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一種新型Fndc5基因敲除小鼠模型的創(chuàng)建的制作方法

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一種新型Fndc5基因敲除小鼠模型的創(chuàng)建的制作方法與工藝

本發(fā)明涉及一種新型fndc5基因敲除小鼠模型的創(chuàng)建,并涉及其在制作糖尿病、肥胖等病理模型的用途,屬于病理模型的藥理用途領(lǐng)域。



背景技術(shù):

隨著飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變,系統(tǒng)能量穩(wěn)態(tài)失衡,糖尿病發(fā)生率逐年增加,已成為倍受關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。骨骼肌在調(diào)控系統(tǒng)能量穩(wěn)態(tài)上扮演著重要的角色。一方面骨骼肌自身發(fā)生物質(zhì)代謝如糖代謝等調(diào)控系統(tǒng)能量穩(wěn)態(tài);另一方面骨骼肌能分泌肌因子作用于脂肪、肝臟等器官調(diào)節(jié)系統(tǒng)能量穩(wěn)態(tài)。

研究發(fā)現(xiàn)fndc5在運(yùn)動(dòng)的刺激下作為pgc1-α依賴的產(chǎn)物,隨后裂解產(chǎn)生irisin進(jìn)入血液作用于白色脂肪,刺激ucp1表達(dá)提高產(chǎn)熱;促使白色脂肪棕色化,從而提高和改善了肥胖和糖尿病患者的代謝狀態(tài),為治愈肥胖和糖尿病提供了可能,表明fndc5可以作為藥效篩選的新的靶點(diǎn)。

本發(fā)明利用技術(shù)創(chuàng)建了fndc5敲除小鼠動(dòng)物模型,本發(fā)明解決了篩選出對(duì)該靶點(diǎn)發(fā)揮作用藥物的問(wèn)題。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明的主要目的是提供一種新的糖尿病并發(fā)癥-周圍神經(jīng)病變的大鼠模型。

本發(fā)明的主要目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:

本發(fā)明將fndc5-t1和fndc5-t3的talen質(zhì)粒對(duì),體外轉(zhuǎn)錄成mrna后,共顯微注射mrna到小鼠的受精卵中,一共注射120個(gè)受精卵,出生23只小鼠。兩周齡后,剪取4周齡出生小鼠任一只耳朵大約三分之一,提取基因組dna。以此基因組dna為模板進(jìn)行pcr反應(yīng),將產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)測(cè)序圖可分析小鼠的突變情況:如果測(cè)序峰全是單峰說(shuō)明該小鼠是wt(野生型);如果測(cè)序峰在預(yù)定位置出現(xiàn)雙峰且2種峰恰好對(duì)應(yīng)不同的突變類型則該小鼠為fndc5基因敲出首建鼠(founder)。根據(jù)發(fā)生移碼突變情況,選取雄性founder小鼠分別與野生型c57小鼠(♀)交配,出生的小鼠兩周齡后按上述方法進(jìn)行基因型鑒定。通過(guò)測(cè)序圖可分析f1代小鼠的突變情況:如果測(cè)序峰全是單峰說(shuō)明該小鼠是wt(野生型);如果測(cè)序圖出現(xiàn)雙峰則該小鼠為雜合子;如果測(cè)序圖也是單峰但是在預(yù)期位置出現(xiàn)缺失突變則該小鼠為純合基因敲除小鼠,建立穩(wěn)定遺傳f1代小鼠品系,從而可以應(yīng)用于相關(guān)藥物的藥效評(píng)價(jià)。

圖1是fndc5的基因組及蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)圖,注:a為fndc5蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu),b為fndc5基因組結(jié)構(gòu)(箭頭為talen的靶點(diǎn)位置);

圖2是fndc5talen的ssa活性檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖;

圖3是fndc5talen的ssa活性檢測(cè)報(bào)告圖;

