本發(fā)明屬于食品加工領(lǐng)域，涉及從番茄加工工業(yè)粗產(chǎn)品中一次性高純度分離六氫番茄紅素和八氫番茄紅素的方法。

背景技術(shù)：

番茄紅素是一種類胡蘿卜素，具有明亮的紅色。天然存在的番茄紅素及其前體物質(zhì)以全反式結(jié)構(gòu)為主，經(jīng)加熱或者其它處理手段后全反式結(jié)構(gòu)會發(fā)生順反異構(gòu)變化。番茄紅素的分子式為C₄₀H₅₆(式a)，其為由11個(gè)共軛雙鍵和2個(gè)非共軛雙鍵構(gòu)成的直鏈型多不飽和烯烴。研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素具有抗氧化活性、抗衰老活性、吸收可見光及紫外線從而減少日光性損傷的活性。不論是作為有益健康的保健品還是作為色素，均受到人們廣泛的關(guān)注。

六氫番茄紅素和八氫番茄紅素是類胡蘿卜素和番茄紅素天然合成途徑的中間產(chǎn)物，分子式分別為C₄₀H₆₂和C₄₀H₆₄(式b和式c)。六氫番茄紅素具有彼此共軛的五個(gè)雙鍵，而八氫番茄紅素具有彼此共軛的三個(gè)雙鍵。雖然早在上世紀(jì)五十年代就有科研人員注意到這兩種番茄紅素前體的存在，但是對這兩種無色物質(zhì)類胡蘿卜素的研究相對較少。

式a：全反式番茄紅素

式b：全反式六氫番茄紅素

式c：全反式八氫番茄紅素

近年來，科研人員逐漸開始關(guān)注六氫番茄紅素和八氫番茄紅素，發(fā)現(xiàn)它們作為類胡蘿卜素的前體也具有重要的作用。Britton等人通過對各種食品進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，六氫番茄紅素和八氫番茄紅素在杏、胡蘿卜、番茄及其制品、西瓜等水果中均有較高含量(G.Britton,F.Khachik,Carotenoids in food，G.Britton，S.Liaaen-Jensen，H.Pfander(著)，Carotenoids第5卷：Nutrition and Health，Birkhauser.Basel，Boston，Berlin，2009：45-66)。特別是在番茄醬中，八氫番茄紅素的含量高達(dá)4.94mg/L，而六氫番茄紅素達(dá)2.85mg/L。2014年A.Martinez等人進(jìn)行了番茄紅素、六氫番茄紅素及八氫番茄紅素的ABTS自由基陽離子脫色試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)六氫番茄紅素和八氫番茄紅素的存在可以使所測組合物擁有更好的ABTS陽離子捕捉能力(A.Martinez，C.M.Stinco，A.J.Melendez-Martinez，J.Phys.Chem.，2014(118)：9819-9825)。Basu等人研究發(fā)現(xiàn)，番茄產(chǎn)品對人的健康有益，其中的番茄紅素和存在于番茄中的其它物質(zhì)(如六氫番茄紅素和八氫番茄紅素)具備協(xié)同效應(yīng)(A.Basu，V.Imrhan，Eur.J.Clin.Nutr.，2007(61)：295-303)。Mathews-Roth的研究發(fā)現(xiàn)，在UV-B引發(fā)的腫瘤試驗(yàn)中，八氫番茄紅素可以使得所測試小鼠的皮膚癌腫瘤的出現(xiàn)推遲并減少腫瘤數(shù)量(M.M.Mathews-Roth，Oncology，1982(39)：33-37)。發(fā)明專利申請WO03/041678也提到六氫番茄紅素可保護(hù)皮膚免受氧或者UV輻射引起的損害。此外，發(fā)明專利申請CN1533269A建議將包含番茄紅素(3-15％)、八氫番茄紅素(0.3-1％)、六氫番茄紅素(0.3-1％)的類胡蘿卜素混合物與其它常規(guī)抗高血壓藥聯(lián)合進(jìn)行給藥。發(fā)明專利CN100391433C報(bào)導(dǎo)了采用含有天然來源的番茄紅素、八氫番茄紅素、六氫番茄紅素及其它類胡蘿卜素和V_E的組合物制備用于防護(hù)皮膚免遭由日光中紫外線輻射引起的損傷。該文獻(xiàn)提到天然番茄紅素組合物在防護(hù)皮膚免遭紫外線損傷時(shí)比合成的番茄紅素更為有效，且在天然番茄紅素組合物中加入八氫番茄紅素和/或六氫番茄紅素能有效提高該組合物防護(hù)皮膚免遭紫外線損傷的效果。由此可以看出，針對動物體和人體的多種研究均表明，六氫番茄紅素和八氫番茄紅素這兩種無色類胡蘿卜素能夠單獨(dú)或者與其它功能組分協(xié)同，參與生物代謝過程并提供有益功能。

