本發(fā)明涉及生物制藥和生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇的方法。

背景技術(shù)：

替卡格雷(Ticagrelor)是由美國(guó)阿斯利康(AstraZeneca)公司研發(fā)的一種新型小分子抗凝血藥物。該藥對(duì)ADP引起的血小板聚集有明顯的抑制作用，且口服使用后起效迅速，因此能有效改善急性冠心病患者的癥狀。在多條替卡格雷的合成路線(xiàn)中(WO2008018822，WO2013150495)，手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇(3)都是關(guān)鍵中間體。例如，其中一條的合成路線(xiàn)如下(中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2014,45.4：315-321):

現(xiàn)有技術(shù)中，手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇[(S)-3]由2-氯-3,4-二氟苯乙酮進(jìn)行化學(xué)不對(duì)稱(chēng)還原合成，該方法常受到產(chǎn)物光學(xué)純度不夠高、得率低、催化劑制備復(fù)雜、成本高和易燃等因素的限制，從而不利于實(shí)際的生產(chǎn)利用。

利用生物催化實(shí)現(xiàn)還原反應(yīng)生產(chǎn)手性仲醇是一種高效的綠色催化技術(shù)。通過(guò)文獻(xiàn)檢索，沒(méi)有生物酶催化該還原反應(yīng)的實(shí)例。因此，通過(guò)廣泛篩選，獲得能高效催化目標(biāo)反應(yīng)的酮還原酶，并據(jù)此建立產(chǎn)率高且操作簡(jiǎn)單的手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇的綠色生產(chǎn)工藝，將具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種制備手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇的方法，與現(xiàn)有化學(xué)合成工藝相比，該方法的產(chǎn)物得率高、光學(xué)選擇性好且環(huán)境友好。

一種制備手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇的方法，以2-氯-3,4-二氟苯乙酮為底物，利用酮還原酶(KRED)催化還原底物，生成手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇，所述酮還原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～21所示。

反應(yīng)的合成路線(xiàn)為：

上述酮還原酶的氨基酸序列均可通過(guò)商業(yè)化的全基因合成制得。

所獲得的產(chǎn)物2-氯-3,4-二氟苯乙醇均具有手性。所述酮還原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.14、17、18、19、20所示時(shí)，酮還原酶催化還原底物生成的2-氯-3,4-二氟苯乙醇主要為R型。

所述酮還原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～13、15、16、21所示時(shí)，酮還原酶催化還原底物生成的2-氯-3,4-二氟苯乙醇主要為S型。

所述酮還原酶可采用本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)手段進(jìn)行制備，具體為：將含酮還原酶基因的基因片段與pET28a質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)的大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中，獲得轉(zhuǎn)化的重組子；將重組子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，細(xì)胞破碎，離心獲得酮還原酶，經(jīng)凍干后，獲得酮還原酶酶粉。

現(xiàn)有技術(shù)中，手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇采用化學(xué)合成法制備獲得，未有生物催化制備的相關(guān)報(bào)道，而本發(fā)明發(fā)現(xiàn)上述序列的酮還原酶可以催化2-氯-3,4-二氟苯乙酮還原成手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇。優(yōu)選地，所述酮還原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.9、10、11、12、13、15、16、21所示；含上述氨基酸序列的酮還原酶催化制備S-2-氯-3,4-二氟苯乙醇的得率和手性純度更高。

優(yōu)選地，反應(yīng)起始時(shí)的反應(yīng)體系中，底物的質(zhì)量百分濃度為1％～25％(w/v)，更優(yōu)選，1～20％；所述酮還原酶的用量為底物質(zhì)量的1％～30％，更優(yōu)選，5～20％。

