MDA5，LGP2)，主要負(fù)責(zé)識(shí)別RNA病毒，激活信號(hào)通路產(chǎn)生I型IFNs以及炎性細(xì)胞因子。

在本發(fā)明優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述RIG-1基因?yàn)轼喌腞IG-1基因；優(yōu)選地，所述鴨的RIG-1基因的多核苷刷序列可以包含與SEQ ID NO.:1所示序列基本相同的序列。

“基本相同”是指一種多肽或核酸序列與參考氨基酸或核酸序列相比表現(xiàn)出至少75％，更好85％或90％以上，最好95％以上的同源性。多肽序列一般至少包含20個(gè)氨基酸，更好30-40個(gè)以上氨基酸，最好50個(gè)以上氨基酸。核酸序列一般至少包含60個(gè)核苷酸，更好90個(gè)以上核苷酸，最好120個(gè)以上核苷酸。在本發(fā)明中，“基本相同”的多肽通常可保留或具有≥50％，較佳地≥60％，更佳地≥70％，最佳地≥80％或≥90％或≥100％如100～500％的參考多肽的生物活性。

“重組DNA序列”指的是一種DNA序列以在自然界中不被發(fā)現(xiàn)存在的方式 排列，該序列可能會(huì)存在于孤立的體外DNA，體內(nèi)額外染色體DNA，或作為體內(nèi)基因組DNA的部分。

“表達(dá)盒”或“構(gòu)建體(物)”是指一種包括目標(biāo)核酸序列或基因序列，能表達(dá)合適蛋白，與宿主細(xì)胞內(nèi)提供適當(dāng)轉(zhuǎn)錄和翻譯的目標(biāo)核酸序列成分操作連接。所述成分可能包括啟動(dòng)子，分泌信號(hào)序列，加尾信號(hào)，內(nèi)含子序列，絕緣子序列及本發(fā)明所述的其他成分?！氨磉_(dá)盒”或“構(gòu)建體”還可包括“載體序列”?！拜d體序列”是指用本發(fā)明重組DNA技術(shù)構(gòu)建的核酸序列以利于表達(dá)構(gòu)建體的克隆和表達(dá)。代表性的表達(dá)載體類(lèi)型包括(但不限于)質(zhì)粒，粘粒，噬菌體載體，病毒載體，及酵母人工染色體。

“雙順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)”是指任何能表達(dá)兩個(gè)獨(dú)立翻譯蛋白產(chǎn)品的構(gòu)建體。這兩種產(chǎn)品可能會(huì)從一個(gè)單一的基因雙順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)或從兩個(gè)獨(dú)立的mRNA翻譯而來(lái)，每個(gè)獨(dú)立的mRNA由同樣的雙順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)編碼?！熬垌?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)”是指任何能提供兩個(gè)以上獨(dú)立翻譯蛋白產(chǎn)品表達(dá)的構(gòu)建體。

“操作性連接”是指一個(gè)目標(biāo)核酸序列和一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列(例如，啟動(dòng)子)物體上聯(lián)系起來(lái)，以便能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目標(biāo)核酸序列編碼的多肽。

“信號(hào)序列”是指一段核酸序列，當(dāng)被引入到編碼多肽的核酸序列，能指導(dǎo)表達(dá)該多肽的細(xì)胞分泌該多肽(如RIG-1蛋白和/或糖基轉(zhuǎn)移酶)。信號(hào)序列最好位于核酸編碼序列5′端，這樣信號(hào)序列的多肽位于翻譯多肽的N-末端?！靶盘?hào)肽”是指信號(hào)序列翻譯的多肽序列。

“宿主細(xì)胞”是指已經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，包括家禽體外培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞，也包括家禽的卵、或受精卵。

“轉(zhuǎn)染”是指在宿主細(xì)胞中引入一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明表達(dá)構(gòu)建體的實(shí)施過(guò)程，包括(但并不限于)：顯微注射，電穿孔，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，磷酸鈣介導(dǎo)轉(zhuǎn)染或病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染等。本發(fā)明表達(dá)構(gòu)建體若已轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞，則稱(chēng)其為“已轉(zhuǎn)染的”?！八矔r(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞”是指這樣的宿主細(xì)胞，在該宿主細(xì)胞中引入了表達(dá)構(gòu)建體但沒(méi)有永久整合到宿主細(xì)胞或其后代的基因組，因而隨時(shí)間推移該表達(dá)構(gòu)建體可被宿主細(xì)胞或其后代丟失?！胺€(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞”是指引入宿主細(xì)胞的表達(dá)構(gòu)建體已整合到宿主細(xì)胞及其后代的基因組。

