本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，涉及u6、mir92a及mir21三種mirna進行單管三重逆轉(zhuǎn)錄的檢測方法及逆轉(zhuǎn)錄后進行單管雙重定量的檢測方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

微rna(mirna)是一類非編碼單鏈小分子rna，長度為20～24個核苷酸，位于基因組的非編碼區(qū)，具有高度保守性，時序性和組織特異性。mirna在發(fā)育、細胞增殖、凋亡、脂類代謝、激素分泌及腫瘤發(fā)生等多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。

mir21是較早發(fā)現(xiàn)的人類mirna之一，在多種生物及哺乳動物多種組織中的廣泛存在。大量研究表明，mir21可作為原癌基因在多種腫瘤中高表達并參與細胞的增生、分化、凋亡等過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。因此，檢測mir21的含量對腫瘤的診斷、治療和預(yù)后等具有重要意義。

mir92a可調(diào)控人體細胞中參與細胞分化、凋亡、遷移、免疫等過程中的相關(guān)基因表達；另一方面多種腫瘤和疾病，如心血管系統(tǒng)疾病中，存在mir92a的表達異常情況。因此mir92a含量可作為一種生物標志物，為相關(guān)疾病的診療提供參考，檢測mir92a含量具有重要基礎(chǔ)和臨床意義。

由于mirna序列短、沒有poly(a)尾巴、在細胞內(nèi)的表達水平比較低，且許多同源mirna(如let-7家族)序列相似度高，僅差1～2個堿基，使設(shè)計的分析探針雜交效率低。為了提高雜交反應(yīng)的親合性和檢測靈敏度，丹麥exiqon公司的鎖核酸(lockednucleicacid，lna)技術(shù)被應(yīng)用于mirna的分析研究。目前，基于鎖核酸(lna)等技術(shù)的支撐，科學(xué)家研究出了多種有效的mirna檢測方法，如northernblotting、微陣列法(mirnaarray)、克隆和測序法、實時熒光定量pcr(rt-qpcr)法等。

rt-qpcr更加簡單方便，不需標記、操作簡單、成本較低、并且靈敏度極高；能在短時間內(nèi)獲得結(jié)果，可檢測多個mirna的表達，需要的rna量較少，因而被廣泛用于組織中mirna表達譜的構(gòu)建。

目前mirna逆轉(zhuǎn)錄成cdna的方法主要有三種：引物延伸逆轉(zhuǎn)錄法；引物加尾法；莖環(huán)引物逆轉(zhuǎn)錄法。延伸及加尾兩種方法操作簡單，一種引物可逆轉(zhuǎn)錄多種mirna，但后續(xù)的定量依賴經(jīng)過修飾的定量引物，特異性不高；莖環(huán)引物克服了mirna序列短的缺點，引入莖環(huán)序列，進一步增加了rna-dna鏈互補配對的堿基數(shù)，提高了其熱穩(wěn)定性，逆轉(zhuǎn)錄效率增加。但逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，逆轉(zhuǎn)錄酶對后續(xù)的qpcr有明顯的抑制作用。qpcr采用的信號檢測模式主要有兩種：sybrgreen熒光染料法和taqman探針法，后者特異性更好。

目前，莖環(huán)引物逆轉(zhuǎn)錄法中，每種mirna都需要設(shè)計一個特異的反轉(zhuǎn)錄引物。若需要對樣本中的多個mirna進行定量，逆轉(zhuǎn)錄需分管進行，步驟繁瑣，從反轉(zhuǎn)錄到定量pcr，工作量較大。另外，對mirna進行定量時，往往需要一個內(nèi)參基因，單管單重定量時，反應(yīng)條件不穩(wěn)定，加樣有誤差，定量不準確，且耗時耗力，較為繁瑣。此外莖環(huán)引物及定量引物在同一體系中，引物二聚體嚴重，易引起過度擴增。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr檢測方法，使u6、mir92a及mir21的三重逆轉(zhuǎn)錄在同一反應(yīng)管中進行，使得多個mirna逆轉(zhuǎn)錄時，步驟更簡潔，轉(zhuǎn)錄效率和特異性更高；且mir21和u6、mir92a和u6分別進行單管雙重定量，使得mir21和mir92a的定量檢測誤差更小，步驟更簡便，定量結(jié)果更準確，可靠。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是提供一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr檢測方法及試劑盒，實現(xiàn)對u6、mir92a及mir21的快速準確定量，應(yīng)用極為方便。

