本發(fā)明屬于綿羊分子標記篩選與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及NGF基因作為綿羊產(chǎn)羔性狀的分子標記及其應(yīng)用。本發(fā)明的分子標記克隆自NGF基因。

背景技術(shù)：

種羊的選育是現(xiàn)代化羊場育種和種羊生產(chǎn)工作中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在影響家畜生產(chǎn)效益的幾大科技因素中，遺傳育種與繁殖的科技貢獻率占50％，因此提高羊群繁殖力有助于提高生產(chǎn)效益。第一，在舍飼養(yǎng)羊的成本中，母羊飼養(yǎng)成本占飼養(yǎng)總成本的60％以上，提高母羊的繁殖性能能顯著提高生產(chǎn)者經(jīng)濟效益。第二，通過種羊的選育，增加種羊淘汰率，降低飼養(yǎng)成本。第三，在規(guī)?；?、集約化養(yǎng)殖場由于遺傳因素、飼養(yǎng)管理水平等因素引起母羊?qū)遗洳辉?、產(chǎn)弱羔、死羔等繁殖問題凸顯，導(dǎo)致羊群年繁殖效率降低。傳統(tǒng)育種方法中，對家畜性狀選擇的方法多依賴于家畜的表型，這種方法在大家畜選育中需要豐富的經(jīng)驗和長達幾十年時間。此外，對于一些特殊性狀，如母羊的產(chǎn)羔數(shù)性狀，該性狀屬于微效多基因控制的低遺傳力的數(shù)量性狀，且受到不同環(huán)境和飼養(yǎng)條件的影響，常規(guī)育種方法遺傳改良進展緩慢。隨著分子標記技術(shù)的發(fā)展和完善，利用與綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀緊密連鎖的分子遺傳標記，對產(chǎn)羔數(shù)性狀進行跟蹤性選擇，減少育種過程中選擇的盲目性，進行早期選育，極大提高育種效率。

神經(jīng)生長因子(Neuron Growth Factor，NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的重要成員之一。NGF與其高親和力受體TrKA結(jié)合，誘導(dǎo)TrKA酪氨酸殘基磷酸化，通過激活磷脂酶Cγ(PLCγ)、磷脂酶肌醇激酶(PI3K)以及銜接蛋白(Shc)信號通路，調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中膽堿能神經(jīng)元的分化和發(fā)育(Counts S等，2005，請在說明書末尾注明完整的參考文獻信息)。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，NGF在大鼠、小鼠、金倉鼠、牛、綿羊、山羊、豬、猴子等物種卵巢中表達(Ren LQ等，2005)。NGF及其受體在卵泡生長發(fā)育、排卵、卵巢激素的合成、配子運輸、精子獲能、受精以及早期的胚胎等方面都有重要的生物學功能(瞿長偉等，2014)，NGF可以促進原始卵泡的組裝和腔前卵泡的形成(Dissen GA等，2001)，通過調(diào)控類固醇激素合成、PGF合成以及卵泡膜細胞增殖參與排卵過程(Dissen GA等，2011)。

通過以上分析，我們可以得出NGF基因參與動物繁殖調(diào)控過程，尤其是卵子發(fā)生和卵泡發(fā)育。尋找NGF基因中變異位點，通過與性狀間的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)基因與性狀之間的關(guān)系是研究基因功能的一個重要手段，也是進行標記輔助選擇的基礎(chǔ)。為此，本發(fā)明開展了綿羊NGF基因序列克隆和SNP篩查、檢測及與產(chǎn)羔數(shù)性狀關(guān)聯(lián)分析。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)的分子輔助選育標記，通過尋找NGF基因的SNP位點，篩選得到一種一種與綿羊產(chǎn)羔性狀相關(guān)的分子標記，以克服常規(guī)育種方法周期長、選擇準確性低、無法進行早期選育等技術(shù)缺陷，通過PCR-RFLP技術(shù)對候選個體的NGF基因進行基因型分析，為綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀檢測提供一種輔助選擇的分子標記。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下

申請人采集湖羊、小尾寒羊外周血液提取基因組DNA，設(shè)計了一種擴增上述基因片段(NGF)和用于檢測該基因片段的分子標記的引物對，該引物對DNA序列如下所示：