“轉(zhuǎn)基因”是指任何一個(gè)已整合至轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞基因組的本發(fā)明表達(dá)構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)。含有這類(lèi)轉(zhuǎn)基因的宿主細(xì)胞稱(chēng)為“轉(zhuǎn)基因細(xì)胞”。這種由部分或全部轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞組成的動(dòng)物是“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”。首選轉(zhuǎn)基因動(dòng)物為轉(zhuǎn)基因家禽(如，雞)。由部分轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞組成的動(dòng)物稱(chēng)為“嵌合體”或“嵌合體動(dòng)物”。

表達(dá)盒組裝

應(yīng)用于本發(fā)明的基因工程方法系標(biāo)準(zhǔn)已知程序(如“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)” 第二版等)。這些標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，可以用來(lái)準(zhǔn)備該發(fā)明的表達(dá)盒。表達(dá)盒包含一些必要元件以在選擇性宿主細(xì)胞內(nèi)開(kāi)展目標(biāo)核酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯，包括啟動(dòng)子，翻譯產(chǎn)物的分泌信號(hào)序列和polyA信號(hào)。類(lèi)似的表達(dá)盒也可能含有內(nèi)含子或非編碼基因序列，旨在提高轉(zhuǎn)錄和翻譯效率及mRNA的穩(wěn)定性。待表達(dá)的核酸序列可以具有其內(nèi)源性的3′端非編碼序列和/或polyA信號(hào)，或包含一個(gè)外源性3′端非編碼序列和/或polyA信號(hào)。例如酪蛋白啟動(dòng)子，分泌信號(hào)序列，3′端非編碼序列和polyA信號(hào)，可用于在乳腺宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)RIG-1蛋白。密碼子的選擇及目標(biāo)核酸序列的構(gòu)造設(shè)計(jì)或選擇包含所需宿主細(xì)胞內(nèi)優(yōu)先使用的密碼子，可用于盡量減少早期翻譯終止，從而最大限度地表達(dá)蛋白。

插入的核酸序列也可能編碼便于識(shí)別和編碼多肽的附加表位標(biāo)簽。編碼的附加表位標(biāo)簽可以包括用于特異位點(diǎn)蛋白水解或化學(xué)裂解以利于蛋白純化后附加表位標(biāo)簽去除的識(shí)別位點(diǎn)。例如凝血酶裂解位點(diǎn)可以摻入重組RIG-1蛋白和其附加表位標(biāo)簽之間。

本發(fā)明構(gòu)建的旨在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)重組RIG-1表達(dá)盒可包括一個(gè)或多個(gè)以下基本組件。

1).啟動(dòng)子

這些序列對(duì)宿主細(xì)胞而言可具內(nèi)源或異源性，可進(jìn)行修飾，并可提供全能(即表達(dá)不受明顯外部刺激影響，不屬細(xì)胞特異)或組織特異性(亦稱(chēng)細(xì)胞特異)表達(dá)。全能表達(dá)啟動(dòng)子序列包括合成的和自然的病毒序列，例如，人巨細(xì)胞病毒直接早期啟動(dòng)子(CMV)；猿猴病毒40(SV40)的早期啟動(dòng)子；Rous肉瘤病毒(RSV)；或腺病毒主要晚期啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子賦予與它們操作性連接的核酸分子較高的轉(zhuǎn)錄水平。啟動(dòng)子可被修飾，如刪除或增加序列，如促進(jìn)子(巨細(xì)胞病毒，SV40，或呼吸道合胞病毒促進(jìn)子)，或促進(jìn)子的串聯(lián)重復(fù)序列。包含強(qiáng)壯促進(jìn)子序列的啟動(dòng)子可增加轉(zhuǎn)錄達(dá)10-100倍。

