一種純化制備高純度木二糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了純化制備高純度木二糖的方法。該方法包括如下步驟：(1)將木聚糖酶解液進(jìn)行超濾，收集濾液；(2)將所述濾液流過(guò)離子交換樹(shù)脂柱，得到木聚糖酶解液的凈化液；(3)對(duì)所述凈化液進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，即可得到所述木二糖。利用本發(fā)明分離純化堿處理甘蔗渣制備的木聚糖酶解液，即能制備高純度的木二糖，聯(lián)產(chǎn)木三糖和木糖，純度分別為95.74±1.43％、85.11±2.27％和86.61±3.57％，且木二糖損失最少，為6.38％。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便、靈活實(shí)用，快速、成本低，利于推廣開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】
一種純化制備高純度木二糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及寡糖的分離純化領(lǐng)域，尤其一種純化制備高純度木二糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 低聚木糖是由2~7個(gè)木糖以β_1，4糖苷鍵連接而成的低聚糖，具有低熱、穩(wěn)定、無(wú) 毒等特性以及獨(dú)特的生理功能。低聚木糖能促進(jìn)人和動(dòng)物腸道內(nèi)雙歧桿菌的增殖，抑制有 害菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)1丐的吸收，其主要有效成分是木二糖和木三糖(Carvalho AFA，de Oliva Neto P, da Silva DF,et al·Xyl〇-〇ligosaccharides from 1ignocellulosic materials: Chemical structure,health benefits and production by chemical and enzymatic hydrolysis[J] .Food Research International，2013,51:75-85) 〇木二糖的甜 度約為蔗糖的40%，含量達(dá)到50%的低聚木糖產(chǎn)品的甜度約為蔗糖的30%，甜味純正，類(lèi)似 蔗糖。目前，低聚木糖已作為新型的功能添加劑，應(yīng)用越來(lái)越廣泛。例如，功能性食品添加 劑：主要用于低糖、無(wú)糖型食品以及醫(yī)用保健食品；飼料添加劑:主要改善動(dòng)物腸道內(nèi)微生 物的生態(tài)平衡，增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用；以及農(nóng)業(yè)添加劑:作為農(nóng)作物的營(yíng) 養(yǎng)物，提高農(nóng)作物的生長(zhǎng)速度和抗病能力(張玲，丁長(zhǎng)河，阮文斌.低聚木糖的應(yīng)用研究和產(chǎn) 品開(kāi)發(fā)進(jìn)展.糧食與油脂，2015,28(2): 9-12)。
[0003] 目前，低聚木糖主要來(lái)源于木質(zhì)纖維素，其單組分的制備和純化方法主要通過(guò)酶 法水解木聚糖，并經(jīng)層析純化后獲得單一組分，如凝膠層析法(張軍華，徐勇，勇強(qiáng)，等.木二 糖和木三糖的分離及其用于雙歧桿菌的體外培養(yǎng)[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2005，25(1): 15-18.)。專利CN1847254A采用聚丙烯酰胺凝膠色譜柱分離低聚木糖各組分，由于聚丙烯酰胺 凝膠價(jià)格昂貴，再生困難。目前，僅在實(shí)驗(yàn)室研究，很難用于低聚木糖的規(guī)?；a(chǎn)。吸附層 析法（Tan SS , Li DY, Jiang ZQ , e t al . Production of xy lobiose from the autohydrolysis explosion liquor of corncob using Thermotoga maritima xylanase B(XynB)immobilized on nickel-chelated Eupergit C.