正向引物F：ACAGAGGGAAACACGAAT，

反向引物R：TAGATGAGGTGCCCAGAC。

申請人利用上述引物對克隆得到一種與綿羊產(chǎn)羔性狀相關(guān)的分子標記，它包含綿羊(品種涵蓋湖羊和小尾寒羊，但不限于這兩個品種)NGF基因的部分序列，其核苷酸序列如下所示：

一種檢測綿羊NGF基因單核苷酸多態(tài)性與產(chǎn)羔性狀相關(guān)的分子標記，其核苷酸序列如下所示：

ACAGAGGGAAACACGAATAAGCGCACACACACTGAGAAAAAGCCAGGGGGTACTGTGGACCCTCCTCCCTGCAGCCTCCGAACCAAGACTTGCAATTGTCACCCTGGGCCGAATGACTGGAGGGCCAGCACACAAGCTGCTTCCAAAAATTTAATAAATAATGATCTTTTAAAACTGTATAAACTATAAATTACCATGCAGTCCTTATAATTTAAAATAATTTACAGGTTGAGGTAGGGAGGGGCGCAGGAGAGTGTAGGGGGGAGCAAGGAAGGGTGGGGGCTGCTGCAGGTCAGGCTCTCCGCCCAGTCTTCCTGCTGAGCACACACACGCAGGCCGTGTCGATCCGGATGAACCGCCAGGCGGCCTGCTTGCCGTCCATGGTCAGCGCCTTGACGAAGGTGTGGGTCGTGGTACAATACGAGTTCCAGTGCTTCGCGTCGATGCCTCGGCACCCGCTGTCCACGGGGTTGGGGTCCCGGCACTTGGTCTCAAAAAAGTACTGTTTGAATACACTGTTGTTGATGTTCACCTCTCCCAGCACCATCACCTCCTTGCCCTTGATGTCCGTGGCGGTTGTCTTGTCCCCCACCCACACGCTGACGCTGTCGCACACCGAGAACTCCCCCCGGTGAAAGACGGGGTGGGATGACGACCGCTTGCTCCTGTGAGTCCTGTTGAAGGAGGCY[G/A]GCCCCGCCGGCCTCGAAGTCCAGATCCTGAGTGTCTGCGGCCACAGGTGGGGGCTGGGTGCTGAACAGCACGCGAGGTGAACGCAGTCGCCGCTTTTTAAAAAGTTTGGGGTCCACAGTGATGTTGTGGGTCTGCCCTGCCACCCTGGCGGCTATCGGCCCAGCCTGGGCGCTGTGGGCTCTGCGGAGGACTGTGTCAAGGTAATGCTGAAGTTTAATCCAGTGGGCTTGAGGGATGGCGTGTCCAGCTGGGACATTGCTCTCGGTGTGCGGTGCTGCCTGTATGCCGATCAAAAGAGCTGTGATCAGAGTGTAGAACAACATGGACATTACGCTATGCACCTGGAATGAAACAGAAATGAGGATTATTCCGCGGGGCGCTGAGCGTTGGATGAGGGTGGTTTCTGGGTACTTCGGAGTTGACCTTCCCAGAGGATGACAAGGAGGCTTCCCCTGGTGGCTAAGGGCAAGGTGACCCTGGAATTTCAAACTGGGACCCTTTTGAGAGTGAAAGGCGATGCTATGACTGTAACGCTAGGGTGACAGGCTTAAACAGGGCTGGCTCAGACAACCTGGTGTCTGGGCACCTCATCTA，

上述序列的689位堿基處的R是G或A，該突變導(dǎo)致RFLP-Sfi Ⅰ多態(tài)性。

在申請人提交的序列表SEQ ID NO：1中，其中第689堿基處的堿基是突變后的堿基A。

申請人設(shè)計了一種檢測權(quán)利要求1所述分子標記的PCR引物對，該引物對的序列如下所示：

正向引物F：ACAGAGGGAAACACGAAT，

反向引物R：TAGATGAGGTGCCCAGAC。

申請人提供了一種篩選與綿羊產(chǎn)羔性狀相關(guān)分子標記的方法，該方法包括以下步驟：

從綿羊外周血液全血中提取基因組DNA，在位于Gene Bank登陸號ID:101104540的綿羊NGF基因序列突變位點附近設(shè)計一對引物，該引物對的DNA序列如SEQ ID NO：2和3所述，對綿羊基因組DNA進行PCR擴增和序列測定，得到如SEQ ID NO：1所示的序列，通過序列比對，篩查SNP，再利用SEQ ID NO：2和3所述的引物對進行PCR擴增，將擴增獲得片段利用限制性內(nèi)切酶Sfi Ⅰ進行酶切分型及檢測。