2).內(nèi)含子

含有內(nèi)含子序列(即基因組序列)的核酸序列相比無(wú)內(nèi)含子的序列表達(dá)量較高。因此，在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和轉(zhuǎn)譯起始密碼子之間及3′末端和轉(zhuǎn)譯終止密碼子之間，或RIG-1蛋白編碼核酸序列內(nèi)部插入內(nèi)含子序列可導(dǎo)致該酶較高表達(dá)水平。這樣的內(nèi)含子序列，包括5′端剪接位點(diǎn)(供體位點(diǎn))和3′端剪接位點(diǎn)(受體位點(diǎn))，至少被100個(gè)非編碼序列堿基對(duì)分開(kāi)。這些內(nèi)含子序列可衍生自其啟動(dòng)子被用來(lái)驅(qū)動(dòng)RIG-1蛋白表達(dá)的基因，自然RIG-1蛋白基因，或其它合適基因的基因組序列。應(yīng)選擇這樣的內(nèi)含子序列，以盡量減少表達(dá)盒內(nèi)重復(fù)序列的存在，因?yàn)檫@樣的重復(fù)序列可增加重組機(jī)會(huì)，從而造成結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。這些內(nèi)含子最好位于RIG-1蛋白編碼核酸序列之內(nèi)，與自然人RIG-1蛋白基因的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)類(lèi)似。

3).信號(hào)序列

每個(gè)表達(dá)盒將另外包括能提供從宿主細(xì)胞分泌重組RIG-1蛋白的信號(hào)序列。這樣的信號(hào)序列存在于能分泌其蛋白產(chǎn)物的自然基因。本發(fā)明可采用來(lái)自于RIG-1蛋白基因，宿主細(xì)胞特異性表達(dá)基因，或另一個(gè)其蛋白產(chǎn)物已知分泌基因，或可合成的信號(hào)序列。

4).終止區(qū)域

每個(gè)表達(dá)盒將另外包括核酸序列，該序列包含轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化序列。該序列被鏈接于RIG-1蛋白編碼核酸序列的3′末端。這些序列可包括其5′端區(qū)域驅(qū)動(dòng)RIG-1蛋白表達(dá)基因的3′末端和多聚腺苷酸化信號(hào)(即山羊β-酪蛋白基因的3′末端)。或者，這樣的序列來(lái)自于該序列已被證明可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后mRNA穩(wěn)定性的基因(例如，那些來(lái)自于牛生長(zhǎng)激素基因，β-珠蛋白基因，或SV40早期啟動(dòng)子區(qū)域的序列)。

5).表達(dá)盒其他功能

RIG-1蛋白編碼核酸序列在其5′端或3′端非翻譯區(qū)(UTR)內(nèi)，和/或在編碼的RIG-1蛋白N-末端的區(qū)域內(nèi)可任選地被修飾，以提高表達(dá)水平。RIG-1蛋白編碼核酸序列內(nèi)的序列可被刪除或突變，以增加分泌和/或避免RIG-1蛋白產(chǎn)品停留于細(xì)胞內(nèi)；例如，作為調(diào)節(jié)，加上內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)或其它分類(lèi)抑制信號(hào)。

此外，表達(dá)盒可含位于RIG-1蛋白編碼核酸序列5′端和/或3′端，從而提高轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞集成率的適當(dāng)序列(即ITR序列，Mol Cell Biol 8：3988-3996，1988)。表達(dá)盒還可含具染色質(zhì)開(kāi)放或絕緣體活性的核酸序列，從而重復(fù)激活鏈接的轉(zhuǎn)基因組織特異性表達(dá)。這樣的序列包括基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MARs)(Mol Repro Dev 44：179-184，1996；Proc Natl Acad Sci USA 89：6943-6947，1992)。另請(qǐng)參見(jiàn)PCT公開(kāi)號(hào)WO95/33841和WO96/04390。

表達(dá)盒還包括利于表達(dá)結(jié)構(gòu)克隆和繁衍的載體序列。用于本發(fā)明并在領(lǐng)域中已知的的標(biāo)準(zhǔn)載體包括(但不限于)質(zhì)粒，粘粒，噬菌體載體，病毒載體，和酵母人工染色體。載體序列可包含在大腸桿菌中繁衍的復(fù)制原點(diǎn)；SV40的復(fù)制原點(diǎn)；用于宿主細(xì)胞選擇的青霉素，新霉素，或嘌呤霉素抗性基因；和/或擴(kuò)增顯性選擇標(biāo)記基因(如二氫葉酸還原酶基因)及其他感興趣的基因。

用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的表達(dá)盒可在引入宿主細(xì)胞前通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶消化線性化。或者，在引入宿主細(xì)胞前除去多余的載體序列，引入的線性片段只由RIG-1蛋白編碼序列，5′端調(diào)節(jié)序列(即啟動(dòng)子)，和3′端調(diào)節(jié)序列(即3′端轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化序列)，及任何側(cè)翼絕緣體或MARs。經(jīng)這些片段轉(zhuǎn)化的細(xì)胞將不含用于原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的大腸桿菌復(fù)制起源，或編碼抗生素耐藥蛋白(如青霉素耐藥蛋白)的核酸分子。