本領(lǐng)域公開了多種制備六氫番茄紅素和/或八氫番茄紅素的方法。然而，由于六氫番茄紅素和八氫番茄紅素在天然產(chǎn)物中的含量很低，而且性質(zhì)又不穩(wěn)定，對堿、光及氧等都非常敏感，因此無論是分離耗時(shí)過長或者步驟過多，均會導(dǎo)致產(chǎn)物損耗，收率低下。例如，發(fā)明專利申請CN101035748A介紹了采用化學(xué)合成方法制備全反式六氫番茄紅素的方法，此方法需要使用鏻鹽，且反應(yīng)需要在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中進(jìn)行，產(chǎn)物為順反異構(gòu)體的混合物。該反應(yīng)流程長、工藝步驟多、對環(huán)境不友好。

另一方面，上世紀(jì)80年代由美國國立衛(wèi)生院的Yoichiro Ito博士提出的高速逆流色譜(High-Speed CounterCurrent Chromatography，HSCCC)已被應(yīng)用于多種天然產(chǎn)物的分離純化過程。高速逆流色譜基于液液分配的基本原理，不采用任何固態(tài)的支撐物(如柱填料、吸附劑、親和劑、板床、篩膜等)，其固定相和流動相都是液體，沒有不可逆吸附。該方法具有無樣品的損失和污染、高效、快速和大制備量分離等優(yōu)點(diǎn)。特別地，對于天然產(chǎn)物復(fù)雜混合物中特定成分的高純度分離純化，高速逆流色譜技術(shù)具有以下優(yōu)勢：

(1)分離效率高：分配分離在旋轉(zhuǎn)運(yùn)動中進(jìn)行，兩相溶劑都被劇烈振動的離心力場甩成微小的顆粒，待分離的樣品各組分會在兩相微粒的極大表面上分配，并能在這些顆粒震蕩與對流的環(huán)境中有效傳遞，實(shí)現(xiàn)上萬次高效連續(xù)的溶劑萃取過程，達(dá)到充分分離與純化。這樣的一步分離就能夠?qū)?fù)雜體系中的特定成分分離到98％以上。

(2)使用成本低：分離過程不是吸附與淋洗，而是對流穿透的過程，因此不使用填料，與使用填料的制備柱色譜相比可以節(jié)省昂貴的填料費(fèi)用。并且，在大規(guī)模生產(chǎn)中可實(shí)現(xiàn)溶劑的回收再利用，運(yùn)行使用的后續(xù)投入很低。

(3)制備量大：由于不使用固相填料，沒有填料在柱內(nèi)的占空體積，柱內(nèi)空間全部是有效空間，從而負(fù)載能力強(qiáng)、制備量大。

(4)回收率高：由于無不可逆吸附，避免了污染、變性和填料失活造成的樣品損失，樣品的回收率高。

(5)潔凈環(huán)保：整個(gè)實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)過程可以封閉進(jìn)行，避免溶劑揮發(fā)造成的環(huán)境污染及對操作人員的身體傷害。

