本申請是以下申請的分案申請：申請日：2007年5月24日；申請?zhí)枺?00780027839.2(pct/us2007/012363)；發(fā)明名稱：同上。相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2006年5月25日申請的美國臨時申請順序號60/808,430的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益。序列表的引用序列表存放在文件名為“pa_53517.txt”的文件中，該文件具有65,000字節(jié)(按ms-windows統(tǒng)計)，創(chuàng)建于2007年5月22日，存放在與本文一起提交的計算機可讀形式的磁盤中并通過引用結(jié)合到本文中。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及植物育種和抗病性領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及含有與抗病性有關(guān)的數(shù)量性狀基因座的大豆屬(glycine)植物的篩選方法和抗病大豆屬植物的育種方法。植物病害可由真菌、病毒、細菌或無脊椎動物引起。本發(fā)明還涉及在真菌病原體豆薯層銹菌(phakopsorapachyrhizi)抗性育種程序中將含有賦予抗病性的數(shù)量性狀基因座(qtl)的保藏(accession)種質(zhì)漸滲入優(yōu)良種質(zhì)中的用途。發(fā)明背景栽培大豆(glycinemax(l.)merril)，是一種全球種植的作為植物油和植物蛋白主要來源的重要經(jīng)濟作物(sinclair和backman，compendiumofsoybeandiseases(大豆病害概要),第三版，apspress,st.paul,mn,第106頁，(1989))。對低膽固醇和高纖維飲食不斷增長的需求也增加了大豆作為健康食品的重要性。在美國，每年由于病害使得大豆產(chǎn)量減少。提高每公頃的產(chǎn)量對于農(nóng)民的利潤率十分重要，尤其在大豆價格低迷的時期。對于農(nóng)村經(jīng)濟和城區(qū)關(guān)聯(lián)產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟，大豆病害引起的財務(wù)損失都非常大。這些損失的影響最終都將在全球大豆市場上反映出來。在美國和加拿大安大略省，估計由病害引起的損失每年都不相同，并且因病害不同而不同。自1999年到2002年，在美國估計大豆產(chǎn)量損失的范圍在800萬公噸至1000萬公噸，在安大略省為90,000-166,000公噸(wrather等，在線，planthealthprogressdoi:10:1094/php-2003-0325-01-rv)。在東半球和西半球均有亞洲大豆銹病(asiansoybeanrust，本文稱為asr)的報道。在東半球，已經(jīng)報道了asr的有澳大利亞、中國、印度、日本、臺灣地區(qū)和泰國。在西半球，已經(jīng)觀察到asr的有巴西、哥倫比亞、哥斯達黎加和波多黎各。asr可以是破壞性病害，據(jù)臺灣報道在某些田間引起的產(chǎn)量損失高達70-80％。被嚴重感染的植物品質(zhì)較差，豆莢較少，種子較小(frederick等，mycology92:217-227(2002))。1994年首次在美國夏威夷發(fā)現(xiàn)asr。asr稍后在2004年夏季傳到美國內(nèi)陸，據(jù)推測是熱帶風(fēng)暴活動的結(jié)果。模型預(yù)測法表明，asr已廣泛擴散到整個美國東南部，田間和實驗室隨后的觀察結(jié)果證實了這種分布狀況。兩種真菌——豆薯層銹菌(phakopsorapachyrhizisydow)和山水蛭層銹菌(phakopsorameibomiae(arthur)arthur)引起asr。與其它銹病不同，豆薯層銹菌(p.pachyrhizi)和山水蛭層銹菌(p.meibomiae)感染植物品種的范圍極其廣泛。已知豆薯層銹菌自然感染豆科植物17個屬中的31個種，在控制條件下感染其余26個屬中的60個種。山水蛭層銹菌自然感染豆科植物19個屬中的42個種，并已人工感染了其余12個屬中的額外18個種。19個屬中的24個植物品種是這兩個菌種的宿主(frederick等，mycology92:217-227(2002)))。已經(jīng)鑒定出大豆植物的asr抗性。已分別在pi200492、pi230970、pi462312(ankur)和pi459025b中鑒定出4個抗豆薯層銹菌的獨立遺傳的顯性小種?；痲tl，本文稱為asr抗性基因座1(asrresistancelocus1)、asr抗性基因座2、asr抗性基因座3和asr抗性基因座4。這些品系以及其余7個品系疑似含有asr抗性的qtl。在臺灣亞洲蔬菜研究開發(fā)中心(asianvegetableresearchanddevelopmentcenter)，pi239871a和pi239871b(野生大豆(g.soja))、pi230971和pi459024b和栽培種taitakaohsiung-5、tainung-4和wayne已被用作區(qū)別種(differentials)鑒定出9個小種。最重要的小種與3個以上區(qū)別種相容，這就表明一些小種已經(jīng)對已知和疑似抗性基因具有多個毒力因子。澳大利亞野生大豆中也產(chǎn)生了抗性。還證實了減速抗性(rate-reducingresistance)。然而，難以對這一抗性類型進行評價，因為銹病發(fā)展的速度依賴于大豆發(fā)育和成熟(sinclair等主編，soybeanrustworkshop.collegeofagricultural,consumer,andenvironmentalsciences.natl.soybeanres.lab.publ.1(1996))。評價可能含有賦予asr抗性的qtl的植物可能是耗時的，并且需要大量具備生物防范作用的空間。培養(yǎng)豆薯層銹菌需要使用經(jīng)批準的生物防范操作臺(biologicalcontainmenthood)。此外，栽培用于asr抗性試驗的植物的溫室和生長室必須按防止意外釋放出生物的方式建造，尤其是在尚未觀察到所述生物的地區(qū)。不同的豆薯層銹菌培養(yǎng)物可具有不同的毒力因子。隨著時間推移，新的豆薯層銹菌菌株有可能傳入美國。因此，設(shè)計培育大豆抗asr抗性的任何育種程序都必需能夠快速應(yīng)對豆薯層銹菌種群的變化。同樣，用在其它地理位置的大豆作物育種除提供該區(qū)域農(nóng)民喜歡的農(nóng)藝性狀以外，還需要選擇影響該區(qū)域的特定菌株的抗性。因此，非常需要用于篩選抗asr種質(zhì)的快速、省時和有成本效益的高通量方法。這種方法不僅必須提供速度和效率，而且還必須能夠用最少的空地量進行，便于在同一時間篩選多個樣品。本發(fā)明提供用于包含抗病性qtl的大豆植物的篩選和選擇方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種用于測定大豆植物對病害的抗性、免疫性或易感性的方法，該方法包括：(a)由大豆植物中剝離出植物組織；(b)將所述組織在培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；(c)將所述組織暴露在植物病原體中；和(d)對所述組織由該病原體所引起的病害的抗性、免疫性或易感性進行評價。此外，可通過以下步驟評價植物對病原體的反應(yīng)：(e)從所述植物中分離出核酸(dna和/或rna)；(f)測定所述核酸(dna、rna和/或cdna)存在的與所述抗性、免疫性或易感性相關(guān)的數(shù)量性狀基因座的一個或多個分子標記；和(g)選出所述植物用于育種程序。植物對特定病原體的抗性、免疫性或易感性的測定法對本領(lǐng)域任何技術(shù)人員而言是顯而易見的。植物組織可以是葉、維管組織、花、豆莢、根、莖、種子或它們的組成部分，或者是由組織分離出來的細胞。將所述組織暴露在植物病原體中可通過選自以下的方法來完成：(a)將病原體直接用到組織中；(b)培養(yǎng)基中含有病原體；和(c)包含將被病原體有效污染的物質(zhì)接種到組織中。植物病原體可以是真菌、病毒、細菌或無脊椎動物。植物病原體暴露可以病原體大分子、細胞、組織、整個生物或其組合的形式，其中病原體及其組成部分或是有生命的或是死的，只要該材料在宿主組織中介導(dǎo)免疫應(yīng)答。本發(fā)明的相關(guān)病原體大分子包括但不限于毒素、細胞壁、細胞膜、抗原和多糖。本發(fā)明還包括賦予針對真菌病原體的抗病性的qtl，所述真菌病原體選自豆薯層銹菌(phakopsorapachyrhizi)、山水蛭層銹菌(phakopsorameibomiae)(亞洲大豆銹病)、平頭刺盤孢(colletotrichumtruncatum)、束狀刺盤孢平頭變種(colletotrichumdematiumvar.truncatum)、大豆小叢殼(glomerellaglycines)(大豆炭疽病)、大豆疫霉菌(phytophthorasojae)(疫霉根莖腐病)、核盤菌(sclerotiniasclerotiorum)(核盤菌莖腐病)、大豆腐皮鐮孢(fusariumsolanif.sp.glycines)(猝死綜合征)、鐮孢(fusariumspp.)(鐮孢根腐病)、菜豆殼球孢(macrophominaphaseolina)(炭腐病)、大豆殼針孢(septoriaglycines)(褐斑病)、瓜果腐霉(pythiumaphanidermatum)、德巴利腐霉(pythiumdebaryanum)、畸雌腐霉(pythiumirregulare)、終極腐霉(pythiumultimum)、群結(jié)腐霉(pythiummyriotylum)、簇囊腐霉(pythiumtorulosum)(腐霉種子腐病)、菜豆間座殼大豆變種(diaporthephaseolorumvar.sojae)(豆莢枯病)、phomopsislongicola(莖枯病)、擬莖點霉(phomopsisspp.)(擬莖點霉種子腐病)、東北霜霉(peronosporamanshurica)(霜霉病)、立枯絲核菌(rhizoctoniasolani)(絲核菌根莖腐病，絲核菌地上部分枯萎病)、大豆莖褐腐病菌(phialophoragregata)(莖褐腐病)、大豆北方莖潰瘍病菌(diaporthephaseolorumvar.caulivora)(莖潰瘍病(stemcanker))、菊池尾孢(cercosporakikuchii)(種子紫斑病(purpleseedstain))、鏈格孢(alternariasp.)(黑斑病(targetspot))、大豆尾孢(cercosporasojina)(蛙眼病(frogeyeleafspot))、齊整小核菌(sclerotiumrolfsii)(白絹病)、arkoolanigra(黑色葉斑病)、根串珠霉(thielaviopsisbasicola)(黑色根腐病)、漏斗笄霉(choanephorainfundibulifera)、三孢笄霉(choanephoratrispora)(笄霉葉枯病)、三葉草小光殼(leptosphaerulinatrifolii)(小光殼葉斑病)、mycoleptodiscusterrestris(mycoleptodiscus根腐病)、侵菅新赤殼(neocosmosporavasinfecta)(新赤殼莖腐病)、大豆生葉點霉(phyllostictasojicola)(葉點霉葉斑病)、大豆棘殼孢(pyrenochaetaglycines)(棘殼孢葉斑病)、cylindrocladiumcrotalariae(紅色頸腐病(redcrownrot))、dactuliochaetaglycines(紅色葉斑枯病)、大豆痂圓孢(spacelomaglycines)(瘡痂病)、匍柄霉(stemphyliumbotryosum)(匍柄霉葉枯病)、山扁豆生棒孢(corynesporacassiicola)(黑斑病)、榛針孢酵母(nematosporacoryli)(酵母斑點病(yeastspot))和多主瘤梗孢(phymatotrichumomnivorum)(棉根腐病)。本發(fā)明還包括賦予針對病毒病原體的抗病性的qtl，所述病毒病原體選自苜?；ㄈ~病毒屬(alfamovirus)(苜?；ㄈ~病毒(alfafamosaicvirus，amv))、豇豆花葉病毒屬(comovirus)(菜豆莢斑駁病毒(beanpodmottlevirus，bpmv))、馬鈴薯y病毒屬(potyvirus)(菜豆黃色花葉病毒(beanyellowmosaicvirus，bymv))、雀麥花葉病毒屬(bromovirus)(豇豆褪綠斑駁病毒(cowpeachloroticmottlevirus，ccmv))、菜豆金色花葉病毒屬(begomovirus)(綠豆黃色花葉病毒(mungbeanyellowmosaicvirus，mymv))、馬鈴薯y病毒屬(花生斑駁病毒(peanutmottlevirus，pemov))、馬鈴薯y病毒屬(花生條紋病毒(peanutstripevirus，pstv))、黃瓜花葉病毒屬(cucumovirus)(花生矮化病毒((peanutstuntvirus，psv))、花椰菜花葉病毒屬(caulimovirus)(大豆褪綠斑駁病毒(soybeanchloroticmottlevirus，sbcmv))、菜豆金色花葉病毒屬(大豆皺葉病毒(soybeancrinkleleafvirus，sclv))、黃矮病毒屬(luteovirus)(大豆矮縮病毒(soybeandwarfvirus，sbdv))、馬鈴薯y病毒屬(大豆花葉病毒(soybeanmosaicvirus，smv))、線蟲傳多面體病毒屬(nepovirus)(大豆極度矮化病毒(soybeanseverestuntvirus，sssv))和線蟲傳多面體病毒屬(煙草環(huán)斑病毒(tobaccoringspotvirus，trsv))。本發(fā)明還包括賦予針對細菌病原體的抗病性的qtl，所述細菌病原體選自枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)(芽孢桿菌種子腐病)、薩氏假單胞菌大豆致病變種(pseudomonassavastonoipv.glycinea)(細菌疫病)、丁香假單胞菌丁香亞種(pseudomonassyringaesubsp.syringae)(細菌皺葉病)、地毯草黃單胞菌大豆致病變種(xanthomonasaxonopodispv.glycines)(細菌斑疹病)、萎蔫短小桿菌萎蔫致病變種(curtobacteriumflaccumfacienspv.flaccumfaciens)(細菌褐斑病)、萎蔫短小桿菌萎蔫致病變種(curtobacteriumflaccumfacienspv.flaccumfaciens)、茄科羅爾斯通氏菌(ralstoniasolanacearum)(桑青枯病)和丁香假單胞菌煙草致病變種(pseudomonassyringaepv.tabaci)(野火病)。本發(fā)明還包括賦予針對無脊椎動物病原體的抗病性的qtl，所述無脊椎動物病原體選自大豆蚜(aphisglycines)、大豆胞囊線蟲(heteroderaglycines)、花生根結(jié)線蟲(meloidogynearenari)、北方根結(jié)線蟲(meloidogynehapla)、南方根結(jié)線蟲(meloidogyneincognita)、爪哇根結(jié)線蟲(meloidogynejavanica)(根結(jié)線蟲)、哥倫比亞紐帶線蟲(hoplolaimuscolumbus)、帽狀紐帶線蟲(hoplolaimusgaleatus)、大針紐帶線蟲(hoplolaimusmagnistylus)(紐帶線蟲(lancenematode))、短體線蟲(pratylenchusspp.)(根斑線蟲(lesionnematode))、突出針線蟲(paratylenchusprojectus)、細尾針線蟲(paratylenchustenuicaudatus)(針線蟲)、腎形小盤旋線蟲(rotylenchulusreniformis)(腎形線蟲(reniformnematode))、裝飾小環(huán)線蟲(criconemellaornata)(環(huán)線蟲)、鞘線蟲(hemicycliophoraspp.)(鞘線蟲(sheathnematode))、螺旋線蟲(heliocotylenchusspp.)