另外，用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的表達(dá)盒限制性消化酶消化片段可包括RIG-1蛋白編碼序列，5′端和3′端調(diào)控序列，和任何側(cè)翼絕緣體或MARs，這些序列可與編 碼抗生素抗性蛋白的核酸序列鏈接以用于轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的抗性選擇(如通過(guò)新霉素或嘌呤霉素)。

表達(dá)盒的評(píng)估

使用本發(fā)明所述表達(dá)盒在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物之前，可應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)確定該表達(dá)盒功能。表達(dá)盒的遺傳穩(wěn)定性能，重組蛋白的分泌程度和重組蛋白物理和功能屬性亦可在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生之前評(píng)估。含全能啟動(dòng)子的表達(dá)盒可轉(zhuǎn)染任何動(dòng)物細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)物介質(zhì)可用Western印跡分析或生化活性測(cè)定(Ellman活性測(cè)定；Biochem Pharmacol 7：88-95，1961)直接測(cè)試分泌蛋白的存在，以確定依據(jù)本發(fā)明所建RIG-1蛋白編碼表達(dá)盒而轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系是否生產(chǎn)重組RIG-1蛋白。凡某個(gè)細(xì)胞系經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并已被證明生產(chǎn)活性重組蛋白，該細(xì)胞系可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

轉(zhuǎn)基因雞的產(chǎn)生

在本發(fā)明中，可以采用赤道開(kāi)窗法，將含目的基因的重組載體通過(guò)顯微注射針注射到雞受精蛋胚盤(pán)下腔，制備F0代轉(zhuǎn)基因雞。

在本發(fā)明優(yōu)選地實(shí)施方式中，赤道開(kāi)窗法的具體操作如下：

(1)新鮮受精蛋經(jīng)75％酒精表面消毒后，平置于蛋托上標(biāo)記最高點(diǎn)，室溫過(guò)夜使胚盤(pán)上浮固定。

(2)在標(biāo)記處用牙科鉆開(kāi)一個(gè)邊長(zhǎng)3mm左右的窗口，在冷光源下尋找胚盤(pán)，一旦發(fā)現(xiàn)胚盤(pán)，用顯微注射針吸取2-3μl重組慢病毒濃縮液注射到胚盤(pán)下腔，當(dāng)胚盤(pán)中間透明區(qū)變紅，說(shuō)明注射成功。

(3)用封口膜將開(kāi)口處封閉固定。

(4)將注射病毒和開(kāi)口沒(méi)注射病毒的受精蛋全部放置于溫度37.8℃，濕度50％的孵化器內(nèi)，18d后將其轉(zhuǎn)移到出雛器中，溫度37.5℃，濕度50％孵育至出殼。

轉(zhuǎn)基因在動(dòng)物，組織或相關(guān)細(xì)胞基因組DNA中的存在，及轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)可通過(guò)在相關(guān)領(lǐng)域中公認(rèn)的技術(shù)包括雜交和PCR技術(shù)而確認(rèn)。

一些轉(zhuǎn)基因方法會(huì)導(dǎo)致嵌合動(dòng)物的產(chǎn)生。在嵌合動(dòng)物中，部分轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中所述表達(dá)構(gòu)建體的啟動(dòng)子處于活動(dòng)狀態(tài)，從而表達(dá)所需的重組RIG-1蛋白。嵌合動(dòng)物可被用于特性描述或分離重組RIG-1蛋白。嵌合動(dòng)物的生殖細(xì)胞可用于繁衍并產(chǎn)生全轉(zhuǎn)基因的非嵌合后代。

直接通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法產(chǎn)生，或通過(guò)嵌合動(dòng)物繁衍的全轉(zhuǎn)基因后代可被用于繁殖以維持轉(zhuǎn)基因品系，及特性描述或分離重組RIG-1蛋白。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)首次培育出了能夠穩(wěn)定表達(dá)鴨RIG-I基因的轉(zhuǎn)基因雞；

(2)采用本發(fā)明的方法培育的轉(zhuǎn)基因雞，具有顯著的抗禽流感特性。

(3)根據(jù)本發(fā)明的方法制備的轉(zhuǎn)基因雞體內(nèi)能夠穩(wěn)定表達(dá)鴨RIG-I，并顯著提高雞的抗病毒感染能力和降低病毒感染死亡率。

