本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有絲氨酸蛋白酶活性的重組多肽的方法，通過(guò)這類方法可獲得的多肽，以及所述多肽在醫(yī)學(xué)、美容以及工業(yè)中的用途。

背景技術(shù)：

使蛋白質(zhì)中的肽鍵裂解的酶也被稱為蛋白酶、朊酶、肽酶或蛋白水解酶[1]，并且發(fā)揮功能以通過(guò)降低反應(yīng)的活化能來(lái)加速特定生物反應(yīng)的速率[2]。最常假設(shè)蛋白酶僅涉及于消化有關(guān)的過(guò)程中，但超過(guò)2％的人類基因組編碼蛋白酶基因的事實(shí)表明蛋白酶起到比單獨(dú)的消化更加復(fù)雜的功能[3]。確實(shí)，蛋白酶已經(jīng)顯示涉及于從生長(zhǎng)因子到受體的許多細(xì)胞組分的調(diào)控，以及包括免疫、補(bǔ)體級(jí)聯(lián)和血液凝固的過(guò)程中[3]。除了涉及于內(nèi)穩(wěn)定過(guò)程中以外，增加或失調(diào)的蛋白酶活性已經(jīng)經(jīng)由其與腫瘤生長(zhǎng)和侵入的關(guān)聯(lián)而牽涉于癌癥中[4]。

簡(jiǎn)單地說(shuō)，蛋白酶最初作為非活性前體、或酶原產(chǎn)生，并且分布于特定器官或位置中，在此其具有極小的催化能力直至其通過(guò)蛋白水解性裂解而活化[5]?？刂频鞍酌富钚缘母喾g后機(jī)制包括磷酸化、輔因子結(jié)合、以及酶和/或底物在囊泡或顆粒中的分離。另外，活性酶的有效濃度還可以由蛋白酶抑制劑嚴(yán)格調(diào)控，這些蛋白酶抑制劑可以通過(guò)與蛋白酶形成復(fù)合物并且有效“平衡”蛋白水解活性來(lái)降低功能性功效。

蛋白酶已經(jīng)在醫(yī)學(xué)中使用數(shù)十年并且是一類既定的并且耐受良好的治療劑[3]。在所公布的文獻(xiàn)中早期記載的蛋白酶的用途在100多年前出現(xiàn)[7-9]。一般來(lái)說(shuō)，蛋白酶已經(jīng)用于四個(gè)領(lǐng)域中：用經(jīng)口施用的藥劑管理胃腸病癥，作為消炎劑，作為血栓溶解劑用于血栓栓塞病癥，以及作為局部施用的藥劑用于傷口清創(chuàng)[10]。自從1978年首次批準(zhǔn)蛋白酶藥物(尿激酶，一種指定用于血栓溶解和導(dǎo)管清除的絲氨酸蛋白酶)以來(lái)，更多的11種藥物已經(jīng)獲美國(guó)食品和藥物管理局(US Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)用于治療用途[3]。這些藥物中的大多數(shù)指定用于治療血液病癥并且包括血栓溶解劑：阿替普酶(alteplase)、瑞替普酶(reteplase)以及替奈普酶(tenecteplase)；和促凝血?jiǎng)阂蜃覫X、因子VIIa、凝血酶以及繃帶中的局部凝血酶。其它獲批準(zhǔn)的蛋白酶治療劑指定用于消化(胰脂肪酶)、肌肉痙攣以及作為藥妝品(具有生物活性成分的美容產(chǎn)品預(yù)期具有醫(yī)學(xué)或類藥物效益；肉毒桿菌毒素A和肉毒桿菌毒素B)[3]。

迄今獲US FDA批準(zhǔn)的蛋白酶源自于一系列存在的或已經(jīng)適應(yīng)中溫的哺乳動(dòng)物或細(xì)菌，即，嗜中溫生物體。為了追尋更有效并且更靈活的蛋白酶，已經(jīng)檢查了來(lái)源于來(lái)自寒冷環(huán)境的生物體的分子的治療潛力。來(lái)自在寒冷環(huán)境中成長(zhǎng)的三域生命(細(xì)菌、古生菌、真核生物)的那些生物體(即，嗜冷生物)已經(jīng)發(fā)展出在低溫和中溫下一般具有高比活性、低底物親和力以及高催化速率的酶[18-20]。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)與嗜中溫變體相比較時(shí)，嗜冷酶中更大靈活性的特性允許在更低的能量成本下蛋白酶與底物相互作用并且轉(zhuǎn)化底物。相對(duì)容易的相互作用是可能的，這是因?yàn)槭壤涞鞍酌傅拇呋稽c(diǎn)可以更容易地容納底物[20]。然而，這種增加的靈活性常常伴隨有穩(wěn)定性的折中[21]。因此，與哺乳動(dòng)物類似物成對(duì)比，嗜冷蛋白酶對(duì)熱、低pH以及自體溶解的滅活更敏感[18、19、21-25]。

雖然嗜冷蛋白酶已經(jīng)從生物來(lái)源，諸如大西洋鱈魚(大西洋真鱈(Gadusmorhua))或南冰洋磷蝦(南極磷蝦(Euphausia superba))獲得，但適合數(shù)量的同質(zhì)冷適應(yīng)蛋白酶的大規(guī)模生產(chǎn)可以使用重組技術(shù)獲得。已經(jīng)鑒別多種魚酶和蛋白酶，克隆，并且在微生物中表達(dá)[36]。在產(chǎn)生用于治療目的的其它蛋白酶中，非人類來(lái)源或產(chǎn)生宿主是優(yōu)選的以使得潛在的污染可以避免。因此廣泛采用重組技術(shù)以產(chǎn)生獲批準(zhǔn)的哺乳動(dòng)物(重組)治療性蛋白質(zhì)，諸如凝血因子(來(lái)自重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢或幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞)、血栓溶解劑(來(lái)自大腸桿菌(Escherichia coli))或肉毒桿菌毒素(肉毒桿菌(Clostridium botulinum))[3]。因此，將似乎需要探索經(jīng)由重組技術(shù)產(chǎn)生冷適應(yīng)蛋白酶的可能性。在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)此已經(jīng)存在若干或多或少成功的嘗試。然而，重組冷適應(yīng)酶的大規(guī)模生產(chǎn)與若干復(fù)雜因素相關(guān)，諸如冷適應(yīng)酶的短半衰期和自體溶解活性，其使得生產(chǎn)在更標(biāo)準(zhǔn)化的工業(yè)條件和溫度下有困難。

本發(fā)明試圖通過(guò)提供一種產(chǎn)生重組絲氨酸蛋白酶多肽，諸如冷適應(yīng)胰蛋白酶的方法克服這些問(wèn)題，這種方法適合于大規(guī)模生產(chǎn)。

本發(fā)明進(jìn)一步試圖提供與從天然來(lái)源純化的絲氨酸蛋白酶相比具有改善的特性，諸如穩(wěn)定性和催化活性的突變體絲氨酸蛋白酶多肽。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了一種產(chǎn)生具有絲氨酸蛋白酶活性的重組多肽的方法，其包括

(a)用編碼包含融合至具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽的N端的活化肽的酶原多肽的核酸分子轉(zhuǎn)化微生物宿主細(xì)胞或其群體，

其中酶原多肽缺乏信號(hào)序列；

(b)將所述酶原多肽在宿主細(xì)胞中表達(dá)為包涵體；

(c)從宿主細(xì)胞純化酶原多肽；以及

(d)通過(guò)暴露于蛋白酶，諸如胰蛋白酶活化酶原多肽，

其中步驟(c)包括從包涵體溶解酶原多肽并且將多肽再折疊成生物活性形式。

因此，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生具有絲氨酸蛋白酶活性的重組多肽的體外方法。

具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽包括能夠使蛋白質(zhì)中的肽鍵裂解的天然存在的與非天然存在的催化多肽，其中絲氨酸在多肽的活性位點(diǎn)(如根據(jù)EC編號(hào)3.4.21所定義)處充當(dāng)親核氨基酸。絲氨酸蛋白酶活性可以是類胰凝乳蛋白酶(即，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶以及彈性蛋白酶)或類枯草桿菌蛋白酶。

在一個(gè)實(shí)施方案中，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽展現(xiàn)胰蛋白酶活性。舉例來(lái)說(shuō)，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽可以是真核或原核來(lái)源的天然存在的胰蛋白酶，或這樣的胰蛋白酶的突變型式。特定包括冷適應(yīng)胰蛋白酶，諸如來(lái)自大西洋鱈魚(大西洋真鱈)、大西洋和太平洋鮭魚(例如，大西洋鮭(Salmo salar)和大麻哈魚(Oncorhynchus)屬)以及阿拉斯加青鱈(黃線狹鱈(Theragra chalcogramma))的胰蛋白酶，和其突變形式(如下文詳細(xì)描述)。

胰蛋白酶的三種主要同工酶已經(jīng)從大西洋鱈魚表征，指定為胰蛋白酶I、II以及III(參看等,1989,《歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)》180:85-94，其公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式并入本文中)。舉例來(lái)說(shuō)，參看GenBank入藏號(hào)ACO90397。

另外，大西洋鱈魚表達(dá)胰凝乳蛋白酶的兩種主要同工酶，指定為胰凝乳蛋白酶A和B(參看和Bjarnason,1991,《比較生物化學(xué)與生理學(xué)B輯(Comp.Biochem.Physiol.B)》998:327-335，其公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式并入本文中)。舉例來(lái)說(shuō)，參看GenBank入藏號(hào)CAA55242.1。

在一個(gè)實(shí)施方案中，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下組成：與來(lái)自大西洋鱈魚(大西洋真鱈)的胰蛋白酶I的氨基酸序列，即，SEQID NO:1共享至少70％序列一致性的氨基酸序列：

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IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEG

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TEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSG

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200

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VCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY

[SEQ ID NO:1]

(其中氨基酸序列和編號(hào)是根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)[PDB]條目‘2EEK！’)

如同許多蛋白酶一樣，來(lái)自大西洋鱈魚的胰蛋白酶I作為非活性前體、或酶原產(chǎn)生，其包含裂解分開(kāi)以產(chǎn)生成熟的活性胰蛋白酶的前肽(或“活化”)序列。胰蛋白酶的初始表達(dá)產(chǎn)物還包含在表達(dá)之后去除的信號(hào)序列。

來(lái)自大西洋鱈魚的胰蛋白酶I的酶原序列，包括信號(hào)序列，在下文以SEQID NO:2示出(并且對(duì)應(yīng)于Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)入藏號(hào)P16049-1)：

其中：

信號(hào)肽＝氨基酸1至13(加下劃線)

前肽＝氨基酸14至19(加粗斜體)

成熟的胰蛋白酶＝氨基酸20至241

如本文所用的術(shù)語(yǔ)‘氨基酸’包括標(biāo)準(zhǔn)的二十種遺傳編碼的氨基酸和其對(duì)應(yīng)的呈‘D’形式的立體異構(gòu)體(與天然的‘L’形式相比較)、ω-氨基酸和其它天然存在的氨基酸、非常規(guī)氨基酸(例如，α,α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸等等)以及化學(xué)衍生的氨基酸(參看下文)。

除非另有明確規(guī)定，否則當(dāng)特定列舉氨基酸，諸如‘丙氨酸’或‘Ala’或‘A’時(shí)，這個(gè)術(shù)語(yǔ)指的是L-丙氨酸與D-丙氨酸。其它非常規(guī)氨基酸也可以是本發(fā)明的多肽的適合組分，只要所需的功能特性由多肽保留即可。對(duì)于所示的多肽，每個(gè)編碼的氨基酸殘基在適當(dāng)時(shí)由單字母名稱表示，對(duì)應(yīng)于常規(guī)氨基酸的俗名。

按照慣例，本文所公開(kāi)的氨基酸序列以N端至C端方向提供。

通常，本發(fā)明的組合物中所使用的多肽包含L-氨基酸或由L-氨基酸組成。

具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽可以包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:1共享至少80％、85％、90％、95％、95％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽可以包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成。