本發(fā)明的引物對可以用于綿羊NGF基因多態(tài)性檢測和標記輔助選擇中。

本發(fā)明所述的分子標記可以用于綿羊產(chǎn)羔性狀標記輔助選擇中。

更詳細的技術(shù)方案見《具體實施方式》所述。

附圖說明

序列表SEQ ID NO：1是本發(fā)明制備的與綿羊產(chǎn)羔性狀相關(guān)的分子標記的核苷酸序列，序列長度為1283bp，在該序列表的689位堿基處存在一個等位基因突變(G>A)。

序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3是擴增NGF基因片段，篩選該基因SNP以及檢測綿羊產(chǎn)羔性狀分子標記的引物對正，反向引物的序列(也是實現(xiàn)綿羊G>A突變的PCR-Sfi Ⅰ-RFLP基因型分型方法的正、反向引物的引物對)。

圖1：綿羊NGF基因部分測序結(jié)果和SNP位點。

圖2：綿羊NGF基因PCR-Sfi Ⅰ-RFLP檢測結(jié)果。瓊脂糖濃度為1％，附圖標記說明：泳道M為DL2000DNA Marker(包含100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp共6中帶型)；AA基因型片段大小為1283bp，GG基因型片段大小分別為696bp和587bp；GA基因型片段大小分別為587bp、696bp和1283bp。

圖3：是本發(fā)明篩選的與綿羊產(chǎn)羔性狀相關(guān)的分子標記的核苷酸序列，該序列的689位堿基處的R是G或A，該突變導(dǎo)致RFLP-Sfi Ⅰ多態(tài)性。

具體實施方式

以下實施用于對本發(fā)明的進一步說明，但不理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的前提下，對本發(fā)明所做的修飾或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1

1、血樣采集

采集具有頭胎產(chǎn)羔記錄的綿羊(品種為湖羊和小尾寒羊)外周血液樣品，血樣采自甘肅省金昌中天羊業(yè)有限公司。

2、基因組DNA提取

具體步驟如下：

(1)取1mL采集的全血加入等體積的PBS緩沖液，溫和震蕩10min；

(2)4℃下12000g離心10min后，棄上清；

(3)重復(fù)步驟(1)和步驟(2)至上清液透明，沉淀變?yōu)榘咨?/p>

(4)加入700μL DNA抽提液(1M Tris-Cl(pH＝8.0)25mL、0.5M EDTA(pH＝8.0)100mL、10％SDS 50mL、2M NaCl 25mL，定容至500mL，按常規(guī)方法進行高壓滅菌)，懸浮沉淀物，并于37℃水浴1h；

(5)加入3μL蛋白酶K(20mg/mL)溶液，混勻，55℃水浴消化過夜，至細胞沉淀被全部消化；

(6)冷卻步驟(5)溶液至室溫，加入等體積的Tris飽和酚溶液，冰水浴并溫和搖動15min；

(7)4℃下，12000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一干凈離心管中；

(8)加入0.5倍體積的飽和酚溶液和0.5倍體積的氯仿，冰水浴并溫和搖動15min；

(9)4℃下12000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一干凈離心管中；

(10)加入等體積的氯仿，冰水浴并溫和震蕩15min；

(11)4℃下12000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一干凈離心管中；

(12)加入2倍體積的預(yù)冷無水乙醇(-20℃)，顛倒混勻多次至DNA沉淀析出，然后-20℃下靜置30min；

(13)4℃下12000g離心10min，棄上清；

(14)加入1mL 70％的乙醇，溫和震蕩10min；

(15)4℃下12000g離心10min，棄上清；

(16)重復(fù)步驟(14)和(15)一次；

(17)待乙醇揮發(fā)干凈后加入200μL超純水溶解DNA，測定溶度后于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

3、引物設(shè)計

根據(jù)綿羊NGF基因(Gene Bank登陸號：ID:101104540)突變位點附近序列，利用Oligo7設(shè)計一對特異性引物。其引物DNA序列如下所示：

