本發(fā)明涉及PLK1抑制劑及其制備方法與應(yīng)用，屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：PLK1是Polo-類激酶家族成員，是一類高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與細(xì)胞分裂過程中的中心體成熟、紡錘體形成以及染色體分離等過程，對細(xì)胞有絲分裂過程起重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，PLK1在肺癌、乳腺癌及胃癌等多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)，其過表達(dá)也是腫瘤不良預(yù)后的標(biāo)志之一，但在正常細(xì)胞中其表達(dá)水平很低，有時(shí)甚至無法測出。因此，PLK1在腫瘤診斷和治療中是廣受關(guān)注的靶點(diǎn)。應(yīng)用反義技術(shù)、小分子RNA干擾技術(shù)或小分子抑制劑敲除腫瘤細(xì)胞中表達(dá)PLK1的基因或抑制PLK1的活性，能造成腫瘤細(xì)胞生長抑制甚至凋亡。已有研究證明，反義寡核苷酸或小分子干擾RNA，能特異性地降低PLK1的表達(dá)，但對正常細(xì)胞沒有明顯影響。也有研究報(bào)道從有機(jī)合成的化學(xué)小分子或天然產(chǎn)物中篩選PLK1的化學(xué)小分子抑制劑，如ON01910、BI2536、HMN-214、GSK461364等，可通過與ATP競爭性或非競爭性結(jié)合來抑制PLK1活性，這些小分子抑制劑部分已進(jìn)入臨床研究階段。然而，反義寡核苷酸易被核酸酶水解，有效作用時(shí)間短；小分子RNA干擾技術(shù)也存在安全性、穩(wěn)定性的問題。此外，寡核苷酸以及小分子RNA都難以穿透細(xì)胞膜，跨膜運(yùn)輸?shù)膯栴}一直難以解決。因此，目前主要的研究方向是從有機(jī)合成的化學(xué)小分子或天然產(chǎn)物中篩選PLK1的化學(xué)小分子抑制劑。然而，目前成功上市用于腫瘤治療的小分子激酶抑制劑都存在一個(gè)共同的弱點(diǎn)—產(chǎn)生耐藥性。由于腫瘤細(xì)胞能夠在治療過程中很快產(chǎn)生突變，從而使激酶對小分子抑制劑的結(jié)合力下降，使其對小分子抑制劑的治療不敏感，因而產(chǎn)生耐藥性，PLK1的化學(xué)小分子抑制劑具有同樣的耐藥性問題。因此，開發(fā)新型的PLK1抑制劑是本領(lǐng)域亟需解決的技術(shù)問題之一。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一在于提供一類新型的PLK1抑制劑。本發(fā)明的另一目的在于提供所述PLK1抑制劑的制備方法。本發(fā)明的再一目的在于提供含有所述PLK1抑制劑的組合物。本發(fā)明的再一目的在于提供所述PLK1抑制劑或含有所述PLK1抑制劑的組合物的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供通式(I)所示的化合物、其立體異構(gòu)體或藥學(xué)上可接受的鹽：其中：R1～R8各自獨(dú)立地為氫或C1～3烷基；優(yōu)選地，R1～R8均為甲基A為-(CH2)m-，在A中，任意CH2上的氫原子被C1～3烷基、-OH、-NH2、-O-(C＝O)-R9或-NH-(C＝O)-R9所取代；B為-(CH2)n-CH3，在B中，任意CH2或CH3上的氫原子被C1～3烷基、-OR11或-NR10R11所取代；優(yōu)選地，所述A為所述R12選自-OH、-NH2、-O-(C＝O)-R9或-NH-(C＝O)-R9；更優(yōu)選地，A為優(yōu)選地，所述B為R9為R10為C1～3烷基；R11為C1～6烷基或R17；R17為在R9或R17中，任意CH2上的氫原子被0～2個(gè)C1～6烷基、-OH、-NH2、鹵素、-OR19、-NHR20或-NR20R21所取代；X或Y各自獨(dú)立地為O、NH或NR22，R13～R15各自獨(dú)立地為H、鹵素、C1～3烷基；R16為C1～6烷基；優(yōu)選地，R16為甲基、乙基、正丙基、異丙基、一氟甲基、二氟甲基或三氟甲基；R18為氫、鹵素、C1～3烷基、羧基或硝基，優(yōu)選地，R18為羧基；所述R19～R22各自獨(dú)立地為C1～3烷基；所述C1～6烷基或所述C1～3烷基被0～3個(gè)鹵素取代，優(yōu)選被0～3個(gè)氟取代；p、p’各自獨(dú)立地選自0、1、2、3或4；優(yōu)選地，p、p’各自獨(dú)立地為1、2、3或4；q、q’、r、r’、s、s’各自獨(dú)立地選自0、1、2、3或4；優(yōu)選地，q、q’、r、r’、s、s’均為0；t選自0、1、2、3或4；優(yōu)選地，t為1。本發(fā)明通式(I)所示的化合物為吡咯-咪唑類聚酰胺化合物能夠特異性識別且高強(qiáng)度的結(jié)合于SEQINNO:1所示的PLK1基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)域中的DNA序列，抑制PLK1基因的轉(zhuǎn)錄，抑制PLK1蛋白的表達(dá)，造成腫瘤細(xì)胞生長抑制或凋亡。