然而，多肽或者可以包含以下或由以下組成：作為SEQ ID NO:1的突變體或變體的氨基酸序列?！白凅w”意指多肽與SEQ ID NO:1不共享100％氨基酸序列一致性，即，SEQ ID NO:1的一個(gè)或多個(gè)氨基酸必須發(fā)生突變。舉例來(lái)說(shuō)，多肽可以包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少50％一致性，更優(yōu)選地與所述序列具有至少60％、70％或80％或85％或90％一致性，并且最優(yōu)選地與所述氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。因此，在指定位置處的氨基酸可以缺失，被取代，或可以是一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入/添加位點(diǎn)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，取代可以是保守的或非保守的。

一致性百分比可以通過(guò)例如在Expasy工具網(wǎng)站(http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html)上的LALIGN程序(Huang和Miller,《應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展(Adv.Appl.Math.)》(1991)12:337-357，其公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式并入本文中)使用全局比對(duì)選項(xiàng)、計(jì)分矩陣BLOSUM62、開(kāi)放空隙罰分-14、擴(kuò)展空隙罰分-4作為參數(shù)來(lái)確定?；蛘撸瑑蓚€(gè)多肽之間的序列一致性百分比可以使用適合的計(jì)算機(jī)程序，例如威斯康星大學(xué)遺傳計(jì)算小組(University of Wisconsin Genetic Computing Group)的GAP程序來(lái)確定，并且應(yīng)了解，一致性百分比是關(guān)于已經(jīng)最佳比對(duì)序列的多肽來(lái)計(jì)算。

或者，比對(duì)可以使用Clustal W程序(如Thompson等,1994,《核酸研究(Nucl.Acid Res.)》22:4673-4680中所描述，其以引用的方式并入本文中)進(jìn)行。所使用的參數(shù)可以如下：

-快速兩兩比對(duì)參數(shù)：K元組(字符)大小；1，窗口大小；5，空隙罰分；3，頂部對(duì)角數(shù)；5。計(jì)分方法：x％。

-多個(gè)比對(duì)參數(shù)：空隙開(kāi)放罰分；10，空隙擴(kuò)展罰分；0.05。

-計(jì)分矩陣：BLOSUM。

或者，BESTFIT程序可以用于確定局部序列比對(duì)。

因此，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽可以是SEQ ID NO:1的變體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:1或2的變體，其包含一個(gè)或多個(gè)選自由以下氨基酸位置組成的群組的突變氨基酸(其中相同突變位點(diǎn)可以通過(guò)參考兩個(gè)替代性編號(hào)系統(tǒng)定義)：

通過(guò)參考蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)[PDB]條目2EEK！(SEQ ID NO:1)定義：

E21、H25、H29、V47、K49、D50、L63、H71、H72、R74、N76、T79、Y82、S85、S87、N98、I99、V121、M135、V138、M145、V148、D150、K154、L160、M175、S179、A183、L185、V212、Y217、P225、A229、V233、L234、V238、M242、N244和/或Y245。

通過(guò)參考Uniprot條目P16049-1 9(SEQ ID NO:2)定義：

E25、H29、H33、V49、K51、D52、L65、H72、H73、R75、N77、T80、Y83、S86、S88、N99、I100、V122、M134、V137、M144、V147、D149、K152、L158、M173、S177、A181、L184、V208、Y213、P221、A225、V229、L230、V234、M238、N240和/或Y241。

因此，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽可以是SEQ ID NO:1的變體，其包含一個(gè)或多個(gè)選自由以下組成的群組的氨基酸突變：

通過(guò)參考蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)[PDB]條目2EEK！(SEQ ID NO:1)定義：

E21T、H25Y、H29(Y/N)、V47I、K49E、D50Q、L63I、H71D、H72N、R74(K/E)、N76(T/L)、T79(S/N)、Y82F、S85A、S87(K/R)、S89R、N98T、I99L、V121I、M135Q、V138I、M145(T/L/V/E/K)、V148G、D150S、K154(T/V)、L160(I/A)、M175(K/Q)、S179N、A183V、L185G、V212I、Y217(D/H/S)、P225Y、A229V、V233N、L234Y、V238I、M242I、N244S和/或Y245N。

通過(guò)參考Uniprot條目P16049-1和(SEQ ID NO:2)定義：

E25T、H29Y、H33(Y/N)、V49I、K51E、D52Q、L65I、H72D、H73N、R75(K/E)、N77(T/L)、T80(S/N)、Y83F、S86A、S88(K/R)、N99T、I100L、V122I、M134Q、V137I、M144(T/L/V/E/K)、V147G、D149S、K152(T/V)、L158(I/A)、M173(K/Q)、S177N、A181V、L184G、V208I、Y213(D/H/S)、P221Y、A225V、V229N、L230Y、V234I、M238I、N240S和/或Y241N。

舉例來(lái)說(shuō)，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽可以包含以下或由以下組成：具有下列定義的突變之一或其組合(表1)的SEQ ID NO:1的氨基酸序列：

表1

同樣地，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽可以包含以下或由以下組成：具有下列定義的突變之一或其組合(表2)的SEQ ID NO:1的氨基酸：

表2

在上表1和2中，在通過(guò)參考SEQ ID NO:2中的突變(即，UniProtP16049-1)定義具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽的情況下，應(yīng)了解，成熟的蛋白酶將以I20開(kāi)始作為其N端氨基酸。然而，其通常將最初表達(dá)為在N端處具有活化序列的酶原多肽(參看下文)。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:1的氨基酸序列的變體，其在位置25處不包含組氨酸。

舉例來(lái)說(shuō)，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽可以包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由SEQ ID NO:3的氨基酸序列組成(表1中的“EZA-016”，包含H25N突變；參看下文序列中的方框)：

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[SEQ ID NO:3]

在一個(gè)替代性優(yōu)選實(shí)施方案中，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:1的氨基酸序列的變體，其在位置160處不包含賴氨酸。

舉例來(lái)說(shuō)，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽可以包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由SEQ ID NO:4的氨基酸序列組成(表1中的“EZA-034”，包含L160I突變；參看下文序列中的方框)：

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[SEQ ID NO:4]

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，上文所鑒別的突變(通過(guò)參考大西洋鱈魚的胰蛋白酶I的氨基酸序列，SEQ ID NO:1定義)也可以在來(lái)自其它物種的胰蛋白酶中制得。舉例來(lái)說(shuō)，在SEQ ID NO:3和4中突出強(qiáng)調(diào)的特定突變(分別是H25N和L160I，參考SEQ ID NO:1和PDB 2EEK！)可以在來(lái)自阿拉斯加青鱈的胰蛋白酶中制得(例如，參看GenBank：BAH70476.3，其中活性胰蛋白酶的氨基酸序列在位置I20處開(kāi)始，以使得H25對(duì)應(yīng)于BAH70476.3中的H29，等等)。

在一個(gè)替代性實(shí)施方案中，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下組成：天然存在的絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列。因此，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽可以由真核或原核來(lái)源的天然存在的胰蛋白酶的氨基酸序列組成。特定包括冷適應(yīng)胰蛋白酶，諸如來(lái)自大西洋鱈魚(大西洋真鱈)、大西洋和太平洋鮭魚(例如，大西洋鮭和大麻哈魚屬)以及阿拉斯加青鱈(黃線狹鱈)的胰蛋白酶。

舉例來(lái)說(shuō)，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽可以包含SEQ ID NO:1的氨基酸或由SEQ ID NO:1的氨基酸組成(即，如蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)條目2EEK！中所示)。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽還可以包含以下或由以下組成：上文所定義的氨基酸序列中的任一者的片段，其中這個(gè)片段展現(xiàn)抗微生物(例如，抗細(xì)菌)活性。

“片段”包括上述氨基酸序列，諸如(但不限于)SEQ ID NO:1、2、3或4中的任一者的至少5個(gè)相連氨基酸。舉例來(lái)說(shuō)，片段可以包含上述氨基酸序列中的任一者的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200個(gè)或更多個(gè)相連氨基酸。

鑒別保留抗微生物(例如，抗細(xì)菌)活性的上文所定義的絲氨酸蛋白酶多肽的片段的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。舉例來(lái)說(shuō)，一系列不同片段可以通過(guò)已知的重組方法使用本發(fā)明的表達(dá)方法產(chǎn)生，并且然后體外暴露于代表性微生物(諸如細(xì)菌菌株、病毒和/或真菌菌株)以確定這些片段中的哪一者抑制(部分或完全)所述微生物的生長(zhǎng)和/或增殖。

舉例來(lái)說(shuō)，在來(lái)自大西洋鱈魚的胰蛋白酶I(SEQ ID NO:1)中，據(jù)信下文突出強(qiáng)調(diào)的區(qū)域保留母體蛋白的抗細(xì)菌特性：

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[SEQ ID NO:1]

展現(xiàn)抗細(xì)菌活性的對(duì)應(yīng)區(qū)域可以在本文所描述的其它氨基酸序列中的任一者中鑒別。

本發(fā)明方法的開(kāi)發(fā)是歷經(jīng)很長(zhǎng)時(shí)期(18個(gè)月)的大量努力以克服通過(guò)重組方式產(chǎn)生胰蛋白酶樣酶的難點(diǎn)的頂峰。僅僅在若干失敗的嘗試之后，本發(fā)明者設(shè)計(jì)出本發(fā)明方法，其中具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽是通過(guò)表達(dá)為不含信號(hào)肽的包涵體并且隨后再折疊活性多肽而產(chǎn)生。

本發(fā)明方法的特有特征是在微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)包含融合至具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽的N端的活化肽的酶原多肽(其中酶原多肽缺乏信號(hào)序列)的步驟。

“酶原多肽”意指具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽的非活性前體形式(‘前酶’)，其可以隨后蛋白水解性裂解以釋放活性絲氨酸蛋白酶多肽。舉例來(lái)說(shuō)，在具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽是胰蛋白酶的情況下，酶原多肽是胰蛋白酶原。

“活化肽”意指在通過(guò)暴露于蛋白酶，諸如胰蛋白酶活化酶原后釋放的短肽(通常長(zhǎng)度是四個(gè)或五個(gè)氨基酸)(參看Chen,Jian-Min等,"胰蛋白酶原活化肽的進(jìn)化(Evolution of trypsinogen activation peptides)"《分子生物學(xué)與進(jìn)化(Molecular biology and evolution)》20.11(2003):1767-1777，其公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式并入本文中)。應(yīng)了解，活化肽可以是天然存在的活化肽或其突變型式。

在一個(gè)實(shí)施方案中，其中活化肽包含以下或由以下組成：選自下列群組的氨基酸序列：

將編碼酶原多肽的核酸分子插入適于在所選擇的宿主細(xì)胞類型中表達(dá)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)載體中(參看下文)。

適合于在微生物宿主細(xì)胞中使用的表達(dá)載體廣泛可購(gòu)得(從諸如Novagen、Invitrogen、Qiagen、Stratagene以及GenScript的公司)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼胰蛋白酶原多肽的核酸分子處于適合于在大腸桿菌中使用的表達(dá)載體中，諸如表達(dá)載體E3(從GenScript USA Inc,Piscataway,USA可得)。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明的方法可以使用任何適合的微生物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞來(lái)進(jìn)行，例如，細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞以及酵母細(xì)胞。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在步驟(a)中宿主細(xì)胞是細(xì)菌宿主細(xì)胞(諸如大腸桿菌和假交替單胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis))。舉例來(lái)說(shuō)，在步驟(a)中宿主細(xì)胞可以是大腸桿菌宿主細(xì)胞(諸如BL21(E3)、BL21(DE3)、BL21Star(DE3)、ArcticExpress(DE3)以及HMS174細(xì)胞)。

在一個(gè)替代性實(shí)施方案中，在步驟(a)中宿主細(xì)胞是酵母宿主細(xì)胞(諸如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))。

一旦用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，即在適合于誘導(dǎo)酶原多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。用于不同類型的微生物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基在本領(lǐng)域中是眾所周知的(舉例來(lái)說(shuō)，參看Green和Sambrook,2012,《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(MolecularCloning,A Laboratory Manual)》,第四版,Cold Spring Harbor,New York，這個(gè)文獻(xiàn)中的相關(guān)公開(kāi)內(nèi)容特此以引用的方式并入)。