[J].Bioresource Technology, 2008,99(1): 200-204)。專利CN101632877A利用活性炭層析法進(jìn)行低聚木糖中各組分的分 離。此方法利用乙醇為洗脫劑，成本高;活性炭使用周期短，裝炭、卸炭工作量大，浪費(fèi)時(shí)間， 大量廢炭丟棄為生產(chǎn)垃圾;另外，活性炭分離效果差，得到的產(chǎn)品純度低，不利于綠色生產(chǎn)。 離子交換層析法(范麗，徐勇，連之娜，等.高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法定量測(cè)定 低聚木糖樣品中的低聚木糖[J].色譜，2011，29(1) :75-78)，其中凝膠層析法應(yīng)用最廣。專 利CN10830936B采用模擬移動(dòng)床提純低聚木糖中的木二糖和雜糖組分，雖然木二糖組分的 含量較高，為94%以上，但提純收率較低，僅為30-46 %，成本高，且不能實(shí)現(xiàn)其他單組份的 分離。
[0004] 有文獻(xiàn)采用聚乙二醇6000/檸檬酸鈉的雙水相木聚糖酶水解體系制備木二糖，再 采用葡聚糖凝膠LH-20分離純化木二糖(李鑫，顧夕梅，繩敖楠，等.雙水相木聚糖酶水解體 系制備木二糖及其純化[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2015,35(5): 93-97.)，雖分離出高純度 (98.5%)的木二糖，但操作繁瑣，成本高，實(shí)驗(yàn)規(guī)模小。納濾分離低聚木糖(趙鶴飛，楊瑞金， 趙偉，等.秸桿低聚木糖溶液納濾分離特性和滲濾工藝[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2009,25(4): 253-259 .)，雖可以高效純化低聚木糖，但是不能實(shí)現(xiàn)單組分的分離，且木二糖的損失較大， 為 12.45%。
[0005] 鑒于以上可知，國(guó)內(nèi)外關(guān)于木二糖分離純化方面的報(bào)道不多。國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上僅有 其標(biāo)準(zhǔn)品銷(xiāo)售，價(jià)格昂貴。因此，發(fā)展簡(jiǎn)易方便，產(chǎn)品純度高，且能同時(shí)分離木二糖和木三糖 的分離純化方法是必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種純化制備高純度木二糖的方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)低聚木 糖中單一組分的分離純化，所得木二糖的純度和回收率高，可聯(lián)產(chǎn)分離出木三糖和木糖，操 作簡(jiǎn)單、快速和成本低。
[0007] 本發(fā)明提供的純化制備高純度木二糖的方法，包括如下步驟：（1)將木聚糖酶解液 進(jìn)行超濾，收集濾液；（2)將所述濾液流過(guò)離子交換樹(shù)脂柱，得到木聚糖酶解液的凈化液； (3)對(duì)所述凈化液進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，即可得到所述木二糖。
[0008] 上述的方法，步驟(1)中，所述木聚糖酶解液是指采用木聚糖酶對(duì)木聚糖原料進(jìn)行 酶解后的產(chǎn)物，所述木聚糖原料可為甘蔗渣、玉米芯、麥桿或木薯渣;所述木聚糖酶解液可 為通過(guò)如下步驟得到的產(chǎn)物:將濃度為20~60 g//L木聚糖原料和水的混合體系的pH值調(diào)節(jié) 至5.0~6.0，按原料固形物含量每克800單位的量在加入木聚糖酶酶液后，在35~45 °C下酶 解24小時(shí)，得到所述木聚糖酶解液。
[0009] 所述酶解之前還包括采用堿對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理得到粗木聚糖的步驟，所述堿以堿 的水溶液的形式存在，質(zhì)量濃度可為8.0 %~10.0 % ;所述堿中還可包括質(zhì)量濃度為0~ 3.0 %的H2〇2，但不為0;處理時(shí)間可為12~24h;所述處理具體可為按料液比如lg: 10mL的比 例將甘蔗渣與如質(zhì)量濃度為8.0%的NaOH，質(zhì)量濃度為2.48%的H2〇2堿液混合在40°C，浸泡 處理如24h，紗布過(guò)濾，濾液再經(jīng)超濾(截留分子量為3000Da)超濾濃縮，再用4倍體積95%的 乙醇沉淀離心，沉淀烘干即得粗木聚糖。