本發(fā)明通式(I)所示的化合物能夠穿過細(xì)胞膜和核膜，特異性地識別PLK1基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子序列，并且其屬于聚酰胺類化合物，現(xiàn)有技術(shù)(Single-dosepharmacokineticandtoxicityanalysisofpyrrole-imidazolepolyamidesinmice,Synold,TimothyW.；Xi,Bixin；Wu,Jun；etal,CANCERCHEMOTHERAPYANDPHARMACOLOGYVolume:70Issue:4Pages:617-625,Published:OCT2012)表明這類結(jié)構(gòu)能夠抵抗核酸酶水解，因此本發(fā)明通式(I)所示的化合物還能夠抵抗核酸酶的水解。因此，本發(fā)明通式(I)所示的吡咯-咪唑類聚酰胺化合物克服了寡核苷酸以及小分子RNA有效作用 時(shí)間短和跨膜運(yùn)輸?shù)膯栴}。此外，本發(fā)明通式(I)所示的吡咯-咪唑類聚酰胺直接作用于PLK1基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)域中的序列，不同于小分子抑制劑作用于激酶蛋白分子，因此克服了小分子激酶抑制劑的耐藥性難題。優(yōu)選地，在本發(fā)明所述的通式(I)所示的化合物、其立體異構(gòu)體或藥學(xué)上可接受的鹽中，所述化合物具有式(II)～式(V)所示的結(jié)構(gòu)：優(yōu)選地，R10為甲基或三氟甲基；優(yōu)選地，所述R12選自NH2、優(yōu)選地，所述R11選自CH3、CF3、CH2COOH、進(jìn)一步優(yōu)選地，在本發(fā)明所述的通式(I)所示的化合物、其立體異構(gòu)體或藥學(xué)上可接受的鹽中，所述化合物包括：本發(fā)明所述C1～3烷基包括甲基、乙基、正丙基或異丙基；所述C1～6烷基表示碳原子數(shù)為1～6的直鏈或直鏈烷基，包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、仲戊基、正己基或異己基等。本發(fā)明所述C1～6烷基或所述C1～3烷基被0～3個(gè)鹵素取代表示如上所述的C1～3烷基或C1～6烷基中的氫被0～3個(gè)鹵素原子取代，例如-CH2F、-CHF2、-CF3、-CH2FCH3、-CHF2CH3、-CF2CH2CH3等。另一方面，本發(fā)明提供所述的通式(I)所示的化合物、其立體異構(gòu)體或藥學(xué)上可接受的鹽的制備方法，其中，所述方法包括如下步驟：(a)制備苯肼樹脂負(fù)載的式(IV)樹脂；式(IV)A’為-(CH2)m-，在A中，任意CH2上的氫原子被-OPOH、-NHPNH所取代；優(yōu)選地，所述A’為所述R12為-OPOH或-NHPOH；更優(yōu)選地，A’為(b)脫除式(IV)中的POH或PNH；(c)以氧化劑及切割劑進(jìn)行氧化反應(yīng)及切割反應(yīng)以制得式(I)所示的化合物；所述切割劑為NH2-(CH2)n-CH3，在切割劑中，任意CH2或CH3上的氫原子被-OR11或-NR10R11所取代；優(yōu)選地，所述切割劑為優(yōu)選地，所述氧化劑為醋酸銅、N-溴代丁二酰亞胺和氧氣中的一種或多種的組合；A’及切割劑中各基團(tuán)的定義與本發(fā)明相同，POH、PNH分別表示羥基保護(hù)基及氨基保護(hù)基；優(yōu)選地，所述POH、PNH為Boc、Fmoc、Cbz、Trt或Allyl，更優(yōu)選Fmoc。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，在本發(fā)明方法中，在步驟(b)與步驟(c)之間以對脫除POH或PNH暴露的羥基或氨基進(jìn)行縮合反應(yīng)以形成-O-(C＝O)-R9或-NH-(C＝O)-R9的步驟；所述R23為羥基或鹵素。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，在本發(fā)明方法中，所述方法中的步驟(c)被步驟(c’)所替代，并且在步驟(c’)之后進(jìn)一步包括步驟(c”)；(c’)以氧化劑及切割劑進(jìn)行氧化反應(yīng)及切割反應(yīng)；所述切割劑為NH2-(CH2)n-CH2N(R10)-(CH2)p’-YH，(c”)以對步驟(c’)所得產(chǎn)物中的YH進(jìn)行縮合反應(yīng)后以制得式(I)所示的所述的化合物；R24為羥基或鹵素；選擇性地，在步驟(b)與步驟(c’)之間，將脫除POH或PNH暴露的羥基或氨基以POH’或PNH’進(jìn)行保護(hù)，所述POH’或PNH’為可耐受堿性條件的羥基保護(hù)基或氨基保護(hù)基；并在步驟(c”)進(jìn)行縮合反應(yīng)之后脫除POH’或PNH’以制得式(I)所示的所述的化合物；優(yōu)選地，所述POH’或PNH’為叔丁氧羰基。