一個方面，本發(fā)明提供了用于u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物組。

所述的逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物組包括以下3條引物序列：引物stem-loopprimer21，其核苷酸序列如seqidno：1所示：5’-ctcaactgctctgctccagtcgcggattcagttgagtcaacat-3’；引物stem-loopprimer92a，其核苷酸序列如seqidno：2所示：5’-gtcgtatccagtcgtcgctccgactcgcgctggatacgacacaggccg-3’；引物stem-loopprimeru6，其核苷酸序列如seqidno：3所示：5’-gtcgtatccagctctgctccagtcgcggattctggatacgacaaaata-3’。

另一個方面，本發(fā)明提供了一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的定量檢測引物組和定量檢測探針組。

所述的定量檢測引物組和定量檢測探針組是：定量檢測引物組1和定量檢測探針組1；和/或定量檢測引物組2和定量檢測探針組2。

所述的定量檢測引物組1包括以下4條定量檢測引物：定量pcr上游引物m2102，其核苷酸序列如seqidno：4所示：5’-ccccggtagcttatcagactg-3’；定量pcr下游引物m2103，其核苷酸序列如seqidno：5所示：5’-ctcaactgctctgctccagt-3’；定量pcr上游引物u602，其核苷酸序列如seqidno：6所示：5’-ctcgcttcggcagcaca-3’；定量pcr下游引物u603，其核苷酸序列如seqidno：7所示：5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’；

所述的定量檢測探針組1包括以下2條定量檢測探針：探針m2104，其序列為seqidno：8(5’-gttgactcaactgaatccgcg-3’)所示的核苷酸序列或其互補的核苷酸序列；探針u604，其序列為seqidno：9(5’-agaagattagcatggcccct-3’)所示的核苷酸序列或其互補的核苷酸序列；

探針m2104和探針u604的核苷酸序列的5’端標記有不同的熒光基團，所述的熒光基團分別選自fam、hex、vic中的一種；探針m2104和探針u604的核苷酸序列的3’端標記有猝滅基團mgb。

所述的定量檢測引物組2包括以下4條定量檢測引物：定量pcr上游引物序列m9202，其核苷酸序列如seqidno：10所示：5’-ccctgtattgcacttgtcc-3’；定量pcr上游引物序列m9203，其核苷酸序列如seqidno：11所示：5’-gtcgtatccagtcgtcgc-3’；定量pcr上游引物u602，其核苷酸序列如seqidno：6所示：5’-ctcgcttcggcagcaca-3’；定量pcr下游引物u603，其核苷酸序列如seqidno：7所示：5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’；

所述的定量檢測探針組2包括以下2條定量檢測探針：

探針m9204，其序列為seqidno：12(5’-cggcctgtgtcgtatcca-3’)所示的核苷酸序列或其互補的核苷酸序列；探針u604，其序列為seqidno：9(5’-agaagattagcatggcccct-3’)所示的核苷酸序列或其互補的核苷酸序列；

探針m9204和探針u604的核苷酸序列的5’端標記有不同的熒光基團，所述的熒光基團分別選自fam、hex、vic中的一種；探針m2104和探針u604的核苷酸序列的3’端標記有猝滅基團mgb。

另一個方面，本發(fā)明提供了一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr檢測試劑盒。

所述的試劑盒包括本發(fā)明所述的逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物組、定量檢測引物組和定量檢測探針組。

所述的試劑盒還包括酶系、pcr反應(yīng)試劑和定量標準品。

所述的酶系包括mmlvdna聚合酶、tfldna聚合酶和stoffel片段；

所述的pcr反應(yīng)試劑包括：

ph8.3～8.5的tris-h2so4，ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸，檸檬酸鈉，(nh4)2so4，mgso4，聚氧乙烯月桂醚，乙?；Ｑ灏椎鞍缀蚫ntp。