因此，在步驟(b)中可以在至少18℃的溫度下，例如在18℃、22℃、28℃或37℃下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。

步驟(b)表達(dá)的持續(xù)時(shí)間可以是至少6小時(shí)，例如8小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。

在利用諸如BL21(DE3)、BL21Star(DE3)以及ArcticExpress(DE3)的宿主細(xì)胞的情況下，可以由諸如IPTG(例如，1mM)的試劑誘導(dǎo)表達(dá)。

在本發(fā)明方法的步驟(c)中，通過(guò)溶解并再折疊包涵體多肽來(lái)純化所表達(dá)的酶原多肽。此外，用于這種純化的適合方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的(例如，參看Singh和Panda,2005,《生物科學(xué)與生物工程雜志(J.Biosci.Bioeng.)》99(4):303-10以及Burgess,2009,《酶學(xué)方法(Methods Enzymol.)》463:259-82，這些文獻(xiàn)中的相關(guān)公開(kāi)內(nèi)容特此以引用的方式并入)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，再折疊多肽包括使多肽與PBS/甘油緩沖液(例如，1xPBS，10％甘油，pH 7.4)接觸。

本發(fā)明的方法有利之處在于其不需要在溶解和再折疊步驟期間包括自體蛋白水解抑制劑(諸如苯甲脒)。這樣，在一個(gè)實(shí)施方案中，無(wú)自體蛋白水解抑制劑存在于步驟(c)中。

在溶解和再折疊之后，通過(guò)暴露于胰蛋白酶(其使活化肽裂解以顯露活性絲氨酸蛋白酶多肽)蛋白水解性活化純化的酶原多肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自大西洋鱈魚的胰蛋白酶用于在步驟(d)中活化酶原多肽。

本發(fā)明的方法能夠產(chǎn)生具有高比活性的重組絲氨酸蛋白酶多肽。舉例來(lái)說(shuō)，在步驟(d)中產(chǎn)生的活化多肽的比活性可以是至少20U/mg，例如至少30U/mg、40U/mg、50U/mg或至少60U/mg。

本發(fā)明的方法能夠產(chǎn)生良好產(chǎn)量的重組絲氨酸蛋白酶多肽。舉例來(lái)說(shuō)，在步驟(d)中產(chǎn)生的活化多肽的數(shù)量可以是至少0.1mg，例如至少0.5mg、1mg、2mg、3mg、5mg或10mg。

本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了一種具有絲氨酸蛋白酶活性的分離多肽，其通過(guò)本發(fā)明的方法(如上文詳述)可獲得。

“分離”意指多肽并不位于細(xì)胞內(nèi)或以其它方式提供于細(xì)胞內(nèi)。因此，多肽可以作為無(wú)細(xì)胞制劑提供。

本發(fā)明的多肽的優(yōu)選實(shí)施方案在上文關(guān)于本發(fā)明的方法描述。因此，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽可以展現(xiàn)胰蛋白酶活性。

舉例來(lái)說(shuō)，多肽可以包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO:1的氨基酸序列共享至少70％序列一致性，例如至少80％、85％、90％、95％、95％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列(諸如SEQ ID NO:3和4)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:1或2的變體，其包含一個(gè)或多個(gè)選自由以下氨基酸位置組成的群組的突變氨基酸(其中相同突變位點(diǎn)通過(guò)參考兩個(gè)替代性編號(hào)系統(tǒng)定義)：

通過(guò)參考蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)[PDB]條目2EEK！定義：

E21、H25、H29、V47、K49、D50、L63、H71、H72、R74、N76、T79、Y82、S85、S87、N98、I99、V121、M135、V138、M145、V148、D150、K154、L160、M175、S179、A183、L185、V212、Y217、P225、A229、V233、L234、V238、M242、N244和/或Y245。

通過(guò)參考Uniprot條目P16049-1 9和SEQ ID NO:2定義：

E25、H29、H33、V49、K51、D52、L65、H72、H73、R75、N77、T80、Y83、S86、S88、N99、I100、V122、M134、V137、M144、V147、D149、K152、L158、M173、S177、A181、L184、V208、Y213、P221、A225、V229、L230、V234、M238、N240和/或Y241。

因此，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽可以是SEQ ID NO:1的變體，其包含一個(gè)或多個(gè)選自由以下組成的群組的氨基酸突變：

通過(guò)參考蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)[PDB]條目2EEK！定義：

E21T、H25Y、H29(Y/N)、V47I、K49E、D50Q、L63I、H71D、H72N、R74(K/E)、N76(T/L)、T79(S/N)、Y82F、S85A、S87(K/R)、S89R、N98T、I99L、V121I、M135Q、V138I、M145(T/L/V/E/K)、V148G、D150S、K154(T/V)、L160(I/A)、M175(K/Q)、S179N、A183V、L185G、V212I、Y217(D/H/S)、P225Y、A229V、V233N、L234Y、V238I、M242I、N244S和/或Y245N。

通過(guò)參考Uniprot條目P16049-1和SEQ ID NO:2定義：

E25T、H29Y、H33(Y/N)、V49I、K51E、D52Q、L65I、H72D、H73N、R75(K/E)、N77(T/L)、T80(S/N)、Y83F、S86A、S88(K/R)、N99T、I100L、V122I、M134Q、V137I、M144(T/L/V/E/K)、V147G、D149S、K152(T/V)、L158(I/A)、M173(K/Q)、S177N、A181V、L184G、V208I、Y213(D/H/S)、P221Y、A225V、V229N、L230Y、V234I、M238I、N240S和/或Y241N。

舉例來(lái)說(shuō)，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽可以包含以下或由以下組成：具有下列定義的突變之一或其組合(表1)的SEQ ID NO:1的氨基酸序列：

表1

同樣地，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽可以包含以下或由以下組成：具有下列定義的突變之一或其組合(表2)的SEQ ID NO:1的氨基酸：

表2

在上表1和2中，在通過(guò)參考SEQ ID NO:2中的突變(即，UniProt P16049-1)定義具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽的情況下，應(yīng)了解，成熟的蛋白酶將以I20開(kāi)始作為其N端氨基酸。然而，其通常將表達(dá)為在N端處具有活化序列的酶原多肽(參看上文)。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，上文所鑒別的突變(通過(guò)參考大西洋鱈魚的胰蛋白酶I的氨基酸序列，SEQ ID NO:1定義)也可以在來(lái)自其它物種的胰蛋白酶中制得。舉例來(lái)說(shuō)，在SEQ ID NO:3和4中突出強(qiáng)調(diào)的特定突變(分別是H25N和L160I，參考SEQ ID NO:1和PDB 2EEK！)可以在來(lái)自阿拉斯加青鱈的胰蛋白酶中制得(例如，參看GenBank：BAH70476.3，其中活性胰蛋白酶的氨基酸序列在位置I20處開(kāi)始，以使得H25對(duì)應(yīng)于BAH70476.3中的H29，等等)。

在一個(gè)替代性實(shí)施方案中，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽包含以下或由以下組成：天然存在的絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列。因此，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽可以由真核或原核來(lái)源的天然存在的胰蛋白酶的氨基酸序列組成。特定包括冷適應(yīng)胰蛋白酶，諸如來(lái)自大西洋鱈魚(大西洋真鱈)、大西洋和太平洋鮭魚(例如，大西洋鮭和大麻哈魚屬)以及阿拉斯加青鱈(黃線狹鱈)的胰蛋白酶。舉例來(lái)說(shuō)，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽可以包含SEQ ID NO:1的氨基酸或由SEQ ID NO:1的氨基酸組成。

然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明的這類天然存在的絲氨酸蛋白酶多肽必須以不同于其在自然界中所發(fā)現(xiàn)的形式的形式提供。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的多肽可以由天然存在的真核胰蛋白酶的氨基酸序列組成，但缺乏存在于在自然界中表達(dá)的蛋白質(zhì)上的糖基化部分。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)了解，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽還可以包含上文所定義的氨基酸序列中的任一者的片段或由這個(gè)片段組成，其中這個(gè)片段展現(xiàn)抗微生物活性(如上文關(guān)于本發(fā)明的第一個(gè)方面所論述)。

有利地，本發(fā)明的第二個(gè)方面的重組多肽相對(duì)于天然存在的絲氨酸蛋白酶展現(xiàn)一種或多種改善或其它方面有益的特性。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽相對(duì)于從大西洋鱈魚分離(即，從鱈魚純化并且具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(PDB 2EEK！)；作為從Zymetech Ltd可購(gòu)得；還參看EP 1 202 743 B，其相關(guān)公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式并入本文中)的胰蛋白酶I展現(xiàn)改善的穩(wěn)定性。

舉例來(lái)說(shuō)，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽相對(duì)于從大西洋鱈魚分離的胰蛋白酶I的胰蛋白酶多肽可以展現(xiàn)改善的熱穩(wěn)定性?！盁岱€(wěn)定性”意指多肽當(dāng)暴露于高溫時(shí)保留其絲氨酸蛋白酶活性的能力。熱穩(wěn)定性可以通過(guò)測(cè)定當(dāng)多肽在60℃下儲(chǔ)存3.5小時(shí)時(shí)絲氨酸蛋白酶活性的保留來(lái)評(píng)估(參看下文的實(shí)施例)。

具有改善的熱穩(wěn)定性的本發(fā)明的例示性多肽包括那些多肽，其包含以下或由以下組成：具有下列定義的突變之一(參看表1)的SEQ ID NO:1的氨基酸(PDB 2EEK！)：

(a)K154E(“EZA-006”)；

(b)N98T(“EZA-007”)；

(c)I99L(“EZA-008”)；

(d)V212I(“EZA-0010”)；

(e)Y217D、M175K(“EZA-011”)；

(f)Y217H(“EZA-012”)；

(g)A229V(“EZA-014”)；

(h)H25Y(“EZA-015”)；

(i)H25N(“EZA-016”)；

(j)H72N(“EZA-019”)；

(k)R74E(“EZA-021”)；

(l)N76L、Y82F(“EZA-023”)；

(m)T79N(“EZA-025”)；

(n)K49E、D50Q(“EZA-026”)；

(o)S87R(“EZA-027”)；

(p)E21T、H71D、D150S、K154V(“EZA-028”)；

(q)S179N、V233N(“EZA-029”)；

(r)M135Q(“EZA-030”)；

(s)M145K、V148G(“EZA-031”)；

(t)L63I、S85A(“EZA-033”)；

(u)L160I(“EZA-034”)；

(v)V138I、L160A、A183V(“EZA-035”)；

(w)V121I(“EZA-036”)；

(x)V47I、V238I、M242I(“EZA-037”)；以及

(y)L234Y(“EZA-039”)

其中突變位置參考PDB條目號(hào)2EEK！中的氨基酸編號(hào)鑒別。

或者或另外，本發(fā)明的多肽相對(duì)于從大西洋鱈魚分離的胰蛋白酶I可以展現(xiàn)改善的自體蛋白水解穩(wěn)定性。

“自體蛋白水解穩(wěn)定性”意指多肽保留其絲氨酸蛋白酶活性而不會(huì)因多肽催化本身蛋白水解性裂解引起失活的能力。自體蛋白水解穩(wěn)定性可以通過(guò)測(cè)定當(dāng)多肽在25℃下儲(chǔ)存8小時(shí)時(shí)絲氨酸蛋白酶活性的保留來(lái)評(píng)估(參看下文的實(shí)施例)。

具有改善的自體蛋白水解穩(wěn)定性的本發(fā)明的例示性多肽包括那些多肽，其包含以下或由以下組成：具有下列定義的突變之一(參看表1)的SEQ ID NO:1的氨基酸(PDB 2EEK！)：