(6)工藝放大好：在小型儀器上摸索的工藝條件易于在大型儀器和生產(chǎn)過程中實(shí)現(xiàn)。

就HSCCC在分離番茄紅素及其前體化合物中的用途而言，Yun Wei等討論了采用制備級高速逆流從番茄醬中提取番茄紅素的方法，得到最佳分離體系為正己烷：二氯甲烷：乙腈＝10：3.5：6.5(Yun Wei，Tianyou Zhang，Guoqing Xu，Yoichiro Ito，Journal of Chromatography A,2001(929)：169-173)。Susanne Baldermann等討論了采用高速逆流方法分離全反式番茄紅素的方法并考察了溫度對分離效果的影響(Susanne Baldermann，Katharina Ropeter，NilsPeter Fleischmann，J.Chromatogr.A，2008(1192)：191-193)。中國專利CN1120862C也介紹了一種用高速逆流色譜從番茄紅素粗品中分離制備出高純度單體番茄紅素的方法，可得到純度在95％以上的番茄紅素單體。但是，這些研究中只討論了番茄紅素的分離方法，并沒有涉及六氫番茄紅素和八氫番茄紅素分離。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)由于物料體系組分復(fù)雜、工藝和步驟多、實(shí)驗(yàn)流程長、溶劑和能量消耗大(即生產(chǎn)效率低)的缺陷，本發(fā)明提供了一種六氫番茄紅素和八氫番茄紅素的分離方法，所述方法包括如下步驟：

(1)將一種或多種非極性溶劑與一種或多種極性溶劑充分混合后靜置分相，獲得上相溶劑和下相溶劑；

(2)將番茄紅素油樹脂溶解于所述步驟(1)獲得的上相溶劑，作為待分離樣品；

(3)以所述步驟(1)獲得的上相溶劑作為固定相，以所述步驟(1)獲得的下相溶劑作為流動相，通過高速逆流色譜對步驟(2)的待分離樣品進(jìn)行分離，一次得到六氫番茄紅素餾分與流動相的混合液以及八氫番茄紅素餾分與流動相的混合液；

(4)分別去除所述步驟(3)獲得的六氫番茄紅素餾分和八氫番茄紅素餾分中的流動相溶劑，獲得六氫番茄紅素產(chǎn)品和八氫番茄紅素產(chǎn)品。

具體而言，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

1.一種六氫番茄紅素和八氫番茄紅素的分離方法，所述方法包括如下步驟：

(1)將一種或多種非極性溶劑與一種或多種極性溶劑充分混合后靜置分相，獲得上相溶劑和下相溶劑；

(2)將番茄紅素油樹脂溶解于所述步驟(1)獲得的上相溶劑，作為待分離樣品；

(3)以所述步驟(1)獲得的上相溶劑作為固定相，以所述步驟(1)獲得的下相溶劑作為流動相，通過高速逆流色譜對步驟(2)的待分離樣品進(jìn)行分離，一次得到六氫番茄紅素餾分與流動相的混合液以及八氫番茄紅素餾分與流動相的混合液；

(4)分別去除所述步驟(3)獲得的六氫番茄紅素餾分和八氫番茄紅素餾分中的流動相溶劑，獲得六氫番茄紅素產(chǎn)品和八氫番茄紅素產(chǎn)品。

2.如段落1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述非極性溶劑為介電常數(shù)小于2.8的一種或多種溶劑。

3.如段落1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述極性溶劑為介電常數(shù)大于3.6的一種或多種溶劑。

4.如段落1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述非極性溶劑為由碳數(shù)5-7的正烷烴、石油醚和二氯甲烷組成的組中的一種或多種。

5.如段落4所述的方法，其特征在于，所述非極性溶劑為碳數(shù)5-7的正烷烴與二氯甲烷的混合溶劑。

6.如段落1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述極性溶劑為選自于由乙腈、乙酸、乙酸乙酯和丙酮組成的組的一種或多種。

7.如段落1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述非極性溶劑為正戊烷與二氯甲烷的混合溶劑、正己烷與二氯甲烷的混合溶劑或正庚烷與二氯甲烷的混合溶劑，且所述極性溶劑為乙腈。