所述的定量標準品為：定量標準品1和/或定量標準品2；根據(jù)mirna及莖環(huán)引物序列，分別合成mir21質(zhì)粒、mir92a質(zhì)粒和u6質(zhì)粒。mir21質(zhì)粒含有如seqidno：13(5'-ctcaactgctctgctccagtcgcggattcagttgagtcaacatcagtctgataagcta-3’)所示核苷酸序列；mir92a質(zhì)粒含有如seqidno：14(5'-gtcgtatccagtcgtcgctccgactcgcgctggatacgacacaggccgggacaagtgcaata-3’)所示核苷酸序列；u6質(zhì)粒含有如seqidno：15(5'-aacgcttcacgaatttgcgtgtcatccttgcgcaggggccatgctaatcttctctgtatcgttccaattttagtatatgtgctgccgaagcgagcac-3')所示核苷酸序列。計算質(zhì)?？截悢?shù)，u6、mir92a和mir21質(zhì)粒分別稀釋至e⁵、e⁴、e³、e²拷貝數(shù)/μl。將同濃度的u6、mir21質(zhì)?；旌?，即得到同時含u6、mir21質(zhì)粒且u6、mir21質(zhì)粒濃度分別為5e⁴、5e³、5e²、5e拷貝數(shù)/μl的定量標準品1；將同濃度的u6、mir92a質(zhì)?；旌希吹玫酵瑫r含u6、mir92a質(zhì)粒且u6、mir92a質(zhì)粒濃度分別為5e⁴、5e³、5e²、5e拷貝數(shù)/μl的定量標準品2。

再一個方面，本發(fā)明提供了一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的檢測方法，所述的檢測方法指利用本發(fā)明所述的u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的逆轉(zhuǎn)錄引物組、定量檢測引物組和定量檢測探針組，及所述的酶系、pcr反應(yīng)體系和定量標準品，使用rt-qpcr技術(shù)對u6、mir92a及mir21進行定量分析；

所述的檢測方法包括以下步驟：

(1)提取mirna：取待測全血樣本，提取樣本的mirna；

(2)逆轉(zhuǎn)錄mirna：

a、以步驟(1)提取的mirna作為模板，各逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物使用不同濃度，按以下配比配制premix：

b、將上述premix溫和混勻，70℃預(yù)熱5分鐘，立即轉(zhuǎn)入冰上5分鐘，得到premix-1；

c、按以下配比配制rtmix：

其中，rt-pcr反應(yīng)液包括：ph8.3～8.5的tris-h2so442～65mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸9～32mm、檸檬酸鈉2～4.3mm、(nh4)2so49～23mm、mgso43.5～9mm、質(zhì)量百分比為0.10％～0.5％的聚氧乙烯月桂醚、質(zhì)量體積比為0.01％～0.1％的乙?；Ｑ灏椎鞍?；

d、將步驟(2)-c配制的rtmix與步驟(2)-b中得到的premix-1混合，普通pcr儀進行逆轉(zhuǎn)錄，得到逆轉(zhuǎn)錄的cdna；

其中，逆轉(zhuǎn)錄時使用的pcr反應(yīng)程序為：25℃，5分鐘；42℃，60分鐘；70℃，15分鐘；4℃，保存；

(3)雙重定量pcr：

a、分別以步驟(2)-d得到的cdna、以及定量標準品為模板，按以下配比配制mir21和u6單管雙重定量及mir92a和u6單管雙重定量反應(yīng)體系：

其中，定量pcr反應(yīng)液包括：ph8.3～8.5的tris-h2so442～65mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸10～30mm、檸檬酸鈉2～4.3mm、(nh4)2so49～23mm、mgso43.5～9mm、質(zhì)量百分比為0.10％～0.5％的聚氧乙烯月桂醚、質(zhì)量體積比為0.01％～0.1％的乙酰化牛血清白蛋白、dntp0.2～0.5mm、定量檢測引物組600～1000nm和定量檢測探針組150～300nm；

