本發(fā)明與蜂膠活性成分純化的技術(shù)有關(guān)，更詳而言之是指一種可大量制備、分離與純化蜂膠中蒿素C(artepillin C)活性成分的方法。

背景技術(shù)：

蜂膠在民間醫(yī)藥利用有悠久的歷史，其具有各種生理活性，如抗癌活性、抗氧化活性、抗炎活性、抗菌活性等。具有生物活性的化合物包括肉桂酸衍生物、黃酮類、酯類、芳香醛和醇和萜類化合物等，類黃酮、芳香羧酸和酚的衍生物被認(rèn)為抗菌和抗氧化性質(zhì)的治療效果的主要成分。其中，巴西蜂膠包含有3-[4-羥基-3,5-二(3-甲基-2-丁烯基)苯基]-2-丙烯酸，別名蒿素C(artepillin C)，因蜜蜂從巴西樹種(Baccharisdracunculifolia)搜集材料，含有大量的抗氧化蒿素C(artepillin C)成分。

已知萃取與純化蜂膠中類黃酮類與蒿素C(artepillin C)活性成分的方法，如歐洲專利EP0976399B1，將浸泡粉碎蜂膠塊的乙醇，甘油和/或水的步驟中得到可用的蜂膠萃取物，再用陰離子交換樹脂處理萃取物中的類黃酮類與蒿素C(artepillin C)成分。此方法的有機(jī)溶劑處理去除蜂膠中蠟質(zhì)成分的過程，會(huì)造成蒿素C(artepillin C)與類黃酮成分的嚴(yán)重?fù)p失，且有機(jī)溶劑容易造成殘留毒害與安全性疑慮。

其次，歐洲申請專利WO 2005094853 A1，選擇不含有醇的甘油三酯或脂肪酸萃取蜂膠中有效蒿素C(artepillin C)成分的溶劑。中國申請專利CN1879656A，則添加界面活性劑如環(huán)狀糊精，增加對蜂膠的有效成分的水溶性作用。中國申請專利CN1108057A，將蜂膠置于甘油中浸泡、加熱、攪拌并進(jìn)行熱過濾，制備出一種水溶性蜂膠。前述專利的方法并無法去除蜂膠中蠟質(zhì)成分，且助溶劑會(huì)大大地降低蜂膠中蒿素C(artepillin C)與類黃酮成分純度，無法有效發(fā)揮蜂膠的機(jī)能功效。

再者，如中國專利CN101244086B所示，其提出利用超臨界二氧化碳萃取蜂膠的方法，將細(xì)河沙與蜂膠的重量比例為5.3：1，萃取溫度為55℃、壓力為30MPa、萃取時(shí)間為2-4小時(shí)。中國專利CN101099547B，則提出利用水萃取蜂膠中具有生物活性的水溶性蜂膠萃取物。此兩篇專利方法，并無法完全萃取出蜂膠中蒿素C(artepillin C)與類黃酮成分。

由上可知，已知蜂膠活性成分萃取與純化的方法，不是制作過程較為繁雜、純度不足，即是耗時(shí)或需使用大量的有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑在制作過程中可能會(huì)與機(jī)能成分產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，完成后溶劑去除與濃縮過程中，加熱蒸發(fā)溶劑也易造成機(jī)能成分被破壞與溶劑殘留的問題，顯然仍需改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的即在提供一種制備、分離與純化蜂膠中蒿素C(artepillin C)活性成分的方法，其可大量分離與純化蜂膠中蒿素C(artepillin C)的活性成分，且能保持蒿素C(artepillin C)活性成分的生物活性，不需經(jīng)繁復(fù)的溶劑去除與濃縮、分離程序，且無溶劑殘留等安全疑慮，制作成本低，甚為環(huán)保、安全，甚具實(shí)用價(jià)值。