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，在本發(fā)明方法中，所述式(VI)為式(VI-1)；優(yōu)選地，式(VI-1)按如下路線制備：(1)以苯肼樹脂以及4-叔丁氧羰基氨基-1-甲基-1H-吡咯-2-羧酸為原料經(jīng)重復(fù)縮合及脫叔丁氧羰基保護(hù)基制得式(1)所示的化合物：(2)以式(1)所示的化合物與R-2-(9-芴甲氧羰基氨基)-4-叔丁氧羰基氨基丁酸進(jìn)行縮合反應(yīng)制得式(2)所示的化合物；(3)式(2)所示的化合物脫除叔丁氧羰基保護(hù)基后與4-叔丁氧羰基氨基-1-甲基-1H-吡咯-2-羧酸進(jìn)行縮合反應(yīng)，重復(fù)脫叔丁氧羰基保護(hù)基及縮合反應(yīng)制得式(3)所示的化合物：(4)以式(3)所示的化合物與4-叔丁氧羰基氨基-1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸進(jìn)行縮合反應(yīng)并脫除叔丁氧羰基保護(hù)基得式(4)所示的化合物：(5)以式(4)所示的化合物與1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸進(jìn)行縮合反應(yīng)制得式(VI-1)所示的化合物。本發(fā)明對上述路線中縮合反應(yīng)以及脫叔丁氧羰基保護(hù)基反應(yīng)的條件不作限定。再一方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含有效劑量的本發(fā)明所述的通式(I)所示的化合物、其立體異構(gòu)體或藥學(xué)上可接受的鹽，或進(jìn)一步包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。再一方面，本發(fā)明提供所述的通式(I)所示的化合物、其立體異構(gòu)體或藥學(xué)上可接受的鹽或所述的藥物組合物在制備治療或預(yù)防細(xì)胞過度增殖性疾病的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述的細(xì)胞過度增殖性疾病包括結(jié)腸癌、直腸癌、腦瘤、肺癌、表皮鱗癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)直腸癌、腎細(xì)胞癌、胃癌、食管腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、皮膚癌、甲狀腺癌、頭頸癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及鼻咽癌中的一種或多種；更優(yōu)選地，所述的細(xì)胞過度增殖性疾病包括乳腺癌、肺癌或胃癌。綜上所述，本發(fā)明提供了一種新型的PLK1抑制劑以及制備方法與應(yīng)用。該P(yáng)LK1抑制劑能夠特異性高強(qiáng)度的結(jié)合于SEQ:NO:1所示的PLK1基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)域中的DNA序列，抑制PLK1基因的轉(zhuǎn)錄，抑制PLK1蛋白的表達(dá)，造成腫瘤細(xì)胞生長抑制或凋亡。并且其能夠穿過細(xì)胞膜和核膜及抵抗核酸酶水解。此外，其還克服了小分子激酶抑制劑的耐藥性難題。本發(fā)明中的縮寫具有如下意義：PLK1:Polo-LikeKinase1,保羅樣激酶1；BOC:t-butyloxycarbonyl，叔丁氧羰基；Fmoc:fluorenylmethyloxycarbonyl，芴甲氧羰基；HOAt:1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑； DMF:N,N-二甲基甲酰胺；THF:四氫呋喃；DIEA:N,N-二異丙基乙胺；TFA:三氟乙酸；PyBOP:六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷。附圖說明圖1為化合物1～5的合成路線圖；圖2為化合物1的HRMS圖譜；圖3為化合物2的HRMS圖譜；圖4為化合物3的HRMS圖譜；圖5為赫斯特酸衍生物Ht-2的HNMS圖譜；圖6為化合物4的HRMS圖譜；圖7為化合物5的HRMS圖譜；圖8為化合物2穿透細(xì)胞膜與核膜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖9為化合物2抑制Hela細(xì)胞PLK1蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖10為化合物2抑制Hela細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖11為實(shí)施例9給藥組的給藥劑量和頻率示意圖；圖12～圖14為實(shí)施例9化合物2抑制非小細(xì)胞肺癌腫瘤細(xì)胞在荷瘤小鼠中的增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。具體實(shí)施方式為了對本發(fā)明的技術(shù)特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行以下詳細(xì)說明，應(yīng)理解這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。