圖4是fndc5基因敲除首建鼠的鑒定圖,注:突變型1的dna序列(向下箭頭所指峰形)和突變型2的dna序列(向上箭頭所指峰形)。

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明,本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)例僅是范例性的,并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是,在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下,可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改和替換,但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)驗(yàn)例

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型c57bl/6小鼠品系,購(gòu)自北京維通利華有限公司,合格證號(hào):scxk(京)2014-0001。飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所spf級(jí)動(dòng)物房,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證:syxk(京)2013-0023,動(dòng)物房溫度20~26℃,相對(duì)濕度40~70%。

1.1.2talen質(zhì)粒

talen質(zhì)粒pcs5-etalen-t由北京唯尚立德生物科技有限公司合成。靶位點(diǎn)位置t1:tttctagaagaaggatgtgcggatgctccggttcattcaggaggtgaaca,其中左邊tale識(shí)別序列:ttctagaagaaggatgt17bp,右邊tale識(shí)別序列:gttcacctcctgaatg16bp,間隔15bp。靶位點(diǎn)位置t3:tccggcacctcaaggccaactctgccgtggtcagctgggatgtcctggagga,其中左邊tale識(shí)別序列:ccggcacctcaaggcc16bp,右邊tale識(shí)別序列:cctccaggacatcccag17bp,間隔17bp。

1.1.3引物

對(duì)于靶點(diǎn)位置1,設(shè)計(jì)基因型檢測(cè)pcr引物:catgtttccttagctctactgtgg(正向),ggagaaagcatgcatggcagtctc(反向)pcr片段長(zhǎng)度為518bp;對(duì)于靶點(diǎn)位置3,設(shè)計(jì)基因型檢測(cè)pcr引物:ggacccttggtttggccagtcta(正向),ctctaccatcatcctccatgcctg(反向)pcr片段長(zhǎng)度為479bp。real-time引物:fndc5-f:atgaaggatggggaggaa,fndc5-r:gcggcagaagagagctataaca,18s-f:catgcagaacccacgacagta,18s-r:cctcacgcagcttgttgtcta。

1.1.4試劑

本實(shí)驗(yàn)的引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。amppcrmix(takara,ro74a)試劑盒、transzolupplusrnakit(tran,er501-01)、easyscriptfirst-strandcdnasynthesissupermxi(tran,ae301-03)、transstrttopgreenqpcrsupremix(tran,aq131-02)、base(堿液)、neutrlization(中和液)等。

1.2方法

1.2.1四品系fndc5基因敲除鼠的構(gòu)建

將fndc5-t1和fndc5-t3的talen質(zhì)粒對(duì),體外轉(zhuǎn)錄成mrna后,共顯微注射mrna到小鼠的受精卵中,一共注射120個(gè)受精卵,出生23只小鼠。兩周齡后,剪取4周齡出生小鼠任一只耳朵大約三分之一,放置在做好標(biāo)記的1.5ml的離心管中,加入75ul堿液(base)95℃以上40分鐘;然后加入75ul中和液(neutrlization),常溫靜置幾分鐘,溶液即為提取的基因組dna。以此基因組dna為模板進(jìn)行pcr反應(yīng),將產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)測(cè)序圖可分析小鼠的突變情況:如果測(cè)序峰全是單峰說(shuō)明該小鼠是wt(野生型);如果測(cè)序峰在預(yù)定位置出現(xiàn)雙峰且2種峰恰好對(duì)應(yīng)不同的突變類型則該小鼠為fndc5基因敲出首建鼠(founder)。共有15只小鼠帶有突變,其中3只移碼:7(t1一條缺失2bp,一條缺失4bp)、founder13(t1缺失2bp)、founder18(t1一條缺9bp,一條缺2bp;t3缺2bp)。根據(jù)發(fā)生移碼突變情況,選取雄性founder7(m-fn-7,♂)小鼠、founder13(m-fn-13,♂)小鼠、和founder18(m-fn-18,♂)小鼠分別與野生型c57小鼠(♀)交配,出生的小鼠兩周齡后按上述方法進(jìn)行基因型鑒定。通過(guò)測(cè)序圖可分析f1代小鼠的突變情況:如果測(cè)序峰全是單峰說(shuō)明該小鼠是wt(野生型);如果測(cè)序圖出現(xiàn)雙峰則該小鼠為雜合子;如果測(cè)序圖也是單峰但是在預(yù)期位置出現(xiàn)缺失突變則該小鼠為純合基因敲除小鼠。我們從中選出4中突變類型#7-t1-1(t1缺失2個(gè)堿基ct)、#7-t1-2(t1缺失4個(gè)堿基gctc)、#13-t1-1(t1缺失2個(gè)堿基tg)、#18-t1-1(t1缺失2個(gè)堿基tc)建立穩(wěn)定遺傳f1代小鼠品系。