酶混合液包括：等體積的tfldna聚合酶和stoffel片段。

b、單管雙重定量反應(yīng)體系配制好后，利用定量pcr儀進行擴增，所用的定量程序為：第一步：37℃，5分鐘；94℃～96℃8～12分鐘；第二步：94℃～95℃15～30秒，62℃～68℃15～50秒，68℃～72℃20～40秒，4～8個循環(huán)；第三步：93℃～95℃15～20秒，62℃，15～30，68℃～72℃，20秒，10個循環(huán)；第四步：93℃～95℃，15秒，52℃～62℃，15秒，68℃～72℃，30～60秒，40個循環(huán)；

c、定量分析：

mir21和u6單管雙重定量分析：在定量pcr儀的不同熒光通道分別讀取mir21和u6的擴增曲線；根據(jù)5e⁴、5e³、5e²、5e拷貝數(shù)/μl定量標準品1的擴增結(jié)果，分別繪制mir21和u6的標準曲線；利用該標準曲線，計算步驟(2)-d得到的cdna中mir21和u6的定量值；以mir21的定量值除以u6的定量值，即得本待測全血樣本中mir21的相對含量。

mir92a和u6的單管雙重定量分析：在定量pcr儀的不同熒光通道分別讀取mir92a和u6的擴增曲線；根據(jù)5e⁴、5e³、5e²、5e拷貝數(shù)/μl定量標準品2的擴增結(jié)果，分別繪制mir92a和u6的標準曲線；利用該標準曲線，計算步驟(2)-d得到的cdna中mir92a和u6的定量值；以mir92a的定量值除以u6的定量值，即得本待測全血樣本中mir92a的相對含量。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的rt-pcr反應(yīng)液包括：ph8.3的tris-h2so442mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸9mm、檸檬酸鈉2mm、(nh4)2so49mm、mgso43.5mm、質(zhì)量百分比為0.10％的聚氧乙烯月桂醚、質(zhì)量體積比為0.01％的乙?；Ｑ灏椎鞍祝?/p>

在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的rt-pcr反應(yīng)液包括：ph8.5的tris-h2so465mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸32mm、檸檬酸鈉4.3mm、(nh4)2so423mm、mgso49mm、質(zhì)量百分比為0.5％的聚氧乙烯月桂醚、質(zhì)量體積比為0.1％的乙?；Ｑ灏椎鞍?；

在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的rt-pcr反應(yīng)液包括：ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸18mm、檸檬酸鈉3mm、(nh4)2so420mm、mgso47mm、質(zhì)量百分比為0.10％的聚氧乙烯月桂醚、質(zhì)量體積比為0.1％的乙?；Ｑ灏椎鞍祝?/p>

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的定量pcr反應(yīng)液包括：ph8.3的tris-h2so442mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸9mm、檸檬酸鈉2mm、(nh4)2so49mm、mgso43.5mm、質(zhì)量百分比為0.10％的聚氧乙烯月桂醚、質(zhì)量體積比為0.01％的乙?；Ｑ灏椎鞍住ntp0.2mm、定量檢測引物組600nm和定量檢測探針組150nm；

在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的定量pcr反應(yīng)液包括：ph8.5的tris-h2so465mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸32mm、檸檬酸鈉4.3mm、(nh4)2so423mm、mgso49mm、質(zhì)量百分比為0.5％的聚氧乙烯月桂醚、質(zhì)量體積比為0.1％的乙?；Ｑ灏椎鞍?、dntp0.5mm、定量檢測引物組1000nm和定量檢測探針組300nm；

在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的定量pcr反應(yīng)液包括：ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸18mm、檸檬酸鈉3mm、(nh4)2so420mm、mgso47mm、質(zhì)量百分比為0.10％～0.5％的聚氧乙烯月桂醚、質(zhì)量體積比為0.01％～0.1％的乙?；Ｑ灏椎鞍?、dntp0.2mm、定量檢測引物組800nm和探定量檢測針組200nm；