(4)使用本發(fā)明的方法制備轉(zhuǎn)基因雞，具有顯著較高的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率，能夠顯著降低轉(zhuǎn)基因雞的培育成本。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步詳陳本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明詳細(xì)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。以下實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料和試劑如無(wú)特別說(shuō)明均可從市售渠道獲得。

實(shí)施例1，pGV205-RIG-I重組慢病毒載體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中綠頭鴨RIG-I基因(EU363349)使用VectorNTI設(shè)計(jì)兩端含限制性?xún)?nèi)切酶NheⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增引物：

RIG-1-F：5’-CAGCTAGCATGACGGCGGACGAGAAG-3’；(SEQ ID NO.:2)

RIG-1-R：5’-GCCTCGAGCTAAAATGGTGGGTACAAGTTGG-3’(SEQ ID NO.:3)。

以北京金定鴨的脾臟cDNA為模版，RIG-1-F和RIG-1-R為引物進(jìn)行鴨脾臟RIG-1基因的PCR擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)為：95℃5min；95℃30s、58℃30s、72℃3.5min，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的目的基因膠回收，克隆至pMD18-T載體中構(gòu)建pMD-RIG重組質(zhì)粒，并由Invitrogen公司測(cè)序鑒定。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中綠頭鴨RIG-1基因(EU363349)進(jìn)行序列比對(duì)，測(cè)序結(jié)果表明克隆得到的RIG-1基因全長(zhǎng)2802bp(SEQ ID NO.:1)，與GenBank中綠頭鴨RIG-1基因(EU363349)的同源性為100％。

將克隆的鴨RIG-I基因和pcDNA3.1載體(購(gòu)自Invitrogen公司)同時(shí)用限制性?xún)?nèi)切酶NheⅠ和XhoⅠ雙酶切，然后通過(guò)連接、轉(zhuǎn)化、克隆構(gòu)建pcDNA3.1-RIG-I重組質(zhì)粒。

將pcDNA3.1-RIG-I重組質(zhì)粒和慢病毒毒載體pGV205(圖1，購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)同時(shí)用限制性?xún)?nèi)切酶NheⅠ和AgeⅠ雙酶切，結(jié)果如圖2，然后通過(guò)連接、轉(zhuǎn)化、克隆構(gòu)建重組慢病毒載體pGV205-RIG-I。

實(shí)施例2，轉(zhuǎn)基因雞的制作與鑒定

將構(gòu)建的重組慢病毒載體pGV205-RIG-I，包裝成重組慢病毒；采用赤道開(kāi)窗法，將重組慢病毒通過(guò)顯微注射針注射到新生受精蛋胚盤(pán)下腔，經(jīng)遺傳操作的授精蛋正常條件孵化至出殼，成功制備了轉(zhuǎn)入鴨RIG-I基因的轉(zhuǎn)基因雞。

經(jīng)過(guò)發(fā)明人多次實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)出的赤道開(kāi)窗法最佳條件如下，在該條件下注射的受精蛋可以有較高的孵化率，孵出的轉(zhuǎn)基因雞陽(yáng)性率也顯著提高。

受精蛋胚盤(pán)注射及孵化

(1)新鮮受精蛋經(jīng)75％酒精表面消毒后，平置于蛋托上標(biāo)記最高點(diǎn)，室溫過(guò)夜使胚盤(pán)上浮固定。

(2)在標(biāo)記處用牙科鉆開(kāi)一個(gè)邊長(zhǎng)3mm左右的窗口，在冷光源下尋找胚盤(pán)，一旦發(fā)現(xiàn)胚盤(pán)，用顯微注射針吸取2-3μl重組慢病毒濃縮液注射到胚盤(pán)下腔，當(dāng)胚盤(pán)中間透明區(qū)變紅，說(shuō)明注射成功。

(3)用封口膜將開(kāi)口處封閉固定。

(4)將注射病毒和開(kāi)口沒(méi)注射病毒的受精蛋全部放置于溫度37.8℃，濕度50％的孵化器內(nèi)，18d后將其轉(zhuǎn)移到出雛器中，溫度37.5℃，濕度50％孵育至出殼。

RIG-I轉(zhuǎn)基因雞PCR結(jié)果

通過(guò)翅靜脈采集RIG-I轉(zhuǎn)基因雞的血液，使用血液基因組試劑盒提取血液DNA作為模板，使用RIG-I鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶大小為503bp(503bp是PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因雞時(shí)擴(kuò)增的序列，上游引物為鴨RIG-I基因中的序列(下劃線標(biāo)示部分)，下游引物為載體上的序列)，與預(yù)期大小一致(圖3)。挑選F0代轉(zhuǎn)基因公雞分別與4只野生型母雞合籠，其繁育的部分F1代雞中也確定整合有外源基因RIG-I。