[0010] 上述的方法，步驟（1)中，所述超濾中采用的超濾膜的孔徑可為0.001~〇.〇1_，具 體可為〇 · ΟΟΙμπι，操作壓力可為〇 · 1~〇 · 2MPa，具體可為0 · 15MPa。
[0011]上述的方法，步驟(2)中，所述離子交換樹(shù)脂柱的填充物可為陰離子交換樹(shù)脂D201 (強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交換樹(shù)脂)和陽(yáng)離子交換樹(shù)脂001-7(強(qiáng)酸性苯乙烯系陽(yáng)離子交換 樹(shù)脂）；串聯(lián)順序優(yōu)選為陽(yáng)離子交換樹(shù)脂001-7-陰離子交換樹(shù)脂D201，所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 001-7和所述陰離子交換樹(shù)脂D201的體積比可為(0.5~2.5): 1，優(yōu)選為（1.0~2.0): 1，更優(yōu) 選為1 · 5:1;進(jìn)樣流速可為(0· 5~3.0)mL/min，優(yōu)選為（1 · 5~2.5)，更優(yōu)選為2 · OmL/min;最 佳條件為:所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂001-7和所述陰離子交換樹(shù)脂D201的體積比為1.67:1和進(jìn) 樣流速為1.76mL/min，所得脫色率為96.85 ± 1.43 %、脫鹽率為77.59 ± 3.79 %和糖保留率 為 96·64±2·59%。
[0012]上述的方法中，步驟(3)中，所述凝膠過(guò)濾層析具體可采用葡聚糖凝膠G-10層析 柱，凝膠層析柱的高徑比可為（15~35):1，優(yōu)選為30:1;進(jìn)樣體積可為1~9%的柱床體積， 如5% ;所述凝膠過(guò)濾層析采用水進(jìn)行洗脫，所述水可為脫氣去離子水，洗脫速度可為0.3~ 1.2mL/min，優(yōu)選為0.6mL/min，洗脫體積可為1.0~3.0倍柱床體積，如1.5倍;最佳條件為： 洗脫速度為ο. 73mL/min、凝膠柱高徑比為34.03:1，所得木二糖的純度為95.74± 1.43%、回 收率為 93.61±3.50%。
[0013] 通過(guò)所述凝膠過(guò)濾層析即可對(duì)所述木聚糖酶解液的凈化液中的各組分進(jìn)行分離； 所述方法在所述凝膠過(guò)濾層析后還包括得到木糖和木三糖的步驟，即在得到所述木二糖的 同時(shí)還包括得到木糖和木三糖，因此，本發(fā)明純化制備木二糖的方法可聯(lián)產(chǎn)木三糖和木糖。
[0014] 所述方法在所述凝膠過(guò)濾層析之后，通過(guò)如下步驟確定各組分:采用HPLC檢測(cè)收 集液中的成分，通過(guò)對(duì)比樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間確定各組分，如通過(guò)對(duì)比收集液和木二 糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間確定該組分為木二糖。
[0015] 具體地，按照洗脫液的流出順序，收集得到的第0.8~1.2倍柱床體積的洗脫液為 木二糖，第1.2~1.4倍柱床體積的洗脫液為木糖，第0.5~0.7倍柱床體積的洗脫液為木三 糖。
[0016] 本發(fā)明具有如下有益效果：
[0017] (1)利用本發(fā)明分離純化堿處理甘蔗渣制備的木聚糖酶解液，即能制備高純度的 木二糖，聯(lián)產(chǎn)木三糖和木糖，純度分別為95 · 74 ± 1 · 43 %、85 · 11 ± 2 · 27 %和86 · 61 ± 3 · 57 %， 且木二糖損失最少，為6.38%。
[0018] (2)本發(fā)明方法簡(jiǎn)便、靈活實(shí)用，快速、成本低，利于推廣開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。