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的定量程序為：第一步：37℃，5分鐘；94℃8分鐘；第二步：94℃15秒，62℃15秒，68℃20秒，4個循環(huán)；第三步：93℃15秒，62℃15秒，68℃20秒，10個循環(huán)；第四步：93℃15秒，52℃15秒，68℃30秒，40個循環(huán)；

在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的定量程序為：第一步：37℃，5分鐘；96℃12分鐘；第二步：95℃30秒，68℃50秒，72℃40秒，8個循環(huán)；第三步：95℃20秒，62℃30秒，72℃20秒，10個循環(huán)；第四步：95℃15秒，62℃15秒，72℃，60秒，40個循環(huán)；

在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的定量程序為：第一步：37℃，5分鐘；95℃，10分鐘；第二步：95℃，15秒，65℃，15秒，72℃，20秒，5個循環(huán)；第三步：95℃，15秒，62℃，15秒，72℃，20秒，10個循環(huán)；第四步：95℃，15秒，52℃，15秒，72℃，40秒，40個循環(huán)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有效效果為：

1、本發(fā)明提供了mir21、mir92a、u6的逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物。這三個逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物可在同一反應(yīng)管中逆轉(zhuǎn)錄擴增mir21、92a和u6，實現(xiàn)了單管三重逆轉(zhuǎn)錄，使得mir21、92a和u6的逆轉(zhuǎn)錄步驟大大簡化，克服了現(xiàn)有技術(shù)中莖環(huán)引物逆轉(zhuǎn)錄時，一種莖環(huán)引物只能逆轉(zhuǎn)錄一種cdna，擴增多基因時，需分別擴增，分管操作步驟繁瑣的缺點。

2、本發(fā)明提供的mir21、mir92a、u6的逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物，增加了rna-dna鏈互補配對的堿基，提高了其熱穩(wěn)定性，逆轉(zhuǎn)錄效率增加。

3、本發(fā)明優(yōu)化了逆轉(zhuǎn)錄酶的使用方法，降低了對后續(xù)定量pcr的抑制。

4、本發(fā)明提供了高靈敏和高特異性的定量檢測引物序列和定量檢測探針、與之相匹配的pcr反應(yīng)程序和條件，并提供了mir21和u6、mir92a和u6進行單管雙重定量的檢測方法，避免了現(xiàn)有技術(shù)中qpcr單管單重定量時的操作誤差，使得定量結(jié)果更準確，定量結(jié)果更可靠。同時，單管雙重定量使得定量步驟更加簡潔，縮短檢測時間的同時還節(jié)省了檢測試劑和檢測費用。

5、本發(fā)明提供的mir21和u6、mir92a和u6單管雙重定量的檢測方法，可檢測到5e拷貝數(shù)/μl定量標準品中的mir21和mir92a，檢測靈敏度和特異性高。

6、本發(fā)明引入了stoffel片段和tfldna聚合酶的雙聚合酶的擴增方法。其中stoffel片段為去除5’-3’外切酶活性結(jié)構(gòu)域的taqdna聚合酶，去除5’-3’外切酶活性的同時，恢復(fù)了少量3’-5’外切酶的校正活性，彌補了tfldna聚合酶特異性不足的缺陷。而tfldna聚合酶則提供切除taqman探針的5’-3’外切酶活性。另一方面，stoffel片段和tfldna聚合酶耐抑制劑能力都較強，使得根據(jù)本發(fā)明的rt-qpcr反應(yīng)體系中可以加入更多的模版，靈敏度提升。

7、本發(fā)明引入的tris-3-(n-嗎啉基)丙磺酸-檸檬酸鈉緩沖液替代常規(guī)的tris-hcl緩沖液，使得檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強，避免了普通rt-qpcr方法特異性不高的缺點。

