(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及兩種抗蟲基因和一種草甘膦抗性基因構(gòu)建的表達(dá)載體。

(二)

背景技術(shù)：

農(nóng)業(yè)害蟲是影響農(nóng)作物生產(chǎn)的第一大重要因素。目前，化學(xué)農(nóng)藥仍然是害蟲防治的主要角色，對于維持農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的穩(wěn)定發(fā)展發(fā)揮了重要作用。農(nóng)藥采用的是非特異毒殺方式，殺死靶標(biāo)害蟲的同時也對有益昆蟲和鳥類起到了毒殺作用。長時間的使用，對自然環(huán)境造成嚴(yán)重的污染，破壞了生態(tài)平衡；由于在食物鏈中的富集，對人畜安全直接構(gòu)成威脅。

雜草是影響農(nóng)作物生產(chǎn)的第二大重要因素。它與農(nóng)作物競爭水資源、肥料、光源等，造成農(nóng)作物的產(chǎn)量降低，同時還會降低農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)。傳統(tǒng)的手工除草方法費(fèi)時費(fèi)力并且效率很低，機(jī)械除草費(fèi)用較高，而化學(xué)藥劑除草對技術(shù)要求較高并且極易對植物造成藥害，影響作物本身的生長發(fā)育，同時化學(xué)藥劑還可能會影響到鄰近敏感的農(nóng)作物。

自1996年轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植以來，轉(zhuǎn)基因抗蟲、抗除草劑或同時具有抗蟲和抗除草劑的復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因作物得到空前地發(fā)展。許多國家批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因大豆的種植或者進(jìn)口。轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米主要對鱗翅目害蟲玉米螟和棉鈴蟲有比較高的抗蟲能力，對其他玉米害蟲，包括小地老虎等也有一定的抗性。隨著轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的廣泛種植，農(nóng)業(yè)害蟲對轉(zhuǎn)基因抗蟲作物逐漸產(chǎn)生了抗性，降低了轉(zhuǎn)基因作物的抗蟲能力和使用壽命。為了提高轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的抗蟲能力和延緩害蟲抗性的產(chǎn)生，轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的研發(fā)方向是同時使用2個抗蟲基因，例如crylab和crylf同時使用。

crylab是一種殺蟲能力比較強(qiáng)的bt晶體殺蟲蛋白質(zhì)，對玉米螟的殺蟲活性尤為高；cry2ab是另一種殺蟲性比較高的殺蟲晶體蛋白。單個抗蟲蛋白往往殺蟲譜比較窄，轉(zhuǎn)基因抗蟲作物長時間使用一種殺蟲蛋白還可能引起害蟲抗性的產(chǎn)生。相比單個基因，多基因的聚合使用在轉(zhuǎn)基因作物中具有以下幾個方面的優(yōu)勢：殺蟲效果更好，經(jīng)濟(jì)實(shí)用；殺蟲譜更廣，多個抗蟲基因之間殺蟲譜可以互相彌補(bǔ)，不同的基因?qū)νN害蟲的殺蟲效果也存在差異，可以相互補(bǔ)充；可以有效延緩抗性品種的使用壽命，理論上農(nóng)業(yè)害蟲同時對兩種不同的bt基因同時產(chǎn)生抗性的可能性要低于單個bt基因，因而多個抗蟲基因同時使用能夠有效地延緩害蟲抗性的產(chǎn)生。因此，讓轉(zhuǎn)基因抗蟲作物同時表達(dá)兩種無交互抗性的bt殺蟲蛋白對治理昆蟲抗性的發(fā)生是一種經(jīng)濟(jì)而有效的措施。