(螺旋線蟲(spiralnematode))、細小刺線蟲(belonolainusgracilis)、長尾刺線蟲(belonolainuslongicaudatus)(刺線蟲(stingnematode))、五溝線蟲(quinisulciusacutus)、矮化線蟲(tylenchorhynchusspp.)(矮化線蟲(stuntnematode))和短小擬毛刺線蟲(paratrichodorusminor)(毛刺線蟲(stubbyrootnematode))。本發(fā)明還提供篩選出來的對以下病原體有抗性的大豆組織和植物：豆薯層銹菌、山水蛭層銹菌(亞洲大豆銹病)、平頭刺盤孢、束狀刺盤孢平頭變種、大豆小叢殼(大豆炭疽病)、大豆疫霉菌(疫霉根莖腐病)、核盤菌(核盤菌莖腐病)、大豆腐皮鐮孢(猝死綜合征)、鐮孢(鐮孢根腐病)、菜豆殼球孢(炭腐病)、大豆殼針孢、(褐斑病)、瓜果腐霉、德巴利腐霉、畸雌腐霉、終極腐霉、群結(jié)腐霉、簇囊腐霉(腐霉種子腐病)、菜豆間座殼大豆變種(豆莢枯病)、phomopsislongicola(莖枯病)、擬莖點霉(擬莖點霉種子腐病)、東北霜霉(霜霉病)、立枯絲核菌(絲核菌根莖腐病，絲核菌地上部分枯萎病)、大豆莖褐腐病菌(莖褐腐病)、大豆北方莖潰瘍病菌(莖潰瘍病)、菊池尾孢(種子紫斑病)、鏈格孢(黑斑病)、大豆尾孢(蛙眼病)、齊整小核菌(白絹病)、arkoolanigra(黑色葉斑病)、根串珠霉、(黑色根腐病)、漏斗笄霉、三孢笄霉(笄霉葉枯病)、三葉草小光殼(小光殼葉斑病)、mycoleptodiscusterrestris(mycoleptodiscus根腐病)、侵菅新赤殼(新赤殼莖腐病)、大豆生葉點霉(葉點霉葉斑病)、大豆棘殼孢(棘殼孢葉斑病)、cylindrocladiumcrotalariae(紅色頸腐病)、dactuliochaetaglycines(紅色葉斑枯病)、大豆痂圓孢(瘡痂病)、匍柄霉(匍柄霉葉枯病)、山扁豆生棒孢(黑斑病)、榛針孢酵母(酵母斑點病)、多主瘤梗孢(棉根腐病)、苜?；ㄈ~病毒屬(苜蓿花葉病毒，amv)、豇豆花葉病毒屬(菜豆莢斑駁病毒，bpmv)、馬鈴薯y病毒屬(菜豆黃色花葉病毒，bymv)、雀麥花葉病毒屬(豇豆褪綠斑駁病毒，ccmv)、菜豆金色花葉病毒屬(綠豆黃色花葉病毒，mymv)、馬鈴薯y病毒屬(花生斑駁病毒，pemov)、馬鈴薯y病毒屬(花生條紋病毒，pstv)、黃瓜花葉病毒屬(花生矮化病毒，psv)、花椰菜花葉病毒屬(大豆褪綠斑駁病毒，sbcmv)、菜豆金色花葉病毒屬(大豆皺葉病毒，sclv)、黃矮病毒屬(大豆矮縮病毒，sbdv)、馬鈴薯y病毒屬(大豆花葉病毒，smv)、線蟲傳多面體病毒屬(大豆極度矮化病毒，sssv)、線蟲傳多面體病毒屬(煙草環(huán)斑病毒，trsv)、枯草芽孢桿菌(芽孢桿菌種子腐病)、薩氏假單胞菌大豆致病變種(細菌疫病)、丁香假單胞菌丁香亞種(細菌皺葉病)、地毯草黃單胞菌大豆致病變種(細菌斑疹病)、萎蔫短小桿菌萎蔫致病變種(細菌褐斑病)、萎蔫短小桿菌萎蔫致病變種、茄科羅爾斯通氏菌(桑青枯病)、丁香假單胞菌煙草致病變種(野火病)、大豆蚜、大豆胞囊線蟲、花生根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲(根結(jié)線蟲)、哥倫比亞紐帶線蟲、帽狀紐帶線蟲、大針紐帶線蟲(紐帶線蟲)、短體線蟲(根斑線蟲)、突出針線蟲、細尾針線蟲(針線蟲)、腎形小盤旋線蟲(腎形線蟲)、裝飾小環(huán)線蟲(環(huán)線蟲)、鞘線蟲、螺旋線蟲、細小刺線蟲、長尾刺線蟲(刺線蟲)、五溝線蟲、矮化線蟲或短小擬毛刺線蟲(毛刺線蟲)。本發(fā)明還提供選自大豆屬成員的精選植物，更尤其選自glycinearenaria、glycineargyrea、glycinecanescens、澎湖大豆(glycineclandestine)、glycinecurvata、glycinecyrtoloba、glycinefalcate、glycinelatifolia、glycinelatrobeana、栽培大豆(glycinemax)、glycinemicrophylla、glycinepescadrensis、glycinepindanica、glycinerubiginosa、野生大豆(glycinesoja)、大豆(glycinesp.)、glycinestenophita、煙豆(glycinetabacina)和短絨野大豆(glycinetomentella)。本發(fā)明還提供用于選擇方法的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中含有未處理水、蒸餾水或去離子水。培養(yǎng)基可含有維持病原體或植物組織的任何必需成分，只要該成分不干擾qtl所賦予的抗性的表達。本發(fā)明還提供采用所述方法選出的大豆植物。本發(fā)明還提供選自以下基因座的qtl：疫霉(根腐病)感染耐受性基因座、大豆腐皮鐮孢(猝死綜合征)抗性基因座、大豆尾孢(蛙眼病)抗性基因座、大豆莖褐腐病菌(phialophoragegata)(莖褐腐病)抗性基因座、核盤菌(莖腐病)抗性基因座、asr抗性基因座1、asr抗性基因座2、asr抗性基因座3、asr抗性基因座4、asr抗性基因座5、asr抗性基因座6、asr抗性基因座7、asr抗性基因座8、asr抗性基因座9、asr抗性基因座10、asr抗性基因座11、asr抗性基因座12和asr抗性基因座13。本發(fā)明還提供篩選出來的含有一個或多個真菌病抗性qtl的植物，其中包括asr抗性基因座1、asr抗性基因座2、asr抗性基因座3、asr抗性基因座4、asr抗性基因座5、asr抗性基因座6、asr抗性基因座7、asr抗性基因座8、asr抗性基因座9、asr抗性基因座10、asr抗性基因座11、asr抗性基因座12和asr抗性基因座13。本發(fā)明還提供用于asr抗性基因座1的一個或多個單核苷酸多態(tài)性(snp)標記基因座，其中所述snp標記選自ns0093250、ns0119710、ns0103004、ns0099454、ns0102630、ns0102915、ns0102913、ns0123728、ns0129943、ns0102168、ns0092723、ns0098177、ns0127343和ns0101121。還提供了用于asr抗性基因座3的一個或多個snp標記基因座，其中所述snp標記選自ns0099746、ns0123747、ns0126598、ns0128378、ns0096829、ns0125408、ns0098902、ns0099529、ns0097798、ns0137477、ns0095322、ns0136101和ns0098982。本發(fā)明提供用于asr抗性基因座5、asr抗性基因座6、asr抗性基因座7、asr抗性基因座8和asr抗性基因座9的示例性的snp標記基因座ns0103033。本發(fā)明提供用于asr抗性基因座10、asr抗性基因座11、asr抗性基因座12和asr抗性基因座13的另一個示例性snp標記基因座ns0124935。此外，作圖在距所述標記分子10厘摩以內(nèi)的一個或多個標記可用于asr抗性基因座的選擇和漸滲。本發(fā)明還提供用于大豆asr抗性選擇和漸滲的方法，該方法包括：(a)從大量大豆植物中分離出核酸；(b)檢測所述分離的核酸中存在的與asr抗性基因座1-13有關(guān)的一個或多個標記分子(其中所述標記分子選自seqidno:67-99)，以及作圖在距所述標記分子10厘摩以內(nèi)的任何一種標記分子；和(c)選出包含所述一個或多個標記分子的大豆植物，從而選出asr抗性大豆植物。本發(fā)明還提供采用所述方法篩選出來的大豆植物。發(fā)明詳述本發(fā)明提供大豆植物對真菌病的抗性、免疫性或易感性的篩選方法。在一個優(yōu)選的實施方案中，植物選自大豆屬。野生多年生大豆屬于大豆亞屬(subgenusglycine)，具有廣泛的遺傳多樣性。栽培大豆(glycinemax(l.)merr.)及其野生一年生祖先(野生大豆(glycinesoja(sieb.和zucc.)))屬于黃豆亞屬(subgenussoja)，含有2n＝40條染色體，是雜交親和的，通常生長成茁壯可育的f1雜種，攜帶相似的基因組。栽培大豆品種和野生多年生大豆品種之間可進行雜交，雜交是否成功在各保藏品種之間有所不同。研究表明，若干野生多年生大豆保藏品種具有褐斑病、大豆銹病、根腐病、黃色花葉病毒和白粉病抗性。在全球的保藏種質(zhì)中，有100,000多個栽培大豆保藏品種，大概不到10,000個野生大豆保藏品種，大約3500個多年生大豆保藏品種。尚不知確切數(shù)目。主要的大豆保藏物保存在澳大利亞、巴西、中國、德國、印度、印尼、日本、俄羅斯、南韓和美國。許多其它較少但重要的保藏物遍及亞洲和歐洲。不知道在保藏物中有多少許多保藏品種是重復(fù)的。美國農(nóng)業(yè)部大豆種質(zhì)保藏中心(usdasoybeangermplasmcollection)是亞洲以外最大的保藏中心(verma等，主編，soybean:genetics,molecularbiologyandbiotechnology(1996))。目前保藏了20,765個品種，由19個品種保藏物組成，包括18,680個栽培大豆保藏品種和1,166個野生大豆及多年生大豆保藏品種。在一個優(yōu)選的實施方案中，對大豆植物對病害的抗性、免疫性或易感性進行了測定，包括：(a)由大豆植物分離出植物組織；(b)將所述組織在培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；(c)將所述組織暴露在植物病原體中；和(d)評價所述組織對該病原體所引起的病害的抗性、免疫性或易感性。此外，可通過以下步驟評價植物對病原體的反應(yīng)：(e)從所述植物中分離出核酸；(f)測定所述核酸存在的與所述抗性、免疫性或易感性相關(guān)的數(shù)量性狀基因座的一個或多個分子標記；和(g)選出用于育種程序的所述植物。植物對特定病原體的抗性、免疫性或易感性的測定法對本領(lǐng)域任何技術(shù)人員而言是顯而易見的。植物組織可以是葉、維管組織、花、豆莢、根、莖、種子或它們的組成部分，或者是由組織分離出來的細胞。將所述組織暴露在植物病原體中可通過選自以下的方法來完成：(a)將病原體直接用到組織中；(b)培養(yǎng)基中含有病原體；和(c)將包含被病原體有效污染的物質(zhì)接種到組織中。植物病原體可以是真菌、病毒、細菌或無脊椎動物。植物病原體暴露可以是病原體大分子、細胞、組織、整個生物或其組合的形式，其中病原體及其組成部分或是有生命的或是死的，只要該材料在宿主組織中介導(dǎo)免疫應(yīng)答。本發(fā)明的相關(guān)病原體大分子包括但不限于毒素、細胞壁、細胞膜、抗原和多糖。在一個優(yōu)選的實施方案中，葉組織可包含子葉、具一小葉的葉片、具三葉的葉片和先出葉。大豆葉有四種類型：1)第一對單片子葉(simplecotyledons或seedleaves)，2)第二對單片初生葉，亦稱具一小葉的葉片，3)具三葉的營養(yǎng)葉，和4)先出葉，這是類似葉的植物部分。具一小葉的葉片生長在子葉以上的第一節(jié)上。其它所有葉都是具三葉的葉片，其中在具一小葉的葉片之后萌發(fā)的第一對便是第一具三葉的葉片，其后則萌發(fā)第二具三葉的葉片，然后是第三具三葉的葉片(h.r.boerma和j.e.specht(主編.)soybeanmonograph,第三版,am.soc.agron.,madison,wi(2004))。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明能夠測定大豆植物對真菌病的抗性、免疫性或易感性。由真菌引起的大豆病害包括但不限于豆薯層銹菌、山水蛭層銹菌(亞洲大豆銹病)、平頭刺盤孢、束狀刺盤孢平頭變種、大豆小叢殼(大豆炭疽病)、大豆疫霉菌(疫霉根莖腐病)、核盤菌(核盤菌莖腐病)、大豆腐皮鐮孢(猝死綜合征)、鐮孢(鐮孢根腐病)、菜豆殼球孢(炭腐病)、大豆殼針孢(褐斑病)、瓜果腐霉、德巴利腐霉、畸雌腐霉、終極腐霉、群結(jié)腐霉、簇囊腐霉(腐霉種子腐病)、菜豆間座殼大豆變種(豆莢枯病)、phomopsislongicola(莖枯病)、擬莖點霉(擬莖點霉種子腐病)、東北霜霉(霜霉病)、立枯絲核菌(絲核菌根莖腐病，絲核菌地上部分枯萎病)、大豆莖褐腐病菌(莖褐腐病)、大豆北方莖潰瘍病菌(莖潰瘍病)、菊池尾孢(種子紫斑病)、鏈格孢(黑斑病)、大豆尾孢(蛙眼病)、齊整小核菌(白絹病)、arkoolanigra(黑色葉斑病)、根串珠霉、(黑色根腐病)、漏斗笄霉、三孢笄霉(笄霉葉枯病)、三葉草小光殼(小光殼葉斑病)、mycoleptodiscusterrestris(mycoleptodiscus根腐病)、侵菅新赤殼(新赤殼莖腐病)、大豆生葉點霉(葉點霉葉斑病)、大豆棘殼孢(棘殼孢葉斑病)、cylindrocladiumcrotalariae(紅色頸腐病)、dactuliochaetaglycines(紅色葉斑枯病)、大豆痂圓孢(瘡痂病)、匍柄霉(匍柄霉葉枯病)、山扁豆生棒孢(黑斑病)、榛針孢酵母(酵母斑點病)和多主瘤梗孢(棉根腐病)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明能夠測定大豆植物對病毒病的抗性、免疫性或易感性。病毒引起的大豆病害包括但不限于苜?；ㄈ~病毒屬(苜?；ㄈ~病毒，amv)、豇豆花葉病毒屬(菜豆莢斑駁病毒，bpmv)、馬鈴薯y病毒屬(菜豆黃色花葉病毒，bymv)、雀麥花葉病毒屬(豇豆褪綠斑駁病毒，ccmv)、菜豆金色花葉病毒屬(綠豆黃色花葉病毒，mymv)、馬鈴薯y病毒屬(花生斑駁病毒，pemov)、馬鈴薯y病毒屬(花生條紋病毒，pstv)、黃瓜花葉病毒屬(花生矮化病毒，psv)、花椰菜花葉病毒屬(大豆褪綠斑駁病毒，sbcmv)、菜豆金色花葉病毒屬(大豆皺葉病毒，sclv)、黃矮病毒屬(大豆矮縮病毒，sbdv)、馬鈴薯y病毒屬(大豆花葉病毒，smv)、線蟲傳多面體病毒屬(大豆極度矮化病毒，sssv)和線蟲傳多面體病毒屬(煙草環(huán)斑病毒，trsv)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明能夠測定大豆植物對細菌病的抗性、免疫性或易感性。由細菌引起的大豆病害包括但不限于枯草芽孢桿菌(芽孢桿菌種子腐病)、薩氏假單胞菌大豆致病變種(細菌疫病)、丁香假單胞菌丁香亞種(細菌皺葉病)、地毯草黃單胞菌大豆致病變種(細菌斑疹病)、萎蔫短小桿菌萎蔫致病變種(細菌褐斑病)、萎蔫短小桿菌萎蔫致病變種、茄科羅爾斯通氏菌(桑青枯病)和丁香假單胞菌煙草致病變種(野火病)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明能夠測定大豆植物對有害動物病害的抗性、免疫性或易感性。由有害動物引起的大豆病害包括但不限于大豆蚜、大豆胞囊線蟲、花生根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲(根結(jié)線蟲)、哥倫比亞紐帶線蟲、帽狀紐帶線蟲、大針紐帶線蟲(紐帶線蟲)、短體線蟲(根斑線蟲)、突出針線蟲、細尾針線蟲(針線蟲)、腎形小盤旋線蟲(腎形線蟲)、裝飾小環(huán)線蟲(環(huán)線蟲)、鞘線蟲、螺旋線蟲、細小刺線蟲、長尾刺線蟲(刺線蟲)、五溝線蟲、矮化線蟲和短小擬毛刺線蟲(毛刺線蟲)。本發(fā)明還提供大豆抗病性的qtl的選擇和漸滲的方法，該方法包括：(a)從大量大豆植物中分離出核酸；(b)檢測所述分離的核酸中存在的與抗病性qtl有關(guān)的一個或多個標記分子；和(c)選出包含所述一個或多個標記分子的大豆植物，從而選出抗病大豆植物。可將本發(fā)明的抗病性qtl導(dǎo)入優(yōu)良的大豆品系?！皟?yōu)良系”是由優(yōu)良農(nóng)藝性能育種和選擇所產(chǎn)生的任何品系。