緣是，為達(dá)成前述的目的，本發(fā)明提供一種制備、分離與純化蜂膠中蒿素C(artepillin C)活性成分的方法，其步驟至少包含有：萃?。簩⒎淠z與預(yù)定比例的乙醇混合，再以離心方式去除蜂膠乙醇混合液中的雜質(zhì)，以獲得蜂膠乙醇萃取液；除蠟：在預(yù)定溫度與壓力的超臨界流體操作條件下，將超臨界二氧化碳流體與蜂膠乙醇萃取液通入一層析管柱進(jìn)行分離，使蜂膠乙醇萃取液在該層析管柱中分離出蠟質(zhì)與蒿素C(artepillin C)、類黃酮成分，并自該層析管柱的底部去除蜂膠的蠟質(zhì)成分，自該層析管柱的頂部取出蒿素C(artepillin C)與類黃酮成分；分離蒿素C(artepillin C)與類黃酮成分：在預(yù)定溫度與壓力的超臨界流體操作條件下，將超臨界二氧化碳流體與前述蜂膠中蒿素C(artepillin C)、類黃酮成分通入一吸附管柱內(nèi)進(jìn)行分離，使蒿素C(artepillin C)成分被該吸附管柱吸附，而在該吸附管柱的底部收集類黃酮成分；靜置：將該吸附管柱靜置預(yù)定時(shí)間；及純化蒿素C(artepillin C)成分：在預(yù)定溫度與壓力的操作條件下，將乙醇通入該吸附管柱進(jìn)行純化，用以在該吸附管柱的底部脫附被吸附的蒿素C(artepillin C)成分，在該吸附管柱的頂部收集被純化的蒿素C(artepillin C)成分。

更進(jìn)一步地，萃取的步驟中，蜂膠乙醇萃取液以1:5-10(W/V)的比例將蜂膠與乙醇混合離心去除雜質(zhì)而成。

更進(jìn)一步地，備取1-2Kg的蜂膠，以1:5-10(W/V)的比例與乙醇混合產(chǎn)生10-20L蜂膠乙醇混合液。

更進(jìn)一步地，除蠟的步驟中，在操作壓力3000-4000psi、溫度40-60℃、超臨界二氧化碳流速6-9L/hr與蜂膠乙醇萃取液流速1-3L/hr的操作條件下，將超臨界二氧化碳流體與蜂膠乙醇萃取液通入所述層析管柱內(nèi)，在所述層析管柱底部去除蜂膠蠟質(zhì)成分。

更進(jìn)一步地，所述層析管柱內(nèi)為內(nèi)徑36mm、高度1000mm的不銹鋼槽體，其內(nèi)充填有不銹鋼單體片，所述單體片為Pro-Pak protruded metal、saddles、rings、structured packing或knitted packing金屬。

更進(jìn)一步地，分離蒿素C與類黃酮成分的步驟中，在操作壓力2000-3000psi、溫度40-60℃、超臨界二氧化碳流速6-9L/hr的操作條件下，通入所述吸附管柱內(nèi)進(jìn)行分離。

更進(jìn)一步地，所述吸附管柱內(nèi)為內(nèi)徑36mm、高度1000mm的不銹鋼槽體，其內(nèi)充填有吸附劑，所述吸附劑為硅膠Silica gel、Sephadex或Resin這些可吸附蒿素C成分的材料。

更進(jìn)一步地，靜置的步驟中，將所述吸附管柱靜置1-2小時(shí)。

更進(jìn)一步地，純化蒿素C成分的步驟中，在操作壓力2000-3000psi、溫度40-60℃、40-60％乙醇流速1-3L/hr的操作條件下，將乙醇通入所述吸附管柱進(jìn)行純化。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明提供一種制備、分離與純化蜂膠中蒿素C(artepillin C)活性成分的方法，其利用超臨界二氧化碳當(dāng)為溶劑，并配合層析與吸附技術(shù)，可大量分離與純化蜂膠中蒿素C(artepillin C)的活性成分，且能保持蒿素C(artepillin C)活性成分的生物活性，不需經(jīng)繁復(fù)的溶劑去除與濃縮、分離程序，且無溶劑殘留等安全疑慮，制作成本低，甚為環(huán)保、安全，具實(shí)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明一較佳實(shí)施例的流程圖。