8.如段落7所述的方法，其特征在于，所述碳數(shù)5-7的正烷烴、二氯甲烷和乙腈的比例為(5-30):(1-20):(5-30)(v/v/v)。

9.如段落8所述的方法，其特征在于，所述碳數(shù)5-7的正烷烴、二氯甲烷和乙腈的比例為(5-25):(2-10):(5-20)(v/v/v)。

10.如段落1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述充分混合后靜置分相為：

將所述一種或多種非極性溶劑以及所述一種或多種極性溶劑加入至分液漏斗，經(jīng)振搖充分混合后靜置分相，獲得兩相混合液。

11.如段落1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，在所述靜置分相后，分別收集所述兩相混合液的上相溶劑和下相溶劑，分別對所述上相溶劑和下相溶劑進(jìn)行脫氣處理。

12.如段落11所述的方法，其特征在于，所述脫氣處理在超聲振蕩器中進(jìn)行，脫氣完成后靜置，使得溶劑恢復(fù)至室溫。

13.如段落1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述番茄紅素油樹脂為番茄加工工業(yè)產(chǎn)品或副產(chǎn)品。

14.如段落13所述的方法，其特征在于，所述番茄紅素油樹脂為番茄醬、番茄皮渣或番茄纖維產(chǎn)品提取所得。

15.如段落1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述高速逆流色譜儀的設(shè)定轉(zhuǎn)速為700-900rpm。

16.如段落15所述的方法，其特征在于，所述高速逆流色譜儀的設(shè)定轉(zhuǎn)速為800-900rpm。

17.如段落1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述高速逆流色譜儀的柱溫為5-25℃。

18.如段落1-17中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述流動相的流速為2-10ml/min。

19.如段落1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述高速逆流色譜儀的檢測器的波長分別為286nm和348nm。

20.如段落1-19中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，借助氮吹儀或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀實(shí)施所述溶劑的去除。

本發(fā)明所述的“室溫”是指環(huán)境溫度在16-26℃的溫度范圍。

有益效果

本發(fā)明針對在對復(fù)雜體系進(jìn)行高效提純時(shí)傳統(tǒng)方法效能低的問題，采用高速逆流色譜法，僅需一次操作即可由工業(yè)產(chǎn)品或副產(chǎn)品提取高純度的天然六氫番茄紅素和八氫番茄紅素。本發(fā)明的方法工藝簡單、操作方便、樣品損耗少、高效快速、所得產(chǎn)品純度高，是一種適合制備高純度番茄紅素前體的良好方法。

附圖說明

圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例4，利用高速逆流色譜分離番茄紅素及其前體混合物的色譜圖。色譜圖中的各峰為：峰1和峰2為雜質(zhì)混合物，峰3是番茄紅素，峰4是六氫番茄紅素，而峰5為八氫番茄紅素。其中，出現(xiàn)峰4的色譜圖(黑色)是在348nm的檢測波長下得到的，出現(xiàn)峰5的色譜圖(灰色)是在286nm的檢測波長下得到的。

圖2為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例4，利用高速逆流色譜分離過程中在不同時(shí)間獲得的產(chǎn)品。從左至右分別是：起始物(番茄紅素油樹脂)；①10-20min(對應(yīng)于峰1，淡黃色)；②35-39min(對應(yīng)于峰2，淺黃色)；③55-65min(對應(yīng)于番茄紅素，琥珀色)；④110-130min(對應(yīng)于六氫番茄紅素，無色)；⑤130-160min(對應(yīng)于八氫番茄紅素，無色)。

具體實(shí)施方式

下文將詳細(xì)闡述本發(fā)明。

根據(jù)一些實(shí)施方式，所述步驟(1)中，所述非極性溶劑為介電常數(shù)小于2.8的一種或多種溶劑。優(yōu)選地，所述非極性溶劑選自于由碳數(shù)5-7的正烷烴、石油醚和二氯甲烷組成的組中的一種或多種。其中，所述碳數(shù)5-7的正烷烴分別為正戊烷、正己烷和正庚烷。優(yōu)選地，所述非極性溶劑為正戊烷與二氯甲烷的混合溶劑、正己烷與二氯甲烷的混合溶劑或正庚烷與二氯甲烷的混合溶劑。