附圖說明

圖1從左到右依次為5e⁴、5e³、5e²、5e拷貝數(shù)/μl定量標準品1的擴增結(jié)果曲線，fam通道為mir21通道，hex通道為u6通道。

圖2mir21和u6單管雙重定量繪制的mir21和u6標準曲線及待測樣本定量值，fam通道為mir21通道，hex通道為u6通道。

圖3從左到右依次為5e⁴、5e³、5e²、5e拷貝數(shù)/μl定量標準品2的擴增結(jié)果曲線，fam通道為mir92a通道，hex通道為u6通道。

圖4mir92a和u6單管雙重定量繪制的mir92a和u6標準曲線及待測樣本定量值，fam通道為mir92a通道，hex通道為u6通道。

圖5從左到右依次為對比例1的5e⁴、5e³、5e²、5e拷貝數(shù)/μl定量標準品1的mir21的擴增結(jié)果曲線。

圖6從左到右依次為對比例1的5e⁴、5e³、5e²、5e拷貝數(shù)/μl定量標準品2的mir92a的擴增結(jié)果曲線。

具體實施方式

以下實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。對所公開的實施例的下述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例中，而是可以應(yīng)用于符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的更寬的范圍。

除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。

以下實施例中未作具體說明的分子生物學(xué)試驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進行；所述試劑盒生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實施例1一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的檢測試劑盒

該試劑盒包括：u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物組。

逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物組包括：

引物stem-loopprimer21：5’-ctcaactgctctgctccagtcgcggattcagttgagtcaacat-3’；

引物stem-loopprimer92a：5’-gtcgtatccagtcgtcgctccgactcgcgctggatacgacacaggccg-3’；

引物stem-loopprimeru6：5’-gtcgtatccagctctgctccagtcgcggattctggatacgacaaaata-3’。

實施例2一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的檢測試劑盒

該試劑盒包括：(1)實施例1所述的u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物組；(2)u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的定量檢測引物組和定量檢測探針組。

定量檢測引物組包括：

定量檢測引物組1和定量檢測探針組1；

和定量檢測引物組2和定量檢測探針組2。

定量檢測引物組1包括：

定量pcr上游引物m2102：5’-ccccggtagcttatcagactg-3’；定量pcr下游引物m2103：5’-ctcaactgctctgctccagt-3’；定量pcr上游引物u602：5’-ctcgcttcggcagcaca-3’；定量pcr下游引物u603：5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’；

定量檢測探針組1包括：

探針m2104：5’-gttgactcaactgaatccgcg-3’和探針u604：5’-agaagattagcatggcccct-3’；

探針m2104的核苷酸序列的5’端標記有fam熒光基團，探針u604的核苷酸序列的5’端標記有hex熒光基團，所述的熒光基團為；探針m2104和探針u604的核苷酸序列的3’端標記有猝滅基團mgb。

定量檢測引物組2包括：

定量pcr上游引物序列m9202：5’-ccctgtattgcacttgtcc-3’；定量pcr下游引物序列m9203：5’-gtcgtatccagtcgtcgc-3’；定量pcr上游引物u602：5’-ctcgcttcggcagcaca-3’；定量pcr下游引物u603：5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’；

定量檢測探針組2包括：

探針m9204：5’-cggcctgtgtcgtatcca-3’和探針u604：5’-agaagattagcatggcccct-3’；

探針m9204核苷酸序列的5’端標記有fam熒光基團，探針u604的核苷酸序列的5’端標記有hex熒光基團；探針m2104和探針u604的核苷酸序列的3’端標記有猝滅基團mgb。

實施例3一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的檢測試劑盒

該試劑盒包括：

(1)實施例1中的逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物組；

(2)實施例2中的定量檢測引物組和定量檢測探針組；

(2)酶系：mmlvdna聚合酶、tfldna聚合酶和stoffel片段；

(3)pcr反應(yīng)試劑：ph8.5的tris-h2so4，ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸，檸檬酸鈉，(nh4)2so4，mgso4，聚氧乙烯月桂醚，乙酰化牛血清白蛋白和dntp。