圖2為已知蜂膠萃取蒿素C(artepillin C)、類黃酮與蠟的感官評價(jià)比較分析圖。

圖3為本發(fā)明一較佳實(shí)施例與已知蜂膠萃取方法的蒿素C(artepillin C)、類黃酮與蠟的感官評價(jià)比較分析圖。

圖4為本發(fā)明一較佳實(shí)施例的HPLC圖譜圖。

具體實(shí)施方式

以下，茲舉本發(fā)明一較佳實(shí)施例，并配合附圖做進(jìn)一步的詳細(xì)說明如后，其中：

首先，請參閱圖1所示，本發(fā)明一較佳實(shí)施例的制備、分離與純化蜂膠中蒿素C(artepillin C)活性成分的方法100，可大量分離、純化以取得蜂膠中蒿素C(artepillin C)的活性成分，不但制作成本低，且能保持蒿素C(artepillin C)成分 的生物活性，其第一步驟為萃取110：將1-2Kg(本實(shí)施例為2Kg)的蜂膠，以1:5-10(W/V)(本實(shí)施例為1：10W/V)的比例與乙醇(共溶劑)混合產(chǎn)生10-20L(本實(shí)施例為20L)的蜂膠乙醇混合液，再以離心方式去除蜂膠乙醇混合液中的雜質(zhì)，以獲得蜂膠乙醇萃取液。

本發(fā)明的第二步驟為除蠟120：在操作壓力3000-4000psi(本實(shí)施例為4000psi)、溫度40-60℃(本實(shí)施例為60℃)、超臨界二氧化碳流速6-9L/hr(本實(shí)施例為9L/hr)與蜂膠乙醇萃取液流速1-3L/hr(本實(shí)施例為3L/hr)的操作條件下，將超臨界二氧化碳流體與蜂膠乙醇萃取液通入一層析管柱進(jìn)行分離，使蜂膠乙醇萃取液可在該層析管柱中分離出蠟質(zhì)與蒿素C(artepillin C)、類黃酮成分，并自該層析管柱的底部去除蜂膠的蠟質(zhì)成分，自該層析管柱的頂部取出蒿素C(artepillin C)與類黃酮成分。

該層析管柱內(nèi)為內(nèi)徑36mm、高度1000mm的不銹鋼槽體，其內(nèi)充填有不銹鋼單體片，該單體片為Pro-Pak protruded metal、saddles、rings、structured packing或knitted packing等金屬。

本發(fā)明的第三步驟為分離蒿素C(artepillin C)與類黃酮成分130：在操作壓力2000-3000psi(本實(shí)施例為3000psi)、溫度40-60℃(本實(shí)施例為60℃)、超臨界二氧化碳流速6-9L/hr(本實(shí)施例為9L/hr)的操作條件下，將超臨界二氧化碳流體與前述蜂膠中蒿素C(artepillin C)、類黃酮成分通入一吸附管柱內(nèi)進(jìn)行分離，使蒿素C(artepillin C)成分被該吸附管柱吸附，而在該吸附管柱的底部收集類黃酮成分。

該吸附管柱內(nèi)為內(nèi)徑36mm、高度1000mm的不銹鋼槽體，其內(nèi)充填有吸附劑，該吸附劑為硅膠(Silica gel)、聚酰胺(Sephadex)或Resin(樹脂)等可吸附蒿素C(artepillin C)成分的材料。

本發(fā)明的第四步驟為靜置140：將該吸附管柱靜置1-2小時(shí)。

本發(fā)明的最后步驟為純化蒿素C(artepillin C)成分150：在操作壓力2000-3000psi(本實(shí)施例為3000psi)、溫度40-60℃(本實(shí)施例為60℃)、40-60％(本實(shí)施例為60％)乙醇流速1-3L/hr(本實(shí)施例為3L/hr)的操作條件下，將乙醇通入該吸附管柱進(jìn)行純化，用以在該吸附管柱的底部脫附被吸附的蒿素C(artepillin C)成分，在該吸附管柱的頂部收集被純化的蒿素C(artepillin C)成分。