圖1為化合物1～5的合成路線圖，其由Fmoc保護(hù)的苯肼樹脂為原料，經(jīng)多步制得式(1)，隨后依次制得式(2)～式(6)，最后根據(jù)式(5)或式(6)制得化合物1～5。實(shí)施例1化合物1的制備(a)樹脂溶脹：于一個(gè)10mL的固相反應(yīng)器中加入400mgFmoc保護(hù)的苯肼樹脂(0.66mmol/g，0.264mmol)及3mLCH2Cl2，將樹脂溶脹30min，抽除CH2Cl2，備用；(b)脫除Fmoc保護(hù)基：將3mL20％哌啶/DMF溶液加入步驟(a)溶脹后的樹脂中，N2鼓泡混勻，10min后，抽除溶劑，再加入3mL20％哌啶/DMF溶液，N2鼓泡混勻，10min后，用DMF(4×3mL)洗滌樹脂，再用3mL無水DMF洗滌樹脂，備用；(c)氨基酸縮合：將4-叔丁氧羰基氨基-1-甲基-1H-吡咯-2-羧酸(254mg，1.056mmol)和三光氣(BTC，128mg，0.433mmol)溶于2mL無水THF，向該溶液中緩慢滴加三甲基吡啶(collidine，488μL，3.696mmol)，反應(yīng)立即產(chǎn)生大量白色沉淀，加完反應(yīng)3min，再加入2mLDIEA/DMF溶液(5％,v/v)，白色沉淀完全消失，將該反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到步驟(b)脫除保護(hù)基的苯肼樹脂中，N2鼓泡混勻，縮合反應(yīng)0.5～1h，抽除反應(yīng)液，用DMF(4×3mL)洗滌樹脂，備用；(d)脫除叔丁氧羰基保護(hù)基：用CH2Cl2(2×3mL)洗滌，抽除CH2Cl2，加入3.0mLTFA/苯酚/H2O(v:v:v＝92:5:2.5)混合溶液脫除步驟(b)所得縮合產(chǎn)物上的叔丁氧羰基保護(hù)基，2min后抽除溶劑，再次加入3.0mLTFA/苯酚/H2O(v:v:v＝92:5:2.5)混合溶液反應(yīng)20min，用CH2Cl2(2×3mL)及DMF(4×3mL)洗滌樹脂，再用3mL無水DMF洗滌樹脂，備用；重復(fù)上述縮合及脫保護(hù)步驟(c)和(d)，直至完成式(1)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽的合成；(e)γ-氨基酸的縮合：將R-2-(9-芴甲氧羰基氨基)-4-叔丁氧羰基氨基丁酸(465mg，1.056mmol)和三光氣(128mg，0.433mmol)溶于2mL無水THF，向該溶液中緩慢滴加三甲基吡啶(488μL，3.696mmol)，反應(yīng)立即產(chǎn)生大量白色沉淀，加完反應(yīng)1min，加入HOAt(144mg，1.056mmol)，再加入2mLDIEA/DMF溶液(5％,v/v)，反應(yīng)5min，白色沉淀完全消失，將該反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到式(1)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的直鏈肽(NH2-Py-Py-Py-Py-苯肼樹脂)中，N2鼓泡混勻，縮合反應(yīng)0.5～1h，抽除反應(yīng)液，用DMF(4×3mL)洗滌樹脂，得到式(2)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽；(f)重復(fù)脫保護(hù)及縮合護(hù)步驟(d)和(c)，其中，直至完成得到式(3)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽的合成；(g)氨基酸縮合：將4-叔丁氧羰基氨基-1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸(255mg，1.056mmol)和三光氣(128mg，0.433mmol)溶于1mL無水THF，向該溶液中緩慢滴加三甲基吡啶(488μL，3.696mmol)，反應(yīng)立即產(chǎn)生大量白色沉淀，加完反應(yīng)3min，加入HOAt(144mg，1.056mmol)，再加入2mLDIEA/DMF溶液(5％,v/v)，白色沉淀完全消失，將該反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到步驟(f)所得式(3)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽中，N2鼓泡混勻，縮合反應(yīng)0.5～1h，抽除反應(yīng)液，用DMF(4×3mL)洗滌樹脂，備用；(h)脫除叔丁氧羰基保護(hù)基：用CH2Cl2(2×3mL)洗滌，抽除CH2Cl2，加入3.0mLTFA/苯酚/H2O(v:v:v＝92:5:2.5)混合溶液脫除步驟(g)所得產(chǎn)物上的叔丁氧羰基保護(hù)基，2min后抽除溶劑，再次加入3.0mLTFA/苯酚/H2O(v:v:v＝92:5:2.5)混合溶液反應(yīng)20min，用CH2Cl2(2×3mL)及