優(yōu)良系的實例是農(nóng)民或大豆育種人員可從商業(yè)途徑獲得的品系，例如hartztm變種h4994、hartztm變種h5218、hartztm變種h5350、hartztm變種h5545、hartztm變種h5050、hartztm變種h5454、hartztm變種h5233、hartztm變種h5488、hartztm變種hla572、hartztm變種h6200、hartztm變種h6104、hartztm變種h6255、hartztm變種h6586、hartztm變種h6191、hartztm變種h7440、hartztm變種h4452roundupreadytm、hartztm變種h4994roundupreadytm、hartztm變種h4988roundupreadytm、hartztm變種h5000roundupreadytm、hartztm變種h5147roundupreadytm、hartztm變種h5247roundupreadytm、hartztm變種h5350roundupreadytm、hartztm變種h5545roundupreadytm、hartztm變種h5855roundupreadytm、hartztm變種h5088roundupreadytm、hartztm變種h5164roundupreadytm、hartztm變種h5361roundupreadytm、hartztm變種h5566roundupreadytm、hartztm變種h5181roundupreadytm、hartztm變種h5889roundupreadytm、hartztm變種h5999roundupreadytm、hartztm變種h6013roundupreadytm、hartztm變種h6255roundupreadytm、hartztm變種h6454roundupreadytm、hartztm變種h6686roundupreadytm、hartztm變種h7152roundupreadytm、hartztm變種h7550roundupreadytm、hartztm變種h8001roundupreadytm(hartzseed,stuttgart,arkansas,usa)；a0868、ag0202、ag0401、ag0803、ag0901、a1553、a1900、ag1502、ag1702、ag1901、a1923、a2069、ag2101、ag2201、ag2205、a2247、ag2301、a2304、a2396、ag2401、ag2501、a2506、a2553、ag2701、ag2702、ag2703、a2704、a2833、a2869、ag2901、ag2902、ag2905、ag3001、ag3002、ag3101、a3204、a3237、a3244、ag3301、ag3302、ag3006、ag3203、a3404、a3469、ag3502、ag3503、ag3505、ag3305、ag3602、ag3802、ag3905、ag3906、ag410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owa,usa)；3900rr、4401rr、4703rr、4860rr、4910、4949rr、5250rr、5404rr、5503rr、5660rr、5703rr、5770、5822rr、pgy4304rr、pgy4604rr、pgy4804rr、pgy5622rr和pgy5714rr(progenyagproducts,wynne,arkansas,usa)；r3595rcx、r3684rcn、r3814rr、r4095rcn、r4385rcn和r4695rcn(renzehybridsinc.,carroll,iowa,usa)；s3532-4、s3600-4、s3832-4、s3932-4、s3942-4、s4102-4、s4542-4和s4842-4(stineseedco.,adel,iowa,usa)；374rr、398rrs(taylorseedfarmsinc.,whitecloud,kansas,usa)；usg5002t、usg510nrr、usg5601t、usg7440nrr、usg7443nrr、usg7473nrr、usg7482nrr、usg7484nrr、usg7499nrr、usg7504nrr、usg7514nrr、usg7523nrr、usg7553nrs和usg7563nrr(unisouthgeneticsinc.,nashville,tennessee,usa)；v38n5rs、v39n4rr、v42n3rr、v48n5rr、v284rr、v28n5rr、v315rr、v35n4rr、v36n5rr、v37n3rr、v40n3rr、v47n3rr和v562nrr(royster-clarkinc.,washingtonc.h.,ohio,usa)；rr2383n、2525na、rr2335n、rr2354n、rr2355n、rr2362、rr2385n、rr2392n、rr2392na、rr2393n、rr2432n、rr2432na、rr2445n、rr2474n、rr2484n、rr2495n和rr2525n(willcrossseed,kingcityseed,kingcity,missouri,usa)；1493rr、1991nrr、2217rr、2301nrr、2319rr、2321nrr、2341nrr、2531nrr、2541nrr、2574rr、2659rr、2663rr、2665nrr、2671nrr、2678rr、2685rr、2765nrr、2782nrr、2788nrr、2791nrr、3410rr、3411nrr、3419nrr、3421nrr、3425nrr、3453nrr、3461nrr、3470crr、3471nrr、3473nrr、3475rr、3479nrr、3491nrr、3499nrr、wx134、wx137、wx177和wx300(wilkenseeds,pontiac,illinois,usa)。優(yōu)良植物是來自優(yōu)良系的代表性植物。本發(fā)明的抗病性qtl還可被導(dǎo)入含有以下一個或多個基因的優(yōu)良大豆轉(zhuǎn)基因植物中：除草劑耐受性、增產(chǎn)、昆蟲防治、真菌病抗性、病毒抗性、線蟲抗性、細菌病抗性、支原體病抗性、改進油產(chǎn)量、高產(chǎn)油、高產(chǎn)蛋白質(zhì)、萌發(fā)和幼苗生長控制、增加動物和人類營養(yǎng)、低棉子糖、環(huán)境脅迫抗性、提高可消化性、工業(yè)用酶、藥物蛋白、肽和小分子、改進加工性狀、改善口味、固氮作用、雜種制種、降低變應(yīng)原性、生物聚合物和生物燃料，等等?？赏ㄟ^植物生物工程學(xué)的方法作為大豆的轉(zhuǎn)基因來提供這些農(nóng)藝性狀。還要了解的是，本發(fā)明的大豆植物可具有任何成熟群體的特性。選定大豆植物的花粉可深低溫冷藏，用于與其它成熟群體的優(yōu)良系雜交以將抗真菌病基因座漸滲入天然雜交不可能正常獲得的品系中?；ǚ凵畹蜏乩洳丶夹g(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的(tyagi等，cryoletters，24：119-124(2003)，liang等，actabotanicasinica，35：733-738(1993)和honda等，euphytica126：315-320(2002))。qtl的抗病作用可根據(jù)親本基因型和測定抗病作用的環(huán)境條件而改變。這都在植物育種領(lǐng)域技術(shù)人員掌握之中，并且無需過多實驗即可采用本文所述方法，從植物種群或者從親本基因型保藏物中選出當含有病害基因座時能導(dǎo)致相對于親本基因型抗病性提高的基因型的植物。本文中，植物病害可由真菌、病毒、細菌或無脊椎動物引起。已經(jīng)報道了大豆的多種分子遺傳學(xué)圖(mansur等，cropsci.36:1327-1336(1996)；shoemaker等，genetics144:329-338(1996)；shoemaker等，cropscience32:1091-1098(1992)；shoemaker等，cropscience35:436-446(1995)；tinley等，j.cellbiochem.增刊14e:291(1990)；cregan等，cropscience39:1464-1490(1999))。栽培大豆、野生大豆和栽培大豆x.野生大豆共享連鎖群(shoemaker等，genetics144:329-338(1996))。如本文所用，當提及栽培大豆的連鎖群g、c2、j和n時是指對應(yīng)于栽培大豆的遺傳學(xué)圖連鎖群g、c2、j和n的連鎖群(mansur等，cropscience.36:1327-1336(1996)；cregan等，cropscience39:1464-1490(1999)和美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)機構(gòu)(agriculturalresearchservice,unitedstatesdepartmentofagriculture)的大豆數(shù)據(jù)庫)。qtl的等位基因當然可包含多基因或者甚至在鄰接基因組區(qū)(contiguousgenomicregion)或連鎖群內(nèi)的其它遺傳因子，例如單元型。因此，本文所使用的qtl的等位基因可包含不止一個基因或其它遺傳因子，其中各個單獨的基因或遺傳成分能夠顯示出等位變異，且其中每個基因或遺傳因子還能夠引起所述數(shù)量性狀的表型效應(yīng)。在本發(fā)明的一個實施方案中，qtl的等位基因包含也能夠表現(xiàn)出等位變異的一個或多個基因或其它遺傳因子。因此，所用術(shù)語“qtl的等位基因”并不排除包含不止一個基因或其它遺傳因子的qtl。準確地講，本發(fā)明的“qtl的等位基因”可指其中表型可以是抗病性的單元型窗(haplotypewindow)的單元型。單元型窗是可界定范圍并可被追蹤到的鄰接基因組區(qū)，具有一組一個或多個多態(tài)性標記，其中所述多態(tài)性通過世代表明特性。所述單元型窗內(nèi)的單元型可通過每個標記等位基因的獨特指紋來限定。本文所使用的等位基因是占據(jù)染色體指定基因座的若干可選擇形式的基因。如果在染色體指定基因座上存在的所有等位基因都相同，則植物在該基因座上是純合的。如果在染色體指定基因座上存在的等位基因不相同，則該植物在該基因座上是雜合的。本發(fā)明的植物可以是育種程序的一部分或由育種程序產(chǎn)生。育種方法的選擇取決于植物繁殖的方式、待改進性狀的遺傳力和商用栽培種的類型(例如f1雜種栽培種、純系栽培種等)。栽培種是有意產(chǎn)生或選出的并且通過栽培維持的植物的小種或變種。用于本發(fā)明植物育種的精選的非限制性方法參見下文。可采用任何雜交子代的標記輔助選擇(mas)來改進育種程序。還要了解的是，任何商業(yè)化和非商業(yè)化栽培種都可用于育種程序。例如，苗勢、營養(yǎng)生長勢(vegetativevigor)、脅迫耐受性、抗病性、抽條、開花、結(jié)實、種子大小、種子容重、抗倒伏性(standability)和脫粒性等因素通常決定了選擇。對于高度可遺傳性狀，在單一地點評出的備選的優(yōu)良個體植物可能是有效的，然而對于遺傳力低的性狀，應(yīng)根據(jù)從有關(guān)植物家系重復(fù)評價所得到的平均值來進行選擇。通行的選擇方法常常包括系譜選擇、改進的系譜選擇、混合選擇和輪回選擇。在一個優(yōu)選的實施方案中，采取回交或輪回育種程序。遺傳的復(fù)雜性影響育種方法的選擇?；亟挥N可用于將一個或少數(shù)幾個高度可遺傳性狀的有利基因轉(zhuǎn)移到所需要的栽培種內(nèi)。這一方法已被廣泛用于培育抗病栽培種。各種輪回選擇技術(shù)被用來改進由多個基因控制的數(shù)量遺傳性狀。自花傳粉農(nóng)作物中輪回選擇的應(yīng)用取決于是否易于傳粉、每個傳粉事件成功雜交的頻率和每個成功雜交的雜種子代數(shù)?？蓪τN系進行兩代或更多代的檢驗，并在代表商業(yè)化目標區(qū)域的環(huán)境中與適當標準進行比較。最佳品系是用于新的商業(yè)化栽培種的候選品系；性狀上仍有缺陷的品系則可用作親本以產(chǎn)生用于進一步選擇的新種群。鑒定優(yōu)良植物的一種方法是觀察該植物相對于其它實驗植物和廣泛栽培的標準栽培種的特性。如果單次觀察沒有結(jié)果，則重復(fù)觀察可更好地估計其遺傳價值。育種人員可以選擇兩個或多個親本系并使之雜交，隨后進行重復(fù)自交和選擇，以產(chǎn)生多種新的遺傳組合。新的大豆栽培種的開發(fā)需要開發(fā)和選擇大豆變種，使這些變種雜交并選出優(yōu)良雜種進行雜交。通過所選出的雄性可育親本之間的手工雜交或采用雄性不育系統(tǒng)來產(chǎn)生雜交種子。選出雜種的某些表明種子的確是雜種的單一基因性狀，例如豆莢色、花色、種子產(chǎn)量、茸毛色或除草劑抗性。親本系的其它數(shù)據(jù)以及雜種表型都影響育種人員決定是否繼續(xù)特定的雜種雜交。可以采用系譜育種和輪回選擇育種方法來開發(fā)育種群體的栽培種。育種程序?qū)⒌米詢蓚€或多個栽培種或者各種廣泛來源的所需性狀合并到育種庫(breedingpool)，從中通過自交并選出所需表型從而開發(fā)出栽培種?？蓪π碌脑耘喾N進行評價以確定哪一個具有商業(yè)潛力。通常采用系譜育種以改進自花傳粉農(nóng)作物。使具有有利互補性狀的兩個親本雜交以產(chǎn)生f1。f2種群通過一個或數(shù)個f1自交而產(chǎn)生。選出最佳家系中的最佳個體進行選擇?？蓮膄4代開始對家系進行重復(fù)檢驗以改進具有低遺傳力的性狀的選擇效率。在育種的深入階段(即f6和f7)，檢驗最佳品系或表型上相似的品系的混合品系作為新的栽培種予以推廣的可能性?；亟挥N已被用來將簡單遺傳的高度可遺傳性狀的基因轉(zhuǎn)移至所需要的純合栽培種或是回交親本的近交系。將待轉(zhuǎn)移的性狀來源稱為供方親本。預(yù)期所得植物具有回交親本(例如栽培種)的特性，所需性狀轉(zhuǎn)移自供方親本。在最初的雜交后，選出具有供方親本表型的個體并與回交親本重復(fù)雜交(回交)。預(yù)期所得親本具有回交親本(例如栽培種)的特性，所需性狀轉(zhuǎn)移自供方親本。單粒種子世代方法(single-seeddescentprocedure)從嚴格意義上來說是指種植分離的種群，每株植物收獲一粒種子樣品，用一粒種子樣品種植出下一代。當種群從f2繼續(xù)種植到所需的近交水平時，可以分別追蹤植物(從中衍生出品系)到不同的f2個體。由于一些種子不萌發(fā)或者一些植物無法產(chǎn)生至少一粒種子而使種群的植物數(shù)各代都減少。因此，當各代繼續(xù)生長完成時，種群中不是所有最初采樣的f2植物都可用子代表示。多粒種子方法(multiple-seedprocedure)中，大豆育種人員常常從種群中的每株植物收獲一個或多個豆莢，使它們混在一起脫粒以形成批量。采用部分批量種植下一代，部分保存?zhèn)溆?。該方法被稱為改進的單粒種子世代技術(shù)或豆莢批量技術(shù)(pod-bulktechnique)。多粒種子方法已被用在收獲時節(jié)省人力。用機器為豆莢脫粒比在單粒種子方法中用手從每一豆莢中取出一粒種子要快得多。多粒種子方法還使種植近交各代種群相同數(shù)目的種子成為可能。常用于不同性狀和農(nóng)作物的其它育種方法的內(nèi)容可參見幾本參考書之一(例如fehr，principlesofcultivardevelopment第1卷,第2-3頁(1987))。本發(fā)明還提供本發(fā)明的植物部分。植物部分包括但不限于種子、胚乳、胚珠和花粉。在本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實施方案中，植物部分是種子。本發(fā)明的植物或其部分可以在培養(yǎng)物中培育并再生。從各種組織類型再生出大豆植物的方法和大豆的組織培養(yǎng)方法是本領(lǐng)域已知的(參見例如widholm等，invitroselectionandculture-inducedvariationinsoybean(大豆的體外選擇和培養(yǎng)誘導(dǎo)型變異)，載于soybean:genetics,molecularbiologyandbiotechnology,verma和shoemaker主編,cabinternational,wallingford,oxon,england(1996))。植物(例如大豆)的再生技術(shù)可使用各種組織或細胞類型作為起始材料。特別對于大豆，已經(jīng)研發(fā)出始于某些分化組織類型的再生方法，例如分生組織(cartha等，can.j.bot.59:1671-1679(1981))、下胚軸切片(cameya等，plantscienceletters21:289-294(1981))和莖節(jié)節(jié)段(saka等，plantscienceletters,19:193-201(1980)；cheng等，plantscienceletters,19:91-99(1980))。