2.結(jié)果

2.1四品系fndc5基因敲出小鼠的建立

2.1.1fndc5基因敲除talen靶點(diǎn)位置的設(shè)計(jì)

根據(jù)fndc5的基因組結(jié)構(gòu),fndc5proteindomain的分析,決定破壞thefniiidomain,因此talen的靶點(diǎn)位置將設(shè)計(jì)在外顯子3上或者外顯子3前,如箭頭所示結(jié)果見附圖1。

2.1.2fndc5talen的ssa活性檢測(cè)

根據(jù)ssa活性結(jié)果,我們選擇活性比較高的靶點(diǎn)fndc5-t1和fndc5-t3進(jìn)行后續(xù)的fndc5基因敲除小鼠的構(gòu)建結(jié)果見附圖2。

2.1.3fndc5基因敲除首建鼠的鑒定

將受精卵注射后出生23只小鼠,兩周齡后,按照上述的方法對(duì)出生的小鼠進(jìn)行基因型分析和鑒定。結(jié)果如圖3所示,我們選取founder7(t1一條缺失2bp,一條缺失4bp)進(jìn)行測(cè)序圖分析。測(cè)序峰形圖在突變位點(diǎn)開始出現(xiàn)雙峰,表明為雜合子。通過(guò)峰形分析,可以將突變型1的dna序列(黑色箭頭所指峰形)和突變型2的dna序列(紅色箭頭所指峰形)分析出來(lái)。結(jié)果為一條在ccggttcattcagga前缺失2個(gè)堿基ct;一條在cggttcattcagg前缺失4個(gè)堿基gctc,均發(fā)生移碼突變。

2.1.2f1四品系fndc5基因敲除鼠的鑒定

根據(jù)發(fā)生移碼突變情況,選取的founder7小鼠、founder13小鼠、和founder18小鼠分別與野生型c57小鼠交配,出生的小鼠兩周齡后按上述方法進(jìn)行基因型鑒定。通過(guò)測(cè)序圖可分析f1代小鼠的突變情況:如果測(cè)序峰全是單峰說(shuō)明該小鼠是wt(野生型);如果測(cè)序圖出現(xiàn)雙峰則該小鼠為雜合子;如果測(cè)序圖也是單峰但是在預(yù)期位置出現(xiàn)缺失突變則該小鼠為純合基因敲除小鼠,這個(gè)圖3中已經(jīng)進(jìn)行了類似分析。我們從中選出4種突變類型#7-t1-1(t1缺失2個(gè)堿基ct)、#7-t1-2(t1缺失4個(gè)堿基gctc)、#13-t1-1(t1缺失2個(gè)堿基tg)、#18-t1-1(t1缺失2個(gè)堿基tc)建立穩(wěn)定遺傳f1小鼠品系。四品系f1小鼠的突變位點(diǎn)及突變后導(dǎo)致提前產(chǎn)生終止密碼子的位置見表1。其中紅色標(biāo)記部分是talen設(shè)計(jì)敲除的靶位點(diǎn)序列,這些缺失突變都會(huì)導(dǎo)致提前產(chǎn)生終止密碼子。

表1四品系f1小鼠的突變情況

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