根據(jù)一些實(shí)施方式，其特征在于，所述步驟(1)中，所述極性溶劑為介電常數(shù)大于3.6的一種或多種溶劑。所述極性溶劑為選自于由乙腈、乙酸、乙酸乙酯和丙酮組成的組的一種或多種。優(yōu)選地，所述極性溶劑為乙腈。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟(1)中，所述非極性溶劑為正戊烷與二氯甲烷，所述極性溶劑為乙腈。優(yōu)選地，所述正戊烷、二氯甲烷和乙腈的比例為正戊烷:二氯甲烷:乙腈＝(5-30):(1-20):(5-30)(v/v/v)；更優(yōu)選地，所述正戊烷、二氯甲烷和乙腈的比例為正戊烷:二氯甲烷:乙腈＝(5-25):(2-10):(5-20)(v/v/v)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟(1)中，所述非極性溶劑為正己烷與二氯甲烷，所述極性溶劑為乙腈。優(yōu)選地，所述正己烷、二氯甲烷和乙腈的比例為正己烷:二氯甲烷:乙腈＝(5-30):(1-20):(5-30)(v/v/v)；更優(yōu)選地，所述正己烷、二氯甲烷和乙腈的比例為正己烷:二氯甲烷:乙腈＝(5-25):(2-10):(5-20)(v/v/v)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟(1)中，所述非極性溶劑為正庚烷與二氯甲烷，所述極性溶劑為乙腈。優(yōu)選地，所述正庚烷、二氯甲烷和乙腈的比例為正庚烷:二氯甲烷:乙腈＝(5-30):(1-20):(5-30)(v/v/v)；更優(yōu)選地，所述正庚烷、二氯甲烷和乙腈的比例為正庚烷:二氯甲烷:乙腈＝(5-25):(2-10):(5-20)(v/v/v)。

根據(jù)一些實(shí)施方式，所述步驟(1)中，所述充分混合后靜置分相為：將所述一種或多種極性溶劑以及所述一種或多種非極性溶劑加入至分液漏斗，振搖2-3次充分混合后靜置分相，獲得兩相混合液。

根據(jù)一些實(shí)施方式，所述步驟(1)中，在所述靜置分相后，分別收集所述兩相混合液的上相溶劑和下相溶劑，分別對所述上相溶劑和下相溶劑進(jìn)行脫氣處理。

根據(jù)一些實(shí)施方式，所述脫氣處理在超聲振蕩器中進(jìn)行，脫氣完成后靜置，使得溶劑恢復(fù)至室溫。

根據(jù)一些實(shí)施方式，所述步驟(2)中，所述番茄紅素油樹脂為番茄加工工業(yè)產(chǎn)品或副產(chǎn)品提取所得，特別地為番茄醬、番茄皮渣或番茄纖維產(chǎn)品。

本發(fā)明使用的高效逆流色譜技術(shù)的一般操作過程為本領(lǐng)域所公知。具體而言，以非極性-極性兩相溶劑的一個(gè)相作為固定相，另一相作為流動相，將待分離樣品溶解于其中一相中。首先，將固定相泵入高速逆流色譜儀的色譜柱內(nèi)，待液體充滿后啟動主機(jī)，設(shè)定轉(zhuǎn)速、柱溫和檢測波長，待系統(tǒng)穩(wěn)定后，以一定的流速泵入流動相進(jìn)行平衡；待平衡后，加入待分離樣品；根據(jù)檢測器圖譜的出峰情況，收集各餾分與流動相的混合液。

就本發(fā)明而言，以所述步驟(1)獲得的上相溶劑作為固定相，以所述步驟(1)獲得的下相溶劑作為流動相，將番茄紅素油樹脂溶解于所述步驟(1)獲得的上相溶劑，作為待分離樣品。

根據(jù)一些實(shí)施方式，所述步驟(3)中，所述高速逆流色譜儀的設(shè)定轉(zhuǎn)速為700-900rpm；優(yōu)選地，高速逆流色譜儀的設(shè)定轉(zhuǎn)速為800-900rpm。