據(jù)報道，由未成熟大豆胚外植體產(chǎn)生的體細胞胚再生出完全性成熟的大豆植物(ranch等，invitrocellular&developmentalbiology21:653-658(1985))。另據(jù)報道，通過器官發(fā)生和胚胎發(fā)生從組織培養(yǎng)物中再生出成熟的大豆植物(barwale等，planta167:473-481(1986)；wright等，plantcellreports5:150-154(1986))。本發(fā)明還提供通過篩選大豆植物對病害的抗性、免疫性或易感性來選出抗病大豆植物，所述選擇包括測定大豆植物的基因組核酸中存在的在遺傳上與抗病性相關(guān)qtl的等位基因連鎖的標記分子，其中qtl的等位基因也位于與抗病大豆有關(guān)的連鎖群上。所述病害可由真菌、病毒、細菌或無脊椎動物引起。本發(fā)明還提供賦予亞洲大豆銹病抗性的qtl，包括asr抗性基因座1、asr抗性基因座2、asr抗性基因座3、asr抗性基因座4、asr抗性基因座5、asr抗性基因座6、asr抗性基因座7、asr抗性基因座8、asr抗性基因座9、asr抗性基因座10、asr抗性基因座11、asr抗性基因座12和asr抗性基因座13。已經(jīng)分別在pi200492、pi230970、pi462312(ankur)和pi459025b中鑒定出4個顯性和獨立遺傳的豆薯層銹菌抗性基因座(本文標注為asr抗性基因座1-4)。在本發(fā)明中，asr抗性基因座1位于大豆g連鎖群上。監(jiān)測asr抗性基因座1漸滲所用的snp標記選自ns0093250、ns0119710、ns0103004、ns0099454、ns0102630、ns0102915、ns0102913、ns0123728、ns0129943、ns0102168、ns0092723、ns0098177、ns0127343和ns0101121。asr抗性基因座1snp標記dna序列(表示為seqidno:67-80)可用標注為seqidno:1-28的引物擴增，并且用標注為seqidno:100-127的探針檢測。在本發(fā)明中，asr抗性基因座2最有可能位于j連鎖群上，接近或在含有褐莖腐病(brownstemrot)抗性、大豆胞囊線蟲抗性和蛙眼病抗性的抗病基因簇內(nèi)，或者位于n連鎖群上。在本發(fā)明中，asr抗性基因座3位于c2連鎖群上。監(jiān)測asr抗性基因座3漸滲所用的snp標記選自ns0099746、ns0123747、ns0126598、ns0128378、ns0096829、ns0125408、ns0098902、ns0099529、ns0097798、ns0137477、ns0095322、ns0136101、ns0098982、ns0103749、ns0118897、ns0119715和ns0130920。這些標記dna序列(表示為seqidno:81-97)可用標注為seqidno:29-62的引物擴增，并且用標注為seqidno:128-161的探針檢測。在本發(fā)明中，asr抗性基因座4很可能位于n連鎖群上。本發(fā)明還提供在相關(guān)研究中鑒定賦予asr抗性的單元型。這些全基因組測量表明與asr抗性相關(guān)的2個snp標記位于13號染色體的2個不同的窗內(nèi)。在第一單元型窗內(nèi)，監(jiān)測asr抗性基因座5、asr抗性基因座6、asr抗性基因座7、asr抗性基因座8和asr抗性基因座9漸滲所用的snp標記是ns0103033。這個snp標記dna序列(表示為seqidno:98)可用標注為seqidno:63-64的引物擴增，并且用標注為seqidno:162-163的探針檢測。在第二單元型窗內(nèi)，監(jiān)測抗性基因座10、asr抗性基因座11、asr抗性基因座12和asr抗性基因座13漸滲所用的snp標記是ns0124935。這個snp標記dna序列(表示為seqidno:99)可用標注為seqidno:65-66的引物擴增，并且用標注為seqidno:164-165的探針檢測。還要了解的是，作圖在距所述標記分子10厘摩以內(nèi)的一個或多個標記可用于asr抗性基因座的選擇和漸滲。還要了解的是，本發(fā)明提供包含本發(fā)明分子(agent)的細菌、病毒、微生物、昆蟲、哺乳動物和植物細胞。核酸分子或其片段在某些環(huán)境下能夠與其它核酸分子特異性雜交。如本文所使用的一樣，如果兩個核酸分子能夠形成反向平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，則這兩個分子能夠彼此特異性地雜交。一個核酸分子是另一個核酸分子的“互補分子”，只要它們具有完全互補性。如本文所使用的一樣，當一個核酸分子的每個核苷酸與另一個核酸分子的核苷酸都互補時，則分子間表現(xiàn)出“完全互補性”。如果兩個分子可以彼此雜交，具有足夠的穩(wěn)定性使得其在至少常規(guī)“低嚴格性”條件下彼此保持退火，則這兩個分子是“最低限度互補的”。同樣地，如果分子可以彼此雜交，具有足夠的穩(wěn)定性使得其在常規(guī)“高嚴格性”條件下彼此保持退火，則它們是“互補的”。常規(guī)嚴格性條件可參見sambrook等，載于molecularcloning,alaboratorymanual(分子克隆實驗室指南),第二版,coldspringharborpress,coldspringharbor,newyork(1989)和haymes等，載于nucleicacidhybridization,apracticalapproach(核酸雜交實用方法),irlpress,washington,dc(1985)。因此，偏離完全互補性是允許的，只要這種偏離不會完全排除分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力。為了將核酸分子用作引物或探針，只需要在所采用的特定溶劑和鹽濃度下，在序列上充分互補以便能夠形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。本文所使用的基本同源序列是與在高嚴格性條件下比較起來是與互補的核酸序列特異性雜交的核酸序列。本發(fā)明的核酸探針和引物可在嚴格性條件下與靶dna序列雜交。術(shù)語“嚴格性雜交條件”的定義是探針或引物與靶序列特異性雜交而不與非靶序列雜交的條件，可憑經(jīng)驗確定。術(shù)語“嚴格性條件”通過具體雜交方法(sambrook等，1989，于9.52-9.55)，在功能上限定了有關(guān)核酸探針與靶核酸(即特定的目標核酸序列)的雜交。還可參見sambrook等(1989)于9.47-9.52、9.56-9.58；kanehisanucl.acidsres.12:203-213(1984)和wetmur等,j.mol.biol.31:349-370(1968)。促進dna雜交合適的嚴格性條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，例如約45℃下6.0x氯化鈉/檸檬酸鈉(ssc)，隨后50℃下2.0xssc洗滌，或者可參見currentprotocolsinmolecularbiology(最新分子生物學(xué)實驗指南),johnwiley&sons,n.y.,1989,6.3.1-6.3.6。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以從低嚴格性的50℃下大約2.0xssc至高嚴格性的50℃下大約0.2xssc中選擇。此外，洗滌步驟中的溫度可從室溫約22℃的低嚴格性條件向約65℃的高嚴格性條件升高。溫度和鹽兩者均可改變，或者將溫度或鹽濃度之一保持恒定，而另一個則可以變化。例如，使用dna或rna探針或引物的雜交可以如下進行：對于高嚴格性，65℃下，6xssc，0.5％sds，5xdenhardt’s，100μg/ml非特異性dna(例如經(jīng)超聲處理的鮭精dna)，洗滌為65℃下0.5xssc，0.5％sds。預(yù)期如果探針或引物與靶序列結(jié)合的特異性受到保護，則較低嚴格性雜交條件(例如較低雜交和/或洗滌溫度)可用來鑒定具有較低序列相似性程度的有關(guān)序列。因此，由于其與dna、rna或cdna片段的互補序列段選擇性形成雙鏈體分子的能力，所以可以使用本發(fā)明的核苷酸序列。通過雜交來檢測dna區(qū)段的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，因此根據(jù)應(yīng)用前景，我們可以展望采用不同的雜交條件以獲得探針對靶序列的不同程度的選擇性，并且方法的選擇將取決于所需要的結(jié)果。本文所使用的分子(agent)，是天然存在的分子，或者如有需要則可是“基本純的”，它指的是基本上從與其天然狀態(tài)正常締合的所有其它分子中分離出來的分子。更優(yōu)選基本純的分子是制備物中存在的主要類型?；炯兊姆肿涌梢允浅ヌ烊换旌衔镏写嬖诘钠渌肿?溶劑除外)后大于60％，優(yōu)選大于75％，更優(yōu)選大于90％，更優(yōu)選大于95％。術(shù)語“基本純的”往往不包括其天然狀態(tài)中存在的分子。對于結(jié)構(gòu)特征例如一核酸與另一核酸分子雜交的能力，或者對于蛋白質(zhì)與抗體結(jié)合的能力(或者與其它分子競爭以結(jié)合)，本發(fā)明的分子(agent)優(yōu)選為“生物活性的”?；蛘?，這類特征可以是催化性的，因此涉及分子(agent)介導(dǎo)化學(xué)反應(yīng)的能力。本發(fā)明的分子(agent)還可以是重組分子。本文所使用的術(shù)語重組分子是指任何分子(agent)(例如dna、肽等)，也就是說人為操縱的核酸分子，或者不論是否是間接的，都由人為操縱的核酸分子產(chǎn)生。本發(fā)明的分子(agent)可用以下成分標記：有助于檢測分子(agent)的試劑(例如熒光標記(prober等，science238:336-340(1987)；歐洲專利144914)、化學(xué)標記(美國專利4,582,789、美國專利4,563,417)、修飾堿基(歐洲專利119448)，所有這些文獻都通過引用全部結(jié)合到本文中)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的核酸可在中等嚴格性條件下(例如大約2.0xssc，大約65℃)與seqidno:67至seqidno:99中所列的一個或多個核酸分子或其互補序列或者兩者之一的片段特異性雜交。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的核酸可在高嚴格性條件下與seqidno:67至seqidno:99中所列的一個或多個核酸分子或其互補序列或者兩者之一的片段特異性雜交。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明優(yōu)選的標記核酸分子具有seqidno:67至seqidno:99中所列的核酸序列或其互補序列或者兩者之一的片段。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明優(yōu)選的標記核酸分子與seqidno:67至seqidno:99中所列的核酸序列或其互補序列或者兩者之一的片段共享介于80％和100％之間或者介于90％和100％之間的序列同一性。在本發(fā)明又一個方面，本發(fā)明優(yōu)選的標記核酸分子與seqidno:67至seqidno:99中所列的序列或其互補序列或者兩者之一的片段共享介于95％和100％之間的序列同一性。在本發(fā)明一個更優(yōu)選的方面，本發(fā)明優(yōu)選的標記核酸分子與seqidno:67至seqidno:99中所列的核酸序列或其互補序列或者兩者之一的片段共享介于98％和100％之間的序列同一性。可以采用額外的遺傳標記來選擇具有本發(fā)明大豆真菌病抗性相關(guān)qtl的等位基因的植物。公共標記數(shù)據(jù)庫的實例包括例如美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)機構(gòu)的大豆數(shù)據(jù)庫。本發(fā)明的遺傳標記包括“顯性”或“共顯性”標記?！肮诧@性標記”表示存在兩個或多個等位基因(每二倍體個體有兩個)。“顯性標記”表示只存在單個等位基因。存在顯性標記表型(例如dna條帶)表示以純合狀態(tài)或雜合狀態(tài)存在的一個等位基因。缺乏顯性標記表型(例如dna條帶不存在)僅僅只是“某些其它”未確定的等位基因存在的證據(jù)。在其中個體主要是純合的且基因座主要是二態(tài)的種群的情況下，顯性和共顯性標記可能有相同價值。因為種群雜合性變得更高，并且等位基因變得更多，因此比起顯性標記，共顯性標記基因型的信息量常常更大?？梢圆捎门c本發(fā)明qtl的等位基因在遺傳上連鎖或相關(guān)聯(lián)的標記，例如簡單序列重復(fù)標記(ssr)、aflp標記、rflp標記、rapd標記、表型標記、snp、同工酶標記、微陣列轉(zhuǎn)錄譜(walton，seedworld22-29(1993年7月)；burow等,moleculardissectionofcomplextraits(復(fù)雜性狀的分子剖析),13-29,paterson主編,crcpress,newyork(1988)。這類標記的分離方法為本領(lǐng)域所知。例如，通過篩選基因組文庫的微衛(wèi)星重復(fù)序列(microsatelliterepeat)，對“陽性”克隆進行測序，設(shè)計出鄰接重復(fù)序列的引物，并用這些引物使基因組dna擴增，從而可獲得基因座專一性ssr標記。所得到的擴增產(chǎn)物的大小可按基本重復(fù)單元的整數(shù)發(fā)生變化。為了檢測多態(tài)性，pcr產(chǎn)物可經(jīng)放射性標記，用變性聚丙烯酰胺凝膠分離，并通過放射自顯影檢測。大小差異>4bp的片段還可用瓊脂糖凝膠分離，從而避免了放射性。通過使用核酸擴增方法，可有利于dna、rna或cdna樣品中多態(tài)性位點的檢測。這類方法尤其增加跨多態(tài)性位點或包括該位點以及位于其遠端或近端的序列的多核苷酸的濃度。這類擴增分子可容易地通過凝膠電泳或其它方法檢測出來。實現(xiàn)這種擴增最優(yōu)選的方法采用使用引物對的聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr)(mullis等，coldspringharborsymp.quant.biol.51:263-273(1986)、歐洲專利申請50,424、歐洲專利84,796、歐洲專利258,017、歐洲專利237,362、歐洲專利201,184、美國專利4,683,202、美國專利4,582,788、美國專利4,683,194)，所述引物對能夠與界定其雙鏈形式的多態(tài)性的近端序列雜交。除了pcr外，還可采用替代方法，例如“連接酶鏈式反應(yīng)”(lcr)(barany，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)88:189-193(1991)，該文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。lcr使用兩對寡核苷酸探針按指數(shù)級來擴增特異性靶。選擇每對寡核苷酸的序列，以便該對序列與所述靶同一鏈的鄰接序列雜交。這類雜交形成模板依賴性連接酶的底物。如同pcr一樣，所得產(chǎn)物進而用作隨后循環(huán)的模板，獲得所需序列的指數(shù)擴增?；蛘?，可以應(yīng)用“寡核苷酸連接測定法”(ola)(landegren等，science241:1077-1080(1988)，該文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。ola方案使用經(jīng)設(shè)計能夠與靶單鏈的鄰接序列雜交的兩個寡核苷酸。ola同lcr一樣，特別適于檢測點突變。然而，與lcr不同，ola引起靶序列“線性”擴增而不是指數(shù)擴增?；谠诰哂兴玫降摹岸押塑账帷毙蛄械暮怂岽嬖谙逻B接兩個(或多個)寡核苷酸，從而擴增該二寡核苷酸的方案也是已知的(wu等，genomics4:560-569(1989)，該文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)，可容易地進行調(diào)整以適于本發(fā)明的目的。