DMF(4×3mL)洗滌樹脂，再用3mL無水DMF洗滌樹脂，得式(4)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽；(i)末端氨基酸的縮合：將1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸(132mg，1.056mmol)和PyBOP(550mg，1.056mmol)溶于3mL無水DMF，加入DIEA(350μL，2.112mmol)，反應(yīng)5min，將該反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到步驟(h)所得的式(4)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽中，N2鼓泡混勻，縮合反應(yīng)2h，抽除反應(yīng)液，用DMF(4×3mL)洗滌樹脂，得到式(5)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽；(j)化合物1的合成采用步驟(b)中的方法脫除式(5)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽中的Fmoc保護(hù)基后，將樹脂取出，加入1mLDMF、200μL二甲氨基丙胺及10mgCu(OAc)2，室溫振搖反應(yīng)12h，將樹脂濾除，并用20mLCH2Cl2洗滌樹脂；將有機(jī)相濃縮，殘留物用半制備型HPLC純化：10％乙腈-H2O(含1％的TFA)等梯度洗脫5min，10％至100％的乙腈-H2O(含1％的TFA)梯度洗脫25min，保留時(shí)間TR＝15min，收集產(chǎn)物，冷凍干燥，得到淡黃色固體化合物1，其HRMS如圖2所示。HRMS(ESI)m/z:理論計(jì)算值C55H68N21O9[M+H]+1166.5503實(shí)測:1166.5508。實(shí)施例2化合物2的制備按實(shí)施例1同樣的步驟制得式(5)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽，并采用實(shí)施例1中的步驟(b)脫除式(5)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽中的Fmoc保護(hù)基；將赫斯特酸衍生物Ht-1(539mg，1.056mmol)和PyBOP(550mg，1.056mmol)溶于3mL無水DMF，加入DIEA(350μL，2.112mmol)，反應(yīng)5min，將該反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到脫除Fmoc的式(5)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽中，N2鼓泡混勻，縮合反應(yīng)1h，抽除反應(yīng)液，用DMF(4×3mL)洗滌樹脂；將樹脂取出，加入1mLDMF、200μL二甲氨基丙胺及10mgCu(OAc)2，室溫振搖反應(yīng)12h，將樹脂濾除，并用20mLCH2Cl2洗滌樹脂；將有機(jī)相濃縮，殘留物用半制備型HPLC純化：10％乙腈-H2O(含1％的TFA)等梯度洗脫5min，10％至100％的乙腈-H2O(含1％的TFA)梯度洗脫25min，保留時(shí)間TR＝18.5min，收集產(chǎn)物，冷凍干燥，得到淡黃色固體化合物2，其HRMS如圖3所示。HRMS(ESI)m/z:理論計(jì)算值C84H96N27O11[M+H]+1658.7777,實(shí)測:1658.7774.C84H97N27O112+；赫斯特酸衍生物Ht-1的結(jié)構(gòu)如下(制備方法參見J.AM.CHEM.SOC.2004,126,3736-3747)：實(shí)施例3化合物3的制備按實(shí)施例1同樣的步驟制得式(5)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽，并采用實(shí)施例1中的步驟(b)脫除式(5)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽中的Fmoc保護(hù)基；將Boc2O(243μL，1.056mmol)溶于3mL無水DMF，加入DIEA(350μL，2.112mmol)，將該反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到脫除Fmoc的式(5)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽中，N2鼓泡混勻，縮合反應(yīng)20min。