本發(fā)明涉及糖蛋白提取
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種土鱉蟲糖蛋白的提取純化方法。
背景技術(shù)：
：土鱉蟲為鱉蠊科昆蟲地鱉或冀地鱉的雌蟲干燥體，主產(chǎn)福建、河北、陜西、甘肅、青海、山東、河南、江蘇、浙江、湖南等地，具有破血逐瘀，續(xù)筋接骨之功效，是一種重要的傳統(tǒng)中藥。其生物體內(nèi)含有多種活性蛋白、氨基酸、不飽和脂肪酸、微量元素、生物堿和脂溶性維生素等物質(zhì)，現(xiàn)在藥理研究表明土鱉蟲具有溶栓、抗凝血、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂等作用?；钚噪膹V泛存在于自然界中，生物體很多活性物質(zhì)都以肽的形式存在，沒(méi)有肽，就沒(méi)有活性，沒(méi)有生命。科學(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)了具有免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)、酶調(diào)節(jié)、抗病毒、降血壓和降血脂等功能性肽。由于功能性肽的特殊功能，使得人們對(duì)它需求增加，現(xiàn)在已提取出多種功能性肽多用于醫(yī)用和保健，如功能性大豆蛋白肽已經(jīng)用于降血脂。目前，對(duì)土鱉蟲化學(xué)成分的研究主要集中在氨基酸、脂肪酸、微量元素、生物堿等方面，對(duì)土鱉蟲糖蛋白的研究較少；現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了采用水提法對(duì)新鮮的土鱉蟲進(jìn)行糖蛋白的提取，然后再通過(guò)Sevag法、離子交換層析法進(jìn)行糖蛋白的純化；雖然采用Sevag法可有效除去游離蛋白，但是所得的糖蛋白的提取率低而且生物活性較差、純度低。因此，有必要提供一種更合理的糖蛋白的提取純化方法，以提高土鱉蟲糖蛋白的提取率同時(shí)還保持糖蛋白的生物活性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種土鱉蟲糖蛋白的提取純化方法，該方法可提高糖蛋白提取率、同時(shí)保持糖蛋白生物活性。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種土鱉蟲糖蛋白的提取純化方法，所述提取純化方法包括下列步驟：(1)預(yù)處理：取新鮮的雌性土鱉蟲清洗干凈，然后加入pH3～6的PBS溶液浸泡10～30min，然后用蒸餾水清洗，將所述雌性土鱉蟲烘干、粉碎，得到土鱉蟲粉；(2)脫脂處理：取步驟(1)得到的土鱉蟲粉，然后加入所述土鱉蟲粉重量5～10倍的脫脂溶劑進(jìn)行超聲處理，抽濾，得到脫脂土鱉蟲粉；(3)糖蛋白的提取：取步驟(2)中的脫脂土鱉蟲粉，然后再加入脫脂土鱉蟲粉重量3～8倍的0.2～0.35mol/L鹽溶液進(jìn)行微波輔助浸提，然后再進(jìn)行水浴浸提，離心分離，經(jīng)過(guò)減壓濃縮得到土鱉蟲糖蛋白粗提液；(4)糖蛋白的純化：取步驟(3)中的土鱉蟲糖蛋白粗提液，加入所述土鱉蟲糖蛋白粗提液體積3～10倍的體積濃度為45％～65％的乙醇進(jìn)行分級(jí)沉淀，棄去上清液，收集沉淀物，然后用蒸餾水將沉淀物進(jìn)行復(fù)溶，調(diào)pH為3.5～5.8，溫度控制在40℃～60℃，再加入所述沉淀物重量0.2～0.5倍復(fù)合酶進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后在95℃條件滅酶，得到酶解液，然后將酶解液進(jìn)行超濾膜處理后得到的截留液過(guò)DEAE-52陰離子交換柱進(jìn)行分離純化，用0.2～0.35mol/L的氯化鈉洗脫，檢測(cè)糖蛋白的出峰位置，分管收集，合并洗脫峰，將洗脫液透析處理，冷凍干燥得到土鱉蟲糖蛋白純品。作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，步驟(2)中的脫脂溶劑為質(zhì)量濃度為8％～10％的十二烷基苯磺酸鈉。作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，步驟(2)中超聲處理時(shí)的超聲功率為220～400V，超聲時(shí)間為0.5～2min，溫度控制在25℃～35℃。