還可采用其它已知的核酸擴增方法，例如等位基因特異性寡聚體、分支dan技術(shù)、基于轉(zhuǎn)錄的擴增系統(tǒng)或者等溫擴增方法，來進行擴增并分析這類多態(tài)性(美國專利5,130,238，歐洲專利329,822，美國專利5,169,766，歐洲專利359,789，kwoh等，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)86:1173-1177(1989)，歐洲專利368,906，walker等，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)89:392-396(1992)，所有這些文獻都通過引用全部結(jié)合到本文中)。多態(tài)性還可通過單鏈構(gòu)象多態(tài)性(sscp)分析來鑒定。sscp是能夠在通常長度介于150個和250個核苷酸之間的單鏈dna中鑒定出最多序列變異的方法(elles，methodsinmolecularmedicine:moleculardiagnosisofgeneticdiseases(分子醫(yī)學(xué)方法：遺傳疾病的分子診斷),humanapress(1996)；orita等,genomics5:874-879(1989))。在變性條件下，單鏈dna可呈獨特的依賴于其序列構(gòu)象的構(gòu)象。這種構(gòu)象通常不同，即使僅單個堿基發(fā)生變化。據(jù)報道，大多數(shù)構(gòu)象改變的物理構(gòu)型或大小足以用電泳檢測出。snp的一個主要特征是多態(tài)性的位點在單個核苷酸上。snp比其它類別的多態(tài)性更穩(wěn)定。其自發(fā)突變率大約為10-9(kornberg，dnareplication(dna復(fù)制),w.h.freeman&co.,sanfrancisco(1980))。因為snp由序列變異產(chǎn)生，所以新的多態(tài)性可通過對基因組或cdna分子進行隨機測序來鑒定。snp還可由缺失、點突變和插入產(chǎn)生。這就是說，snp作為標記也是有利的，因為由于它們幾乎不會從獨立起源產(chǎn)生，因此它們通常能診斷出“世代身份(identitybydescent)”。無論什么起因，任何單個堿基改變都可以是snp。snp發(fā)生的頻率比其它類別的多態(tài)性高，可更容易地鑒定出來。在本發(fā)明中，snp可代表單一插入/缺失事件，它可由一個或多個堿基對或單核苷酸多態(tài)性組成。snp可用多種方法的任一種表征。這類方法包括對位點進行直接或間接測序、采用其中相應(yīng)的等位基因位點產(chǎn)生或破壞限制位點的限制性內(nèi)切酶、采用等位基因特異性雜交探針、采用對由多態(tài)性不同等位基因編碼的蛋白質(zhì)是特異性的抗體或者其它生化分析。snp可用鏈終止方法的變通法(sanger等，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)74:5463-5467(1977))進行測序，其中放射性同位素的使用被熒光標記的二脫氧核苷酸替換，并進行毛細管型自動測序(美國專利5,332,666，該專利的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中；美國專利5,821,058，該專利的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。自動測序儀可獲自例如appliedbiosystems,fostercity,ca(3730xldna分析儀)；beckmancoulter,fullerton,ca(ceqtm8000遺傳分析系統(tǒng))和li-cor,inc.,lincoln,ne(4300dna分析系統(tǒng))。snp的分析方法可以分成兩組。第一組基于引物延伸測定法，例如固相微測序(solid-phaseminisequencing)或焦磷酸測序(pyrosequencing)。固相微測序法中，dna聚合酶尤其用來延伸使緊接變異核苷酸退火的引物。與變異位點上的核苷酸互補的單一標記的核苷三磷酸被用于延伸反應(yīng)。僅在含有變異位點上的核苷酸的序列可通過聚合酶延伸?？蓪⒁镪嚵泄潭ㄔ诠滔嘀С煮w上，其中各引物被裝在4個小孔中，各孔分別用于dna中存在的4種核苷三磷酸之一。將各試驗生物的模板dna或rna加到各孔中，使之退火至引物。然后，用聚合酶和標記的二脫氧核苷酸三磷酸，使引物延伸一個核苷酸。反應(yīng)完成時可用能夠檢測可能是放射性或熒光的標記的裝置成像。采用這種方法，可觀察和檢測若干不同的snp(等，hum.mutat.13:1-10(1999))。焦磷酸測序技術(shù)基于dna鏈延長時從每個dntp釋放的焦磷酸(ppi)的間接生物發(fā)光測定法。在klenow聚合酶介導(dǎo)的堿基摻入后，釋放出ppi，并與腺苷5-酰硫酸(aps)一起用作導(dǎo)致atp形成的atp硫酸化酶的底物。隨后，通過螢光素酶的作用，atp完成了使螢光素轉(zhuǎn)化成其氧化衍生物。隨之產(chǎn)生的光輸出量與所添加的堿基數(shù)(最多約4個堿基)成比例。為便于該方法的持續(xù)合成能力，dntp過量通過腺苷三磷酸雙磷酸酶降解，起始反應(yīng)混合物中也存在該酶，以便在測序過程中僅dntp被加到模板上(alderborn等，genomeres.10:1249-1258(2000))。設(shè)計來檢測和分析焦磷酸測序反應(yīng)的儀器的一個實例可獲自biotage，charlottesville，va(pyromarkmd)?；谝镅由鞙y定的最新snp檢測方法是good測定法。good測定法(sauer等，nucleicacidsres.28:e100(2000))是利用maldi-tof(基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間)質(zhì)譜法的等位基因特異性引物延伸方案。含有snp的dna區(qū)先通過pcr擴增法進行擴增。殘余dntp用堿性磷酸酶破壞。在引物延伸反應(yīng)中，再用特異性引物(一組預(yù)處理的a-s-dntp和a-s-ddntp)及新鮮dna聚合酶產(chǎn)生等位基因特異性產(chǎn)物。通過5’-磷酸二酯酶消化脫去未修飾的dna，修飾產(chǎn)物是甲基化的以提高質(zhì)譜分析的檢測靈敏度。所有步驟以最小實際樣品體積在單個小瓶中進行，不需要純化。延伸反應(yīng)可產(chǎn)生正電荷或負電荷，用質(zhì)譜法進行檢測(sauer等，nucleicacidsres.28:e13(2000))。其中進行g(shù)ood測定法分析的儀器為例如得自brukerdaltonics(billerica，ma)的maldi-tof系統(tǒng)。第二組基于異源雙鏈體dna分子的識別，包括寡核苷酸雜交、taq-man測定法、分子信標、電子斑點印跡測定法(electronicdotblotassay)和變性高效液相色譜法。寡核苷酸雜交可用微陣列整體進行(southern，trendsgenet.12:110-115(1996))。測定法或?qū)崟rpcr通過在擴增反應(yīng)期間雙標記的熒光探針的雜交和切割，來檢測特異性pcr產(chǎn)物的累積。taq-man測定法包括4種寡核苷酸，其中兩種用作pcr引物并產(chǎn)生包括待檢測多態(tài)性的pcr產(chǎn)物。其余兩種是等位基因特異性的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)探針。fret探針摻入緊密相鄰的熒光團和猝滅劑分子間，以便使熒光團的熒光猝滅。fret探針的信號由fret寡核苷酸降解產(chǎn)生，使得熒光團在猝滅劑附近釋放出來，因此當適當波長激發(fā)時能夠發(fā)光。在本測定中，采用帶有不同熒光報道染料的兩個fret探針，其中單一染料被摻到能夠只與兩個等位基因的一個高特異性退火的寡核苷酸中。可用的報道染料包括6-羧基-4,7,2’,7’-四氯熒光素(tet)、2'-氯-7'-苯基-1,4-二氯-6-羧基熒光素(vic)和6-羧基熒光素氨基磷酸(fam)。一個可用的猝滅劑為6-羧基-n,n,n’,n’-四甲基羅丹明(tamra)。當taqdna聚合酶遇到退火探針的5’端時，退火(但不是非退火)fret探針被該酶降解，從而從其猝滅劑附近釋放出熒光團。在pcr反應(yīng)后，兩種熒光劑各自的熒光，以及鈍態(tài)參比(passivereference)的熒光用熒光測定法測定。兩種染料各自的歸一化熒光強度可與樣品中最初存在的各等位基因的量成比例，因此可推斷出樣品的基因型。測定法或?qū)崟rpcr中檢測熒光信號所使用的儀器的實例為7500實時pcr系統(tǒng)(appliedbiosystems,fostercity,ca)。分子信標是形成莖－環(huán)結(jié)構(gòu)并具有內(nèi)部猝滅的熒光團的寡核苷酸探針。當它們與互補靶結(jié)合時，經(jīng)歷開啟其熒光的構(gòu)象轉(zhuǎn)換。這些探針識別它們的靶，比線性探針具有較高特異性，并且可容易地區(qū)分由單個核苷酸而彼此不同的靶。分子的環(huán)部分用作與靶核酸互補的探針序列。莖通過使探針序列任一側(cè)的兩條互補臂序列退火而形成。熒光部分附在一個臂的末端上，非熒光的猝滅部分附在另一臂的末端上。該莖雜交使得熒光團和猝滅劑彼此接近以致于不發(fā)出熒光。當分子信標遇到靶序列時，就形成了比莖雜交更強更穩(wěn)定的探針－靶雜交體。探針經(jīng)歷促使臂序列分開的自發(fā)構(gòu)象改組，將熒光團與猝滅劑分隔開，允許熒光團發(fā)出熒光(bonnet等，1999)。分子信標的功率取決于僅與探針序列極佳互補的靶序列雜交的能力，因此允許檢測單個堿基差異(kota等，plantmol.biol.rep.17:363-370(1999))?？梢栽诶绲米詓tratagene(lajolla，ca)的multiplexquantitativepcr系統(tǒng)上進行分子信標檢測。電子斑點印跡測定法(electronicdotblotassay)采用半導(dǎo)體微芯片，該芯片由被含有鏈霉抗生物素的瓊脂糖滲透層覆蓋的微電極的陣列組成。將生物素化擴增子涂在芯片上，通過正偏壓直流電電泳到所選擇的墊片上，通過與滲透層中的鏈霉抗生物素的相互作用而被包埋在其中。然后，各墊片上的dna與熒光標記的等位基因特異性寡核苷酸的混合物雜交。之后，可通過增加安培數(shù)使各個墊片上的電荷極性逆轉(zhuǎn)，從而使單個堿基對錯配的探針優(yōu)先變性。隨著安培數(shù)遞增至完成，用數(shù)碼照相機對陣列進行拍照，并使熒光量化。然后，通過對目標區(qū)域的像素統(tǒng)計值取平均來確定熒光強度(gilles等，naturebiotech.17:365-370(1999))?；谧R別異源雙鏈dna分子的最新應(yīng)用是采用變性高效液相色譜法(dhplc)。這一技術(shù)代表高靈敏全自動化測定法，它結(jié)合了用于高通量snp分析的peltier冷卻的96孔自動進樣器。這是基于離子對的反相高效液相色譜方法。該分析法的核心是聚苯乙烯－二乙烯基苯共聚物，它起著固定相的作用。流動相由離子配對劑三乙基乙酸銨(teaa)緩沖液和有機試劑乙腈(acn)組成，它介導(dǎo)dna與固定相結(jié)合，以便實現(xiàn)dna隨后從柱上分離出來。can的線性梯度便于根據(jù)存在的異源雙鏈體來進行片段分離。因此，dhplc識別引起雙鏈pcr擴增dna中錯配核苷酸之間形成異源雙鏈體的突變和多態(tài)性。在一個典型的測定法中，在野生型和突變型dna重退火期間，序列變異產(chǎn)生異源雙鏈和同源雙鏈的混合群體。當該混合群體在部分變性溫度下用dhplc進行分析時，異源雙鏈分子由于其解鏈溫度低而在同源雙鏈分子之前從柱上洗脫出來(kota等，genome44:523-528(2001))。通過dhplc分析snp所使用的儀器的實例是得自transgenomic,inc.(omaha,ne)的hs系統(tǒng)。用于高通量監(jiān)測植物基因表達的基于微陣列的方法可用作遺傳標記系統(tǒng)。這一基于“芯片”的方法包括將核酸分子微陣列用作基因特異性雜交靶，以定量或定性測定植物基因的表達(schena等，science270:467-470(1995)，該文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中；shalon，博士論文，stanforduniversity(1996)，該論文的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)?？赏瑫r查找大段序列上的每個核苷酸?？衫秒s交來有效地對核苷酸序列進行分析。這類微陣列可用核酸分子的任何組合進行探測。特別優(yōu)選的用作探針的核酸分子組合包括得自已知組織類型或已知發(fā)育階段或者遭受已知脅迫(環(huán)境或人造脅迫)或其任何組合的植物的mrna分子群(例如從兩葉期水分脅迫葉片中制備的mrna)。通過該方法產(chǎn)生的表達譜可以用作標記。為了qtl作圖，所包括的標記必須可診斷出起源以便對隨后的種群作出推測。snp標記對于作圖是理想的，因為在特定種尚存的種群中，從獨立起源得出特定snp等位基因的可能性非常低。因此，snp標記可用于跟蹤和輔助qtl的漸滲，特別在單元型的情況下。另外的標記分子的遺傳連鎖可通過基因作圖模型和運行軟件包mapmaker/qtl(lincoln和lander，mappinggenescontrollingquantitativetraitsusingmapmaker/qtl(運用mapmaker/qtl對控制數(shù)量性狀的基因作圖),whiteheadinstituteforbiomedicalresearch,massachusetts,(1990)來確立，所述基因作圖模型例如但不限于lander和botstein報道的側(cè)翼標記模型(lander和botstein,genetics,121:185-199(1989))以及l(fā)ander和botstein描述的基于最大似然法的區(qū)間作圖法(lander和botstein,genetics,121:185-199(1989))。另外的軟件包括qgene，2.23版(1996)，康乃爾大學(xué)植物育種和生物統(tǒng)計學(xué)系，266emersonhall，cornelluniversity，ithaca，ny，該軟件的手冊通過引用全部結(jié)合到本文中)。采用qgene軟件是特別優(yōu)選的方法。計算最大似然估計(mle)看標記是否存在，連同假定無qtl效應(yīng)的mle一起以避免假陽性。如下計算優(yōu)勢比的log10(lod)：lod＝log10(存在qtl/mle但假定無連鎖qtl的mle)。lod分值主要表明假定qtl存在相對于qtl不存時，數(shù)據(jù)更可能增至多大。在給定置信度(例如95％)時，為避免假陽性的lod閾值取決于標記的數(shù)目和基因組的長度。表明lod閾值的圖表可參見lander和botstein，genetics,121:185-199(1989)，另可參見arús和moreno-gonzález，plantbreeding,hayward,bosemark,romagosa(主編)chapman&hall,london,第314-331頁(1993)。還可以使用另外的模型。已經(jīng)報道了區(qū)間作圖法的許多修改和替代方法，包括非參數(shù)方法的使用(kruglyak和lander，genetics,139:1421-1428(1995)，該文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。也可采用多元回歸方法或模型，其中性狀用多個標記進行回歸分析(jansen，biometricsinplantbreed,vanoijen,jansen(主編)，第九屆歐洲植物育種學(xué)會生物統(tǒng)計學(xué)分會植物育種大會會議錄(proceedingsoftheninthmeetingoftheeucarpiasectionbiometricsinplantbreeding),thenetherlands,第116-124頁(1994)；weber和wricke,advancesinplantbreeding,blackwell,berlin,16(1994)。