目前已有很多相關(guān)的專利和文獻(xiàn)報道了利用抗蟲或抗除草劑基因構(gòu)建的表達(dá)載體，例如：劉桂珍等在2007年利用莧菜凝集素基因(ara)與cry1ac基因構(gòu)建到同一植物表達(dá)載體中，將該載體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，獲得了抗同翅目和鱗翅目害蟲的轉(zhuǎn)基因植物(劉桂珍，周長生，陳凌娜，陳正華的雙價抗蟲基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建及其轉(zhuǎn)基因植物獲得方法；中國200710106077.7[p].2008-4-16)；bohorova等將融合基因cry1bcry1ab轉(zhuǎn)入玉米中來防治多種農(nóng)業(yè)害蟲(bohorovan,frutosr,royerm,p,pachecom,rasconq,mcleans,hoisingtond.(2011)thoerapplgenet.103,817-826；沈志成等在2011年將抗除草劑基因p450構(gòu)建到植物表達(dá)載體中，將該載體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，獲得了抗煙嘧磺隆等除草劑的轉(zhuǎn)基因植物(沈志成，林朝陽，徐曉麗，李新蘭的抗除草劑基因及其在轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中的應(yīng)用；中國201110237649.1[p].2011-8-18)。對現(xiàn)有的文章和專利分析發(fā)現(xiàn)，還沒有將cry1ab、cry2ab和g10evo基因構(gòu)建在同一個植物轉(zhuǎn)化載體中的報道。本發(fā)明首次公開了一種基于cry1ab、cry2ab和g10evo構(gòu)建的植物轉(zhuǎn)化載體，用該載體轉(zhuǎn)化所得的轉(zhuǎn)基因玉米能夠高抗棉鈴蟲、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等水稻、玉米和棉花的主要鱗翅目害蟲，不但拓寬了轉(zhuǎn)基因玉米的殺蟲譜，而且有效地延緩了害蟲抗性的產(chǎn)生；同時g10evo基因在植物中表達(dá)使植物對草甘膦產(chǎn)生抗性，從而可以利用草甘膦選擇性地防除雜草。該玉米即將進(jìn)入生產(chǎn)性試驗(yàn)的安全評價階段，有望在今后進(jìn)入商業(yè)化種植。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種同時表達(dá)cry1ab、cry2ab和g10evo的表達(dá)載體，以及在抗蟲農(nóng)作物中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種抗蟲耐草甘膦表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有抗蟲基因cry1ab、抗蟲基因cry2ab和草甘膦抗性基因g10evo。

進(jìn)一步，所述抗蟲基因cry1ab核苷酸序列為seqidno：1所示；所述抗蟲基因cry2ab核苷酸序列為seqidno：2所示；所述草甘膦抗性基因g10evo的核苷酸序列為seqidno：3所示。

本發(fā)明所述的表達(dá)載體是將兩個同源性非常低的抗蟲蛋白編碼基因cry1ab、cry2ab和草甘膦抗性基因g10evo構(gòu)建到同一個植物表達(dá)載體中，使相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因作物具有較寬的殺蟲譜，同時延緩昆蟲對殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性。該載體可以將以上三個基因同時轉(zhuǎn)入受體植物，使植物具有抗棉鈴蟲、甜菜夜蛾、玉米螟等主要鱗翅目害蟲和抗草甘膦除草劑的特性。鑒于目前已商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物廣泛應(yīng)用的bt基因?qū)ハx具有一定的毒殺作用，但是長時間使用一種殺蟲蛋白會使害蟲對現(xiàn)有的轉(zhuǎn)bt基因農(nóng)作物產(chǎn)生抗性。本發(fā)明中所使用的基因?qū)θ祟惡透叩葎游锸前踩?，無任何毒副作用。

進(jìn)一步，所述表達(dá)載體包含啟動抗蟲基因cry1ab表達(dá)的玉米泛素啟動子(zmubipromoter)pzmubi，終止該基因表達(dá)的玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepc)終止子pepct；啟動抗蟲基因cry2ab表達(dá)的水稻actin啟動子pactin，終止該基因表達(dá)的camv35s終止子t35s；啟動草甘膦抗性基因g10evo表達(dá)的camv35s啟動子(包含水稻actin的內(nèi)含子)p35s-actinintron，終止該基因表達(dá)的camv35s終止子t35s。