(a)I99L(“EZA-008”)；

(b)V212I(“EZA-0010”)；

(c)Y217D、M175K(“EZA-011”)；

(d)Y217H(“EZA-012”)；

(e)A229V(“EZA-014”)；

(f)H25Y(“EZA-015”)；

(g)H25N(“EZA-016”)；

(h)H29Y(“EZA-017”)；

(i)H72N(“EZA-019”)；

(j)R74E(“EZA-021”)；

(k)N76T(“EZA-022”)；

(l)N76L、Y82F(“EZA-023”)；

(m)T79S(“EZA-0024”)；

(n)T79N(“EZA-025”)；

(o)K49E、D50Q(“EZA-026”)；

(p)S87R(“EZA-027”)；

(q)E21T、H71D、D150S、K154V(“EZA-028”)；

(r)S179N、V233N(“EZA-029”)；

(s)M135Q(“EZA-030”)；

(t)M145K、V148G(“EZA-031”)；

(u)L63I、S85A(“EZA-033”)；

(v)L160I(“EZA-034”)；

(w)V138I、L160A、A183V(“EZA-035”)；

(x)V121I(“EZA-036”)；以及

(y)V47I、V238I、M242I(“EZA-037”)

其中突變位置參考PDB條目號(hào)2EEK！中的氨基酸編號(hào)鑒別。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明的多肽相對(duì)于從大西洋鱈魚分離(即，從鱈魚純化并且具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列；作為可購(gòu)得)的胰蛋白酶I可以展現(xiàn)改善的催化活性。

舉例來(lái)說(shuō)，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽相對(duì)于從大西洋鱈魚分離的胰蛋白酶I可以展現(xiàn)改善(即，升高)的Kcat。

具有改善的Kcat的本發(fā)明的例示性多肽包括那些多肽，其包含以下或由以下組成：具有下列定義的突變之一(參看表1)的SEQ ID NO:1的氨基酸(PDB2EEK！)：

(a)H25N(“EZA-016”)；

(b)H29Y(“EZA-017”)；

(c)H71D(“EZA-018”)；

(d)H72N(“EZA-019”)；

(e)N76T(“EZA-022”)；

(f)N76L、Y82F(“EZA-023”)；

(g)M145K、V148G(“EZA-031”)；

(h)M175Q(“EZA-032”)；

(i)L63I、S85A(“EZA-033”)；

(j)L160I(“EZA-034”)；

(k)V138I、L160A、A183V(“EZA-035”)；

(l)V47I、V238I、M242I(“EZA-037”)；以及

(m)V238I(“EZA-038”)

其中突變位置參考PDB條目號(hào)2EEK！中的氨基酸編號(hào)鑒別。

或者或另外，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽相對(duì)于從大西洋鱈魚分離的胰蛋白酶I可以展現(xiàn)改善(即，較低)的Km。

具有改善的Km的本發(fā)明的例示性多肽包括那些多肽，其包含以下或由以下組成：具有下列定義的突變之一(參看表1)的SEQ ID NO:1的氨基酸(PDB2EEK！)：

(a)K154T(“EZA-003”)；

(b)I99L(“EZA-008”)；

(c)V212I(“EZA-0010”)；

(d)Y217D、M175K(“EZA-011”)；

(e)Y217S(“EZA-013”)；

(f)A229V(“EZA-014”)；

(g)H25Y(“EZA-015”)；

(h)K49E、D50Q(“EZA-026”)；

(i)E21T、H71D、D150S、K154V(“EZA-028”)；以及

(j)M135Q(“EZA-030”)

其中突變位置參考PDB條目號(hào)2EEK！中的氨基酸編號(hào)鑒別。

最后，具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽相對(duì)于從大西洋鱈魚分離的胰蛋白酶I可以展現(xiàn)改善(即，升高)的特異性常數(shù)(Kcat/Km)。

具有改善的Kcat/Km的本發(fā)明的例示性多肽包括那些多肽，其包含以下或由以下組成：具有下列定義的突變之一(參看表1)的SEQ ID NO:1的氨基酸(PDB 2EEK！)：

(a)K154T(“EZA-003”)；

(b)Y217D、M175K(“EZA-011”)；

(c)Y217S(“EZA-013”)；

(d)A229V(“EZA-014”)；以及

(e)M135Q(“EZA-030”)；

其中突變位置參考PDB條目號(hào)2EEK！中的氨基酸編號(hào)鑒別。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明的多肽可以經(jīng)歷由宿主細(xì)胞進(jìn)行的翻譯后修飾。舉例來(lái)說(shuō)，在需要重組表達(dá)的多肽的糖基化的情況下，可以使用酵母宿主細(xì)胞(諸如巴斯德畢赤酵母)。

然而，細(xì)菌宿主細(xì)胞(諸如大腸桿菌)不允許多肽的糖基化。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是非糖基化的。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“氨基酸”包括標(biāo)準(zhǔn)的二十種遺傳編碼的氨基酸和其對(duì)應(yīng)的呈‘D’形式的立體異構(gòu)體(與天然的‘L’形式相比較)、ω-氨基酸、其它天然存在的氨基酸、非常規(guī)氨基酸(例如，α,α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸等等)以及化學(xué)衍生的氨基酸(參看下文)。

除非另有明確規(guī)定，否則當(dāng)特定列舉氨基酸，諸如“丙氨酸”或“Ala”或“A”時(shí)，這個(gè)術(shù)語(yǔ)指的是L-丙氨酸與D-丙氨酸。其它非常規(guī)氨基酸也可以是本發(fā)明的多肽的適合組分，只要所需的功能特性由多肽保留即可。對(duì)于所示的多肽，每個(gè)編碼的氨基酸殘基在適當(dāng)時(shí)由單字母名稱表示，對(duì)應(yīng)于常規(guī)氨基酸的俗名。

在一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所定義的多肽包含L-氨基酸或由L-氨基酸組成。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明的多肽可以包含一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)修飾或衍生的氨基酸或由一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)修飾或衍生的氨基酸組成。

一個(gè)或多個(gè)氨基酸的化學(xué)衍生物可以通過(guò)與功能側(cè)基反應(yīng)而達(dá)成。這類衍生的分子包括例如游離氨基已經(jīng)衍生形成胺鹽酸鹽、對(duì)甲苯磺?；?、羧基苯甲酰氧基、叔丁氧基羰基、氯乙酰基或甲?；哪切┓肿?。游離羧基可以衍生形成鹽、甲酯和乙酯或其它類型的酯和酰肼。游離羥基可以衍生形成O-?；騉-烷基衍生物。化學(xué)衍生物還包括含有二十種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。舉例來(lái)說(shuō)：4-羥基脯氨酸可以代替脯氨酸；5-羥基賴氨酸可以代替賴氨酸；3-甲基組氨酸可以代替組氨酸；高絲氨酸可以代替絲氨酸并且鳥(niǎo)氨酸代替賴氨酸。衍生物還包括含有一個(gè)或多個(gè)添加或缺失的肽，只要維持必需的活性即可。其它包括的修飾是酰胺化、氨基末端?；?例如，乙酰化或硫代乙醇酸酰胺化)、末端羧基酰胺化(例如，使用氨或甲胺)以及類似的末端修飾。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)進(jìn)一步了解，擬肽化合物也可能適用。術(shù)語(yǔ)‘?dāng)M肽’指的是模擬作為治療劑的特定肽的構(gòu)象和所需特征的化合物。

舉例來(lái)說(shuō)，所述多肽不僅包括氨基酸殘基通過(guò)肽(-CO-NH-)鍵聯(lián)連接的分子，而且包括肽鍵反轉(zhuǎn)的分子。這類逆反(retro-inverso)擬肽可以使用本領(lǐng)域中已知的方法制得，例如Meziere等(1997)《免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)》159,3230-3237中所描述的那些，這個(gè)文獻(xiàn)以引用的方式并入本文中。這種方法涉及制造含有涉及骨架的變化，而不是側(cè)鏈的定向的偽肽。含有NH-CO鍵替代CO-NH肽鍵的逆反肽對(duì)蛋白水解的抗性大得多?；蛘?，所述多肽可以是氨基酸殘基中的一者或多者通過(guò)-y(CH₂NH)-鍵代替常規(guī)酰胺鍵聯(lián)連接的擬肽化合物。

在另一個(gè)替代方案中，肽鍵可以完全免除，條件是使用保留氨基酸殘基的碳原子之間的間隔的適當(dāng)連接子部分；可能有利的是連接子部分具有與肽鍵實(shí)質(zhì)上相同的電荷分布和實(shí)質(zhì)上相同的平面性。

還應(yīng)了解，所述多肽可以便利地在其N端或C端處受阻斷以便幫助降低對(duì)外蛋白水解性消化的敏感度。

多種未編碼或修飾的氨基酸，諸如D-氨基酸和N-甲基氨基酸也已經(jīng)用于修飾哺乳動(dòng)物肽。另外，假定的生物活性構(gòu)象可以通過(guò)共價(jià)修飾，諸如環(huán)化或通過(guò)并入內(nèi)酰胺或其它類型的橋來(lái)穩(wěn)定，例如，參看Veber等,1978,《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》75:2636和Thursell等,1983,《生物化學(xué)與生物物理研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Comm.)》111:166，其以引用的方式并入本文中。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明還包括上文所描述的多肽的醫(yī)藥學(xué)上可接受的酸或堿加成鹽。用于制備適用于本發(fā)明的前述堿化合物的醫(yī)藥學(xué)上可接受的酸加成鹽的酸是形成無(wú)毒的酸加成鹽，即，含有藥理學(xué)上可接受的陰離子的鹽的那些，這些鹽尤其諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、酒石酸氫鹽、琥珀酸鹽、馬來(lái)酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、蔗糖酸鹽、苯甲酸鹽、甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽以及雙羥萘酸鹽[即，1,1'-亞甲基-雙(2-羥基-3-萘甲酸鹽)]。

醫(yī)藥學(xué)上可接受的堿加成鹽也可以用于產(chǎn)生多肽的醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽形式?？梢杂米髦苽湫再|(zhì)上呈酸性的本發(fā)明化合物的醫(yī)藥學(xué)上可接受的堿鹽的試劑的化學(xué)堿是與這類化合物形成無(wú)毒的堿鹽的那些。這類無(wú)毒的堿鹽包括(但不限于)來(lái)源于這類藥理學(xué)上可接受的陽(yáng)離子的那些，尤其諸如堿金屬陽(yáng)離子(例如，鉀和鈉)和堿土金屬陽(yáng)離子(例如，鈣和鎂)，銨或水溶性胺加成鹽，諸如N-甲基葡糖胺(葡甲胺)，以及醫(yī)藥學(xué)上可接受的有機(jī)胺的低碳烷醇銨和其它堿鹽。

應(yīng)進(jìn)一步了解，本發(fā)明的多肽可以凍干用于儲(chǔ)存并且在使用前在適合的載劑中重構(gòu)?？梢圆捎萌魏芜m合的凍干方法(例如，噴霧干燥、濾餅干燥)和/或重構(gòu)技術(shù)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，凍干和重構(gòu)可以導(dǎo)致不同程度的活性損失并且使用水平可能必須向上調(diào)整以作補(bǔ)償。優(yōu)選地，凍干(冷凍干燥)的多肽當(dāng)再水合時(shí)損失不大于約20％、或不大于約25％、或不大于約30％、或不大于約35％、或不大于約40％、或不大于約45％、或不大于約50％的其活性(凍干前)。

本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了一種分離的核酸分子，其編碼根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽?！昂怂岱肿印卑―NA(例如，基因組DNA或互補(bǔ)DNA)和mRNA分子，其可以是單股或雙股的。“分離”意指核酸分子并不位于細(xì)胞內(nèi)或以其它方式提供于細(xì)胞內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸分子是cDNA分子。

本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括以下：

(a)本發(fā)明的第四個(gè)方面提供了一種載體(諸如表達(dá)載體)，其包含根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面的核酸分子；以及

(b)本發(fā)明的第五個(gè)方面提供了一種宿主細(xì)胞(諸如微生物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)，其包含根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面的核酸分子或根據(jù)本發(fā)明的第四個(gè)方面的載體。

本發(fā)明的第六個(gè)方面提供了一種治療性組合物，其包含醫(yī)藥學(xué)上有效量的根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的多肽和醫(yī)藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載劑、佐劑或賦形劑。