有研究報道了區(qū)間作圖法與回歸分析結(jié)合的方法，其中表型在假定標記間隔回歸到單一推定qtl，并且同時回歸到用作“余因子(cofactor)”的多個標記(jansen和stam，genetics,136:1447-1455(1994)和zeng,genetics,136:1457-1468(1994)。一般來講，使用余因子降低了qtl估計位置的偏倚和采樣誤差(utz和melchinger，biometricsinplantbreeding,vanoijen,jansen(主編)第九屆歐洲植物育種學(xué)會生物統(tǒng)計學(xué)分會植物育種大會會議錄，thenetherlands，第195-204頁(1994)，從而改進qtl作圖的精度和效率(zeng，genetics,136:1457-1468(1994))?？蓪⑦@些模型推廣到多環(huán)境實驗中以分析基因型－環(huán)境的相互作用(jansen等，theo.appl.genet.91:33-37(1995)。選擇合適的作圖種群對制圖十分重要。合適的作圖種群的選擇取決于所采用的標記系統(tǒng)類型(tanksley等，molecularmappingofplantchromosomes.chromosomestructureandfunction:impactofnewconcepts(植物染色體的分子作圖、染色體結(jié)構(gòu)和功能：新構(gòu)思的影響)j.p.gustafson和r.appels(主編),plenumpress,newyork,第157-173頁(1988)，該文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。必須考慮用于作圖種群的親本來源(適應(yīng)性親本對外來親本)。在遠緣雜交(適應(yīng)性親本x外來親本)中，染色體配對率和重組率可能受到嚴重干擾(被抑制)，通常產(chǎn)生的連鎖距離極大地被縮短。當與近緣雜交(適應(yīng)性親本x適應(yīng)性親本)的子代相比時，遠緣雜交通?？商峁┚哂辛肯鄬Υ蟮亩鄳B(tài)性的分離種群。f2種群是雜交種子產(chǎn)生后自交的第一代。通常單一f1植物自交對于所有基因而言均以孟德爾(1:2:1)模式產(chǎn)生分離的種群。采用共顯性標記系統(tǒng)，從完全分類的f2種群(completelyclassifiedf2population)中獲得最大遺傳信息(mather，measurementoflinkageinheredity:methuenandco.,(1938)，該文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。在顯性標記的情況下，需要子代檢驗(例如f3、bcf2)來鑒定雜合子，因此使之等同于完全分類的f2種群。然而，該方法由于涉及子代檢驗成本和時間而常常令人望而卻步。f2個體的子代檢驗常用于其中表型不是始終反映基因型(例如抗病性)，或者其中性狀表達受qtl調(diào)控的制圖。得自子代檢驗種群(例如f3或bcf2)的分離數(shù)據(jù)可用于制圖。標記輔助選擇因而可根據(jù)標記性狀圖聯(lián)合分析應(yīng)用于子代雜交(f2、f3)，其中連鎖群未被重組事件完全分離(即最大不平衡)。重組近交系(ril)(遺傳相關(guān)品系；通常>f5，由連續(xù)自交f2系開發(fā)出來趨于純合)可以用作作圖種群。通過采用ril，可使從顯性標記獲得的信息最大化，因為所有基因座都是純合的或幾乎純合。在緊密連鎖(即重組約<10％)的條件下，在ril種群中經(jīng)評價的顯性和共顯性標記提供的每個體的信息比回交種群的任一標記類型的信息都多(reiter等，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)89:1477-1481(1992))。然而，由于標記之間的距離變得較大(即基因座變得更加獨立)，因此當與共顯性標記相比時，ril種群中的信息急劇減少?；亟环N群(例如通過成功的變種(回交親本)和攜帶前者不存在的性狀的另一變種(供方親本)之間雜交產(chǎn)生的種群)可用作作圖種群。與回交親本的一系列回交可恢復(fù)其大多數(shù)所需要的性狀。因此，產(chǎn)生出包括幾乎與回交親本相同但每個個體攜帶來自供方親本的不同含量或不同嵌合的基因組區(qū)的個體的種群。如果回交親本的所有基因座是純合的且供方親本和回交親本具有明顯差別的多態(tài)性標記等位基因，則回交種群可用于顯性標記作圖(reiter等，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)89:1477-1481(1992))。采用共顯性標記或顯性標記，從回交種群獲得的信息少于從f2種群獲得的信息，因為從每株植物采樣的是一個而不是兩個重組配子。然而，回交種群當與ril相比時信息量更大(在標記飽和度低時)，因為ril種群中連鎖基因座之間的距離增加(即重組約為.15％)。重組增加可有益于緊密連鎖的清晰度，但是可能在低標記飽和度制圖時是不適合的。由產(chǎn)生除所研究的性狀或基因組區(qū)之外遺傳組成幾乎相同的一系列個體的多次回交所產(chǎn)生的近等基因系(nil)可用作作圖種群。在用nil作圖時，預(yù)期僅部分多態(tài)基因座可作圖至選定區(qū)域?；旌戏蛛x子分析法(bulksegregantanalysis，bsa)是開發(fā)用于快速鑒定標記和目標性狀之間連鎖的方法(michelmore等，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)88:9828-9832(1991))。在bsa中，從單次雜交所產(chǎn)生的分離種群中提取兩批dna樣品。這些批次含有特定性狀(對特定病害的抗性或易感)或基因組區(qū)相同但任意在不連鎖區(qū)(即雜合)的個體。在bsa中，與靶區(qū)不連鎖的區(qū)在混合樣品的多個個體之間沒有不同。傳統(tǒng)qtl作圖的一個替代方法包括對單元型與個體標記作圖而達到更高清晰度(fan等2006genetics)。這一方法跟蹤稱為單元型的dna區(qū)組，如多態(tài)性標記所限定的一樣，在作圖種群中就世代來說，它被認為是相同的。這個假設(shè)導(dǎo)致較大的有效樣品大小，提供了更高清晰度的qtl。表型和基因型(在這種情況下為單元型)之間關(guān)聯(lián)統(tǒng)計顯著性的測定方法，可通過本領(lǐng)域已知任何統(tǒng)計檢驗和所需統(tǒng)計顯著性的任何可接受的閾值來確定。具體方法的應(yīng)用和顯著性閾值都在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員掌握之中。本發(fā)明的snp標記可用來分離或基本純化同樣位于與以下基因座相關(guān)的連鎖群上的qtl的等位基因：asr抗性基因座1、asr抗性基因座2、asr抗性基因座3、asr抗性基因座4、asr抗性基因座5、asr抗性基因座6、asr抗性基因座7、asr抗性基因座8、asr抗性基因座9、asr抗性基因座10、asr抗性基因座11、asr抗性基因座12和asr抗性基因座13。構(gòu)建跨區(qū)的一系列重疊克隆(克隆重疊群)可為包括位于與以下基因座有關(guān)的連鎖群上的真菌病抗性qtl的等位基因的物理圖譜提供了基礎(chǔ)：asr抗性基因座1、asr抗性基因座2、asr抗性基因座3、asr抗性基因座4、asr抗性基因座5、asr抗性基因座6、asr抗性基因座7、asr抗性基因座8、asr抗性基因座9、asr抗性基因座10、asr抗性基因座11、asr抗性基因座12和asr抗性基因座13。酵母人工染色體(yac)克隆系統(tǒng)促進了染色體步查和大型克隆策略。利用本發(fā)明標記的序列標簽位點(sequencetagsite，sts)含量方法可用于構(gòu)建跨染色體區(qū)的yac克隆。這類構(gòu)建yac圖的sts含量方法可提供任何染色體區(qū)的詳細有序的基于sts的圖譜，包括包含同樣位于與以下基因座有關(guān)的連鎖群上的qtl的等位基因的區(qū)域：asr抗性基因座1、asr抗性基因座2、asr抗性基因座3、asr抗性基因座4、asr抗性基因座5、asr抗性基因座6、asr抗性基因座7、asr抗性基因座8、asr抗性基因座9、asr抗性基因座10、asr抗性基因座11、asr抗性基因座12和asr抗性基因座13?？捎猛ㄟ^使用bac、pac或含有大小范圍為70kb至數(shù)百個千堿基的插入序列的噬菌體p1克隆來跨區(qū)繪制的詳細的物理圖譜補充yac圖(cregan，theor.appl.gen.78:919-928(1999)；sternberg,proc.natl.acad.sci.87:103-107(1990)；sternberg,trendsgenet.8:11-16(1992)；sternberg等，newbiol.2:151-162(1990)；ioannou等，nat.genet.6:84-89(1994)；shizuya等，proc.natl.acad.sci.89:8794-8797(1992)，所有這些文獻都通過引用全部結(jié)合到本文中)。采用本發(fā)明的可用標記得到多套克隆重疊以篩選bac、pac、噬菌體p1或黏粒文庫。此外，可應(yīng)用雜交方法將yac圖轉(zhuǎn)化成bac、pac、噬菌體p1或黏粒重疊群圖。完整的yac和inter-alu-pcr的產(chǎn)物以及合適sts的引物序列可用來篩選bac、pac、噬菌體p1或黏粒文庫。使用sts含量信息和指紋法，可將分離用于任何區(qū)的克隆裝配成重疊群(sulston等，comput.appl.biosci.4:125-132(1988))。允許不同核酸序列編碼同一蛋白質(zhì)或肽的遺傳密碼的簡并性在文獻中有記載。當核酸分子編碼同一氨基酸序列但卻包含不同核苷酸序列時，則本文所使用的核酸分子是另一核酸分子的簡并核酸分子。本發(fā)明的一個方面是，本發(fā)明的核酸分子包括與編碼數(shù)量性狀等位基因蛋白質(zhì)的核酸分子是簡并的核酸分子。本發(fā)明的另一方面是，本發(fā)明的核酸分子包括與編碼qtl相關(guān)的一個或多個蛋白質(zhì)的核酸分子同源的核酸分子?？墒褂迷O(shè)計用于轉(zhuǎn)化目的的dna植物轉(zhuǎn)化載體或構(gòu)建體，將外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到植物中。一個特別優(yōu)選的細分的外源材料包含本發(fā)明的核酸分子。這類載體的設(shè)計一般為本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握(參見plantmolecularbiology:alaboratorymanual(植物分子生物學(xué)實驗室指南)，clark主編，springer，newyork(1997)，這類植物的實例包括但不限于苜蓿、擬南芥屬(arabidopsis)、大麥、蕓苔屬(brassica)、青花椰菜、卷心菜、柑桔、棉花、大蒜、燕麥、油料種子油菜、洋蔥、歐洲油菜、亞麻、玉米、觀賞植物、豌豆、花生、胡椒、馬鈴薯、水稻、黑麥、高粱、大豆、草莓、甘蔗、甜菜、番茄、小麥、楊樹、松樹、冷杉、桉樹、蘋果、萵苣、兵豆、葡萄、香蕉、茶樹、草坪草、向日葵、油椰、菜豆屬(phaseolus)等。構(gòu)建體或載體可包括本發(fā)明的真菌病抗性qtl的內(nèi)源啟動子。真菌病抗性的特征最好通過表達已鑒定出的具有內(nèi)源啟動子的qtl蛋白來實現(xiàn)?；蛘?，可以選擇異源啟動子來表達精選的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。這些啟動子可與編碼與真菌抗性qtl對應(yīng)的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列有效連接。異源啟動子可以是根據(jù)成熟期或開花期選出的異源啟動子，因為所需蛋白質(zhì)表達的時間選擇可能對影響真菌病抗性性狀的參數(shù)十分關(guān)鍵。真菌病抗性qtl的有效表達可能還需要在特定組織類型中表達的啟動子?；蛘撸瑔幼涌膳c其它核酸序列(例如編碼轉(zhuǎn)運肽、選擇標記蛋白的核酸序列或反義序列)有效連接?？梢栽谳d體將插入的細胞類型的基礎(chǔ)上或者在其調(diào)節(jié)特征的基礎(chǔ)上，對啟動子進行選擇。這種特征的實例包括轉(zhuǎn)錄活性的提高、可誘導(dǎo)性、組織特異性和發(fā)育階段特異性。植物中，已經(jīng)披露了病毒或合成來源的誘導(dǎo)型啟動子、組成型活性啟動子、時序調(diào)節(jié)啟動子和空間調(diào)節(jié)啟動子(poszkowski等，emboj.,3:2719,1989；odell等，nature,313:810,1985；chau等，science,244:174-181.1989)。常用的組成型啟動子包括camv35s啟動子(odell等，nature，313：810，1985)、增強型camv35s啟動子、玄參花葉病毒(fmv)啟動子(richins等，nucleicacidsres.20:8451,1987)、胭脂堿合酶(nos)啟動子(shaw等nucleicacidsres.12:7831-7846(1984))和章魚堿合酶(ocs)啟動子。可用的誘導(dǎo)型啟動子包括水楊酸或聚丙烯酸誘導(dǎo)的啟動子(pr-1；williams等，biotechnology10:540-543,1992)、施用安全劑誘導(dǎo)的啟動子(取代的苯磺酰胺除草劑；hershey和stoner，plantmol.biol.17:679-690,1991)、熱激啟動子(ou-lee等，proc.natl.acad.sciu.s.a.83:6815,1986；ainley等，plantmol.biol.14:949,1990)、從菠菜亞硝酸還原酶可轉(zhuǎn)錄多核苷酸序列得到的硝酸誘導(dǎo)型啟動子(back等，plantmol.biol.17:9,1991)、激素誘導(dǎo)型啟動子(yamaguchi-shinozaki等，plantmol.biol.15:905,1990)和與rubp羧化酶小亞基和lhcp家族有關(guān)的光誘導(dǎo)型啟動子(kuhlemeier等，plantcell1:471,1989；feinbaum等，mol.gen.genet.226:449-456,1991；weisshaar等，emboj.10:1777-1786,1991；lam和chua,j.biol.chem.266:17131-17135,1990；castresana等，emboj.7:1929-1936,1988；schulze-lefert等，emboj.8:651,1989)。重組載體中特別優(yōu)選的啟動子包括胭脂堿合酶(nos)啟動子(ebert等，1987)、章魚堿合酶(ocs)啟動子(它被攜帶在根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)的根瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒上)、花椰菜花葉病毒啟動子例如花椰菜花葉病毒(camv)19s啟動子(lawton等，1987)、camv35s啟動子(odell等，1985)、玄參花葉病毒35s-啟動子(walker等，1987)；得自核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亞基(ssrubisco)的光誘導(dǎo)型啟動子；得自煙草的eif-4a啟動子(mandel等，plantmol.biol,29:995-1004,1995)；得自擬南芥的幾丁質(zhì)酶啟動子(samac等，plantcell,3:1063-1072,1991)；得自青花椰菜的ltp(脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白)啟動子(pyee等，plantj.,7:49-59,1995)；矮牽牛查耳酮異構(gòu)酶啟動子(vantunen等，emboj.7:1257,1988)；菜豆富含甘氨酸蛋白1啟動子(keller等，embol.,8:1309-1314,1989)；馬鈴薯patatin啟動子(wenzler等，plantmol.biol.,12:41-50,1989)；擬南芥肌動蛋白7啟動子(genbank檢索號u27811.1gi:1002528、17-apr-1997和pct申請wo0144457a2；該文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)；擬南芥肌動蛋白8啟動子(an等，plantj.10:107-121(1996)和pct申請wo0144457a2)；擬南芥核酮糖二磷酸羧化酶－加氧酶小亞基4啟動子(krebbers等，plantmol.biol.11:745-759(1988))；蕓苔油菜籽蛋白基因啟動子(美國專利5,420,034，該專利的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)；擬南芥suc2啟動子(truernit等，planta196:564-570(1995))；擬南芥延伸因子ef-1α啟動子(axelos等，mol.gen.genet.219:106-112(1989))和大豆7sαβ伴大豆球蛋白(conglycin)啟動子，即sphas(doyle等，j.biol.chem.261:9228-9238(1986))。