本發(fā)明所述的表達(dá)載體是以pcambia1300(cambia,canberra,australia)載體為骨架而構(gòu)建的，具體為：草甘膦抗性基因g10evo，包含玉米乙酰羥酸合成酶葉綠體信號肽的核苷酸序列(seqidno：3，5’端被設(shè)計上bamhi酶切位點(diǎn)，3’端被設(shè)計上xhoⅰ位點(diǎn)，bamhi-xhoⅰ片段)與camv35s終止子(seqidno：4，5’端被設(shè)計上xhoⅰ位點(diǎn)，3’端被設(shè)計上hindiii位點(diǎn)，xhoⅰ-hindiii酶切片段)連接，獲得包括基因和終止子的bamhi-hindiii片段。camv的35s啟動子(包含水稻actin的內(nèi)含子)p35s-actinintron，以實(shí)驗(yàn)室保存的pmd19-35sints質(zhì)粒為模板，使用引物35s-kpnif(5′ggtaccatggtggagcacgacactctc3′，添加了kpni位點(diǎn))和引物35s-bamhir(5′ggtacccccttgcggggatcggtgg3′，添加了kpni位點(diǎn))擴(kuò)增獲得p35s-actinintron啟動子(seqidno：6)。p35s-actinintron啟動子經(jīng)kpni和bamhi酶切后與基因-終止子片段(bamhi-hindiii)共同連接到經(jīng)kpni和hindiii酶切的pcambia1300載體中，獲得t-dna載體pcam-p35s-actinintron-g10evo-t35s。

編碼殺蟲蛋白質(zhì)的基因cry2ab(seqidno：2，5’端被設(shè)計上bamhi酶切位點(diǎn)，3’端被設(shè)計上xhoⅰ位點(diǎn)，bamhi-xhoⅰ片段)與camv35s終止子(seqidno：4，5’端被設(shè)計上xhoⅰ位點(diǎn)，3’端被設(shè)計上kpni位點(diǎn)，xhoⅰ-kpni酶切片段)連接，獲得包括基因和終止子的bamhi-kpni片段。水稻actin啟動子(pactin)經(jīng)過hindiii和bamhi酶切后與基因和終止子片段(bamhi-kpni片段)共連接到經(jīng)kpni酶切的pcam-p35s-actinintron-g10evo-t35s中，獲得t-dna載體pcam-pactin-cry2ab-t35s-p35s-actinintron-g10evo-t35s。

編碼殺蟲蛋白的基因cry1ab(seqidno：1，5’端被設(shè)計上bamhi酶切位點(diǎn)，3’端被設(shè)計上saci位點(diǎn)，bamhi-saci片段)與玉米的pepc終止子(seqidno：5，5’端被設(shè)計上saci位點(diǎn)，3’端被設(shè)計上kpni位點(diǎn)，saci-kpni酶切片段)連接，獲得包括基因和終止子的bamhi-kpni片段。玉米u(yù)biquitin-1啟動子pzmubi從玉米的基因組中通過pcr獲得，使用的引物分別是：zmubif(5’ggtaccatgcctacagtgcagcgtgacccggtcgtgc，添加了kpni位點(diǎn))。zmubir(5’gtgggatcctctagagtcgacctgcagaagtaacaccaaacaacag，添加了bamhi位點(diǎn))。玉米u(yù)biquitin-1啟動子pzmubi經(jīng)過kpni和bamhi酶切后和基因-終止子片段(bamhi-kpni片段)共同連接到經(jīng)過kpni酶切的pcam-pactin-cry2ab-t35s-p35s-actinintron-g10evo-t35s載體中，獲得t-dna載體pcam-pzmubi-1-cry1ab-pepct-pactin-cry2ab-t35s-p35s-actinintron-g10evo-t35s，如圖1。該表達(dá)載體包含三個表達(dá)框，即兩個抗蟲基因cry1ab、cry2ab表達(dá)框，賦予轉(zhuǎn)基因植物抗蟲特性；草甘膦抗性基因g10evo表達(dá)框賦予轉(zhuǎn)基因植物抗除草劑草甘膦的特性。