額外的化合物可以包括于組合物中，包括螯合劑，諸如EDTA、檸檬酸鹽、EGTA或谷胱甘肽?？刮⑸?治療性組合物可以按本領(lǐng)域中已知的方式制備，其儲(chǔ)存足夠穩(wěn)定并且適合施用于人類和動(dòng)物。治療性組合物可以凍干，例如，經(jīng)由冷凍干燥、噴霧干燥、噴霧冷卻，或經(jīng)由使用來(lái)自超臨界粒子成型的粒子成型。

“醫(yī)藥學(xué)上可接受”意指不會(huì)降低本發(fā)明多肽的胰蛋白酶活性的有效性的無(wú)毒物質(zhì)。這類醫(yī)藥學(xué)上可接受的緩沖劑、載劑或賦形劑在本領(lǐng)域中是眾所周知的(參看《雷明頓醫(yī)藥科學(xué)(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,第18版,A.R Gennaro編,Mack Publishing Company(1990)和《醫(yī)藥賦形劑手冊(cè)(handbook of Pharmaceutical Excipients)》,第3版,A.Kibbe編,Pharmaceutical Press(2000)，其公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式并入本文中)。

術(shù)語(yǔ)“緩沖劑”欲意指含有酸-堿混合物以穩(wěn)定pH為目的的水性溶液。緩沖劑的實(shí)例是Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸鹽、碳酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乙醇酸鹽、乳酸鹽、硼酸鹽、ACES、ADA、酒石酸鹽、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、二甲胂酸鹽、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO以及TES。

術(shù)語(yǔ)“稀釋劑”欲意指在治療性制劑中以稀釋肽為目的的水性或非水性溶液。稀釋劑可以是鹽水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(諸如紅花油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)中的一者或多者。

術(shù)語(yǔ)“佐劑”欲意指添加至配方中以增加本發(fā)明的多肽的生物作用的任何化合物。佐劑可以是具有不同陰離子的鋅、銅或銀鹽中的一者或多者，例如(但不限于)不同?；M成的氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸鹽、亞硫酸鹽、氫氧化物、磷酸鹽、碳酸鹽、乳酸鹽、乙醇酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽、酒石酸鹽以及乙酸鹽。佐劑還可以是陽(yáng)離子聚合物，諸如陽(yáng)離子纖維素醚、陽(yáng)離子纖維素酯、脫乙?；该髻|(zhì)酸、殼聚糖、陽(yáng)離子樹(shù)狀聚合物，陽(yáng)離子合成聚合物，諸如聚(乙烯基咪唑)，以及陽(yáng)離子多肽，諸如聚組氨酸、聚賴氨酸、聚精氨酸以及含有這些氨基酸的肽。

賦形劑可以是碳水化合物、聚合物、脂質(zhì)以及礦物中的一者或多者。碳水化合物的實(shí)例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇以及環(huán)糊精，將其添加至組合物中，例如，用于促進(jìn)凍干。聚合物的實(shí)例是淀粉、纖維素醚、纖維素羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、海藻酸鹽、角叉菜膠、透明質(zhì)酸和其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸鹽、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚氧化丙烯共聚物、不同程度的水解的聚乙烯醇/聚乙酸乙烯酯、以及聚乙烯吡咯烷酮，全部具有不同分子量，將其添加至組合物中，例如，用于粘度控制、用于達(dá)成生物粘附、或用于保護(hù)脂質(zhì)免于化學(xué)或蛋白水解性降解。脂質(zhì)的實(shí)例是脂肪酸、磷脂、甘油單酯、甘油二酯和甘油三酯、神經(jīng)酰胺、鞘脂和糖脂(全部具有不同?；滈L(zhǎng)度和飽和度)、蛋卵磷酯、大豆卵磷脂、氫化蛋和大豆卵磷脂，出于與聚合物類似的原因?qū)⑵涮砑又两M合物中。礦物的實(shí)例是滑石、氧化鎂、氧化鋅以及氧化鈦，將其添加至組合物中以獲得益處，諸如液體積存的減少或有利的顏料特性。

在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽可以與穩(wěn)定劑，諸如氯化鈣一起提供。

本發(fā)明的多肽可以配制成本領(lǐng)域中已知的適合于遞送多肽劑的任何類型的治療性組合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽可以簡(jiǎn)單地溶解于水、鹽水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(諸如紅花油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)、黃蓍膠和/或各種緩沖劑中。舉例來(lái)說(shuō)，在配制多肽以經(jīng)口施用(諸如在口腔噴霧中)的情況下，治療性組合物可以包含溶解于水、甘油以及薄荷醇中的多肽。例示性口腔噴霧配方在斯堪的納維亞(Scandinavia)內(nèi)作為(由Enzymatica AB,Lund,Sweden)銷售。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在滲透活性溶液中的如上文所描述的蛋白酶多肽。舉例來(lái)說(shuō)，多肽可以在甘油或丙三醇中配制。在不希望受理論約束的情況下，據(jù)信這類滲透活性溶液有助于流體從微生物細(xì)胞內(nèi)移動(dòng)至細(xì)胞外環(huán)境。據(jù)信這繼而通過(guò)建立抑制(至少一部分)諸如細(xì)菌和病毒的微生物細(xì)胞被宿主上皮細(xì)胞(例如，口咽的)吸收的薄的活性屏障而有助于本發(fā)明的多肽的治療作用。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療性組合物可以呈脂質(zhì)體的形式，其中多肽除了其它醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑以外還與諸如脂質(zhì)的兩親劑組合，其以聚集形式作為膠束、不溶性單層以及液晶存在。用于脂質(zhì)體配方的適合脂質(zhì)包括(但不限于)甘油單酯、甘油二酯、硫脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、膽汁酸等等。適合的脂質(zhì)還包括在極性頭基中由聚(乙二醇)修飾用于延長(zhǎng)血流循環(huán)時(shí)間的上述脂質(zhì)。這類脂質(zhì)體配方的制備可以在例如US 4,235,871中找到，其公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式并入本文中。

本發(fā)明的治療性組合物還可以呈生物可降解微球的形式。脂肪族聚酯，諸如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、PLA與PGA的共聚物(PLGA)或聚(己內(nèi)酯)(PCL)以及聚酸酐已經(jīng)廣泛用作微球生產(chǎn)中的生物可降解聚合物。這類微球的制備可以在US 5,851,451中和EP 0 213 303中找到，其公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式并入本文中。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療性組合物以聚合物凝膠的形式提供，其中諸如淀粉、纖維素醚、纖維素羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、海藻酸鹽、角叉菜膠、透明質(zhì)酸和其衍生物、聚丙烯酸、聚乙烯基咪唑、聚磺酸鹽、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚氧化丙烯共聚物、不同程度的水解的聚乙烯醇/聚乙酸乙烯酯、以及聚乙烯吡咯烷酮的聚合物用于含有肽的溶液的增稠。聚合物還可以包含明膠或膠原蛋白。

應(yīng)了解，本發(fā)明的治療性組合物可以包括離子和規(guī)定的pH用于多肽作用的強(qiáng)化。另外，組合物可以經(jīng)受常規(guī)治療性操作，諸如滅菌，和/或可以含有常規(guī)佐劑，諸如防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、緩沖劑、填充劑等等。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，治療性組合物包含Tris或磷酸鹽緩沖液中的中的多肽，連同EDTA、木糖醇、山梨糖醇、丙二醇以及甘油中的一者或多者。

根據(jù)本發(fā)明的治療性組合物可以經(jīng)由本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何適合途徑施用。因此，可能的施用途徑包括經(jīng)口、經(jīng)頰、腸道外(靜脈內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)以及肌肉內(nèi))、局部、經(jīng)眼、經(jīng)鼻、經(jīng)肺、腸道外、經(jīng)陰道以及經(jīng)直腸。從植入物施用也是可能的。

在一個(gè)替代性實(shí)施方案中，治療性組合物是腸道外施用，例如，靜脈內(nèi)、腦室內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、胸骨內(nèi)、顱內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下，或其可以通過(guò)輸注技術(shù)施用。治療性組合物以無(wú)菌水性溶液的形式便利地施用，這種溶液可以含有其它物質(zhì)，例如，足夠的鹽或葡萄糖以使溶液與血液等張。如有必要，水性溶液應(yīng)適當(dāng)?shù)鼐彌_(優(yōu)選地達(dá)到3至9的pH)。在無(wú)菌條件下適合的腸道外配方的制備容易通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)藥技術(shù)實(shí)現(xiàn)。

適合于腸道外施用的配方包括水性和非水性無(wú)菌注射溶液，其可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑以及促使配方與預(yù)期接受者的血液等張的溶質(zhì)；以及水性和非水性無(wú)菌懸浮液，其可以包括懸浮劑和增稠劑。配方可以在單位劑量或多劑量容器，例如密封安瓿和小瓶中呈現(xiàn)，并且可以在冷凍干燥(凍干)條件中儲(chǔ)存，其僅需要在臨用前添加無(wú)菌液體載劑，例如注射用水。即時(shí)注射溶液和懸浮液可以從先前所描述的種類的無(wú)菌粉末、顆粒以及片劑制備。

或者，治療性組合物可以鼻內(nèi)或通過(guò)吸入施用(例如，以氣霧劑噴霧呈現(xiàn)形式從加壓容器、泵、噴霧器或霧化器借助于適合的推進(jìn)劑，諸如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氫氟烷烴諸如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134A3)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227EA3)、二氧化碳或其它適合的氣體)。在加壓氣霧劑的情況下，劑量單位可以通過(guò)提供閥門以遞送計(jì)量的量來(lái)確定。加壓容器、泵、噴霧器或霧化器可以含有活性多肽的溶液或懸浮液，例如使用乙醇與推進(jìn)劑的混合物作為溶劑，其可以另外含有潤(rùn)滑劑，例如脫水山梨糖醇三油酸酯?？梢耘渲朴糜谖肫骰虼等肫髦械哪z囊和藥筒(例如，從明膠制得)以含有本發(fā)明的化合物與適合的粉末基劑(諸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

有利地，多肽以適合于遞送至口腔和/或口咽的粘膜的形式提供。舉例來(lái)說(shuō)，多肽可以在口腔噴霧、糖錠、香錠、口香糖或液體中提供。

治療性組合物將以醫(yī)藥學(xué)上有效劑量施用于患者。如本文所用的‘治療有效量’或‘有效量’或‘治療有效’指的是為給定的病狀和施用方案提供治療作用的量。這是經(jīng)過(guò)計(jì)算以與所需要的添加劑和稀釋劑，即，載劑或施用媒劑聯(lián)合產(chǎn)生所需治療作用的活性物質(zhì)的預(yù)定數(shù)量。此外，其欲意指足以減少并且最優(yōu)選地防止宿主的活動(dòng)、功能以及反應(yīng)的臨床上顯著缺乏的量?；蛘撸委熡行Я孔阋砸鹚拗鞯呐R床上顯著的病狀的改善。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解，化合物的量可以取決于其比活性而變化。適合的劑量可以含有經(jīng)過(guò)計(jì)算以與所需要的稀釋劑聯(lián)合產(chǎn)生所需治療作用的活性組合物的預(yù)定數(shù)量。在制造本發(fā)明的組合物的方法和用途中，提供治療有效量的活性組分。如本領(lǐng)域中眾所周知，治療有效量可以由一般技術(shù)的醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)工作者基于患者特征，諸如年齡、體重、性別、病狀、并發(fā)癥、其它疾病等等來(lái)確定。醫(yī)藥學(xué)上有效劑量的施用可以通過(guò)以個(gè)別的劑量單位或者數(shù)個(gè)較小的劑量單位的形式單次施用以及通過(guò)以特定時(shí)間間隔多次施用細(xì)分的劑量來(lái)進(jìn)行。或者，劑量可以作為連續(xù)輸注經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)段提供。

多肽可以按各種濃度配制，這取決于所使用的化合物的功效/毒性。優(yōu)選地，配方包含濃度介于0.1μM與1mM之間，更優(yōu)選地介于1μM與500μM之間、介于500μM與1mM之間、介于300μM與700μM之間、介于1μM與100μM之間、介于100μM與200μM之間、介于200μM與300μM之間、介于300μM與400μM之間、介于400μM與500μM之間，并且最優(yōu)選地約500μM的活性劑。