本發(fā)明的構(gòu)建體還可包括另外的mrna多核苷酸分子的5’非翻譯區(qū)(5’utr)或前導(dǎo)區(qū)或者可能在翻譯起始中起重要作用的基因。某些5’utr可起翻譯增強子的作用，并且還可整合成為重組載體的組成部分。例如，已經(jīng)證實，得自熱激蛋白基因的非翻譯5’前導(dǎo)多核苷酸分子提高基因在植物中的表達(參見例如美國專利5,659,122(該專利的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)以及美國專利5,362,865(該專利的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中))。因此，重組載體可優(yōu)選含有用來提高核酸序列表達的一個或多個5’非翻譯前導(dǎo)序列。這類增強子序列可能是提高或改變所得mrna的翻譯效率所需要的。優(yōu)選的5’核酸序列包括擬南芥肌動蛋白7前導(dǎo)序列(genbank檢索號u27811.1gi:1002528、17-apr-1997和pct申請wo0144457a2；該申請的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)；擬南芥肌動蛋白8前導(dǎo)序列(an等，plantj.10:107-121(1996)和pct申請wo0144457a2)；擬南芥核酮糖二磷酸羧化酶－加氧酶小亞基4前導(dǎo)序列(krebbers等，plantmol.biol.11:745-759(1988))；蕓苔油菜籽蛋白基因前導(dǎo)序列(美國專利5,420,034，該專利的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)；擬南芥suc2前導(dǎo)序列(truernit等，planta196:564-570(1995))；矮牽牛(petuniahybrida)hsp70基因前導(dǎo)序列(winter等，mol.gen.genet.211:315-319(1988))：擬南芥epsps基因前導(dǎo)序列(klee等，mol.gen.genet.210:437-442(1987))；擬南芥延伸因子ef-1α前導(dǎo)序列(axelos等，mol.gen.genet.219:106-112(1989))和大豆7sαβ伴大豆球蛋白前導(dǎo)序列(doyle等，j.biol.chem.261:9228-9238(1986))。另外這些上游調(diào)節(jié)的多核苷酸分子可得自相對于構(gòu)建體上存在的其它元件是天然或異源的來源。此外，構(gòu)建體可包括得自植物基因3’非翻譯區(qū)(3’utr)的另外的調(diào)節(jié)多核苷酸分子。3’utr或終止子通常提供轉(zhuǎn)錄終止信號和聚腺苷酸化信號，聚腺苷酸化信號的作用是在植物中使腺苷酸核苷酸加到mrna的3’端。位于聚腺苷酸化位點下游幾百個堿基對的核酸序列通常用來終止轉(zhuǎn)錄。此外，某些3’utr提供額外的性質(zhì)，例如提高mrna的穩(wěn)定性，如馬鈴薯蛋白酶抑制劑ii基因的3’utr(an等，theplantcell1:115-122(1989))。其它3’utr可提供增強mrna降解的序列，例如在動物細胞中顯示是引起rna信息穩(wěn)定性較低的5’-uuauuuauu-3’基序(zubiaga等，mol.cellbiol.15:2219-2230(1995))。這些額外的下游調(diào)節(jié)多核苷酸分子可得自相對于構(gòu)建體上存在的其它元件是天然或異源的來源。優(yōu)選的3’utr或終止子是馬鈴薯蛋白酶抑制劑ii基因3’utr(an等，theplantcell1:115-122(1989))；豌豆核酮糖二磷酸羧化酶－加氧酶小亞基e9終止子(coruzzi等，emboj.3:1671-1679(1984))；花椰菜花葉病毒35s終止子；蕓苔油菜籽蛋白基因終止子(美國專利5,420,034)；大豆7sαβ伴大豆球蛋白基因終止子(doyle等，j.biol.chem.261:9228-9238(1986))；菜豆(phaseoulusvulgaris)arc5終止子(goossens等，eur.j.biochem.225:787-795(1994))；根癌土壤桿菌胭脂堿合酶終止子(rojiyaa等，1987，genbank檢索號e01312和美國專利申請us20020192813a1，這些文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)和大豆adr12基因終止子(datta等，plantmol.biol.21:859-869(1993))。載體或構(gòu)建體還可包括得自某些基因的內(nèi)含子的調(diào)節(jié)元件。其實例包括adh內(nèi)含子1(callis等，genesanddevelop.1:1183-1200(1987)；蔗糖合酶內(nèi)含子(vasil等，plantphysiol.91:1575-1579(1989)和tmvω元件(gallie等，theplantcell1:301-311(1989))。優(yōu)選的內(nèi)含子是擬南芥肌動蛋白7內(nèi)含子(genbank檢索號u27811.1gi:1002528、17-apr-1997和pct申請wo200144457a2；這些文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)；擬南芥肌動蛋白8內(nèi)含子(an等，plantj.10:107-121(1996)和pct申請wo200144457a2)及擬南芥延伸因子ef-1α內(nèi)含子(axelos等，mol.gen.genet.219:106-112(1989))。適當時可包括這些元件和其它調(diào)節(jié)元件。載體或構(gòu)建體還可包括選擇標記(selectablemarker)。還可以采用選擇標記來選擇含有外源遺傳物質(zhì)的植物或植物細胞。這些選擇標記的實例包括但不限于neo基因(potrykus等，mol.gen.genet.199:183-188(1985))，它編碼卡那霉素抗性并可用卡那霉素、g418等來選擇；編碼雙丙氨膦(bialaphos)抗性的bar基因；突變型epsp合酶基因(hinchee等，bio/technology6:915-922(1988))，它編碼草甘膦抗性；賦予溴苯腈抗性的腈水解酶基因(stalker等，j.biol.chem.263:6310-6314(1988))；賦予咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突變型乙酰乳酸合酶基因(als)(例如美國專利6,222,100，該專利的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)；甲氨蝶呤抗性dhfr基因(thillet等，j.biol.chem.263:12500-12508(1988))；由例如嗜麥芽假單胞菌(pseudomonasmaltophilia)的麥草畏單加氧酶(dmo)基因賦予的麥草畏耐受性(美國專利申請20030135879，該專利的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。載體或構(gòu)建體還可包括篩選標記(screenablemarker)。篩選標記可用來監(jiān)測表達。示例性的篩選標記包括β-葡糖醛酸糖苷酶基因或編碼已知的各種顯色底物的酶的uida基因(gus)(jefferson，plantmol.biol,rep.5:387-405(1987)，該文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中；jefferson等，emboj.6:3901-3907(1987)，該文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)；r-基因座基因，它編碼的產(chǎn)物調(diào)節(jié)植物組織中花色素苷色素(紅色)的產(chǎn)生(dellaporta等，stadlersymposium11:263-282(1988)，該文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)；β-內(nèi)酰胺酶基因(sutcliffe等，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)75:3737-3741(1978)，該文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)，編碼各種顯色底物是已知的酶的基因(例如padac、顯色頭孢菌素)；螢光素酶基因(ow等，science234:856-859(1986)，該文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)；xyle基因(zukowsky等，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)80:1101-1105(1983)，該文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)，它編碼可以轉(zhuǎn)化顯色兒茶酚的兒茶酚雙加氧酶；α-淀粉酶基因(ikatu等，bio/technol.8:241-242(1990)，該文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)；酪氨酸酶基因(katz等，j.gen.microbiol.129:2703-2714(1983)，該文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)，它編碼能夠使酪氨酸氧化成dopa且多巴醌進而縮合成黑色素的酶和α-半乳糖苷酶。可以采用本領(lǐng)域已知的將轉(zhuǎn)基因?qū)胫参镏械娜魏渭夹g(shù)來制備本發(fā)明的真菌病抗性植物。一般認為植物轉(zhuǎn)化的合適方法實際上包括可將dna導(dǎo)入細胞的任何方法，例如通過電穿孔，參見美國專利號5,384,253；微彈轟擊，參見美國專利號5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861和6,403,865；土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，參見美國專利號5,635,055、5,824,877、5,591,616、5,981,840和6,384,301以及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，參見美國專利號5,508,184。通過例如這些技術(shù)的應(yīng)用，實際上任何植物品種的細胞都可被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，并且這些細胞可發(fā)育成轉(zhuǎn)基因植物。用于棉花轉(zhuǎn)化方面的技術(shù)參見美國專利號5,846,797、5,159,135、5,004,863和6,624,344；蕓苔屬植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)特別參見例如美國專利5,750,871；大豆轉(zhuǎn)化技術(shù)參見例如zhang等(plantcelltissueorgancult56:37-46(1999)和美國專利6,384,301。既然我們已對本發(fā)明進行了一般性描述，通過參考下面以示例方式提供的實施例就能更容易地理解本發(fā)明，實施例并不是對本發(fā)明的限制，除非另有說明。實施例實施例1：含有asr抗性基因座的近等基因系的育種1400個單核苷酸多態(tài)性(snp)標記，隨機分布在大豆遺傳連鎖圖的20個連鎖群中，被用來鑒定與asr抗性基因座1基因座緊密連鎖的snp標記。從williams82與asr抗性基因座1供體pi200492雜交培育出由近等基因系(nil)組成的一組大豆品系。采用了pi200492的衍生系來鑒定在williams82和pi200492之間為多態(tài)的snp標記。然后使用這些多態(tài)性snp標記，利用分離的回交種群l85-2378來鑒定asr抗性基因座1的圖位。通過將williams82與pi200492雜交培育出l85-2378，進行5輪回交循環(huán)或者基本上6輪williams82回交以恢復(fù)大多williams82的良性性狀。因此，產(chǎn)生了由幾乎同回交親本williams82、但nil的每個個體攜帶得自供方親本pi200492的不同數(shù)量或嵌合的基因組區(qū)的個體組成的l85-2378。用上述鑒定出的多態(tài)性snp標記對整個種群進行了基因型分析，隨后采用溫室實驗法對大豆銹病抗性進行了評價。對snp標記基因型與大豆銹病抗性表型間的關(guān)聯(lián)性進行了評價。發(fā)現(xiàn)與asr抗性基因座1病害表型反應(yīng)高度連鎖不平衡的snp標記為ns0093250、ns0119710、ns0103004、ns0099454、ns0102630、ns0102915、ns0102913、ns0123728、ns0129943、ns0102168、ns0092723、ns0098177、ns0127343和ns0101121，參見表1，并被標注為seqidno:67-80。所有這些snp標記都作圖在通用大豆遺傳連鎖圖的g連鎖群的區(qū)域上。表1列出了標注為seqidno:1-28的pcr擴增引物序列和對應(yīng)于這些snp標記的標注為seqidno:100-127的探針。鑒定出兩個snp標記用于監(jiān)測asr抗性基因座1的陽性漸滲，并分別對應(yīng)于snp標記nso102913和nso129943以及對應(yīng)于seqidno:73和seqidno:75。還在下列f2:3種群中，對asr抗性基因座1針對得自美國阿拉巴馬州大豆銹病分離菌種的功效進行了評價：ag4403xpi200492、ag3302xpi200492、ag3201xpi200492、ag26932xpi200492、ag2402xpi200492。在所述各種群中，觀測到3:1分離比率，這表明了單顯性基因遺傳模式。根據(jù)所述用于asr抗性基因座1的方法，由williams82與供方親本pi462312雜交，接著進行5輪回交循環(huán)，或基本上6輪williams82回交以恢復(fù)大多williams82的良性性狀，用由此產(chǎn)生的nil對asr抗性基因座3基因座作圖。因此，產(chǎn)生了由幾乎同回交親本williams82、但是近等基因系的每個個體攜帶了得自供方親本pi200492的不同數(shù)量或嵌合的基因組區(qū)的個體組成的l85-2378。用上述鑒定出的一套多態(tài)性snp標記，對整個種群進行了基因型分析，并且采用溫室實驗法，隨后對大豆銹病抗性進行了評價。對snp標記基因型與大豆銹病抗性表型之間的關(guān)聯(lián)性進行了評價。