將獲得的t-dna載體(

pcam-pzmubi-1-cry1ab-pepct-pactin-cry2ab-t35s-p35s-actinintron-g10evo-t35s)電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌lba4404，獲得含有植物轉(zhuǎn)化載體的若干菌株，用于轉(zhuǎn)基因作物侵染。

本發(fā)明還提供了一種由所述抗蟲耐草甘膦表達(dá)載體構(gòu)建的質(zhì)粒。

本發(fā)明提供了一種包含所述抗蟲耐草甘膦表達(dá)載體的植物細(xì)胞，在植物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)中將草甘膦抗性基因g10evo作為篩選標(biāo)記。

本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體適于雙子葉植物的表達(dá)或者單子葉植物的表達(dá)，雙子葉植物包括：大豆、油菜等；單子葉植物包括：玉米、水稻等。

本發(fā)明提供一種抗蟲耐草甘膦表達(dá)載體在制備抗蟲耐草甘膦植物細(xì)胞中的應(yīng)用，所述植物為水稻、玉米或棉花等農(nóng)作物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明載體同時表達(dá)cry1ab、cry2ab和g10evo蛋白，用該載體轉(zhuǎn)化農(nóng)作物獲得的轉(zhuǎn)基因作物能夠同時抗棉鈴蟲、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等水稻、玉米和棉花的主要鱗翅目害蟲，不但拓寬了殺蟲譜，而且還有效地延緩了害蟲抗性的發(fā)生，同時使轉(zhuǎn)基因作物具有抗草甘膦的能力，這種復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物符合目前轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)方向，更能滿足大規(guī)模農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求。

(四)附圖說明

圖1：實(shí)施例1中基于cry1ab、cry2ab和g10evo構(gòu)建的表達(dá)載體圖譜。

圖2：轉(zhuǎn)基因植物葉片離體抗蟲性測定。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明的步驟、方法或者條件進(jìn)行修改或者替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1、抗蟲蛋白編碼基因cry1ab、cry2ab和草甘膦抗性基因g10evo的表達(dá)載體構(gòu)建

植物轉(zhuǎn)化載體是基于pcambia1300(cambia,canberra,australia)載體而構(gòu)建的。草甘膦抗性基因g10evo，包含玉米乙酰羥酸合成酶葉綠體信號肽的核苷酸序列(seqidno：3，5’端被設(shè)計上bamhi酶切位點(diǎn)，3’端被設(shè)計上xhoⅰ位點(diǎn)，bamhi-xhoⅰ片段)與camv35s終止子(seqidno：4，5’端被設(shè)計上xhoⅰ位點(diǎn)，3’端被設(shè)計上hindiii位點(diǎn)，xhoⅰ-hindiii酶切片段)連接，獲得包括基因(含信號肽)和終止子的bamhi-hindiii片段。

camv的35s啟動子(包含水稻actin的內(nèi)含子)p35s-actinintron，以實(shí)驗(yàn)室保存的pmd19-35sints質(zhì)粒為模板，使用引物35s-kpnif(5′ggtaccatggtggagcacgacactctc3′，添加了kpni位點(diǎn))和引物35s-bamhir(5′ggtacccccttgcggggatcggtgg3′，添加了kpni位點(diǎn))擴(kuò)增獲得(seqidno：6)。p35s-actinintron啟動子經(jīng)kpni和bamhi酶切后與基因-終止子片段(bamhi-hindiii)共同連接到經(jīng)kpni和hindiii酶切的pcambia1300載體中，獲得t-dna載體pcam-p35s-actinintron-g10evo-t35s。