抽除反應(yīng)液，用DMF(4×3mL)洗滌樹脂，得到Boc保護(hù)的式(6)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽；將以上所得樹脂取出，加入1mLDMF、200μLN,N-雙(3-氨丙基)甲胺，90℃振搖反應(yīng)1h，冷至室溫，將樹脂濾除，并用20mLCH2Cl2洗滌樹脂；將有機(jī)相濃縮，殘留物用半制備型HPLC純化：10％乙腈-H2O(含1％的TFA)等梯度洗脫5min，10％至100％的乙腈-H2O(含1％的TFA)梯度洗脫25min，保留時(shí)間TR＝16min，收集產(chǎn)物，冷凍干燥，得到淡黃色固體，備用；取上述固體4mg(3μmol)溶于0.5mL無水DMF，加入赫斯特酸衍生物Ht-2(2.7mg，6μmol)、PyBOP(3.1mg，6μmol)和DIEA(5μL，30μmol)，室溫振搖反應(yīng)2h，用半制備型HPLC純化：10％乙腈-H2O(含1％的TFA)等梯度洗脫5min，10％至100％的乙腈-H2O(含1％的TFA)梯度洗脫25min，保留時(shí)間TR＝18min，收集產(chǎn)物，冷凍干燥得固體；將該固體溶于1mLCH2Cl2，冰浴下加入1mLTFA，0℃反應(yīng)1h，加入20mL冷的乙醚，離心收集沉淀，用半制備型HPLC純化：10％乙腈-H2O(含1％的TFA)等梯度洗脫5min，10％至100％的乙腈-H2O(含1％的TFA)梯度洗脫25min，保留時(shí)間TR＝17min，收集產(chǎn)物，冷凍干燥，得到淡黃色固體產(chǎn)物化合物3，其HRMS如圖4所示。HRMS(ESI)m/z:理論計(jì)算值C83H95N28O10[M+2H]2+822.3926,實(shí)測822.3934.赫斯特酸衍生物Ht-2的結(jié)構(gòu)及合成路線如下：將Ht-2-B(11.4g,44.2mmol)與4-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)苯-1,2-二胺(Ht-2-A，10g,31.0mmol，制備方法參見Inorg.Chem.1998,37,6018-6022)溶于乙酸(100mL)中，油浴加熱回流反應(yīng)4小時(shí)。減壓蒸除乙酸，冷卻至室溫，柱 層析純化，得到草綠色固體。將所得產(chǎn)物溶于甲醇(100ml)，磁力攪拌，氮?dú)獗Ｗo(hù)，冰水浴冷卻，緩慢滴加3.1g氫氧化鈉的50ml水溶液，滴畢，室溫反應(yīng)8h，TLC檢測反應(yīng)完全，蒸除甲醇，稀鹽酸調(diào)pH酸性，析出固體，過濾，干燥，得黃綠色固體Ht-2，其HNMR分別如圖5所示。HNMR(DMSO-d6，400MHz)：2.44(s,3H),2.79(s,2H),3.23(s,2H),6.96(m,1H),7.05(brs,1H),7.47(m,1H),7.69-7.73(m,2H),8.08(m,1H),8.33-8.49(m,2H),8.83(s,1H)，12.73(brs,1H),13.41(brs,1H)。MS(ES):453.2[(M+H)+]。實(shí)施例4化合物4的制備按實(shí)施例1同樣的步驟制得式(5)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽，并采用實(shí)施例1中的步驟(b)脫除式(5)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽中的Fmoc保護(hù)基；將實(shí)施例2中的赫斯特酸衍生物Ht-1(539mg，1.056mmol)和PyBOP(550mg，1.056mmol)溶于3mL無水DMF，加入DIEA(350μL，2.112mmol)，反應(yīng)5min，將該反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到脫除Fmoc的式(5)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽中，N2鼓泡混勻，縮合反應(yīng)1h，抽除反應(yīng)液，用DMF(4×3mL)洗滌樹脂；將樹脂取出，加入1mLDMF、200μLN,N-雙(3-氨丙基)甲胺及10mgCu(OAc)2，室溫振搖反應(yīng)12h，將樹脂濾除，并用20mLCH2Cl2洗滌樹脂；將有機(jī)相濃縮，殘留物用半制備型HPLC純化：10％乙腈-H2O(含1％的TFA)等梯度洗脫5min，10％至100％的乙腈-H2O(含1％的TFA)梯度洗脫25min，保留時(shí)間TR＝17min，收集產(chǎn)物，冷凍干燥，得固體，備用；將3.4mg上述所得固體(2μmol)溶于0.5mL無水DMF，加入間苯二甲酸(3.3mg，20μmol)、PyBOP(10.4mg，20μmol)和DIEA(50μL，300μmol)，室溫振搖反應(yīng)2h，用半制備型HPLC純化：10％乙腈-H2O(含1％的TFA)等梯度洗脫5min，10％至100％的乙腈-H2O(含1％的TFA)梯度洗脫25min，保留時(shí)間TR＝18.0min，收集產(chǎn)物，冷凍干燥，得到淡黃色產(chǎn)物化合物4；其HRMS如圖6所示。HRMS(ESI)m/z:理論計(jì)算值C94H106N28O14[M+2H]2+925.4216,實(shí)測925.4209。