[0020] 圖2為不同填充物對(duì)堿預(yù)處理甘蔗渣制備的木聚糖酶解液脫色脫鹽效果的影響， 其中，圖2中A為脫色率;圖2中B為脫鹽率;圖2中C為糖保留率。
[0021] 圖3為不同陰陽(yáng)離子串聯(lián)順序?qū)A預(yù)處理甘蔗渣制備的木聚糖酶解液脫色脫鹽效 果的影響。
[0022] 圖4為不同陰陽(yáng)離子填充體積比例對(duì)堿預(yù)處理甘蔗渣制備的木聚糖酶解液脫色脫 鹽效果的影響，其中，左縱坐標(biāo)對(duì)應(yīng)脫色率、糖保留率，右縱坐標(biāo)對(duì)應(yīng)脫鹽率。
[0023] 圖5為不同進(jìn)樣流速對(duì)堿預(yù)處理甘蔗渣制備的木聚糖酶解液脫色脫鹽效果的影 響，其中，左縱坐標(biāo)對(duì)應(yīng)脫色率、糖保留率，右縱坐標(biāo)對(duì)應(yīng)脫鹽率。
[0024] 圖6為洗脫液洗脫流速、陰陽(yáng)離子樹(shù)脂串聯(lián)柱陰陽(yáng)離子填充體積比例對(duì)堿預(yù)處理 甘蔗渣制備的木聚糖酶解液脫色脫鹽效果的3D圖，其中圖6中A為脫色率，圖6中B為脫鹽率， 圖6中C為糖保留率。
[0025] 圖7為不同洗脫速度對(duì)堿預(yù)處理甘蔗渣制備的木聚糖酶解液分離純化效果的影 響。
[0026] 圖8為不同葡聚糖凝膠G-10柱高徑比對(duì)堿預(yù)處理甘蔗渣制備的木聚糖酶解液分離 純化效果的影響。
[0027] 圖9洗脫速度、凝膠柱高徑比對(duì)堿預(yù)處理甘蔗渣制備的木聚糖酶解液分離純化效 果的3D圖，其中，圖9中A為木二糖純度，圖9中B為木二糖回收率。
[0028]圖10 HPLC檢測(cè)葡聚糖凝膠G-10分離純化各組分成分圖，其中，圖10A為標(biāo)準(zhǔn)樣品， 其中XI代表木糖，X2代表木二糖，X3代表木三糖；圖10B堿預(yù)處理甘蔗渣制備的木聚糖酶解 液;圖10中C木糖組分;圖10中D為木二糖組分;圖10中E為木三糖組分。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0030] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0031] 下述實(shí)施例中利用DNS法確定開(kāi)始和終止收集濾液的時(shí)間的操作步驟如下：取 0.5mL流出液加入2倍體積的DNS，沸水浴5min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光值，從而確定流出液是否 含糖，當(dāng)糖含量大于0時(shí)，開(kāi)始收集至到流出液中檢測(cè)不到糖，停止收集。
[0032] 下述實(shí)施例中純化制備高純度木二糖的方法，包括如下步驟：（1)將木聚糖酶解液 進(jìn)行超濾，收集濾液;所用超濾膜的孔徑可為〇. 001~〇. Olym，操作壓力可為0.1~0.2MPa; (2)將濾液流過(guò)離子交換樹(shù)脂柱，得到木聚糖酶解液的凈化液；（3)對(duì)凈化液進(jìn)行凝膠過(guò)濾 層析，即可得到木二糖。
[0033] 實(shí)施例1、純化制備高純度木二糖的條件的優(yōu)化 [0034] 一、脫色脫鹽柱填充物的選擇
[0035] 按照如下步驟純化制備高純度木二糖：
[0036] (1)超濾：將堿預(yù)處理甘蔗渣制備的木聚糖酶解液用超濾膜（截留分子量為 lOOOODa，孔徑為0. ΟΟΙμπι)進(jìn)行過(guò)濾(操作壓力為0.15MPa)，收集濾液，除去大分子物質(zhì)及部 分非糖類(lèi)物質(zhì)。其中，堿預(yù)處理甘蔗渣制備的木聚糖酶解液的步驟參照文獻(xiàn)"Xue，JL， Zhao，S，et al.A biotechnological process efficiently co-produces two high value-added products,glucose and xylooligosaccharides,from sugarcane bagasse.Bioresourse Technology，2016,204,130-138" 中公開(kāi)的方法，具體如下：按料液 比如lg:10mL的比例將甘蔗渣與含質(zhì)量濃度為8.0%的NaOH、質(zhì)量濃度為2.48%的H 2〇2溶液 混合后，在40°C下浸泡處理24h，紗布過(guò)濾，濾液再經(jīng)超濾(截留分子量為3000Da)濃縮，再用 4倍體積95%的乙醇沉淀后離心，烘干沉淀即得粗木聚糖;將濃度為35g/L粗木聚糖和水的 混合體系的pH值調(diào)節(jié)至5.5，按原料固形物含量每克800單位的酶量加入木聚糖酶酶液后， 在36 °C下酶解24小時(shí)，得到木聚糖酶解液。