正向引物F：ACAGAGGGAAACACGAAT；

反向引物R：TAGATGAGGTGCCCAGAC。

4、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

采用PCR方法，以湖羊和小尾寒羊的基因組DNA為模板，PCR擴增目的片段。PCR擴增反應(yīng)總體系為25μL：其中DNA模板(50ng/μL)1μL，2×Easy Taq PCR Super MIX 12.5μL(TranGen)，上述制備的正向引物和反向引物各0.4μL(10μM)，ddH₂O補足至25μL。PCR擴增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸60s，共34個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。

對擴增得到PCR產(chǎn)物利用1％瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。對長度為1283bp的PCR產(chǎn)物進行序列測定，得到如SEQ ID NO：1所述的DNA片段。將不同綿羊個體的PCR產(chǎn)物混合測序，其測序峰圖部分結(jié)果見圖1。位于該片段(序列)的689位堿基處的G>A突變引起了Sfi Ⅰ酶切位點(即：[G/A]GCCNNNN↓NGGCC)多態(tài)性。

5、限制性酶切片段的多態(tài)性(RFLP)檢測

采用常規(guī)Sfi Ⅰ-RFLP方法對綿羊NGF基因SNP位點進行基因分型，酶切反應(yīng)體系為10μL：其中PCR產(chǎn)物為4μL，限制性內(nèi)切酶(Sfi Ⅰ)為0.5μL，10×buffer 1μL，ddH₂O 4.5μL，樣品混勻后離心，37℃孵育60min。

取5μL酶切產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳，之后進行基因分型和鑒定，結(jié)果如圖2所示。此擴增片段大小為1283bp，該酶切多態(tài)位點位于該片段的696堿基位處，當該變異位點為G堿基時，會產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶Sfi Ⅰ的酶切位點(即：GGCCNNNN↓NGGCC)，Sfi Ⅰ酶切PCR產(chǎn)物后會產(chǎn)生2個大小分別為587bp和696bp的條帶，其基因型鑒定為GG型；當該位點為A堿基時，則不能產(chǎn)生Sfi Ⅰ的限制酶酶切位點，Sfi Ⅰ酶切PCR產(chǎn)物后仍為一條1283bp的條帶，其基因型鑒定為AA型；當該位點出現(xiàn)為G/A雜合型時，由于同時存在G和A堿基，則Sfi Ⅰ酶切PCR產(chǎn)物后產(chǎn)生3條大小分別為1283bp、587bp和696bp的條帶，其基因型鑒定為GA型。

6、綿羊NGF基因產(chǎn)羔數(shù)性狀關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用

本試驗共檢測了943只綿羊，包括500只湖羊和443只小尾寒羊的多態(tài)性，確定其基因型后，進行基因型與產(chǎn)羔數(shù)性狀之間的關(guān)聯(lián)性分析。利用SPSS 19.0軟件中的廣義線性模型(General Linear Model，GLM)程序，并采用方差分析的最小二乘分析法進行分析。具體的線性模型如下所述：

Yijk＝μ+Genotypei+Breedj+Combinationk+εijkl

其中，Yijkl是性狀觀察值；μ為總體均數(shù)；Genotypei為基因型效應(yīng)；Breedj為品種效應(yīng)；Combinationk為組合的效應(yīng)；εijkl為隨機誤差；假定εijk相互獨立，服從N(0，σ2)分布。

基因型檢測結(jié)果表明在943只綿羊個體中GG基因型有666只(其中湖羊340只，小尾寒羊326只)，GA型有260只(其中湖羊150只，小尾寒羊110只)，AA基因型有17只(其中湖羊10只，小尾寒羊7只)?；蛐团c產(chǎn)羔數(shù)性狀分析結(jié)果見表1。

表1 NGF基因不同基因型與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性

注：具有相同字母肩標的平均值間差異不顯著(P>0.05)，具有不同字母肩標的平均值間差異顯著(P<0.05)。

綿羊NGF基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)性狀顯著相關(guān)(p<0.05)，其中GG基因型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AA基因型(2.11±0.03v.s 1.53±0.22)，GA基因型產(chǎn)羔數(shù)居中(1.88±0.060)。

主要參考文獻：

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