(4)定量標準品：定量標準品1和定量標準品2。

根據(jù)mirna及莖環(huán)引物序列，在上海捷瑞生物工程有限公司合成mir21質(zhì)粒、mir92a質(zhì)粒和u6質(zhì)粒。mir21質(zhì)粒含有如seqidno：14(5'-ctcaactgctctgctccagtcgcggattcagttgagtcaacatcagtctgataagcta-3’)所示核苷酸序列；mir92a質(zhì)粒含有如seqidno：15(5'-gtcgtatccagtcgtcgctccgactcgcgctggatacgacacaggccgggacaagtgcaata-3’)所示核苷酸序列；u6質(zhì)粒含有如seqidno：16(5'---aacgcttcacgaatttgcgtgtcatccttgcgcaggggccatgctaatcttctctgtatcgttccaattttagtatatgtgctgccgaagcgagcac---3')所示核苷酸序列。dna/rnacopynumbercalculator計算質(zhì)?？截悢?shù)，u6、mir92a和mir21質(zhì)粒分別稀釋至e5、e4、e3、e2拷貝數(shù)/μl。將同濃度的u6、mir21質(zhì)?；旌希吹玫酵瑫r含u6、mir21質(zhì)粒且u6、mir21質(zhì)粒濃度分別為5e⁴、5e³、5e²、5e拷貝數(shù)/μl的定量標準品1；將同濃度的u6、mir92a質(zhì)?；旌希吹玫酵瑫r含u6、mir92a質(zhì)粒且u6、mir92a質(zhì)粒濃度分別為5e⁴、5e³、5e²、5e拷貝數(shù)/μl的定量標準品2。

實施例4

一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr檢測方法

所述的檢測方法包括以下步驟：

1、提取mirna：待測人全血樣本，編號分別為s1-s24，各取200μl，提取mirna(采用exiqonmirna提取試劑盒，貨號：300112)；

2、逆轉(zhuǎn)錄mirna：

a、以步驟(1)提取的mirna作為模板，各逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物使用不同濃度，按以下配比配制premix：

b、將上述premix溫和混勻，70℃預(yù)熱5分鐘，立即轉(zhuǎn)入冰上5分鐘，得到premix-1；

c、按以下配比配制rtmix：

試劑工作濃度或添加量

rt-pcr反應(yīng)液8.5μl

200u/μlmmlvdna聚合酶(深圳菲鵬生物)0.5μl；

其中，rt-pcr反應(yīng)液包括：ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸18mm、檸檬酸鈉3mm、(nh4)2so420mm、mgso47mm、質(zhì)量百分比為0.10％的聚氧乙烯月桂醚、質(zhì)量體積比為0.1％的乙?；Ｑ灏椎鞍祝?/p>

d、將步驟(2)-c配制的rtmix與步驟(2)-b中得到的premix-1混合，普通pcr儀進行逆轉(zhuǎn)錄，得到逆轉(zhuǎn)錄的cdna；

其中，逆轉(zhuǎn)錄時使用的pcr反應(yīng)程序為：25℃，5分鐘；42℃，60分鐘；70℃，15分鐘；4℃，保存；

(3)雙重定量pcr：

a、分別以步驟(2)-d得到的cdna、以及定量標準品1為模板，按以下配比配制mir21和u6單管雙重定量反應(yīng)體系：

其中，定量pcr反應(yīng)液包括：ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸18mm、檸檬酸鈉3mm、(nh4)2so420mm、mgso47mm、質(zhì)量百分比為0.10％～0.5％的聚氧乙烯月桂醚、質(zhì)量體積比為0.01％～0.1％的乙?；Ｑ灏椎鞍?、dntp0.2mm、定量pcr上游引物m2102200nm、定量pcr下游引物m2103200nm、定量pcr上游引物u602200nm、定量pcr下游引物u603200nm、探針m2104100nm和探針u604100nm；

酶混合液包括：1μl的tfldna聚合酶(美國abi公司，2u/μl)和1μl的stoffel片段(cetus公司，5u/μl)。

分別以步驟(2)-d得到的cdna、以及定量標準品2為模板，按以下配比配制mir92a和u6單管雙重定量反應(yīng)體系：

其中，定量pcr反應(yīng)液包括：ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸18mm、檸檬酸鈉3mm、(nh4)2so420mm、mgso47mm、質(zhì)量百分比為0.10％～0.5％的聚氧乙烯月桂醚、質(zhì)量體積比為0.01％～0.1％的乙酰化牛血清白蛋白、dntp0.2mm、定量pcr上游引物m9202200nm、定量pcr下游引物m9203200nm、定量pcr上游引物u602200nm、定量pcr下游引物u603200nm、探針m9204100nm和探針u604100nm；