[0037] (2)脫色脫鹽柱填充物的選擇:各取陰離子交換樹(shù)脂SA10AP(北京綠百草科技公 司），D900及大孔吸附樹(shù)脂D101，D201(河北滄州寶恩樹(shù)脂廠)和陽(yáng)離子交換樹(shù)脂SK1B(北京 綠百草科技公司）和001-7(河北滄州寶恩樹(shù)脂廠)20g，優(yōu)適牌活性炭(浙江寧波優(yōu)適活性炭 廠），糖用活性炭，博達(dá)1#、2#活性炭(河南博達(dá)凈水材料有限公司），無(wú)磷活性炭(長(zhǎng)沙承禹 化工有限公司）lg，分別加入步驟（1)所得的濾液100mL，靜態(tài)吸附2h，分隔一段時(shí)間震蕩一 次，2h后濾紙過(guò)濾，收集濾液，分別用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)賽默飛世爾），電導(dǎo)儀(上海 雷磁），HPLC(美國(guó)waters)測(cè)各濾液及步驟（1)所得超濾液的吸光值，電導(dǎo)率(離子強(qiáng)度)和 糖含量(色譜條件如下：大連依利特氨基柱(Hypersil NH2 250*4.6/5um)流動(dòng)相：76%乙 腈、流速 1 .〇mL/min、柱溫30°C。
[0038]根據(jù)吸附前后吸光值（圖2中A)和電導(dǎo)率計(jì)算脫色率（圖2中B)和脫鹽率以及糖含 量的變化（圖2中C)。篩選出陰離子交換樹(shù)脂D201和陽(yáng)離子交換樹(shù)脂001-7具有最高的脫色 率，脫鹽率和糖保留率。計(jì)算公式如下：
[0039] 脫色率=(4041)/^0\100;式中40為過(guò)離子柱前木聚糖酶解液的吸光值）1為 過(guò)離子柱后木聚糖酶解液的吸光值(用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定）；
[0040] 脫鹽率X 100;式中，K0為過(guò)離子柱前木聚糖酶解液的電導(dǎo)率、K1為過(guò) 離子柱后木聚糖酶解液的電導(dǎo)率(用電導(dǎo)儀測(cè)定）；
[0041] 糖保留率iXi/XoX 100;式中，Χ0為過(guò)離子柱前木聚糖酶解液中總糖含量、XI為過(guò) 離子柱后木聚糖酶解液中總糖含量(用HPLC測(cè)定）。
[0042 ]二、陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱串聯(lián)順序的確定 [0043] (1)超濾：同上述一中步驟(1)的操作。
[0044] (2)陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱串聯(lián)順序的確定:利用濕裝柱法分別將D201-001-7交換 樹(shù)脂（￥(〇201):￥(001-7) = 1:1)，001-7-0201交換樹(shù)脂（￥(001-7):￥(0201) = 1:1)裝入到 中丨.6:<55〇11的空層析柱內(nèi)，在流速2.011117 1^11的條件下，分別栗入2001^的步驟（1)所得濾 液，用DNS法確定開(kāi)始收集和終止收集濾液的時(shí)間，再利用一中步驟(2)的方法測(cè)濾液的脫 色率，脫鹽率，糖保留率（圖3)。比較不同陰陽(yáng)離子串聯(lián)順序?qū)γ撋擕}的影響，確定按001- 7-D201順序串聯(lián)時(shí)的脫色率、脫鹽率和糖保留率較大。
[0045]三、不同陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂填充量對(duì)脫色脫鹽的影響 [0046] (1)超濾:同上述一中步驟(1)的操作。