因此，治療性配方可以包含在施用于受試者之后足以殺死或減緩微生物，諸如病毒、細(xì)菌以及酵母的生長(zhǎng)的多肽的量。

本發(fā)明的第七個(gè)方面提供了根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽，其用于醫(yī)學(xué)中。

本發(fā)明的第八個(gè)相關(guān)方面提供了如上文所定義的多肽，其制備用于治療或預(yù)防選自由微生物感染、發(fā)炎以及創(chuàng)傷組成的群組的病癥或病狀的藥物。

“微生物感染”包括細(xì)菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生蟲(chóng)感染以及酵母感染。

舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的多肽可以用于治療或預(yù)防與細(xì)菌感染(有或沒(méi)有生物膜形成)相關(guān)的病癥或病狀，諸如牙周病。

或者，本發(fā)明的多肽可以用于治療或預(yù)防與病毒感染相關(guān)的病癥或病狀，諸如普通感冒和流感。舉例來(lái)說(shuō)，病毒感染可以由腸病毒(諸如人鼻病毒或柯薩奇A病毒)或由單純皰疹病毒引起。

另外，本發(fā)明的多肽可以用于治療或預(yù)防與真菌感染相關(guān)的病癥或病狀，諸如腳癬(香港腳(athlete's foot))和念珠菌病(鵝口瘡)。

本發(fā)明的多肽特別適合用于具有或易感免疫缺陷的受試者。

“免疫缺陷”意指受試者的免疫疾病完全或部分受損害的病狀。免疫缺陷可以是獲得性或繼發(fā)性的，例如在用免疫抑制劑療法治療之后，或可以是原發(fā)性的，例如身體免疫系統(tǒng)的一部分缺少或不正常發(fā)揮功能的天然存在的病癥。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫缺陷是繼發(fā)性或獲得性免疫缺陷。

舉例來(lái)說(shuō)，受試者的免疫缺陷可能因接受免疫抑制劑療法(諸如糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞抑制劑、抗體、作用于親免素(immunophilin)的藥物、干擾素、類鴉片、TNF結(jié)合蛋白、霉酚酸酯以及放射療法)的治療引起。

免疫抑制劑療法通常用于醫(yī)學(xué)中，例如：

(a)以預(yù)防移植的器官和組織(例如，骨髓、心、腎、肝)的排斥反應(yīng)；

(b)以治療自體免疫疾病或自體免疫來(lái)源的疾病(例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力、全身性紅斑狼瘡、肉狀瘤病、局灶節(jié)段性腎小球硬化、克羅恩氏病(Crohn's disease)、白塞氏病(Behcet's Disease)、天皰瘡以及潰瘍性結(jié)腸炎)；以及

(c)以治療其它非自體免疫發(fā)炎性疾病(例如，長(zhǎng)期過(guò)敏性哮喘控制)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫缺陷是天然存在的免疫缺陷。舉例來(lái)說(shuō)，免疫缺陷可以歸因于原發(fā)性免疫缺陷(參看下文)、癌癥(諸如白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤)、慢性感染(諸如獲得性免疫缺陷綜合癥或AIDS)、營(yíng)養(yǎng)不良和/或老齡化。

原發(fā)性免疫缺陷包括促使患者更易發(fā)生感染的多種病癥。如果不加治療，那么這些感染可能是致命的。常見(jiàn)的原發(fā)性免疫缺陷包括體液免疫病癥(影響B(tài)細(xì)胞分化或抗體產(chǎn)生)、T細(xì)胞缺陷以及聯(lián)合B細(xì)胞和T細(xì)胞缺陷、吞噬細(xì)胞病癥以及補(bǔ)體缺陷。這些病癥的主要指示包括多重感染(盡管有積極的治療)、不常見(jiàn)或機(jī)會(huì)性生物體的感染、無(wú)法成長(zhǎng)或不良生長(zhǎng)以及陽(yáng)性家族史。早期識(shí)別和診斷可以顯著改變?cè)l(fā)性免疫缺陷的過(guò)程并且對(duì)患者結(jié)果具有正面影響。

因此，本發(fā)明的多肽用于治療或預(yù)防口腔和/或口咽的繼發(fā)性感染。舉例來(lái)說(shuō)，多肽可以用于治療或預(yù)防鼻溢和/或口腔真菌感染和/或牙齦瘡瘍。

本發(fā)明的多肽特別適用于治療或預(yù)防罹受有規(guī)律的感染事件(例如一年至少五次微生物感染，例如一年至少十次、十五次、二十次、三十次或更多次微生物感染)的PI患者的微生物感染。

本發(fā)明的多肽也特別適用于治療或預(yù)防運(yùn)動(dòng)員，尤其職業(yè)運(yùn)動(dòng)員或其他高機(jī)能運(yùn)動(dòng)員的微生物感染。這類個(gè)體的過(guò)度訓(xùn)練和/或長(zhǎng)期體力消耗可以導(dǎo)致免疫功能的暫時(shí)性削弱，這可以持續(xù)數(shù)小時(shí)至數(shù)天，促使其在那個(gè)時(shí)段期間易受微生物感染(尤其是感冒和流感)。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽用于治療或預(yù)防馬拉松選手的微生物感染。多肽可以在即將馬拉松賽跑之前施用(例如，在事件之前持續(xù)一天或兩天或更多天)，在事件本身當(dāng)天施用，和/或緊接在馬拉松賽跑之后施用(例如，在事件之后持續(xù)一天或兩天或三天或四天或五天或六天或七天或更多天)。

在一個(gè)替代性實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可以用于治療或預(yù)防與發(fā)炎相關(guān)的病癥或病狀。

舉例來(lái)說(shuō)，發(fā)炎性病癥或病狀可以選自由以下組成的群組：疼痛、急性發(fā)炎、慢性發(fā)炎、關(guān)節(jié)炎、發(fā)炎關(guān)節(jié)、滑囊炎、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、敗血性關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、全身性紅斑狼瘡、靜脈炎、腱炎、皮疹、牛皮癬、痤瘡、濕疹、面部脂溢性濕疹，以及手部、面部或頸部濕疹。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可以用于治療或預(yù)防創(chuàng)傷，諸如急性外傷(包括燒傷)、局部潰瘍、疤痕、瘢痕瘤、癤以及疣。

因此，本發(fā)明的多肽可以按創(chuàng)傷護(hù)理產(chǎn)品的形式(即，與創(chuàng)傷護(hù)理材料組合)提供。

“創(chuàng)傷護(hù)理材料”包括適合用于創(chuàng)傷護(hù)理的實(shí)質(zhì)上無(wú)毒的材料，包括海藻酸鹽、無(wú)定形水凝膠、片狀水凝膠、親水纖維(hydrofibre)以及其混合物。

創(chuàng)傷護(hù)理產(chǎn)品可以采取許多不同形式，這取決于所使用的構(gòu)成材料和產(chǎn)品的預(yù)期目的。通常，然而，產(chǎn)品以干燥的無(wú)紡布薄片、冷凍干燥的薄片、固體凝膠薄片、條帶、繩以及粘性凝膠的形式提供，其可以用于繃帶或敷料中或作為繃帶或敷料。

在使用之前，創(chuàng)傷護(hù)理產(chǎn)品應(yīng)是無(wú)菌的并且封裝于微生物不透性容器中。舉例來(lái)說(shuō)，創(chuàng)傷護(hù)理產(chǎn)品可以儲(chǔ)存于管或其它適合的無(wú)菌敷涂器中。

通常，將創(chuàng)傷護(hù)理產(chǎn)品直接敷涂至創(chuàng)傷的表面。任選地，可以在創(chuàng)傷護(hù)理產(chǎn)品的頂部敷涂第二種常規(guī)敷料。此外，在一些情況下，可以在創(chuàng)傷與創(chuàng)傷護(hù)理產(chǎn)品之間敷涂可透性抗粘附敷料。

多肽特別適合于清創(chuàng)(即，從其它方面健康的皮膚去除受感染、死亡或剝落的皮膚)和/或纖維蛋白凝塊的去除。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明的具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽可以與一種或多種額外活性劑組合使用。

舉例來(lái)說(shuō)，額外活性劑選自由以下組成的群組：抗微生物劑(包括抗生素、抗病毒劑以及抗真菌劑)、消炎劑(包括類固醇和非類固醇消炎劑)以及抗敗血?jiǎng)?/p>

或者或另外，本發(fā)明的具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽可以與一種或多種額外酶，諸如糖苷酶組合使用。

本發(fā)明的第九個(gè)方面提供了根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的多肽的用途，其用于制備用以治療或預(yù)防選自由微生物感染、發(fā)炎以及創(chuàng)傷(諸如上文關(guān)于本發(fā)明的第八個(gè)方面詳述的那些)組成的群組的病癥或病狀的藥物。

本發(fā)明的第十個(gè)方面提供了一種在受試者中治療或預(yù)防選自由微生物感染、發(fā)炎以及創(chuàng)傷(諸如上文關(guān)于本發(fā)明的第八個(gè)方面詳述的那些)組成的群組的病癥或病狀的方法，這種方法包括施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的多肽。

除了眾多醫(yī)學(xué)應(yīng)用以外，本發(fā)明的具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽在美容應(yīng)用中也具有效用。

因此，本發(fā)明的第十一個(gè)方面提供了根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的多肽的用途，其在受試者中作為美容療法。

本發(fā)明的第十三個(gè)方面提供了一種受試者中的美容療法的方法，其包括將有效量的根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的多肽施用于受試者。

在上述方面的一個(gè)實(shí)施方案中，美容療法將以下作用中的一者或多者提供給受試者：

(a)皮膚去角質(zhì)(去除死亡和/或剝落的皮膚細(xì)胞)；

(b)保護(hù)免于皮膚中的膠原蛋白和彈性蛋白分解；

(c)粉刺溶解作用；

(d)減少或防止眉間(皺眉)紋；和/或

(e)促進(jìn)頭發(fā)生長(zhǎng)。

本發(fā)明的具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽也具有作為工業(yè)劑的效用。

因此，本發(fā)明的第十四個(gè)方面提供了根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的多肽的用途，其作為工業(yè)劑。

舉例來(lái)說(shuō)，多肽可以用作以下一者或多者：

(a)織物處理劑；

(b)生物催化劑(例如，在醫(yī)藥品的有機(jī)合成中)；

(c)凈化/消毒劑(例如，清潔劑)；

(d)環(huán)境生物修復(fù)劑(例如，為了減少污染)；

(e)分子生物劑；以及

(f)食物產(chǎn)品處理劑(例如，在乳品制造中)。

除非上下文另有指示，否則本發(fā)明的給定方面、特征或參數(shù)的偏好和選項(xiàng)應(yīng)被視為已經(jīng)與本發(fā)明的所有其它方面、特征以及參數(shù)的任何和所有偏好和選項(xiàng)組合公開(kāi)。舉例來(lái)說(shuō)，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含具有SEQID NO:3或4的氨基酸序列的胰蛋白酶多肽的口腔噴霧，其用于治療或預(yù)防細(xì)菌或病毒感染。

在本說(shuō)明書中明顯先前公布的文獻(xiàn)的清單或論述不一定被認(rèn)為是承認(rèn)這個(gè)文獻(xiàn)是技術(shù)現(xiàn)狀的一部分或是公知常識(shí)。

在權(quán)利要求書和/或說(shuō)明書中與術(shù)語(yǔ)“包含”相結(jié)合使用的詞語(yǔ)“一個(gè)/種(a/an)”的使用可以意指“一個(gè)/種”，但其還與“一個(gè)/種或多個(gè)/種”、“至少一個(gè)/種”以及“一個(gè)/種或多于一個(gè)/種”的含義一致。

本發(fā)明的這些和其它實(shí)施方案當(dāng)與上述描述和隨附圖式相結(jié)合考慮時(shí)將更好地理解和了解。然而，應(yīng)了解，上述描述雖然指示本發(fā)明的各種實(shí)施方案和其眾多特定細(xì)節(jié)，但作為說(shuō)明而給出并且不具限制性。在本發(fā)明的范圍內(nèi)在不脫離其精神的情況下可以作出許多替代、修改、添加和/或重排，并且本發(fā)明包括所有這類替代、修改、添加和/或重排。