RIG-I轉(zhuǎn)基因雞Southern blot結(jié)果

用酚氯仿法提取經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性的F0代雞組織基因組，用限制性?xún)?nèi)切酶AgeI和NheI雙酶切，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Southern blot檢測(cè)。雜交條帶3Kb左右，與預(yù)期條帶大小一致，進(jìn)一步確認(rèn)了經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因雞整合有外源基因RIG-I(圖4)。用酚氯仿法提取經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性的F1代雞組 織基因組，用限制性?xún)?nèi)切酶AgeI和NheI雙酶切，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Southern blot檢測(cè)。雜交條帶3Kb左右，與預(yù)期條帶大小一致，進(jìn)一步確認(rèn)了經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因雞整合有外源基因RIG-I。

RIG-I轉(zhuǎn)基因雞RT-PCR結(jié)果

采集RIG-I轉(zhuǎn)基因雞的雞冠組織，經(jīng)液氮研磨后使用RNA提取試劑盒提取雞冠RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，使用RIG-I鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶大小為503bp，與預(yù)期大小一致(圖5)；F0代轉(zhuǎn)基因雞有外源基因RIG-I轉(zhuǎn)錄。應(yīng)用同樣的方法，RT-PCR結(jié)果顯示，部分F1代雞的雞冠組織中也確定有外源基因RIG-I轉(zhuǎn)錄。

RIG-I轉(zhuǎn)基因雞Western blot結(jié)果

經(jīng)PCR、southern blot和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致的轉(zhuǎn)基因雞，提取這些雞的雞冠蛋白，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)雞冠中RIG-I蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明這些雞中均有RIG-I蛋白的表達(dá)(圖6)。提取經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性的F1代雞冠組織蛋白，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)雞冠中RIG-I蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明F1代轉(zhuǎn)基因雞有RIG-I蛋白的表達(dá)。

與轉(zhuǎn)基因組同時(shí)注射、孵化出雛，但利用分子生物學(xué)等方法未能檢測(cè)到外源基因的整合與表達(dá)，被命名為NTG，NTG組中沒(méi)有檢測(cè)到外源基因的整合與表達(dá)。

實(shí)施例3，轉(zhuǎn)基因雞整合位點(diǎn)分析與驗(yàn)證

F0代整合位點(diǎn)分析

提取0475號(hào)F0代RIG-I轉(zhuǎn)基因雞的DNA作為模板，利用設(shè)計(jì)的特異性引物分別與六個(gè)簡(jiǎn)并引物組成引物組合，對(duì)整合位點(diǎn)的上游和下游側(cè)翼序列進(jìn)行Tail-PCR擴(kuò)增，取15μl第三次PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到的結(jié)果(圖7)。

膠回收第三輪Tail-PCR擴(kuò)增在750-2000bp左右的特異性目的片段，連T載，轉(zhuǎn)化，克隆，測(cè)序；將測(cè)序得到的序列在NCBI網(wǎng)站上通過(guò)BLAST程序與GenBank中雞的已知核酸序列和所構(gòu)建的載體序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明目標(biāo)序列整合到雞的2號(hào)染色體上，雞基因組在被測(cè)序列的第44-436bp，HIV載體在第437-749bp；0475號(hào)轉(zhuǎn)基因雞外源基因側(cè)翼序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中雞的2號(hào)染色體上120582895-120583287bp序列有100％的同源性；經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)外源基因插入位點(diǎn)在雞2號(hào)染色體120582894-120582895bp處(約2/5的轉(zhuǎn)基因 雞，10只轉(zhuǎn)基因雞中有4只雞的整合位點(diǎn)在同一位置)。

這表明，本發(fā)明構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因載體能夠整合到轉(zhuǎn)基因雞的基因組中，且具有一定的傾向性。

F0代整合位點(diǎn)結(jié)果驗(yàn)證

根據(jù)測(cè)序結(jié)果序列44-749bp(既要包括雞基因組又要包括HIV載體)之間設(shè)計(jì)特異性驗(yàn)證引物，以0475號(hào)轉(zhuǎn)基因雞基因組為模板擴(kuò)增的條帶大小為620bp與預(yù)期結(jié)果一致。