[0047] (2)不同陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂填充量的確定:將001-7-D201順序串聯(lián)的離子交換樹(shù) 脂分別以V(001-7): V(D201)為0.5 :1、1:1、1.5 :1、2 :1和2.5 :1的比例濕法裝柱，在流速 2. OmL/min的條件下，分別栗入200mL的步驟（1)所得液體，用DNS法確定開(kāi)始收集和終止收 集濾液的時(shí)間，再利用一中步驟(2)的方法測(cè)定濾液的脫色率、脫鹽率和糖保留率(圖4)。比 較不同陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂填充比例對(duì)脫色脫鹽的影響，確定V(001-7):V(D201) = 1.5:1時(shí)， 脫色率、脫鹽率和糖保留率最高。
[0048]四、進(jìn)樣流速對(duì)脫色脫鹽的影響 [0049] (1)超濾:同上述一中步驟(1)的操作。
[0050] (2)進(jìn)樣流速的確定:在上述確定的條件下，分別以0.5mL/min、1. OmL/min、1.5mL/ min、2·0mL/min、2· 5mL/min和3 ·OmL/min進(jìn)樣速度將200mL步驟（1)所得濾液栗入V(001-7): V(D201) = 1.5:1串聯(lián)的離子柱中，用DNS法確定開(kāi)始收集和終止收集濾液的時(shí)間，再利用步 驟(2)的方法測(cè)定濾液的脫色率、脫鹽率和糖保留率（圖5)。比較不同進(jìn)樣流速對(duì)脫色脫鹽 的影響，確定2. OmL/min為脫色脫鹽的最佳進(jìn)樣流速。
[0051] 五、響應(yīng)面優(yōu)化低聚木糖脫色脫鹽條件
[0052] (1)超濾：同上述一中步驟(1)的操作。
[0053] (2)響應(yīng)面優(yōu)化低聚木糖脫色脫鹽條件:根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，選擇進(jìn)樣流速和陰 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂填充比例作為自變量，脫色率、脫鹽率和糖保留率為因變量，進(jìn)行兩因素三 水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)，優(yōu)化出低聚木糖脫色脫鹽的最佳條件是進(jìn)樣流速1.76mL/min、V (001-7): V(D201) = 1 · 67:1，所得脫色率為96 · 85 ± 1 · 43%、脫鹽率為77 · 59 ± 3 · 79 %和糖保 留率為96.64±2· 59% (圖6,表 1-3)。
[0054]表1陰陽(yáng)離子樹(shù)脂串聯(lián)柱對(duì)堿預(yù)處理甘蔗渣制備的木聚糖的酶解液脫色效果響應(yīng) 面二次方程模型方差分析表
[0055]
[0056] 表2陰陽(yáng)離子樹(shù)脂串聯(lián)柱對(duì)堿預(yù)處理甘蔗渣制備的木聚糖的酶解液脫鹽效果響應(yīng) 面二次方程模型方差分析表
[0058]表3陰陽(yáng)離子樹(shù)脂串聯(lián)柱對(duì)堿預(yù)處理甘蔗渣制備的木聚糖的酶解液保留效果響應(yīng) 面二次方程模型方差分析表
[0059]
[0060] 六、洗脫速度對(duì)葡聚糖凝膠G-10分離純化木二糖的影響
[0061] (1)超濾:同上述一中步驟(1)的操作。
[0062] (2)將濾液流過(guò)離子交換樹(shù)脂柱(離子交換樹(shù)脂柱條件:填充物串聯(lián)順序?yàn)?01-7-D201、填充量V(001-7): V(D201) = 1 · 67:1、進(jìn)樣流速為1 · 76mL/min)，DNS法確定開(kāi)始和終止 收集濾液的時(shí)間，收集液即木聚糖酶解液的凈化液。
[0063] (3)洗脫速度的確定：5%柱床體積的步驟(2)所得液體栗入已經(jīng)平衡好的葡聚糖 凝膠G-10層析柱，待液體全部進(jìn)入柱床后，分別以0.3mL/min、0.6mL/min、0.9mL/min和 1.2mL/min的洗脫速度、用1.5倍柱床體積的脫氣去離子水洗脫，每2min收集1管。將收集的 液體用高效液相色譜法(色譜條件如下：大連依利特氨基柱(Hypersil NH2 250*4.6/5um) 流動(dòng)相：76 %乙腈、流速1. OmL/min、柱溫30°C )測(cè)定其組分含量及各組分的回收率，優(yōu)化出 最佳洗脫速度為〇.6mL/min(圖7)。