實(shí)施例5化合物5的制備按實(shí)施例1同樣的步驟制得式(5)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽，并采用實(shí)施例1中的步驟(b)脫除式(5)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽中的Fmoc保護(hù)基；將實(shí)施例2中的赫斯特酸衍生物Ht-1(539mg，1.056mmol)和PyBOP(550mg，1.056mmol)溶于3mL無水DMF，加入DIEA(350μL，2.112mmol)，反應(yīng)5min，將該反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到脫除Fmoc的式(5)所示的負(fù)載在苯肼樹脂上的肽中，N2鼓泡混勻，縮合反應(yīng)1h，抽除反應(yīng)液，用DMF(4×3mL)洗滌樹脂；將樹脂取出，加入1mLDMF、200μLN,N-雙(3-氨丙基)甲胺及10mgCu(OAc)2，室溫振搖反應(yīng)12h，將樹脂濾除，并用20mLCH2Cl2洗滌樹脂；將有機(jī)相濃縮，殘留物用半制備型HPLC純化：10％乙腈—H2O(含1％的TFA)等梯度洗脫5min，10％至100％的乙腈—H2O(含1％的TFA)梯度洗脫25min，保留時(shí)間TR＝17min，收集產(chǎn)物，冷凍干燥，得固體，備用；將3.4mg上述所得固體(2μmol)溶于0.5mL無水DMF，加入實(shí)施例3中的赫斯特酸衍生物Ht-2(2.7mg，6μmol)、PyBOP(3.1mg，6μmol)和DIEA(5μL，30μmol)，室溫振搖反應(yīng)2h，用半制備型HPLC純化：10％乙腈-H2O(含1％的TFA)等梯度洗脫5min，10％至100％的乙腈-H2O(含1％的TFA)梯度洗脫25min，保留時(shí)間TR＝18.5min，收集產(chǎn)物，冷凍干燥，得到淡黃色產(chǎn)物化合物5；其HRMS如圖7所示。HRMS(ESI)m/z:理論計(jì)算值C112H124N34O12[M+2H]2+1068.5064,實(shí)測1068.5052。實(shí)施例6化合物2穿透細(xì)胞膜與核膜的實(shí)驗(yàn)取處于對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞,按每孔1mL(含5萬個(gè)細(xì)胞)接種于12孔板中，置于37度，5％二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；吸除原培養(yǎng)基，分別加入含有不同濃度化合物2的DMEM高糖培養(yǎng)基中，使每孔的藥物濃度分別為0μM、2μM、10μM、50μM；將細(xì)胞重新放入培養(yǎng)箱中孵育24-72小時(shí)，熒光顯微鏡下觀察藥物在細(xì)胞中的定位，所得結(jié)果如圖8所示，從圖8中可以看出10μM濃度化合物2處理Hela細(xì)胞24和48小時(shí)后,能夠有效到達(dá)細(xì)胞。實(shí)施例7化合物2抑制Hela細(xì)胞PLK1蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)取處于對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，按每孔1mL(含5萬個(gè)細(xì)胞)接種于12孔板中，置于37度，5％二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；吸除原培養(yǎng)基，分別加入含有不同濃度化合物2的DMEM高糖培養(yǎng)基中，使每孔的藥物濃度分別為0μM、2μM、10μM、50μM；將細(xì)胞重新放入培養(yǎng)箱中孵育72小時(shí)；吸除培養(yǎng)基，用0.25％胰蛋 白酶室溫消化1min，用新鮮DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，3000rpm離心3分鐘，收集細(xì)胞，用冰冷的PBS清洗兩次。去除PBS，5000rpm離心3分鐘，加RIPA裂解液，冰上孵育2小時(shí)，4度13000rpm離心15min，收集上清液，利用比如braford法測量蛋白濃度，加相應(yīng)裂解液，使各組蛋白濃度一致。配置10％的SDS-PAGE蛋白分離膠和5％的SDS-PAGE蛋白濃縮膠；取50μg總蛋白80v電壓跑膠分離樣品，200mA恒流轉(zhuǎn)膜2h。將膜浸泡于5％脫脂牛奶封閉液，室溫封閉1小時(shí)。加一抗PLK1(稀釋比1：3000)和GAPDH(1：20000)，4度慢搖過夜。用PBST清洗3次，加HRP標(biāo)記的二抗(稀釋比1：3000)，室溫1小時(shí)孵育；然后在暗室進(jìn)行顯色曝光；所得結(jié)果如圖9所示，從圖9中可以看出化合物2能夠有效地抑制Plk1的表達(dá)，且抑制效率與藥物濃度呈正相關(guān)，并且以肌動(dòng)蛋白作為Western印跡實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)參，以證明不同樣品中的蛋白檢測時(shí)上樣量相同。