以下圖式構(gòu)成本說(shuō)明書的一部分并且包括在內(nèi)以進(jìn)一步展示本發(fā)明的某些方面。本發(fā)明通過(guò)與本文所呈現(xiàn)的特定實(shí)施方案的詳細(xì)描述組合參考圖式可以更好地了解。

圖1.重組胰蛋白酶的活化和穩(wěn)定性測(cè)試的示意性描述。

圖2.在BL21(DE3)和ArcticExpress(DE3)宿主細(xì)胞中EZA-034的表達(dá)的例示性SDS-PAGE分析。在4ml LB培養(yǎng)基中在由1mM IPTG誘導(dǎo)下分別在37℃持續(xù)6小時(shí)、28℃持續(xù)8小時(shí)、22℃持續(xù)16小時(shí)或18℃持續(xù)16小時(shí)的四種條件下進(jìn)行EZA-034的表達(dá)優(yōu)化。

圖3.EZA034的表達(dá)的例示性SDS-PAGE分析。在50ml搖瓶中使用兩種菌株BL21(DE3)和ArcticExpress(DE3)、三種培養(yǎng)基TB、TB加上0.5％葡萄糖以及TB加上0.5％葡萄糖減去甘油在由1mM IPTG誘導(dǎo)下分別在37℃持續(xù)6小時(shí)、28℃持續(xù)8小時(shí)、22℃持續(xù)16小時(shí)或18℃持續(xù)16小時(shí)的四種條件下進(jìn)行EZA-034的表達(dá)優(yōu)化。

圖4.在5L發(fā)酵中在兩種大腸桿菌菌株BL21(DE3)和ArcticExpress(DE3)中，在三種不同培養(yǎng)基(TB+0.5％甘油、TB+0.5％葡萄糖以及TB，在由0.5mMIPTG誘導(dǎo)下，在22℃下持續(xù)16小時(shí))中EZA-034的表達(dá)優(yōu)化。(A)EZA-034的表達(dá)的SDS-PAGE分析，(B)總細(xì)胞裂解物中EZA-034的％的圖示，其中％通過(guò)掃描對(duì)應(yīng)的SDS-PAGE定量，(C)所測(cè)試的條件的濕細(xì)胞重量的圖示，以及(D)在所測(cè)試的條件中EZA-034的計(jì)算表達(dá)水平的圖示。

圖5.在5L發(fā)酵中在大腸桿菌菌株ArcticExpress(DE3)中，在由0.5mMIPTG誘導(dǎo)下在22℃下持續(xù)16小時(shí)，分別在TB補(bǔ)料甘油、TB補(bǔ)料葡萄糖或2xTB無(wú)補(bǔ)料中EZA-034的表達(dá)優(yōu)化。(A)EZA-034的表達(dá)的SDS-PAGE分析，(B)總細(xì)胞裂解物中EZA-034的％的圖示，其中％通過(guò)掃描對(duì)應(yīng)的SDS-PAGE定量，(C)所測(cè)試的條件的濕細(xì)胞重量的圖示，以及(D)在所測(cè)試的條件中EZA-034的計(jì)算表達(dá)水平的圖示。低或高的OD指的是在IPTG誘導(dǎo)下的細(xì)胞密度，甘油補(bǔ)料的高OD等同于葡萄糖補(bǔ)料的高OD。

圖6.使用四種不同的活化肽，來(lái)自大西洋鱈魚的野生型胰蛋白酶I的重組表達(dá)的SDS-PAGE分析。

實(shí)施例

實(shí)施例A-產(chǎn)生重組絲氨酸蛋白酶多肽

克隆

將編碼所關(guān)注的絲氨酸蛋白酶多肽的合成基因克隆至不含任何標(biāo)簽的大腸桿菌表達(dá)E3載體(GenScript)中。

編碼來(lái)自大西洋鱈魚的野生型胰蛋白酶I的核酸在下文以SEQ ID NO:11示出(在pUC57中)

編碼來(lái)自大西洋鱈魚的胰蛋白酶I的突變型式的許多核酸分子通過(guò)常規(guī)技術(shù)，即，通過(guò)PCR定點(diǎn)誘變來(lái)合成。

胰蛋白酶的再折疊和純化

使用標(biāo)準(zhǔn)程序，即，熱休克轉(zhuǎn)化，用含有編碼所關(guān)注的絲氨酸蛋白酶多肽(胰蛋白酶)的核苷酸序列的E3載體轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞。

在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中過(guò)度表達(dá)酶原多肽(胰蛋白酶原)并且形成包涵體。

收集誘導(dǎo)之后的細(xì)胞并且通過(guò)超聲處理而裂解。離心之后，在緩沖液(50mM Tris，10mM EDTA，2％Triton X-100，300mM NaCl，2mM DTT，pH 8.0)中洗滌包涵體，并且溶解于50mM Tris，8M脲，pH 8.0中，并且然后在4℃下透析至1×PBS，10％甘油，pH 7.4中過(guò)夜。

來(lái)自再折疊的所表達(dá)的酶原多肽的純度展現(xiàn)>90％的純度并且認(rèn)為不需要其它純化。

然后通過(guò)添加從大西洋鱈魚純化的野生型胰蛋白酶I(0.2U/ml)并且在室溫下孵育24小時(shí)來(lái)活化重組酶原多肽(參看實(shí)施例B)。

例示性多肽

獲得或產(chǎn)生以下多肽：

(a)從大西洋鱈魚純化的野生型胰蛋白酶I(“WT-Tryp”或“野生型”)；

(b)大西洋鱈魚的重組表達(dá)的野生型胰蛋白酶I(SEQ ID NO:1，“R-Tryp”)；以及

(c)大西洋鱈魚的胰蛋白酶I的三十八種不同突變型式(即，SEQ ID NO:1的突變序列)。

鱈魚胰蛋白酶I的三十八種不同突變型式的序列突變示于表1(上文)中。

例示性胰蛋白酶多肽最初表達(dá)為具有融合至N端的活化肽MEEDK(SEQ ID NO:5)的酶原多肽。

實(shí)施例B：重組表達(dá)的大西洋鱈魚的胰蛋白酶I的野生型和突變體形式的穩(wěn)定性

這個(gè)實(shí)施例概述了來(lái)自在大腸桿菌中表達(dá)的39種重組胰蛋白酶突變體的活化的結(jié)果。在24小時(shí)孵育之后由從大西洋鱈魚純化的野生型胰蛋白酶I(WT-Tryp)活化重組胰蛋白酶多肽(R-Tryp)的活性。

材料與方法

重組胰蛋白酶的表達(dá)

參看實(shí)施例A

穩(wěn)定性的評(píng)估

設(shè)計(jì)用于重組樣品的活化和穩(wěn)定性分析的實(shí)驗(yàn)如下進(jìn)行(參看圖1)：

第1天：重組胰蛋白酶的活化

在室溫下在24小時(shí)期間在微量滴定板中由野生型胰蛋白酶(0.2U/ml)活化重組酶(0.2U/ml)。將樣品與20mM Tris-HCl，1mM CaCl₂，50％甘油，pH7.6混合達(dá)到200μl的最終體積。

第2天：活性和穩(wěn)定性測(cè)量

將活化的重組酶轉(zhuǎn)移至新的微量滴定板(II)并且保持于冰上以使酶保持穩(wěn)定并且終止活化過(guò)程。

(a)初始活性A0的測(cè)定

在新的微量滴定板(III)中通過(guò)將245μl含Gly-Pro-Arg的檢驗(yàn)緩沖液與5μl來(lái)自微量滴定板(II)的重組酶混合來(lái)測(cè)定活化酶的活性(A0)。追蹤410nm下的吸光度并且根據(jù)以下公式計(jì)算活性：

其中斜率是在30℃下在200秒期間來(lái)自胰蛋白酶活性的動(dòng)力學(xué)測(cè)量的線性回歸的斜率；df是稀釋因子，60是秒至分鐘的轉(zhuǎn)換，ε是等于8800M^-1cm^-1的延伸系數(shù)，l是等于0.7109cm的光程長(zhǎng)度，10³是mol/l至μmol/ml的轉(zhuǎn)換。

(b)溫度滅活

將100μl活化酶從微量滴定板(II)轉(zhuǎn)移至新的微量滴定板(IV)并且稀釋至200μl達(dá)到50％甘油，pH 7.6的最終濃度。在60℃下將板(IV)孵育3.5小時(shí)(WT-Tryp損失90％的初始活性)。依據(jù)(a)測(cè)定剩余的活性。

第3天：自體催化

將100μl活化酶從微量滴定板(II)轉(zhuǎn)移至含有100μl含0.1U/ml胰蛋白酶的25％甘油和檢驗(yàn)緩沖液(pH 7.6)的新的微量滴定板(V)。在25℃下將板孵育8小時(shí)(WT-Tryp損失90％的初始活性)。如(a)所描述測(cè)定活性(A_AX)。

結(jié)果

三十九種例示性絲氨酸蛋白酶多肽的活性、熱穩(wěn)定性以及自體催化在表3中報(bào)道(重組野生型鱈魚胰蛋白酶EZA-001和其三十八種突變體)。在突變體當(dāng)中活性存在相當(dāng)大的差異。數(shù)種突變體與僅具有5％剩余活性的野生型胰蛋白酶相比表現(xiàn)改善的溫度穩(wěn)定性，并且數(shù)種突變體與野生型胰蛋白酶相比顯示實(shí)質(zhì)上改善的自體催化穩(wěn)定性。

表3

39種例示性絲氨酸蛋白酶多肽的活性

實(shí)施例C：鱈魚胰蛋白酶I的重組突變形式的活性測(cè)量

材料與方法

重組多肽的表達(dá)

使用實(shí)施例A中所描述的方法產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于來(lái)自大西洋鱈魚的胰蛋白酶I的野生型氨基酸序列和其三十八種突變型式的多肽。

活化

通過(guò)在室溫下添加野生型胰蛋白酶(0.2U/ml)并且孵育24小時(shí)來(lái)達(dá)成重組酶(約0.01mg/ml)的活化。在20mM Tris-HCl，1mM CaCl₂，50％甘油，pH 8.0中制得混合物達(dá)到200μl的最終體積。

測(cè)定動(dòng)力學(xué)常數(shù)的活性檢驗(yàn)

在含有1％DMSO的檢驗(yàn)緩沖液中以濃度0.005-0.15mM使用底物(Gly-Pro-Arg)。將245μL底物溶液吸移至96孔板中。通過(guò)添加5μL樣品混合物(上述)開(kāi)始反應(yīng)并且在410nm下在SpectraMax板讀取器中監(jiān)測(cè)。在連續(xù)的15分鐘運(yùn)作的每分鐘進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量。

結(jié)果

結(jié)果示于下表4中。

表4

實(shí)施例D：在大腸桿菌中EZA-034表達(dá)的菌株選擇和搖瓶?jī)?yōu)化

菌株選擇

方法

使用表達(dá)為具有融合至N端的活化肽MEEDK(SEQ ID NO:5)的酶原多肽的例示性突變體胰蛋白酶EZA-034(參看表1；SEQ ID NO:4)進(jìn)行表達(dá)優(yōu)化。