編碼殺蟲蛋白質(zhì)的核苷酸序列cry2ab(seqidno：2，5’端被設(shè)計上bamhi酶切位點(diǎn)，3’端被設(shè)計上xhoⅰ位點(diǎn)，bamhi-xhoⅰ片段)與camv35s終止子(seqidno：4，5’端被設(shè)計上xhoⅰ位點(diǎn)，3’端被設(shè)計上kpni位點(diǎn)，xhoⅰ-kpni酶切片段)連接，獲得包括基因和終止子的bamhi-kpni片段。

水稻actin啟動子(pactin)經(jīng)過hindiii和bamhi酶切后與基因和終止子片段(bamhi-kpni片段)共連接到經(jīng)kpni酶切的pcam-p35s-actinintron-g10evo-t35s中，獲得t-dna載體pcam-pactin-cry2ab-t35s-p35s-actinintron-g10evo-t35s。

編碼殺蟲蛋白質(zhì)的核苷酸序列cry1ab(seqidno：1，5’端被設(shè)計上bamhi酶切位點(diǎn)，3’端被設(shè)計上saci位點(diǎn)，bamhi-saci片段)與玉米的pepc終止子(seqidno：5，5’端被設(shè)計上saci位點(diǎn)，3’端被設(shè)計上kpni位點(diǎn)，saci-kpni酶切片段)連接，獲得包括基因和終止子的bamhi-kpni片段。玉米u(yù)biquitin-1啟動子pzmubi從玉米的基因組中通過pcr獲得，使用的引物分別是：

zmubif(5’ggtaccatgcctacagtgcagcgtgacccggtcgtgc，添加了kpni位點(diǎn))。

zmubir(5’gtgggatcctctagagtcgacctgcagaagtaacaccaaacaacag，添加了bamhi位點(diǎn))。

玉米u(yù)biquitin-1啟動子pzmubi經(jīng)過kpni和bamhi酶切后和基因-終止子片段(bamhi-kpni片段)共同連接到經(jīng)過kpni酶切的pcam-pactin-cry2ab-t35s-p35s-actinintron-g10evo-t35s載體中，獲得t-dna載體pcam-pzmubi-1-cry1ab-pepct-pactin-cry2ab-t35s-p35s-actinintron-g10evo-t35s，如圖1。

將獲得的pcam-pzmubi-1-cry1ab-pepct-pactin-cry2ab-t35s

-p35s-actinintron-g10evo-t35s載體電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌lba4404，獲得含有植物轉(zhuǎn)化載體的若干菌株，用于轉(zhuǎn)基因作物侵染。

實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米的獲得

玉米轉(zhuǎn)化事件所用的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，根據(jù)frame等報道的方法和培養(yǎng)基配方(plantphysiol,2002,129:13-22)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，具體步驟如下：取授粉后8～10天的hi-2玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小為1.0～1.5mm)，將含有t-dna載體pcam-pzmubi-1-cry1ab-pepct-pactin-cry2ab-t35s-p35s-intron-

g10evo-t35s的農(nóng)桿菌與未成熟胚共培育2～3天(22℃)。轉(zhuǎn)移未成熟胚到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(含200mg/l的timentin殺農(nóng)桿菌)，28℃暗培養(yǎng)10～14天。將所有的愈傷組織轉(zhuǎn)移到帶有50ng/ml潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)2～3周。

轉(zhuǎn)移所有的組織到含2-4mm草甘膦的篩選培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)2～3周。隨后轉(zhuǎn)移所有篩選后成活的胚性組織到再生培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)10～14天，每皿一個株系。轉(zhuǎn)移胚性組織到新鮮的再生培養(yǎng)基上，26℃光照培養(yǎng)10～14天。轉(zhuǎn)移所有發(fā)育完全的植株到生根培養(yǎng)基上，26℃光照培養(yǎng)直到根發(fā)育完全。移植到溫室，獲得種子，用于后續(xù)研究和應(yīng)用。