實(shí)施例8化合物2抑制Hela細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)取處于對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，按每孔1mL(含10萬個(gè)細(xì)胞)接種于6孔板中，置于37℃，5％二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；吸除原培養(yǎng)基，分別加入含有不同濃度化合物2的DMEM高糖培養(yǎng)基中，使每孔的藥物濃度分別為0μM、2μM、10μM、50μM；將細(xì)胞重新放入培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)或72小時(shí)，然后統(tǒng)計(jì)最終的細(xì)胞數(shù)量，所得結(jié)果如圖10所示，從圖10中可以看出隨著藥物濃度的升高和作用時(shí)間的延長，Hela細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，說明藥物能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖作用。實(shí)施例9化合物2抑制非小細(xì)胞肺癌腫瘤細(xì)胞在荷瘤小鼠中的增殖實(shí)驗(yàn)將人A549細(xì)胞接種在10mm塑料培養(yǎng)皿中，完全培養(yǎng)基使用DMEM高糖，其含10％FBS和10％雙抗(氯霉素/鏈霉素)；待A549細(xì)胞生長密度達(dá)到90％左右，吸除培養(yǎng)基，用0.25％胰蛋白酶(trypsin)于37℃消化1分鐘；每個(gè)10mm培養(yǎng)皿加入完全培養(yǎng)基4mL，終止胰蛋白酶活性；輕輕吹打，將貼壁細(xì)胞全部吹散為懸浮細(xì)胞；在離心機(jī)中，用1000rpm的速度離心3分鐘，去除上清液，用PBS重懸A549細(xì)胞；用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞濃度，加適量PBS，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1.0×107個(gè)/ml取1mL注射管，吸取1mLA549細(xì)胞懸浮液，在每只裸鼠的右側(cè)腋下接種200萬細(xì)胞，即200μl細(xì)胞懸浮液；接種完A549細(xì)胞后，將裸鼠放回飼養(yǎng)籠。待腫瘤大 小長到約200mm3，邊長5～8mm時(shí)，開始進(jìn)行給藥。給藥1組：給藥劑量和頻率示意圖如圖11所示；藥物的劑量為1mg/Kg體重，換算后化合物2的給藥濃度約為20μmol/只小鼠；將化合物2溶解在生理鹽水中(0.9％NaCl)。從第一次給藥起，每三天給一次藥，一共持續(xù)7次，第21天不給藥，處死小鼠后收集腫瘤樣本；給藥2組：其給藥劑量與給藥頻率與給藥1組相同，其目的在于重復(fù)和確認(rèn)給藥1組的可靠性；對照組：對照組小鼠只給予生理鹽水；每三天在給藥前，稱量并記錄小鼠體重和腫瘤的長寬。腫瘤體積的計(jì)算公式為V＝0.5×長×寬×寬；給藥后的第21天，處死裸鼠，收集腫瘤樣本；化合物2對腫瘤增殖的抑制效果如圖12～14所示，從圖13～14中可以看出，與對照組相比，給藥組裸鼠體內(nèi)接種的人A549肺癌細(xì)胞移植瘤體積和重量都顯著降低，說明以圖11方式進(jìn)行間隔連續(xù)給藥后，能明顯抑制腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的增殖。實(shí)施例10采用SPR(surfaceplasmonresonanceanalysisusingaProteonXPR36(Bio-Rad,California,USA))對化合物1～5與PLK1基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)域DNA序列結(jié)合位置以及強(qiáng)度進(jìn)行測定，其中，所述PLK1基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)域具有如下DNA序列：gggcgctcccatggtgccgcgcggcgGGCGGGtttggattttaaatccccgcggCCAATCAGtggcgcgcaggcttttgtaacgttcccagcGCCGCGtttgaattcggggaggagcgGAGCGGTGCGGAGGCtctgctcggatcgaggtctgcagcgcagcttcgggagcATGAGTGCTGCAGTGACTGCAG測試結(jié)果表明化合物1-5均能與上述DNA序列中灰色部分發(fā)生特異性結(jié)合，并且化合物2～5與該DNA序列的結(jié)合強(qiáng)度結(jié)果如表1所示：化合物化合物2化合物3化合物4化合物5KD(M)2.04×10-92.24×10-94.57×10-91.44×10-8從上表中可以看出化合物2～5與靶標(biāo)DNA的結(jié)合非常強(qiáng)，親和力達(dá)到納摩爾水平，特別是化合物2～4，其中化合物2的與靶標(biāo)DNA的結(jié)合力最強(qiáng)，KD值達(dá)到2.04×10-9。當(dāng)前第1頁1 2 3