以下，茲將本發(fā)明與已知蜂膠萃取方法進(jìn)行比較，以突顯本發(fā)明的特色與功效：

【一】首先，將已知乙醇萃取蜂膠法、超臨界二氧化碳萃取法與超臨界二 氧化碳配合共溶劑乙醇萃取法，比較三種萃取方式所獲得的蜂膠中蒿素C(artepillin C)、類黃酮與蠟質(zhì)成分，及將不同萃取方法獲得的蜂膠萃取物以1cc滴入100cc水中，觀察其顏色、味道與口感接受度。

如圖2所示，蜂膠中蒿素C(artepillin C)、類黃酮與蠟質(zhì)成分的接受度，以0至10分顯示，10分代表萃取物或純化物中的蒿素C(artepillin C)、類黃酮與蠟質(zhì)成分的含量最高，0分代表萃取物或純化物中的蒿素C(artepillin C)、類黃酮與蠟質(zhì)成分的含量最低。

其中，蒿素C(artepillin C)成分含量的分析方法，依照利用C18層析管柱，以HPLC定量分析儀器，比對標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量樣品在波長320nm的吸光值，換算出蜂膠樣品中的蒿素C(artepillin C)濃度。類黃酮成分含量的分析方法，依照以槲皮酮為標(biāo)準(zhǔn)品，定量樣品在波長415nm的吸光值，換算出蜂膠樣品中的類黃酮濃度。蠟質(zhì)成分含量的分析方法，依照將1cc蜂膠萃取物或純化物滴入100cc水中，取懸浮水層上的不溶解物的干物重量，換算出蜂膠樣品中的蠟質(zhì)濃度。顏色、味道與口感品評方法，依照將1cc蜂膠萃取物或純化物滴入100cc水中，如以0分計(jì)算時(shí)顯示其顏色呈現(xiàn)大量混濁、味道刺激與口感不佳，10分即表示其顏色、味道與口感接受度高。

如圖2所示，利用已知乙醇萃取法(如圖中乙醇曲線顯示)，乙醇對蜂膠中蒿素C(artepillin C)、類黃酮與蠟質(zhì)成分的溶解度大，可以完全萃取蜂膠中的機(jī)能成分，但是其缺點(diǎn)即是將萃取物用水稀釋或添加于液體應(yīng)用，蜂膠中這些長鏈的非極性C24-C34的hydrocarbon、esters、acids混合物組合的蠟質(zhì)成分，在液體中會(huì)形成大量樹酯狀的結(jié)晶，造成外觀混濁狀，且強(qiáng)烈抑制蜂膠中機(jī)能成分的吸收與利用。蜂膠乙醇萃取液具有辛辣的刺激味，滴于水中溶解后蠟質(zhì)與油脂會(huì)析出并附著在容器上等缺點(diǎn)。

利用已知超臨界二氧化碳萃取法(如圖中超臨界流體曲線顯示)，只能得到蜂膠中的脂溶性有效成分，無法萃取出蜂膠中蒿素C(artepillin C)與類黃酮成分。

而利用超臨界二氧化碳配合共溶劑乙醇萃取法(如圖中超臨界+乙醇曲線顯示)，優(yōu)點(diǎn)是高壓可快速萃取蜂膠中蒿素C(artepillin C)、類黃酮等有效成分，但缺點(diǎn)是產(chǎn)量較低，無法避免蜂膠中的蠟質(zhì)與油脂成分一并被萃取出來。

從經(jīng)濟(jì)上說，以乙醇萃取法萃取蜂膠，操作方便，成本又低。從技術(shù)上說，超臨界二氧化碳萃取法并無法將蜂膠中大部分蒿素C(artepillin C)、類黃酮成分等同時(shí)萃取出來，而利用超臨界二氧化碳配合共溶劑乙醇萃取法，萃取得到的蒿素C(artepillin C)、類黃酮成分，與乙醇萃取法得到含量相似，但其生產(chǎn)成本 是乙醇萃取法生產(chǎn)成本的二十倍以上。

【二】其次，如圖3所示，本發(fā)明方法證實(shí)可以有效率的完全分離蜂膠中蒿素C(artepillin C)與類黃酮成分，如圖中超臨界二氧化碳萃取法曲線顯示，可去除蜂膠中95％以上的蠟質(zhì)成分，提高蜂膠分離物其顏色、味道與口感接受度。