作為優(yōu)選，所述反應(yīng)的溫度為10～45℃，更優(yōu)選，20～30℃；所述反應(yīng)的時(shí)間為20～25h。

作為優(yōu)選，反應(yīng)液的pH值為6.0～10.0；更優(yōu)選，pH值為7.0～8.0。

上述反應(yīng)體系還包括輔因子及其再生體系；所述的輔因子為NAD⁺/NADH或NADP⁺/NADPH；而輔因子的再生體系則是指能夠?qū)⒀趸洼o因子NAD⁺/NADP⁺轉(zhuǎn)換成還原型輔因子NADH/NADPH的過(guò)程。

優(yōu)選地，所述輔因子用量為底物質(zhì)量的0.02％～2％。

上述反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液需經(jīng)后處理才能獲得成品，所述后處理為：向反應(yīng)液中加入硅藻土，過(guò)濾，采用正己烷萃取濾液，獲得的有機(jī)相經(jīng)洗滌、濃縮后，獲得成品手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明以2-氯-3,4-二氟苯乙酮為底物，采用特定的酮還原酶進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)，獲得得率高、手性純度高的2-氯-3,4-二氟苯乙醇，反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)便，避免了目前純粹的化學(xué)合成方法存在的反應(yīng)條件苛刻、催化劑制備復(fù)雜、成本高、易燃和產(chǎn)物手性純度不夠高等問(wèn)題，具有良好的實(shí)際工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中反應(yīng)0h后取樣所得的樣品的HPLC圖譜。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中反應(yīng)20h后取樣所得的樣品的HPLC圖譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1酮還原酶(KRED)酶粉的搖瓶生產(chǎn)工藝

將含有酮還原酶基因(SEQ ID NO.1至23)的基因片段(由上海捷瑞生物工程有限公司合成)，與pET28a質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.coli BL21(DE3)菌株，篩選得到陽(yáng)性克隆子，接種到4mL含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基活化過(guò)夜(37℃，200rpm)。

取過(guò)夜的培養(yǎng)物，以1/100的接種量轉(zhuǎn)接到100mL含氨芐青霉素抗體的液體LB培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀值達(dá)到0.6，加入IPTG，于30℃下繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜。離心收集細(xì)胞，用10mL磷酸緩沖液(2mM，pH7.0)懸浮細(xì)胞。細(xì)胞懸浮液置于冰浴中超聲波破碎10分鐘，離心，上清液預(yù)凍過(guò)夜，凍干36h，即得凍干粉狀的酮還原酶(KRED)酶粉。

實(shí)施例2酮還原酶(SEQ ID NO.1～21)毫克級(jí)反應(yīng)

在5mL反應(yīng)瓶中，加入10mg的底物2-氯-3,4-二氟苯乙酮和0.1mL異丙醇，待底物完全溶解后，加入1.2ml TEA-HCl緩沖液(0.1M，pH7.0)、0.1mgNAD⁺、0.1mgNADP⁺(溶于0.1ml緩沖液)，再加入20mg葡萄糖以及2mg葡萄糖脫氫酶，最后，分別加入2mg實(shí)施例1中獲得的酮還原酶KRED酶粉(0.5U/mg，溶于0.1ml緩沖液)，在30℃下?lián)u床反應(yīng)20h。

取反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析，檢測(cè)產(chǎn)物的產(chǎn)率和產(chǎn)物ee值，結(jié)果如表1所示：

表1 不同酮還原酶反應(yīng)的產(chǎn)率和產(chǎn)物ee值

產(chǎn)率標(biāo)記說(shuō)明：+代表產(chǎn)率1％-20％，++代表產(chǎn)率20％-50％，+++代表產(chǎn)率50％-80％，++++代表產(chǎn)率80％-95％，+++++代表產(chǎn)率>95％；

ee值標(biāo)記說(shuō)明：ee值指產(chǎn)物2-氯-3,4-二氟苯乙醇的對(duì)映體過(guò)量(enantiomeric excess)，計(jì)算公式如下：ee_S＝(C_S-3-C_R-3)/(C_S-3+C_R-3)*100％或者ee_R＝(C_S-3-C_R-3)/(C_S-3+C_R-3)*100％；