作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，步驟(3)中微波輔助浸提條件：微波功率為200W～300W,微波輔助提取時(shí)間為1～5min。作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，步驟(3)中水浴浸提的溫度為40～60℃，浸提時(shí)間為0.5～2h。作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，步驟(3)中的土鱉蟲糖蛋白粗提液在純化之前，先于截留分子量為500Da的透析袋中，蒸餾水透析48h。作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，步驟(4)中復(fù)合酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶和鏈酶蛋白酶，且所述胃蛋白酶、胰蛋白酶和鏈酶蛋白酶的質(zhì)量比為0.3～0.6:0.2～0.35:0.1～0.3。作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，步驟(4)中超濾膜的截留分子量為8000Da。本發(fā)明還研究了上述方法制備的土鱉蟲糖蛋白在胃癌離體細(xì)胞生長(zhǎng)抑制方面的應(yīng)用。本發(fā)明建立的土鱉蟲糖蛋白的提取純化方法，通過(guò)該方法獲得的土鱉蟲糖蛋白對(duì)胃癌離體細(xì)胞生長(zhǎng)起到抑制作用；為了更好的說(shuō)明土鱉蟲糖蛋白在胃癌離體細(xì)胞生長(zhǎng)抑制中的作用，本發(fā)明通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)及結(jié)果進(jìn)行如下描述：(1)腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)將人胃癌細(xì)胞SGC-7901于37℃、5％CO2、含10％新生小牛血清和1.25μg/ml慶大霉素的RPMI1640培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)，每隔2-3d換新鮮培養(yǎng)基1次。(2)苔盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)土鱉蟲糖蛋白對(duì)細(xì)胞的作用選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個(gè)/ml,接種1ml上述細(xì)胞懸液至25ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入3ml生長(zhǎng)培養(yǎng)液，培養(yǎng)18h，滅菌的PBS洗滌3次后加入3ml不同濃度的土鱉蟲糖蛋白溶液(以維持培養(yǎng)液配置，過(guò)濾除菌)，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h、36h、48h。取出培養(yǎng)瓶，用0.2mL胰酶液在1min內(nèi)將細(xì)胞消化使脫落，隨即加入3ml生長(zhǎng)培養(yǎng)液終止消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，吸取0.5ml細(xì)胞懸液于干凈的試管中，加入0.1ml苔盼染色液(0.4％，以生理鹽水配)，搖勻靜置2min，用血球計(jì)數(shù)板對(duì)未染色的細(xì)胞計(jì)數(shù)，并在1min完成。(3)MTT法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)土鱉蟲糖蛋白的敏感性用生長(zhǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個(gè)/ml，隨即接孔到96孔板，每孔200μl，96孔板邊緣一圈的36個(gè)孔棄用，各孔加200μl滅菌的PBS；37℃，5％CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中放置18h使細(xì)胞貼壁，吸去培養(yǎng)液，各孔用滅菌的PBS洗3次，除去孔中的殘留血清，加入不同濃度的糖蛋白溶液(以維持液配成)各200μl，培養(yǎng)24h、36h、48h，設(shè)空白對(duì)照。