根據(jù)一些實(shí)施方式，所述步驟(3)中，所述高速逆流色譜儀的柱溫為5-25℃。

根據(jù)一些實(shí)施方式，所述步驟(3)中，所述流動相的流速為2-10ml/min。

根據(jù)一些實(shí)施方式，所述步驟(3)中，所述高速逆流色譜儀的檢測器的波長為286nm和348nm。

根據(jù)一些實(shí)施方式，所述步驟(4)中，借助氮吹儀或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀實(shí)施所述溶劑的去除。

實(shí)施例

借助于下述實(shí)施例可更好地理解本發(fā)明，這些實(shí)施例僅用于舉例說明本發(fā)明，不應(yīng)被解釋為對本發(fā)明的限制。

本發(fā)明的實(shí)施例所使用的正戊烷、正己烷、正庚烷、二氯甲烷和乙腈均為北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn)的分析純試劑，水為去離子水，番茄紅素油樹脂購自中糧屯河。番茄紅素油樹脂中番茄紅素含量為6.24wt％；因無法獲得標(biāo)準(zhǔn)品，該番茄紅素油樹脂中的六氫番茄紅素和八氫番茄紅素含量未知。

本發(fā)明的實(shí)施例所使用的高速逆流色譜儀為同田公司生產(chǎn)的TBE300C型高速逆流色譜，高效液相色譜儀為安捷倫1260型高效液相色譜。

在本發(fā)明中，對分離后的番茄紅素及其前體物質(zhì)進(jìn)行測試的方法參考吳增寶等(吳增寶、薛琳、田珊珊、朱啟軍、田潔、彭代萍，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(14)：4436—4437)的分析方法。采用安捷倫1260型高效液相色譜，配備DAD檢測器。系統(tǒng)耐受正相溶劑。采用甲醇-甲基叔丁基醚為流動相，均為色譜純。根據(jù)吳增寶等，以波長286nm產(chǎn)生的色譜圖作為八氫番茄紅素(phytoene)的色譜信號；以波長348nm產(chǎn)生的色譜圖作為六氫番茄紅素(phytofluene)和番茄紅素的色譜信號。同時(shí)，DAD檢測器可實(shí)時(shí)在線記錄每個(gè)色譜峰的紫外-可見吸收光譜。

實(shí)施例1

采用如下步驟實(shí)施六氫番茄紅素和八氫番茄紅素的純化。

(1)按照正己烷:二氯甲烷:乙腈＝5:2:5(v/v/v)的比例，將上述三種溶劑加入至分液漏斗，振搖2-3次充分混合后靜置分相，獲得兩相混合液；用干凈的試劑瓶分別收集該兩相混合液中的上相溶劑和下相溶劑，分別放入超聲振蕩器進(jìn)行脫氣處理，脫氣處理15min后靜置，等待溶劑恢復(fù)至室溫。

(2)取1.0g番茄紅素油樹脂，將其溶解于20ml步驟(1)獲得的上相溶劑，作為待分離樣品；

(3)以步驟(1)獲得的上相溶劑作為固定相，將其泵入高速逆流色譜儀的色譜柱內(nèi)，待液體充滿后啟動主機(jī)，設(shè)定轉(zhuǎn)速為800rpm、柱溫為10℃，待系統(tǒng)穩(wěn)定后，以2ml/min流速泵入下相溶劑作為流動相進(jìn)行平衡；待平衡后，通過進(jìn)樣閥將步驟(2)的待分離樣品加入，在286nm和348nm的檢測波長下，根據(jù)色譜圖的出峰位置收集各樣品餾分。將收集到的餾分放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，去除溶劑，進(jìn)行HPLC分析，得到六氫番茄紅素和八氫番茄紅素，根據(jù)峰面積歸一法測得純度分別為95％和96％。

實(shí)施例2

采用如下步驟實(shí)施六氫番茄紅素和八氫番茄紅素的純化。

(1)按照正戊烷:二氯甲烷:乙腈＝25:8:25(v/v/v)的比例，將上述三種溶劑加入至分液漏斗，振搖2-3次充分混合后靜置分相，獲得兩相混合液；用干凈的試劑瓶分別收集該兩相混合液中的上相溶劑和下相溶劑，分別放入超聲振蕩器進(jìn)行脫氣處理，脫氣處理15min后靜置，等待溶劑恢復(fù)至室溫。