C_S-3指樣品中S-2-氯-3,4-二氟苯乙醇的濃度，C_R-3指樣品中R-2-氯-3,4-二氟苯乙醇的濃度。

+代表ee值<50％，++代表ee值50％-80％，+++代表ee值80％-90％，++++代表ee值90％-99％，+++++代表ee值>99％。

實(shí)施例3百毫克級(jí)制備工藝

在5ml反應(yīng)瓶中，加入150mg的底物2-氯-3,4-二氟苯乙酮和0.3ml異丙醇，待底物完全溶解后，加入1.2ml TEA-HCl緩沖液(0.1M，pH7.0)、7.5mg酮還原酶粉(SEQ ID NO.9)(溶于0.1ml緩沖液)、0.75mgNAD⁺(溶于0.1ml緩沖液)，在30℃下，進(jìn)行磁力攪拌反應(yīng)，設(shè)置兩個(gè)反應(yīng)時(shí)間：0h和20h。

反應(yīng)后取樣對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果如圖1和圖2所示；

圖1為反應(yīng)0小時(shí)后獲得的產(chǎn)物的分析結(jié)果，圖中7.67分鐘的物質(zhì)為底物；

圖2為反應(yīng)20小時(shí)后獲得的產(chǎn)物的分析結(jié)果，圖中，保留時(shí)間為6.47分鐘的物質(zhì)為產(chǎn)物，最終轉(zhuǎn)化率>99.5％。

實(shí)施例4不同溫度和pH下反應(yīng)

在5ml反應(yīng)瓶中，加入150mg的底物2-氯-3,4-二氟苯乙酮和0.3ml異丙醇，待底物完全溶解后，分別加入1.2ml 0.1M不同pH(6.0～10.0)的TEA-HCl緩沖液、7.5mg酮還原酶粉(SEQ ID NO.9)(溶于0.1ml緩沖液)、0.75mgNAD⁺(溶于0.1ml緩沖液)，在不同溫度(10～45℃)，磁力攪拌下，進(jìn)行反應(yīng)20h。反應(yīng)后取樣對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析。各組產(chǎn)率結(jié)果如下表：

表2 不同溫度和pH下反應(yīng)的產(chǎn)率

從上表可以看出：反應(yīng)體系的溫度為10～45℃，優(yōu)選20～30℃。反應(yīng)液的pH值為6.0～10.0，優(yōu)選pH值為7.0～8.0。

實(shí)施例5不同酶量和輔酶量下反應(yīng)

在5ml反應(yīng)瓶中，加入150mg的底物2-氯-3,4-二氟苯乙酮和0.3ml異丙醇，待底物完全溶解后，加入1.2ml 0.1M pH7.0的TEA-HCl緩沖液、分別加入不同量的(底物量的1～30％)酮還原酶粉(SEQ ID NO.9)(溶于0.1ml緩沖液)、分別加入不同量的(底物量的0.02％～2％)NAD⁺(溶于0.1ml緩沖液)，在30℃，磁力攪拌下，進(jìn)行反應(yīng)20h。反應(yīng)后取樣對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析。各組產(chǎn)率結(jié)果如下表：

表3 不同酶量和輔酶量下反應(yīng)產(chǎn)率

從上表可以看出：反應(yīng)體系中，酮還原酶的用量為底物質(zhì)量的1％～30％，優(yōu)選5～20％。輔因子用量為底物質(zhì)量的0.02％～2％。

實(shí)施例6不同底物濃度反應(yīng)

在5ml反應(yīng)瓶中，分別加入(15～375mg)的底物2-氯-3,4-二氟苯乙酮和0.3ml異丙醇，待底物完全溶解后，加入1.2ml 0.1M pH7.0的TEA-HCl緩沖液、按底物量的5％加入不同量的酮還原酶粉(SEQ ID NO.9)(溶于0.1ml緩沖液)、0.75mgNAD⁺(溶于0.1ml緩沖液)，在30℃，磁力攪拌下，進(jìn)行反應(yīng)20h。反應(yīng)后取樣對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析。各組產(chǎn)率結(jié)果如下表：