膠回收目的條帶，連T載，轉(zhuǎn)化，克隆，測(cè)序；將測(cè)序得到的序列在NCBI網(wǎng)站上通過(guò)BLAST程序與GenBank中雞的已知核酸序列和所構(gòu)建的載體序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明目標(biāo)序列整合到雞的2號(hào)染色體上，HIV載體在第41-285bp，雞基因組在被測(cè)序列的第286-660bp；0475號(hào)轉(zhuǎn)基因雞外源基因側(cè)翼序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中雞的2號(hào)染色體上120582895-120583269bp序列有100％的同源性；經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)外源基因插入位點(diǎn)在雞2號(hào)染色體120582894-120582895bp處，所得結(jié)果與前面一致，表明驗(yàn)證正確。

F1代整合位點(diǎn)驗(yàn)證

用0475號(hào)F0代轉(zhuǎn)基因雞整合位點(diǎn)的驗(yàn)證引物，以0475號(hào)轉(zhuǎn)基因雞的后代作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增的條帶大小為620bp與預(yù)期結(jié)果一致。膠回收目的條帶，連T載，轉(zhuǎn)化，克隆，測(cè)序；將測(cè)序得到的序列在NCBI網(wǎng)站上通過(guò)BLAST程序與GenBank中雞的已知核酸序列和所構(gòu)建的載體序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明目標(biāo)序列整合到雞的2號(hào)染色體上，與F0代的結(jié)果一致。

實(shí)施例4，表達(dá)鴨RIG-I的F1代CEF細(xì)胞，對(duì)禽流感病毒復(fù)制的影響

F1代雞胚組織的分子生物學(xué)結(jié)果

PCR結(jié)果

取出部分雞胚組織提取基因組DNA作為模板，用RIG-I檢測(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物為鴨RIG-I基因中的序列(SEQ ID NO.:1中下劃線所示)，下游引物為載體上的序列，擴(kuò)增條帶大小為503bp，與預(yù)期大小一致(圖8)；部分F1代雞胚中整合有外源基因RIG-I。

Southern blot結(jié)果

用酚氯仿法提取經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性的F1代雞胚組織基因組DNA，用限制性?xún)?nèi)切酶AgeI和NheI雙酶切，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Southern blot檢測(cè)。雜交 條帶3Kb左右，與預(yù)期條帶大小一致(圖9)，進(jìn)一步確認(rèn)了經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的部分F1代雞胚整合有外源基因RIG-I。

RT-PCR結(jié)果

用RNA提取試劑盒提取F1代雞胚組織RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板利用RIG-I基因的鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶大小為503bp，與預(yù)期大小一致(圖10)；部分F1代雞胚中確定有外源基因RIG-I轉(zhuǎn)錄。

Western blot結(jié)果

提取經(jīng)PCR、southern blot和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致的F1代雞胚組織蛋白，通過(guò)蛋白免疫印跡檢測(cè)RIG-I蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表明部分F1代雞胚中有RIG-I蛋白的表達(dá)(圖11)。

熒光定量PCR分析TG組CEF細(xì)胞中RIG-I基因mRNA含量結(jié)果

經(jīng)生物學(xué)方法鑒定為陽(yáng)性的胚胎組織制備成的CEF細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80％-90％，用10×TCID₅₀的禽流感病毒感染，分別在感染后8h、16h和24h提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)qRT-PCR分析感染與未感染細(xì)胞中RIG-I的mRNA水平。結(jié)果顯示三個(gè)時(shí)間點(diǎn)感染組細(xì)胞中RIG-I的mRNA水平均高于未感染組，其中感染16h后RIG-I的mRNA水平上調(diào)2.7倍,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明在表達(dá)RIG-I的F1代CEF細(xì)胞中重新建立了RIG-I信號(hào)通路，流感病毒感染后，上調(diào)RIG-I的表達(dá)，能激活信號(hào)通路。

IFA分析F1代CEF細(xì)胞中禽流感病毒的復(fù)制

禽流感病毒感染F1代CEF細(xì)胞，16h后通過(guò)IFA檢測(cè)病毒血清的表達(dá)；感染病毒的CEF細(xì)胞中均觀察到綠色熒光，但TG組與NTG/WT相比熒光強(qiáng)度弱，熒光細(xì)胞數(shù)量少，說(shuō)明流感病毒在TG組細(xì)胞中的增殖量比NTG/WT組中的低(圖13)。IFA結(jié)果表明TG組的CEF細(xì)胞具有抑制禽流感病毒復(fù)制的能力。