樣品液作用后，各孔各加入配置好的5mg/ml,25μl的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，傾倒各孔液體，每孔加入150μl,37℃預(yù)溫的二甲基亞砜(DMSO),震蕩10min后放入酶標(biāo)儀作雙波長(zhǎng)吸光度檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm。(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果苔盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)分析結(jié)果顯示：胃癌細(xì)胞在土鱉蟲糖蛋白作用24h、36h和48h后，均呈現(xiàn)明顯的抑制作用，多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)壞死癥狀，與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異，p＜0.05。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。表1糖蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用土鱉蟲糖蛋白濃度(mg/L)24h抑制率(％)36h抑制率(％)48h抑制率(％)00000.0861.461.852.970.8606.2311.4220.358.60012.4623.6232.4686.0048.7954.8258.54MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示：胃癌細(xì)胞對(duì)糖蛋白比較敏感，作用36h即呈現(xiàn)較明顯的抑制作用，作用48h后抑制作用反而降低，與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異，p＜0.05。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表2糖蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞作用24h、36h和48h的MTT檢測(cè)土鱉蟲糖蛋白濃度(mg/L)24h抑制率(％)36h抑制率(％)48h抑制率(％)00000.0862.688.906.320.8606.1412.2610.174.23828.4636.4632.378.72442.2053.6848.62采用了上述技術(shù)方案后，本發(fā)明的有益效果是：(1)本發(fā)明通過(guò)PBS溶液對(duì)土鱉蟲進(jìn)行浸泡預(yù)處理，可有效除去臭味，然后再加入脫脂劑十二烷基苯磺酸鈉進(jìn)行超聲處理可有效除去土鱉蟲生物體內(nèi)的脂溶性色素及脂肪酸，同時(shí)還可以除去部分水溶性色素，進(jìn)一步降低了脂溶性物質(zhì)對(duì)糖蛋白提取的干擾；(2)本發(fā)明采用微波輔助浸提及水浴浸提，由于微波能可使溶劑分子運(yùn)動(dòng)速度加快，滲透、擴(kuò)散及溶解速度加快，加速糖蛋白從細(xì)胞轉(zhuǎn)移到溶劑中，隨著微波功率的提高，進(jìn)一步提高了糖蛋白的提取效率，大大縮短了提取時(shí)間；(3)本發(fā)明采用酶解法來(lái)去除游離的蛋白質(zhì)，與Sevag法相比，酶解法除蛋白的反應(yīng)條件溫和，而且通過(guò)加入特定的復(fù)合酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和鏈酶蛋白酶)可有效去除游離蛋白質(zhì)，同時(shí)還不會(huì)破壞糖蛋白的活性，經(jīng)過(guò)酶解處理，離子交換柱處理后得到的土鱉蟲糖蛋白純度提高。