酶混合液包括：1μl的tfldna聚合酶(美國abi公司，2u/μl)和1μl的stoffel片段(cetus公司，5u/μl)。

b、單管雙重定量反應(yīng)體系配制好后，利用定量pcr儀進行擴增，所用的定量程序為：第一步：37℃，5分鐘；95℃，10分鐘；第二步：95℃，15秒，65℃，15秒，72℃，20秒，5個循環(huán)；第三步：95℃，15秒，62℃，15秒，72℃，20秒，10個循環(huán)；第四步：95℃，15秒，52℃，15秒，72℃，40秒，40個循環(huán)；

c、定量分析：

mir21和u6單管雙重定量分析：在定量pcr儀的fam熒光通道讀取mir21的擴增曲線，在hex熒光通道讀取u6的擴增曲線；根據(jù)5e⁴、5e³、5e²、5e拷貝數(shù)/μl定量標準品1的擴增結(jié)果(圖1，從左到右依次為5e⁴、5e³、5e²、5e拷貝數(shù)/μl定量標準品1的擴增結(jié)果曲線)，分別繪制mir21和u6的標準曲線(結(jié)果見圖2)；利用標準曲線，計算步驟(2)-d得到的cdna中mir21和u6的定量值(結(jié)果見圖2及表1)；以mir21的定量值除以u6的定量值，即得本待測全血樣本中mir21的相對含量，s1-s24樣本的mir21相對含量結(jié)果見表1。

表1

mir92a和u6單管雙重定量分析：在定量pcr儀的fam熒光通道讀取mir92a的擴增曲線，在hex熒光通道讀取u6的擴增曲線；根據(jù)5e⁴、5e³、5e²、5e拷貝數(shù)/μl定量標準品的擴增結(jié)果(圖3，從左到右依次為5e4、5e3、5e2、5e拷貝數(shù)/μl定量標準品2的擴增結(jié)果曲線)，分別繪制mir92a和u6的標準曲線，結(jié)果見圖4；利用標準曲線，計算步驟(2)-d得到的cdna中mir92a和u6的定量值(結(jié)果見圖4及表2)；以mir92a的定量值除以u6的定量值，即得本待測全血樣本中mir92a的相對含量，s1-s24樣本的mir92a相對含量結(jié)果見表2。

表2

對比例1一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的檢測方法

以5e⁴、5e³、5e²、5e拷貝數(shù)/μl定量標準品1和定量標準品2為模板，以taqdna聚合酶(5u/μl，neb公司)為酶混合液，分別進行mir21和u6單管雙重定量和mir92a和u6單管雙重定量pcr，方法同實施例4。mir21擴增結(jié)果見圖5，mir92a擴增結(jié)果見圖6。由圖1和圖5、圖3和圖6對比分析可知，當模板量為5μl時，使用taqdna聚合酶雖然可以擴增，但是兩個通道會相互抑制，擴增效率明顯降低；而使用stoffel片段、tfldna聚合酶，可以正常擴增，說明本發(fā)明所述的酶混合液對模板的耐受能力更強，擴增效率更高。

對比例2一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的檢測方法

以5e⁴、5e³、5e²、5e拷貝數(shù)/μl定量標準品1和定量標準品2為模板，分別進行mir21和u6單管雙重定量和mir92a和u6單管雙重定量pcr，方法基本同實施例4，僅將定量pcr反應(yīng)液中的ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸18mm和檸檬酸鈉3mm換成ph8.5的tris-hcl66mm。擴增結(jié)果顯示，采用本發(fā)明所述的tris-h2so4、3-(n-嗎啉基)丙磺酸、檸檬酸鈉組成的緩沖液，擴增效果更好，擴增結(jié)果穩(wěn)定性更好。

sequencelisting

<110>廣州海力特生物科技有限公司

<120>一種u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr檢測方法及試劑盒

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gtcgtatccagtcgtcgctccgactcgcgctggatacgacacaggccg48

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ta62

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