TCID50測(cè)定禽流感病毒的病毒滴度

用禽流感病毒感染TG組，NTG組，WT組CEF細(xì)胞，感染后8h，16h，or 24h收集TG/NTG/WT組CEF細(xì)胞上清，檢測(cè)禽流感病毒的TCID₅₀；結(jié)果顯示三個(gè)時(shí)間點(diǎn)TG組病毒TCID₅₀均低于NTG/WT組，其中感染后8h TG組與WT組相比TCID50降低了2.9倍(p<0.05)，感染后16h TG組與WT組相比TCID₅₀降低了6.8倍(p<0.01)，感染后24h TG組與WT組相比TCID₅₀降低了2.5倍(p<0.05)(圖14)，表明本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因雞具有顯著較強(qiáng)的對(duì)禽流感病毒的抵抗能力。

熒光定量PCR檢測(cè)雞IFNβ和PB2基因mRNA含量結(jié)果

用禽流感病毒感染TG組，NTG組，WT組CEF細(xì)胞，感染后8h，16h，or 24h提取F1代CEF細(xì)胞的RNA，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)TG組，NTG組和WT組CEF細(xì)胞中雞IFNβ和流感病毒PB2基因的mRNA拷貝數(shù)。結(jié)果顯示三個(gè)時(shí)間點(diǎn)TG組IFN-β的表達(dá)量均高于NTG/WT組，其中感染16h后TG組IFN-β的表達(dá)量達(dá)到WT組的2.4倍(圖15)；三個(gè)時(shí)間點(diǎn)TG組PB2的mRNA拷貝數(shù)均低于NTG/WT組，其中感染16h后TG組PB2的mRNA拷貝數(shù)是WT組的0.34倍(圖16)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了，流感病毒感染后的表達(dá)RIG-I的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中，上調(diào)IFN-β的表達(dá)，說(shuō)明激活了RIG-I信號(hào)通路。

熒光定量PCR檢測(cè)RIG-I下游細(xì)胞因子mRNA含量結(jié)果

用禽流感病毒感染TG組，WT組CEF細(xì)胞，感染后16h提取F1代CEF細(xì)胞的RNA，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)IFN-β，IRF7，IFIT5，PKR，OASL，MX1的mRNA水平。結(jié)果顯示禽流感病毒感染后TG組CEF細(xì)胞與WT組CEF細(xì)胞相比，RIG-I下游的IFN-β，抗病毒分子(PKR，OASL，MX1)，促炎癥細(xì)胞因子(IRF7，IFIT5)的mRNA水平都有所上調(diào)，IFN-β上調(diào)2.4倍，其他細(xì)胞因子IRF7，IFIT5，PKR，OASL，MX1分別上調(diào)了2.1倍，1.5倍，1.9倍，2倍，1.9倍，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖17所示。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了，流感病毒感染后的表達(dá)RIG-I的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中，上調(diào)抗病毒分子和促炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明激活RIG-I信號(hào)通路，發(fā)揮抑制病毒的作用。

總結(jié)：

本發(fā)明中克隆了北京金定鴨的RIG-I基因連接到pGV205慢病毒載體(上海吉?jiǎng)P公司)中，構(gòu)建了重組慢病毒載體pGV205-RIG-I。

然后通過(guò)赤道開(kāi)窗法，將構(gòu)建的pGV205-RIG-I重組慢病毒載體包裝成的慢病毒注射到受精蛋胚盤(pán)下腔，成功獲得了表達(dá)鴨RIG-I的海蘭白轉(zhuǎn)基因雞，并能將外源基因穩(wěn)定遺傳至F1代。

通過(guò)轉(zhuǎn)基因雞整合位點(diǎn)分析，證明了本發(fā)明的慢病毒載體法制備的轉(zhuǎn)基因雞的整合位點(diǎn)具有一定的傾向性，能夠比較特異地插入于雞2號(hào)染色體的120582894-120582895bp處。

分離培養(yǎng)了表達(dá)鴨RIG-I的F1代CEF細(xì)胞。經(jīng)禽流感病毒感染后，在表達(dá)RIG-I的F1代CEF細(xì)胞中重新建立了RIG-I信號(hào)通路，并具有抑制流感病 毒復(fù)制的作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)RIG-I的F1代轉(zhuǎn)基因雞，能夠穩(wěn)定表達(dá)外源基因RIG-I，并能顯著提高雞的抗病毒感染能力和降低病毒感染死亡率。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。