編碼核酸包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列：

ATGGAAGAAG ATAAAATCGT TGGCGGCTAT GAATGCACGA AACACTCGCAGGCACACCAG 61GTCTCACTGA ACAGCGGTTA CCACTTTTGCGGCGGTAGTC TGGTTAGCAA AGATTGGGTT 121GTTAGTGCGGCCCATTGCTA TAAAAGCGTG CTGCGTGTTC GCCTGGGCGA ACATCACATT181CGTGTGAATG AAGGCACCGA ACAGTACATT AGCTCTAGTAGCGTTATCCG CCATCCGAAC 241TACTCTAGTT ACAACATCAACAACGATATC ATGCTGATCA AACTGACCAA ACCGGCGACG 301CTGAACCAGT ATGTGCACGC CGTTGCACTG CCGACCGAATGCGCAGCGGA TGCAACCATG 361TGTACCGTGA GCGGCTGGGGTAATACGATG AGCTCTGTTG CGGATGGCGA TAAACTGCAG 421TGCCTGTCTA TTCCGATTCT GAGTCATGCG GATTGTGCCA ACTCTTATCCGGGCATGATC 481ACGCAGAGCA TGTTTTGCGC CGGTTACCTGGAAGGCGGTA AAGATAGCTG CCAGGGTGAT 541TCTGGCGGTCCGGTGGTTTG TAACGGCGTT CTGCAGGGTG TGGTTAGCTG GGGCTACGGT601TGTGCAGAAC GTGATCACCC GGGTGTCTAT GCTAAAGTCTGTGTGCTGTC GGGCTGGGTC 661CGTGATACGA TGGCGAACTA TTAA

[SEQ ID NO:12]

在4ml LB培養(yǎng)基中使用四種大腸桿菌菌株BL21(DE3)、ArcticExpress(DE3)以及BL21Star(DE3)，在由1mM IPTG誘導(dǎo)下分別在37℃持續(xù)6小時(shí)、28℃持續(xù)8小時(shí)、22℃持續(xù)16小時(shí)或18℃持續(xù)16小時(shí)的四種條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果與結(jié)論

圖2示出了在BL21(DE3)和ArcticExpress(DE3)宿主細(xì)胞中EZA-034的表達(dá)的例示性SDS-PAGE分析。

下表5示出了總細(xì)胞裂解物中EZA-034的％，通過(guò)掃描對(duì)應(yīng)的SDS-PAGE定量。

表5

在用1mM IPTG誘導(dǎo)下在28℃下持續(xù)8小時(shí)的菌株ArcticExpress(DE3)展現(xiàn)EZA-034的最高單位表達(dá)(每個(gè)細(xì)胞的靶蛋白的表達(dá))。

表達(dá)優(yōu)化

方法

在50ml搖瓶中使用兩種菌株BL21(DE3)和ArcticExpress(DE3)進(jìn)行EZA-034的表達(dá)優(yōu)化。

研究三種培養(yǎng)基：TB、TB加上0.5％葡萄糖以及TB加上0.5％葡萄糖減去甘油，在由1mM IPTG誘導(dǎo)下在四種條件之一下(37℃持續(xù)6小時(shí)、28℃持續(xù)8小時(shí)、22℃持續(xù)16小時(shí)或18℃持續(xù)16小時(shí))。

結(jié)果與結(jié)論

圖3示出了EZA-034的表達(dá)的例示性SDS-PAGE分析。

下表6示出了總細(xì)胞裂解物中EZA-034的％。％通過(guò)掃描對(duì)應(yīng)的SDS-PAGE定量。

表6

下表7示出了所測(cè)試的條件的濕細(xì)胞重量。

表7

下表8示出了在所測(cè)試的條件中EZA-034的計(jì)算表達(dá)水平。

表8

發(fā)現(xiàn)在用1mM IPTG誘導(dǎo)下在22℃下16小時(shí)的菌株ArcticExpress(DE3)和在用1mM IPTG誘導(dǎo)下在18℃下16小時(shí)的BL21(DE3)展現(xiàn)EZA-034的最高表達(dá)。

最佳的兩種培養(yǎng)基是TB和TB加上0.5％葡萄糖。

實(shí)施例E：在5L規(guī)模上EZA-034的發(fā)酵優(yōu)化

培養(yǎng)基和菌株選擇

方法

使用兩種大腸桿菌菌株BL21(DE3)和ArcticExpress(DE3)，在三種不同培養(yǎng)基(TB+0.5％甘油、TB+0.5％葡萄糖以及TB，在由0.5mM IPTG誘導(dǎo)下在22℃下持續(xù)16小時(shí))中進(jìn)行5L發(fā)酵中EZA-034的表達(dá)優(yōu)化。

結(jié)果與結(jié)論

圖4示出了(A)EZA-034的表達(dá)的SDS-PAGE分析，(B)總細(xì)胞裂解物中EZA-034的％的圖示，其中％通過(guò)掃描對(duì)應(yīng)的SDS-PAGE定量，(C)所測(cè)試的條件的濕細(xì)胞重量的圖示，以及(D)在所測(cè)試的條件中EZA-034的計(jì)算表達(dá)水平的圖示。

在用0.5mM IPTG誘導(dǎo)下在22℃下持續(xù)16小時(shí)的菌株ArcticExpress(DE3)選擇用于補(bǔ)料培養(yǎng)物發(fā)酵以供EZA-034的表達(dá)。

在5L發(fā)酵中的補(bǔ)料培養(yǎng)物選擇

方法

使用大腸桿菌菌株ArcticExpress(DE3)，在由0.5mM IPTG誘導(dǎo)下在22℃下持續(xù)16小時(shí)，分別在TB補(bǔ)料甘油、TB補(bǔ)料葡萄糖或2xTB無(wú)補(bǔ)料中進(jìn)行5L發(fā)酵中EZA-034的表達(dá)優(yōu)化。種子培養(yǎng)物是3％。通過(guò)添加30％NH₄OH或添加補(bǔ)料培養(yǎng)物控制pH為約6.8。根據(jù)所溶解的氧氣水平控制空氣流量從3L/min至9L/min。

圖5示出了(A)EZA-034的表達(dá)的SDS-PAGE分析，(B)總細(xì)胞裂解物中EZA-034的％的圖示，其中％通過(guò)掃描對(duì)應(yīng)的SDS-PAGE定量，(C)所測(cè)試的條件的濕細(xì)胞重量的圖示，以及(D)在所測(cè)試的條件中EZA-034的計(jì)算表達(dá)水平的圖示。

甘油的補(bǔ)料培養(yǎng)物得到最高單位表達(dá)水平，并且當(dāng)在誘導(dǎo)下的OD相同時(shí)，甘油補(bǔ)料中EZA-034的最終表達(dá)水平高于葡萄糖補(bǔ)料的水平，約1.9g/L。

再現(xiàn)性測(cè)試顯示，在大腸桿菌ArcticExpress(DE3)中EZA-034的表達(dá)水平在9次再現(xiàn)之后保持恒定(數(shù)據(jù)未示出)。因此，其適合于大規(guī)模生產(chǎn)和長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

實(shí)施例F：EZA-034的純化、內(nèi)毒素去除以及再折疊

包涵體洗滌

通過(guò)在4℃下以8,000g離心20分鐘收集細(xì)胞，并且將濕團(tuán)塊稱重。使總共10g/管的濕團(tuán)塊再懸浮，并且通過(guò)在裂解緩沖液中在50％全功率下超聲處理3秒、在冰上6秒持續(xù)總共30分鐘而裂解。在4℃下使包涵體以13,000rpm旋轉(zhuǎn)減速30分鐘并且如下洗滌：

細(xì)胞裂解：TND緩沖液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，10mM DTT，PH 8.0)加上1％Triton

洗滌1：IB洗滌緩沖液(100mM Tris-HCl，300mM NaCl，10mM EDTA，1％Triton X-100，10mM DTT，pH 8.0)

洗滌2：IB洗滌緩沖液(100mM Tris-HCl，300mM NaCl，10mM EDTA，1％Triton X-100，10mM DTT，pH 8.0)

洗滌3：IB洗滌緩沖液(100mM Tris-HCl，300mM NaCl，10mM EDTA，1％Triton X-100，10mM DTT，pH 8.0)加上2M脲

洗滌4：IB洗滌緩沖液(100mM Tris-HCl，300mM NaCl，10mM EDTA，1％Triton X-100，10mM DTT，pH 8.0)加上2M脲

洗滌5：TND緩沖液加上4M脲

洗滌6：TND緩沖液加上4M脲

洗滌7：TND緩沖液加上4M脲

簡(jiǎn)單地說(shuō)，通過(guò)在4℃下與洗滌緩沖液一起攪拌使包涵體再懸浮，通過(guò)在50％全功率下超聲處理3秒、在冰上6秒持續(xù)總共10分鐘而均化，并且在4℃下以13,000rpm離心30分鐘。最后，將包涵體溶解于40ml的50mM Tris-HCl，8M脲，10mM DTT，pH 8.0中，并且在室溫下孵育30分鐘。在15℃下使樣品以44,000rpm旋轉(zhuǎn)30分鐘。并且，上清液用于進(jìn)一步純化。

用離子交換柱純化

進(jìn)行純化樹(shù)脂和樹(shù)脂體積的優(yōu)化。由1ml SP瓊脂糖快速流純化20ml溶解的蛋白質(zhì)(9mg/ml，如通過(guò)Bradford檢驗(yàn)測(cè)定)，并且由1ml Q瓊脂糖快速流純化流過(guò)物。SDS-PAGE用于分析純化過(guò)程。

分別地，由1ml Q瓊脂糖快速流純化5ml溶解的蛋白質(zhì)，并且由1ml SP瓊脂糖快速流純化5ml。SDS-PAGE用于分析純化過(guò)程。

離子交換Q瓊脂糖用于提高純度。靶蛋白結(jié)合至柱并且用20mM NaCl洗脫。Q瓊脂糖的結(jié)合能力為約20毫克EZA-034/毫升。

EZA-034的按比例放大的純化

使總共45g濕團(tuán)塊(來(lái)自一升表達(dá))裂解，并且洗滌包涵體并且使用優(yōu)化的條件溶解。用Q瓊脂糖快速流柱(體積約50ml)以3.5ml/min的流動(dòng)速率使用50mM Tris-HCl，8M脲，4mM DTT，pH 8.0(無(wú)熱原)作為運(yùn)作緩沖液來(lái)純化總共100ml溶解的蛋白質(zhì)(9.0mg/ml)，收集1.8ml部分。SDS-PAGE用于分析純化過(guò)程。

EZA-034的再折疊優(yōu)化

在20mM Tris-HCl，2mM DTT，1mM CaCl₂，10％甘油，pH 7.6中再折疊純化的EZA-034(10.0mg/ml，95％純度，儲(chǔ)存緩沖液是50mM Tris-HCl，8M脲，30mM NaCl，4mM DTT，pH 8.0)，EZA-034的濃度可以達(dá)到3mg/ml。

EZA-034的再折疊也可能在1x PBS，10％甘油，pH 7.4中進(jìn)行。

如通過(guò)LAL方法測(cè)定，再折疊之后EZA-034的內(nèi)毒素水平介于5與10EU/mg之間。再折疊之后EZA-034的產(chǎn)量為約500mg/L，如通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的純度高于95％。

實(shí)施例G：替代性活化肽的評(píng)估

在上述實(shí)施例中，將具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽表達(dá)為具有融合至N端的活化肽MEEDK(SEQ ID NO:5)的酶原多肽。

在這個(gè)研究中，測(cè)試四種不同的活化肽對(duì)大西洋鱈魚的野生型胰蛋白酶1(參看下文的SEQ ID NO:2)在BL21(DE3)細(xì)胞中的表達(dá)和再折疊的影響。

其中：

信號(hào)肽＝氨基酸1至13(加下劃線)

前肽＝氨基酸14至19(加粗斜體)

成熟的胰蛋白酶＝氨基酸20至241

測(cè)試表達(dá)和測(cè)試的四種變體活化肽如下：

(a)變體1

(b)變體2

(c)變體3

(d)變體4

在這個(gè)研究中也使用以下兩個(gè)活化序列作為對(duì)照：

(i)FAEDDK…[SEQ ID NO:18](“n胰蛋白酶(nTrypsin)”；即，在信號(hào)序列內(nèi)的SEQ ID NO:2)；以及

(ii)MRPLVFLVLLGAA FAEDDK…[SEQ ID NO:17](“ANCH”；來(lái)源于鳀魚前胰蛋白酶原的序列)

其中：

信號(hào)肽＝加下劃線

前肽＝加粗斜體

…＝以IVGG開(kāi)始的成熟的胰蛋白酶序列

使用SDS-PAGE評(píng)估表達(dá)和再折疊，對(duì)于每種活化肽一式兩份運(yùn)作(參看圖6)。

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