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例1一種土鱉蟲糖蛋白的提取純化方法，包括下列步驟：(1)預(yù)處理：取新鮮的雌性土鱉蟲清洗干凈，然后加入pH3.5的PBS溶液浸泡15min，然后用蒸餾水清洗，將雌性土鱉蟲烘干、粉碎，得到土鱉蟲粉；(2)脫脂處理：取步驟(1)得到的土鱉蟲粉100g，然后加入土鱉蟲粉重量5倍的質(zhì)量濃度為8％的十二烷基苯磺酸鈉進(jìn)行超聲處理(超聲功率為260V，超聲時(shí)間為0.5min，溫度控制在25℃)，抽濾，得到脫脂土鱉蟲粉；(3)糖蛋白的提?。喝〔襟E(2)中的脫脂土鱉蟲粉，然后再加入脫脂土鱉蟲粉重量3倍的0.2mol/L鹽溶液進(jìn)行微波輔助浸提(微波功率為230W,提取時(shí)間為1.5min)，然后再進(jìn)行水浴浸提(溫度為45℃，浸提時(shí)間為0.5h)，離心分離，經(jīng)過(guò)減壓濃縮得到土鱉蟲糖蛋白粗提液；(4)糖蛋白的純化：取步驟(3)中的土鱉蟲糖蛋白粗提液，加入土鱉蟲糖蛋白粗提液體積3倍的體積濃度為45％的乙醇進(jìn)行分級(jí)沉淀，棄去上清液，收集沉淀物，然后用蒸餾水將沉淀物進(jìn)行復(fù)溶，調(diào)pH為3.5，溫度控制在45℃，再加入沉淀物重量0.2倍復(fù)合酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和鏈酶蛋白酶的質(zhì)量比為0.35:0.2:0.1)進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后在95℃條件滅酶，得到酶解液，最后將酶解液經(jīng)過(guò)超濾膜(截留分子量為8000Da)處理后，再過(guò)DEAE-52陰離子交換柱進(jìn)行分離純化，用0.2mol/L的氯化鈉洗脫，檢測(cè)糖蛋白的出峰位置，分管收集，合并洗脫峰，將洗脫液透析處理，冷凍干燥得到土鱉蟲糖蛋白純品。此條件下土鱉蟲糖蛋白的提取率為10.89％。實(shí)施例2一種土鱉蟲糖蛋白的提取純化方法，包括下列步驟：(1)預(yù)處理：取新鮮的雌性土鱉蟲清洗干凈，然后加入pH4.2的PBS溶液浸泡20min，然后用蒸餾水清洗，將雌性土鱉蟲烘干、粉碎，得到土鱉蟲粉；(2)脫脂處理：取步驟(1)得到的土鱉蟲粉100g，然后加入土鱉蟲粉重量7倍的質(zhì)量濃度為9％的十二烷基苯磺酸鈉進(jìn)行超聲處理(超聲功率為300V，超聲時(shí)間為1min，溫度控制在28℃)，抽濾，得到脫脂土鱉蟲粉；(3)糖蛋白的提?。喝〔襟E(2)中的脫脂土鱉蟲粉，然后再加入脫脂土鱉蟲粉重量5倍的0.25mol/L鹽溶液進(jìn)行微波輔助浸提(微波功率為260W,提取時(shí)間為2.5min)，然后再進(jìn)行水浴浸提(溫度為50℃，浸提時(shí)間為1h)，離心分離，經(jīng)過(guò)減壓濃縮得到土鱉蟲糖蛋白粗提液；(4)透析處理：取步驟(3)中的土鱉蟲糖蛋白粗提液，于截留分子量為500Da的透析袋中，蒸餾水透析48h，得到土鱉蟲糖蛋白保留液。(5)糖蛋白的純化：取步驟(4)中的土鱉蟲糖蛋白保留液，加入土鱉蟲糖蛋白粗提液體積5倍的體積濃度為55％的乙醇進(jìn)行分級(jí)沉淀，棄去上清液，收集沉淀物，然后用蒸餾水將沉淀物進(jìn)行復(fù)溶，調(diào)pH為4.2，溫度控制在48℃，再加入沉淀物重量0.3倍復(fù)合酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和鏈酶蛋白酶的質(zhì)量比為0.4:0.25:0.17)進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后在95℃條件滅酶，得到酶解液，最后將酶解液經(jīng)過(guò)超濾膜(截留分子量為8000Da)處理后，再過(guò)DEAE-52陰離子交換柱進(jìn)行分離純化，用0.25mol/L的氯化鈉洗脫，檢測(cè)糖蛋白的出峰位置，分管收集，合并洗脫峰，將洗脫液透析處理，冷凍干燥得到土鱉蟲糖蛋白純品。此條件下土鱉蟲糖蛋白的提取率為11.45％。實(shí)施例3一種土鱉蟲糖蛋白的提取純化方法，包括下列步驟：(1)預(yù)處理：取新鮮的雌性土鱉蟲清洗干凈，然后加入pH5的PBS溶液浸泡28min，然后用蒸餾水清洗，將雌性土鱉蟲烘干、粉碎，得到土鱉蟲粉；(2)脫脂處理：取步驟(1)得到的土鱉蟲粉100g，然后加入土鱉蟲粉重量8倍的質(zhì)量濃度為9.5％的十二烷基苯磺酸鈉進(jìn)行超聲處理(超聲功率為350V，超聲時(shí)間為1.5min，溫度控制在32℃)，抽濾，得到脫脂土鱉蟲粉；(3)糖蛋白的提?。