實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻的獲得

轉(zhuǎn)基因植物的獲得方法是根據(jù)文獻(xiàn)中的方法和培養(yǎng)基配方(盧雄斌龔祖塤，1998生命科學(xué)10：125-131；劉凡等，2003分子植物育種1：108-115)。選取成熟飽滿種子去殼，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織作為轉(zhuǎn)化材料。取含t-dna載體pcam-pzmubi-1-cry1ab-pepct-pactin-cry2ab-t35s-p35s-intron-g10evo-t35s的農(nóng)桿菌劃板，挑單菌落接種，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌。將待轉(zhuǎn)化的愈傷組織放入適當(dāng)濃度的農(nóng)桿菌液中(含乙酰丁香酮)，讓農(nóng)桿菌結(jié)合到愈傷組織表面，然后把愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)2-3天。用無菌水沖洗轉(zhuǎn)化后的愈傷，轉(zhuǎn)移到含抗生素的篩選培養(yǎng)基上，篩選培養(yǎng)(50ng/ml潮霉素)兩個月(中間繼代一次)。把篩選后，生長活力良好的愈傷轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)20天左右，然后將預(yù)分化好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基，14小時光照分化發(fā)芽。2-3周后，把抗性再生植株轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上壯苗生根，最后將再生植株洗去瓊脂移植于溫室，獲得含有cry1ab、cry2ab和g10evo基因的植株。

實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因玉米抗蟲能力的測定

試驗(yàn)玉米品系：本試驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因玉米是導(dǎo)入cry1ab、cry2ab和g10evo基因的抗蟲耐草甘膦轉(zhuǎn)基因品系gab。對照為非轉(zhuǎn)基因親本材料瑞豐-1。

實(shí)驗(yàn)室抗蟲能力測定：不同代次的轉(zhuǎn)基因玉米和對照常規(guī)玉米在溫室中發(fā)芽后20天噴灑草甘膦確定是轉(zhuǎn)基因后，各取10株，每株接1齡玉米螟10個，6天后觀察死亡率。亞洲玉米螟來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所玉米害蟲組。將卵塊至于28±1℃，rh70±5％，16h:8h(l:d)條件下孵化，選取孵化12小時內(nèi)的幼蟲供生測實(shí)驗(yàn)用。棉鈴蟲來自是河南科云生物農(nóng)藥(河南濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司)，為實(shí)驗(yàn)室人工飼料培育。

大田抗蟲試驗(yàn)條件和方法：在玉米植株生長至心葉中期(6-8葉完全展開)、抽雄前期和抽絲散粉期分別進(jìn)行人工接亞洲玉米螟初孵幼蟲。將黑頭卵塊(約40-60頭幼蟲)放置在1.5ml離心管中，待幼蟲孵化后投放在心葉叢中。每處理接蟲10株。心葉中期接蟲后10d，20d調(diào)查食葉級別。

抗蟲分級：采用9級標(biāo)準(zhǔn)(marconetal.,1999)：1～3級：蟲孔針刺狀(1級：稀少、分散；2級：中等數(shù)量；3級：大量)。4～6級：蟲孔火柴頭大小(4級：稀少、分散；5級：中等數(shù)量；6級：大量)。7～9級：蟲孔大于火柴頭(7級：稀少分散；8級：中等數(shù)量；9級：大量)?？剐约墑e分類：1～2級(高抗)，3～4級(抗蟲)，5～6級(感蟲)，7～9級(高感)。

試驗(yàn)玉米的種植和管理：在全部種植過程中沒有使用殺蟲農(nóng)藥?；适褂茫翰シN前復(fù)合肥料每畝15公斤，6-7葉期(播種后大約40天)再加復(fù)合肥料每畝20公斤。轉(zhuǎn)基因玉米的雜草防治通過噴施草甘膦實(shí)施，而常規(guī)玉米在草甘膦噴灑后10天進(jìn)行人工除草。