表4 不底物濃度下反應(yīng)產(chǎn)率

從上表可以看出：反應(yīng)體系中，底物的質(zhì)量百分濃度為1％～25％(w/v)，優(yōu)選1～20％。

實(shí)施例7百克級(jí)制備工藝

將450g的底物2-氯-3,4-二氟苯乙酮加至20L反應(yīng)釜中，加入1.5L異丙醇，攪拌至完全溶解；加入8.5L Tris-HCl緩沖液(0.1M,pH7.0)，于30℃下攪拌(450rpm)均勻；然后依次加入22.5g酮還原酶粉(SEQ ID NO.9)、2.25g NAD⁺后，進(jìn)行反應(yīng)。HPLC監(jiān)控，反應(yīng)24h后，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率為99.3％，終止反應(yīng)。

向反應(yīng)液中加入50g硅藻土攪拌0.5h，過(guò)濾，濾液用正己烷萃取(3.0L×2)，濾餅返回反應(yīng)釜，加入正己烷攪拌過(guò)濾，合并有機(jī)相；有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌兩次，濃縮后得到0.37kg的2-氯-3,4-二氟苯乙醇，收率81.4％，GC純度98.7％，ee_S值99.5％。

實(shí)施例8公斤級(jí)制備工藝

將1.35kg的底物2-氯-3,4-二氟苯乙酮加至20L反應(yīng)釜中，加入3L異丙醇，攪拌至完全溶解；加入7.0L Tris-HC緩沖液(0.1M,pH7.0)，于30℃下攪拌(450rpm)均勻；然后依次加入67.5g酮還原酶粉(SEQ ID NO.9)與6.75g NAD⁺后，進(jìn)行反應(yīng)。HPLC監(jiān)控，反應(yīng)24h后，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率為99.2％，終止反應(yīng)。

向反應(yīng)液中加入150g硅藻土攪拌0.5h，過(guò)濾，濾液用正己烷萃取(9.0L×2)，濾餅返回反應(yīng)釜，加入正己烷攪拌過(guò)濾，合并有機(jī)相；有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌兩次，濃縮后得到1.09kg2-氯-3,4-二氟苯乙醇，收率80.1％，GC純度99.2％，ee_S值99.5％。

對(duì)比例1

在5mL反應(yīng)瓶中，加入10mg的底物2-氯-3,4-二氟苯乙酮和0.1mL異丙醇，待底物完全溶解后，加入1.2ml TEA-HCl緩沖液(0.1M，pH7.0)、0.1mgNAD⁺、0.1mgNADP⁺(溶于0.1ml緩沖液)，最后，分別加入2mg酮還原酶KRED酶粉(SEQ ID NO.22，溶于0.1ml緩沖液)，在30℃下?lián)u床反應(yīng)20h。

取反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析，檢測(cè)產(chǎn)物的產(chǎn)率和產(chǎn)物ee值，結(jié)果沒(méi)有2-氯-3,4-二氟苯乙醇產(chǎn)生。

對(duì)比例2

在5mL反應(yīng)瓶中，加入10mg的底物2-氯-3,4-二氟苯乙酮和0.1mL異丙醇，待底物完全溶解后，加入1.2ml TEA-HCl緩沖液(0.1M，pH7.0)、0.1mgNAD⁺、0.1mgNADP⁺(溶于0.1ml緩沖液)，最后，分別加入2mg酮還原酶KRED酶粉(SEQ ID NO.23，溶于0.1ml緩沖液)，在30℃下?lián)u床反應(yīng)20h。

取反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析，檢測(cè)產(chǎn)物的產(chǎn)率和產(chǎn)物ee值，結(jié)果沒(méi)有2-氯-3,4-二氟苯乙醇產(chǎn)生。

上述實(shí)施例只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。