而若先以正己烷去除蜂膠中95％以上的蠟質(zhì)成分后，再利用已知超臨界二氧化碳萃取法(如圖中正己烷+超臨界流體曲線顯示)，只能得到蜂膠中的脂溶性有效成分，無法完全分離出蜂膠中蒿素C(artepillin C)與類黃酮成分。

而若先以正己烷去除蜂膠中95％以上的蠟質(zhì)成分后，再利用已知超臨界二氧化碳配合共溶劑乙醇萃取法(如圖中正己烷+超臨界流體/乙醇曲線顯示)，只能分離出蜂膠中60％的蒿素C(artepillin C)與類黃酮成分。且，選擇有機(jī)溶劑如正己烷去除蜂膠中的蠟質(zhì)，將會(huì)造成蒿素C(artepillin C)與類黃酮成分損失率約30％，處理后的蒿素C(artepillin C)與類黃酮成分回收率僅有60％。

基此，本發(fā)明利用超臨界流體的管柱層析方法，可巧妙地將蜂膠中的蠟質(zhì)分離，同時(shí)地完全分離出蜂膠中蒿素C(artepillin C)與類黃酮成分。相反地，若以正己烷去除蜂膠中95％以上的蠟質(zhì)成分，反而會(huì)造成蒿素C(artepillin C)與類黃酮成分損失率約20-30％，且有機(jī)溶劑容易造成殘留毒害與安全性疑慮。

【三】再者，本發(fā)明分離出蜂膠中蒿素C(artepillin C)與類黃酮成分后，再在超臨界流體操作條件下將蜂膠中蒿素C(artepillin C)成分的吸附于該吸附管柱內(nèi)，并靜置1-2小時(shí)后，再脫附被該吸附管柱吸附的蜂膠中蒿素C(artepillin C)成分，如圖4所示，本發(fā)明方法證實(shí)可有效率的完全純化蜂膠中蒿素C(artepillin C)至純度約90-95％含量，如圖中Step4的HPLC圖譜顯示。

由上可知，本發(fā)明可以完全萃取出蜂膠中蒿素C(artepillin C)與類黃酮成分(如圖2中Ethanol曲線顯示)，完全去除蜂膠中蠟質(zhì)成分(如圖3中SFE column曲線顯示)，更可以從蜂膠中得到純度約90-95％蒿素C(artepillin C)成分(如圖4中Step4的HPLC圖譜顯示)。

其次，由圖4更可顯示與證明:

1.蜂膠經(jīng)過本發(fā)明第一步驟處理，得到的蜂膠乙醇萃取液中蒿素C(artepillin C)成分含量，如圖中步驟1的HPLC圖譜顯示，蜂膠乙醇萃取液中含純度約10-15％的蒿素C成分。

2.蜂膠經(jīng)過本發(fā)明第二、三步驟處理，得到的分離蜂膠中蒿素C(artepillin C)成分含量，如圖中步驟3的HPLC圖譜顯示蜂膠分離液中含純度約20-25％的蒿素C成分。

3.被分離的蜂膠蒿素C(artepillin C)成分液體通入該吸附管柱內(nèi)，進(jìn)行本發(fā)明第五步驟得到純化蜂膠中的蒿素C(artepillin C)成分含量，如圖中步驟4的HPLC圖譜顯示，蜂膠純化液中含純度約90-95％的蒿素C(artepillin C)成分。

綜上所述，本發(fā)明所提供的制備、分離與純化蜂膠中蒿素C(artepillin C)活性成分的方法，其利用超臨界二氧化碳當(dāng)為溶劑，并配合層析與吸附技術(shù)，可大量分離與純化蜂膠中蒿素C(artepillin C)的活性成分，且能保持蒿素C(artepillin C)活性成分的生物活性，不需經(jīng)繁復(fù)的溶劑去除與濃縮、分離程序，且無溶劑殘留等安全疑慮，制作成本低，甚為環(huán)保、安全，甚具實(shí)用價(jià)值；緣是，本發(fā)明確實(shí)符合發(fā)明專利的要件，因此依法提出申請。