抗蟲測定結(jié)果：

在玉米植株生長至心葉中期(6-8葉完全展開)、抽雄前期和抽絲散粉期分別進(jìn)行人工接亞洲玉米螟初孵幼蟲?？瓜x水平測定結(jié)果如表1。

表1轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米抗玉米螟等級鑒定

*玉米螟的死亡率。

抗棉鈴蟲能力：在玉米植株生長至心葉中期(6-8葉完全展開)、抽雄前期和抽絲散粉期分別進(jìn)行人工接棉鈴蟲。觀察玉米的抗棉鈴蟲能力。試驗(yàn)結(jié)果如下表所示：

表2轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米抗棉鈴蟲等級鑒定

*棉鈴蟲的死亡率

人工接蟲的轉(zhuǎn)基因植株上沒有發(fā)現(xiàn)成活進(jìn)入3齡以上的棉鈴蟲，也沒有植株被危害的癥狀。而對照玉米上每株都有進(jìn)入3齡或者更加后期的棉鈴蟲，并且葉片或者花絲有明顯的被取食的危害狀。

在沒有人工接蟲也沒有使用農(nóng)藥條件下，我們調(diào)查了“gab-3”和“gab-8”轉(zhuǎn)基因玉米各200株，轉(zhuǎn)基因植株沒有發(fā)現(xiàn)明顯的棉鈴蟲危害，但是對照玉米發(fā)現(xiàn)32％的植株有棉鈴蟲危害。其中11％對照玉米在幼苗期被棉鈴蟲嚴(yán)重危害而死亡。

此外，我們還進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因植物葉片離體抗蟲性測定。在出苗2-3個星期的第3代和第5代的轉(zhuǎn)基因玉米上采取玉米葉片，每個葉片人工接蟲10玉米螟或者齡棉鈴蟲在培養(yǎng)箱中保溫培養(yǎng)。結(jié)果表明，gab-3、gab-7、gab-8、gab-28和gab-65的抗蟲都為100％。玉米螟和棉鈴蟲在這些轉(zhuǎn)化體的葉片上沒有明顯取食，死亡率為100％，如圖2。

實(shí)施例5、轉(zhuǎn)基因玉米抗草甘膦能力的測定

試驗(yàn)玉米品系：本試驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因玉米是導(dǎo)入cry1ab、cry2ab和g10evo基因的抗蟲耐草甘膦轉(zhuǎn)基因品系gab。對照為非轉(zhuǎn)基因親本材料瑞豐-1。

大田抗草甘膦性能測定：轉(zhuǎn)基因玉米和常規(guī)玉米種子在發(fā)芽后20-30天，4-5葉時期，分別噴施體積比1：100和1：200稀釋的41％草甘膦異丙胺鹽(孟山都公司)，劑量為40l/畝，7天后記錄玉米生長發(fā)育情況和死亡率。

通過在4-6葉期間大田噴施草甘膦，測定了不同代次的轉(zhuǎn)基因玉米的抗草甘膦能力。結(jié)果見表3。

表3轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米耐草甘膦能力試驗(yàn)*

*:每畝噴施40l的1：100或者1：200稀釋的農(nóng)達(dá)(41％草甘膦，孟山都產(chǎn)品)。

結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因玉米的抗草甘膦水平在不同的轉(zhuǎn)化體相差比較大。gab-7和gab-65的抗性水平比較高，其在每畝噴施40l的1：100稀釋的農(nóng)達(dá)(41％草甘膦異丙胺鹽，孟山都)的條件下沒有對轉(zhuǎn)基因玉米有可以看到的不利影響。

還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干實(shí)施例。本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多延伸和拓展。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接到導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有延伸，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>浙江大學(xué)

<120>一種抗蟲耐草甘膦表達(dá)載體、質(zhì)粒及其應(yīng)用

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