(2)取1.0g番茄紅素油樹脂，將其溶解于20ml步驟(1)獲得的上相溶劑，作為待分離樣品；

(3)以步驟(1)獲得的上相溶劑作為固定相，將其泵入高速逆流色譜儀的色譜柱內(nèi)，待液體充滿后啟動主機(jī)，設(shè)定轉(zhuǎn)速為800rpm、柱溫為5℃，待系統(tǒng)穩(wěn)定后，以10ml/min流速泵入下相溶劑作為流動相進(jìn)行平衡；待平衡后，通過進(jìn)樣閥將步驟(2)的待分離樣品加入，在286nm和348nm波長下，根據(jù)色譜圖的出峰位置收集各樣品餾分。將收集到的餾分放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，去除溶劑，進(jìn)行HPLC分析，得到六氫番茄紅素和八氫番茄紅素，根據(jù)峰面積歸一法測得純度分別為84％和82％。

實(shí)施例3

采用如下步驟實(shí)施六氫番茄紅素和八氫番茄紅素的純化。

(1)按照正庚烷:二氯甲烷:乙腈＝20:15:13(v/v/v)的比例，將上述三種溶劑加入至分液漏斗，振搖2-3次充分混合后靜置分相，獲得兩相混合液；用干凈的試劑瓶分別收集該兩相混合液中的上相溶劑和下相溶劑，分別放入超聲振蕩器進(jìn)行脫氣處理，脫氣處理15min后靜置，等待溶劑恢復(fù)至室溫。

(2)取1.0g番茄紅素油樹脂，將其溶解于20ml步驟(1)獲得的上相溶劑，作為待分離樣品；

(3)以步驟(1)獲得的上相溶劑作為固定相，將其泵入高速逆流色譜儀的色譜柱內(nèi)，待液體充滿后啟動主機(jī)，設(shè)定轉(zhuǎn)速為900rpm、柱溫為25℃，待系統(tǒng)穩(wěn)定后，以5ml/min流速泵入下相溶劑作為流動相進(jìn)行平衡；待平衡后，通過進(jìn)樣閥將步驟(2)的待分離樣品加入，在286nm和348nm波長下，據(jù)檢測器圖譜出峰位置收集各樣品餾分。將收集到的餾分放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，去除溶劑，進(jìn)行HPLC分析，得到六氫番茄紅素和八氫番茄紅素，根據(jù)峰面積歸一法測得純度分別為80％和85％。

實(shí)施例4

采用如下步驟實(shí)施六氫番茄紅素和八氫番茄紅素的純化。

(1)按照正己烷:二氯甲烷:乙腈＝20:7:13(v/v/v)的比例，將上述三種溶劑加入至分液漏斗，振搖2-3次充分混合后靜置分相，獲得兩相混合液；用干凈的試劑瓶分別收集該兩相混合液中的上相溶劑和下相溶劑，分別放入超聲振蕩器進(jìn)行脫氣處理，脫氣處理15min后靜置，等待溶劑恢復(fù)至室溫。

(2)取1.0g番茄紅素油樹脂，將其溶解于20ml步驟(1)獲得的上相溶劑，作為待分離樣品；

(3)以步驟(1)獲得的上相溶劑作為固定相，將其泵入高速逆流色譜儀的色譜柱內(nèi)，待液體充滿后啟動主機(jī)，設(shè)定轉(zhuǎn)速為800rpm、柱溫為10℃，待系統(tǒng)穩(wěn)定后，以10ml/min流速泵入下相溶劑作為流動相進(jìn)行平衡；待平衡后，通過進(jìn)樣閥將步驟(2)的待分離樣品加入，在286nm和348nm波長下，據(jù)檢測器圖譜出峰位置收集各樣品餾分。將收集到的餾分放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，去除溶劑，進(jìn)行HPLC分析，得到六氫番茄紅素和八氫番茄紅素，根據(jù)峰面積歸一法測得純度分別為96％和97％。