喝〔襟E(2)中的脫脂土鱉蟲粉，然后再加入脫脂土鱉蟲粉重量7倍的0.3mol/L鹽溶液進(jìn)行微波輔助浸提(微波功率為280W,提取時(shí)間為3.5min)，然后再進(jìn)行水浴浸提(溫度為55℃，浸提時(shí)間為1.5h)，離心分離，經(jīng)過(guò)減壓濃縮得到土鱉蟲糖蛋白粗提液；(4)透析處理：取步驟(3)中的土鱉蟲糖蛋白粗提液，于截留分子量為500Da的透析袋中，蒸餾水透析48h，得到土鱉蟲糖蛋白保留液。(5)糖蛋白的純化：取步驟(4)中的土鱉蟲糖蛋白保留液，加入土鱉蟲糖蛋白粗提液體積8倍的體積濃度為60％的乙醇進(jìn)行分級(jí)沉淀，棄去上清液，收集沉淀物，然后用蒸餾水將沉淀物進(jìn)行復(fù)溶，調(diào)pH為5.3，溫度控制在56℃，再加入沉淀物重量0.45倍復(fù)合酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和鏈酶蛋白酶的質(zhì)量比為0.5:0.3:0.23)進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后在95℃條件滅酶，得到酶解液，最后將酶解液經(jīng)過(guò)超濾膜(截留分子量為8000Da)處理后，再過(guò)DEAE-52陰離子交換柱進(jìn)行分離純化，用0.3mol/L的氯化鈉洗脫，檢測(cè)糖蛋白的出峰位置，分管收集，合并洗脫峰，將洗脫液透析處理，冷凍干燥得到土鱉蟲糖蛋白純品。此條件下土鱉蟲糖蛋白的提取率為12.36％。實(shí)施例4一種土鱉蟲糖蛋白的提取純化方法，包括下列步驟：(1)預(yù)處理：取新鮮的雌性土鱉蟲清洗干凈，然后加入pH5.8的PBS溶液浸泡35min，然后用蒸餾水清洗，將雌性土鱉蟲烘干、粉碎，得到土鱉蟲粉；(2)脫脂處理：取步驟(1)得到的土鱉蟲粉100g，然后加入土鱉蟲粉重量8倍的質(zhì)量濃度為10％的十二烷基苯磺酸鈉進(jìn)行超聲處理(超聲功率為400V，超聲時(shí)間為1.8min，溫度控制在35℃)，抽濾，得到脫脂土鱉蟲粉；(3)糖蛋白的提?。喝〔襟E(2)中的脫脂土鱉蟲粉，然后再加入脫脂土鱉蟲粉重量8倍的0.34mol/L鹽溶液進(jìn)行微波輔助浸提(微波功率為300W,提取時(shí)間為2min)，然后再進(jìn)行水浴浸提(溫度為60℃，浸提時(shí)間為2h)，離心分離，經(jīng)過(guò)減壓濃縮得到土鱉蟲糖蛋白粗提液；(4)透析處理：取步驟(3)中的土鱉蟲糖蛋白粗提液，于截留分子量為500Da的透析袋中，蒸餾水透析48h，得到土鱉蟲糖蛋白保留液。(5)糖蛋白的純化：取步驟(4)中的土鱉蟲糖蛋白保留液，加入土鱉蟲糖蛋白粗提液體積10倍的體積濃度為65％的乙醇進(jìn)行分級(jí)沉淀，棄去上清液，收集沉淀物，然后用蒸餾水將沉淀物進(jìn)行復(fù)溶，調(diào)pH為5.8，溫度控制在60℃，再加入沉淀物重量0.5倍復(fù)合酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和鏈酶蛋白酶的質(zhì)量比為0.58:0.32:0.27)進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后在95℃條件滅酶，得到酶解液，最后將酶解液經(jīng)過(guò)超濾膜(截留分子量為8000Da)處理后，再過(guò)DEAE-52陰離子交換柱進(jìn)行分離純化，用0.32mol/L的氯化鈉洗脫，檢測(cè)糖蛋白的出峰位置，分管收集，合并洗脫峰，將洗脫液透析處理，冷凍干燥得到土鱉蟲糖蛋白純品。此條件下土鱉蟲糖蛋白的提取率為12.08％。對(duì)比實(shí)施例采用傳統(tǒng)方法提?。悍Q取步驟(1)中的土鱉蟲粉100g，加入蒸餾水水浴浸提，過(guò)濾后將所得濾液中加入Sevag試劑(氯仿與正丁醇的體積比為3:1)，除去沉淀蛋白，將上清液過(guò)DEAE-50纖維素離子交換柱純化，用洗脫液洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥得到土鱉蟲糖蛋白純品。此條件下土鱉蟲糖蛋白的提取率為8.15％。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3