發(fā)現(xiàn)與asr抗性基因座3高度連鎖不平衡的snp標記為ns0099746、ns0123747、ns0126598、ns0128378、ns0096829、ns0125408、ns0098902、ns0099529、ns0097798、ns0137477、ns0095322、ns0136101和ns0098992，參見表1，并被標注為seqidno:81-93。這些標記都作圖在通用大豆遺傳學(xué)圖的lgc2連鎖群上。表1列出了標注為seqidno:29-54的pcr擴增引物序列和對應(yīng)于這些snp標記的標注為seqidno:128-153的探針。監(jiān)測asr抗性基因座3漸滲所用的標記對應(yīng)于snp標記nso137477，被標為seqidno:90。為了證實asr抗性基因座3的推定位置，在avrdc-8和ag4403之間培育出分離的f3:4種群。avrdc-8是由臺灣亞洲蔬菜研究開發(fā)中心通過ankur(含有asr抗性基因座3的品系)與pi230970(asr抗性基因座2供體)雜交培育出的品系。目前正在對這個種群的snp標記進行基因型分析，并對針對得自loxley，al的大豆銹病分離菌株的抗性反應(yīng)進行評價，以證實asr抗性基因座3的位置。隨后在基于一組pi系和文獻已報道含有任一qtl的其它系之間多態(tài)性的研究中確定了asr抗性基因座2和asr抗性基因座4的大致位置，所述pi系是已知分別含有asr抗性基因座2或asr抗性基因座4，即是asr抗性基因座2供體和asr抗性基因座4供體的pi230970和pi459025b。根據(jù)多態(tài)性研究，任何多態(tài)性snp標記都是接近asr抗性基因座的候選區(qū)。對于asr抗性基因座2，鑒定出兩個候選區(qū)，該基因座很可能位于j連鎖群，接近或在褐莖腐病、大豆胞囊線蟲抗性和蛙眼病抗病性簇內(nèi)，或者在n連鎖群內(nèi)。asr抗性基因座4很可能位于n連鎖群內(nèi)。表1.用于asr抗性基因座1和asr抗性基因座3鑒定和選擇的snp標記實施例2：孢子的收集和繁殖從monsantoloxleyagronomystation(loxley，al)的受感染植物中收集豆薯層銹菌的亞洲大豆銹病夏孢子，本文稱為loxley菌株。將懸浮于含有0.01％吐溫20(tween-20)的水中的孢子噴撒在葉背面而接種到大豆植物中。感染后7-10天左右無需放大便可目測到病斑發(fā)生，感染后12-14天則形成孢子。收集受感染植物的孢子，將其重懸浮于含有0.01％吐溫20的無菌去離子水中。孢子濃度用血細胞計數(shù)器測定。實施例3：亞洲大豆銹病抗性的離脫葉實驗對兩種類型的葉組織進行了評價以進行asr病害表型分析。對出苗后7-10天具一小葉的葉片或出苗后21-28天具三葉的葉片v3進行了評價。從土壤中出苗后2天左右，大豆植物長出一對具一小葉的葉片，5天左右完全展開，構(gòu)成第一“真葉”。出苗后7天左右，出現(xiàn)具三葉的葉片(在一個葉柄末端包含3片葉)。依次出現(xiàn)三組葉片，第一具三葉的葉片被稱為v1期，在出苗后10天完全伸展。接下來的兩個v期相隔一周發(fā)生。值得注意的是，在葉片展開和硬化后，即不是新葉和嫩葉，才給葉片接種病害。具一小葉的葉片往往硬化得非常快，在出苗后8-10天左右，而v2和v3具三葉的葉片可能直到出苗后24-28天才完全展開。將3張直徑3.2cm的watmann#1濾紙各放入6孔組織培養(yǎng)板(孔容積為15.5毫升)的6孔各孔中。將葉片切成3厘米x3厘米的小塊，將葉片背面(氣孔面)向上放在watmann濾紙上面。將大約2.0毫升無菌去離子水加到6孔組織培養(yǎng)板各孔中。將得自豆薯層銹菌的亞洲大豆銹病夏孢子懸浮于含有0.01％吐溫20的無菌去離子水中，濃度為1x105個夏孢子/毫升。用噴槍(badger155anthem型，badgerair-brushco.，franklinpark，il)與設(shè)置為1千克/平方厘米的壓縮機(tc-20型，airbrushdepot，sandiego，ca)，將約50微升孢子懸液噴灑到各葉片上至濕潤。然后將6孔板用石蠟?zāi)っ芊猓⒎诺皆O(shè)置為22攝氏度的生長室內(nèi)，光周期為12小時/晝長。每2天或每3天監(jiān)測板中病害的進展，并確保各孔不變干。需要時加入去離子水補充至最初的孔容積，或者調(diào)整培育箱相對濕度至大約80％。接種后3-5天左右，發(fā)生病斑的早期癥狀在解剖顯微鏡下應(yīng)是明顯的。接種后9-14天形成孢子的病斑應(yīng)是明顯的。由多次試驗計算出平均大豆銹病嚴重程度分值。銹病嚴重程度分值使用1-5的評價等級；1－是免疫的，2－在50％以下的葉片區(qū)域顯示紅色/棕色病斑，3－在50％以上的葉片區(qū)域顯示紅色/棕色病斑，4－在50％以下的葉片區(qū)域顯示黃褐色病斑和5－在50％以上的葉片區(qū)域顯示黃褐色病斑。本測定法的葉切片可保持存活長達2個月。采用易感亞洲大豆銹病的大豆lee74的實驗，對于每次進行的測定都始終顯示感染程度高。評價推定的抗性種質(zhì)的進一步實驗?zāi)軌騾^(qū)分表2中所示的易感保藏品種的耐受性。保藏品種pi200487表現(xiàn)出遲發(fā)銹病(slowrust)抗性表型。我們正在嘗試以期鑒定出可用于把在pi200487中鑒定出的抗性基因座漸滲到優(yōu)良種質(zhì)中的標記。此外，具一小葉的葉片組織與具三葉的葉片組織的asr評價的比較顯示，對于具三葉的葉片組織，由種子到數(shù)據(jù)點需要45天左右，對于具一小葉的葉片組織則23天左右。實驗時間縮減了一半，這顯然節(jié)省了確定抗病性評級所需要的離脫葉實驗和時間。由于節(jié)省3周時間，植物可以更快的時標繁殖，易感植物可越早剔出，因此節(jié)省了田間和溫室空間。表2.用具一小葉的葉片組織和具三葉的葉片組織測定的抗性和易感保藏品種(accession)的平均銹病分值；“-”表示未進行實驗。實施例4：對于具有漸滲的asr抗性基因座1、asr抗性基因座2和asr抗性基因座3的豆薯層銹菌抗性的優(yōu)良雜交品種的試驗將含有asr抗性基因座1的供方抗性親本系pi200492與不同大豆優(yōu)良系進行雜交，以監(jiān)測asr抗性基因座1的陽性漸滲。用從抗性親本系保藏品種pi200492(asr抗性基因座1)以及已知的抗性保藏品種(pi230970(asr抗性基因座2)和pi462312(asr抗性基因座3))與易感優(yōu)良系雜交得到的品系進行了loxley菌株抗性的葉片實驗。所有試驗品系的抗性分值見表3。平均銹病嚴重程度分值得自4株植物，每株4次重復(fù)，并在不同的4天中進行了評分(10dai、17dai、24dai、32dai)。表3.asr回交事件和優(yōu)良系的平均銹病嚴重程度分值含有asr抗性基因座1基因座的品系具有最大loxley菌株抗性。通過mas證實了asr抗性基因座1的漸滲。實施例5：采用離脫葉實驗測定大豆保藏品種的asr抗性基于溫室實驗法，采用外部起源的asr分離菌種的混合種群，鑒定出700個推定的asr抗性保藏品種。按照實施例3所述方法，用700個usda推定的抗性保藏品種中的250個的一小組進行了asr抗性的葉片實驗。選出得自usda的一組補充的250個asr易感保藏品種，用于在葉實驗中根據(jù)使成熟和地理起源相對應(yīng)而與250個抗性保藏品種進行比較。大多數(shù)抗性保藏品種(這些品種的平均銹病嚴重程度分值為1-2)的平均銹病嚴重程度分值見下表4。1400個snp標記，每隔5厘摩分布在大豆遺傳連鎖圖20個連鎖群中，可用來鑒定用于在下列抗性保藏品種所具有的asr抗性基因座漸滲到優(yōu)良種質(zhì)的標記。表4.asr抗性保藏品種的平均銹病嚴重程度分值此外，對于一組89個抗性保藏品種，對分布在asr抗性基因座3近端和遠端的snp標記進行了基因型分析。發(fā)現(xiàn)4個額外的snp標記(ns0103749、ns0118897、ns0119715和ns0130920)與asr抗性基因座3有關(guān)并列于表中，標注為seqidno:94-97。表5列出了標注為seqidno:55-62的pcr擴增引物序列和對應(yīng)于這些snp標記的標注為seqidno:154-161的探針。該信息將用來鑒定使asr和其它病原體抗性基因座漸滲以優(yōu)先順序排列的新的抗性來源。表5.用于asr抗性基因座3鑒定和選擇的snp標記實施例6.應(yīng)用相關(guān)研究來鑒定賦予真菌病抗性的qtl為了鑒定與病害有關(guān)的區(qū)或基因，第一步是培育抗性變種。之前已鑒定出4個銹病抗性的基因座(asr抗性基因座1、asr抗性基因座2、asr抗性基因座3、asr抗性基因座4)。在這個實施例中，連鎖不平衡和單元型關(guān)聯(lián)作圖被應(yīng)用于大豆種質(zhì)的病例對照數(shù)據(jù)樣品中。用797個snp，對492個大豆品系(246個抗性易感對)的銹病抗性進行評分并進行指紋分析。對豆薯層銹菌分離菌種混合物的抗病性按1-5分進行評分，小于3為抗性，大于4為易感。準確地講，對3、5和9個連續(xù)snp的窗大小進行了病例對照測定、費希爾精確檢驗(fishers'exacttest)、單標記f檢驗和單元型趨勢回歸研究。多項檢驗結(jié)果明顯將2個單獨的單元型窗的2個snp標記與真菌病抗性聯(lián)系在一起，所述單元型窗本文稱為真菌病抗性單元型窗1和2，位于具有真菌病抗性的13號染色體24-45cm。snp標記ns0103033和ns0124935分別位于真菌病抗性單元型窗1和2上。ns0103033(seqidno:98)的引物用seqidno:63和64標注，探針用seqidno:162和163標注。ns0124935(seqidno:99)的引物用seqidno:65和66標注，探針用seqidno:164和165標注。每個單元型的抗性分值和每個單元型的標記等位基因見表5。指定每個窗5個snp標記，且每個的等位基因用單元型序列表示。單元型窗1中ns0103033的等位基因和單元型窗2中ns0124935的等位基因用黑體字表示。至于ns0103033，snp實際為9-bp插入/缺失，其中“z”表示缺失(*********)，“w”表示插入(gaagtggat)。含有得自單元型窗1和/或單元型窗2的抗性單元型的變化見表6。這個作圖成就除了上述asr抗性基因座以外，還鑒定出額外的asr抗病性qtl。表5.asr抗性單元型窗1和2中含有抗性單元型品系的評分一覽表?？剐苑种?表示有抗性的品系，分值1表示稱為易感的品系。表6.13號染色體上asr抗性窗1和/或2中含有單元型的抗性種質(zhì)病害評級。雖然已經(jīng)說明和描述了本發(fā)明的原理，但是對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不偏離本發(fā)明的原理的情況下，可在安排和細節(jié)方面對本發(fā)明作出修改。我們要求落入所附權(quán)利要求書精神和范圍內(nèi)的所有修改的權(quán)益。本說明書所引用的所有出版物和專利文件都通過引用結(jié)合到本文中，如果各個出版物或?qū)＠暾埦唧w和個別規(guī)定了通過引用結(jié)合的程度，則引用程度與之相同。<110>孟山都技術(shù)有限公司(monsantotechnologyllc.)baley,georgejamesbutruille,davidconcibido,vergelceathington,samuelrhaverdink,michaeldkruger,warrenmledeaux,johnrnarvel,jamespitkin,johnwtamulonis,johnpxie,chongqing<120>大豆抗病性數(shù)量性狀基因座及其組成的鑒定方法<130>38-21(53517)<140>60/808430<141>2006-05-25<160>165<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>1cacctgttgcttctccaccat21<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>2gggtggtgctcttggaggta20<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>3taaagcaaaaggacgttacgacaa24<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>4gcattgatttgtccacgaagaac23<210>5<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>5ttgcaattttttatatcttgatttcacat29<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>6gcgaagaatcaaaactggtcaaa23<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>7aagtggaggaggaaatgatgga22<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>8caagggccctgattatgtgaa21<210>9<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>9acaaggacaaggctatgagaagtaaga27<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>10ggccatgaatcaagccactt20<210>11<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>11gagttagatttatccggcaacga23<210>12<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>12cccgaagagatgtcatgttaacaa24<210>13<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>13gggttaccttcatagctgctattttc26<210>14<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>14gggcacaacacctgaatgg19<210>15<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>15ccgcagtgaatcaagtaattagttaataa29<210>16<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>16aaggtttagttcgatcagtgattttga27<210>17<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>17ggtttcagatattttgataagctaattagatg32<210>18<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>18caagaactcacattcctcagatgaag26<210>19<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>19agggcctattgtgatgattaagga24<210>20<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>20aaatctgaaaaagcatcccaaaag24<210>21<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>21gtaataatcccaaacatttttcttcga27<210>22<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>22gggatgagttgaattaattttcaaagta28<210>23<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>23gcatgctgcttttaactatgaaacat26<210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