[0064] 七、凝膠柱高徑比對(duì)葡聚糖凝膠G-10分離純化木二糖的影響
[0065] (1)超濾：同上述一中步驟(1)的操作。
[0066] (2)同上述六中步驟(2)的操作。
[0067] (3)凝膠柱高徑比的確定:在上述六中確定的最佳洗脫速度下，將5 %柱床體積的 步驟(6)所得液體栗入凝膠柱高徑比為15:1、20:1、25:1、30 :1和35:1的葡聚糖6-10的凝膠 柱，每2min收集1管，將收集的液體用高效液相色譜法測(cè)定其組分含量及各組分的回收率 (色譜條件同六），優(yōu)化出最佳凝膠柱高徑比為30:1(圖8)。
[0068] 八、響應(yīng)面法優(yōu)化葡聚糖凝膠G-10分離純化木二糖的最佳條件
[0069] (1)超濾：同上述一中步驟(1)的操作。
[0070] (2)同上述六中步驟(2)的操作。
[0071] (3)響應(yīng)面法優(yōu)化葡聚糖凝膠G-10分離純化木二糖的最佳條件優(yōu)化:根據(jù)單因素 實(shí)驗(yàn)結(jié)論，以洗脫速度和G-10凝膠柱高徑比為自變量，木二糖的純度及回收率為因變量，進(jìn) 行兩因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化出分離純化的最佳條件為洗脫速度〇.73mL/min、凝膠柱 高徑比34.03:1，所得木二糖的純度為95.74± 1.43%、回收率為93.61±3.50% (圖9,表4- 5)〇
[0072]表4葡聚糖凝膠G-10分離純化木二糖純度響應(yīng)面二次方程模型方差分析表
[0074]表5葡聚糖凝膠G-10分離純化木二糖回收率響應(yīng)面二次方程模型方差分析表
[0076]實(shí)施例2、純化制備高純度木二糖
[0077]在實(shí)施例1中優(yōu)化后的條件下純化制備高純度木二糖，具體操作如下：
[0078] (1)超濾：同上述一中步驟(1)的操作。
[0079] (2)將濾液流過(guò)離子交換樹(shù)脂柱（離子交換樹(shù)脂柱條件:填充物串聯(lián)順序?yàn)?01-7-D201、填充量V(001-7): V(D201) = 1 · 67:1、進(jìn)樣流速為 1 · 76mL/min)，用DNS法確定開(kāi)始 收集和終止收集濾液的時(shí)間，收集液即木聚糖酶解液的凈化液。
[0080] (3)取5%柱床體積的步驟（2)所得液體栗入已經(jīng)平衡好的凝膠層析（高徑比為 34.03:1的葡聚糖凝膠G-10柱），待液體全部進(jìn)入柱床后，采用1.5倍柱床體積的脫氣去離子 水洗脫，洗脫速度為ο. 73mL/min，每2min收集1管。將收集的液體用高效液相色譜法測(cè)定其 組分含量及各組分的回收率(色譜條件同實(shí)施例1中的六）。
[0081]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示，其中，標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海索萊寶生物科技股份有限公司，純度 為99 %以上。所得木二糖的純度為95.74 ± 1.43%、回收率為93.61 ± 3.50%。葡聚糖凝膠G-10分離純化木二糖的過(guò)程中，木三糖和木糖同時(shí)被純化出來(lái)，所得木三糖的純度為85.11 ± 2.27%、回收率為52.93 ±12.92 % ;木糖的純度為86.61 ±3.57 %、回收率為44.16 土 8.99%。各組分的計(jì)算公式為:純度=M(木二糖含量)/M(總糖含量），回收率=M(過(guò)凝膠柱 前木二糖含量)/M(過(guò)凝膠柱后木二糖含量）。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種純化制備高純度木二糖的方法，包括如下步驟： (1) 將木聚糖酶解液進(jìn)行超濾，收集濾液； (2) 將所述濾液流過(guò)離子交換樹(shù)脂柱，得到木聚糖酶解液的凈化液； (3) 對(duì)所述凈化液進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，即可得到所述木二糖。2. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于:步驟（1)中，所述超濾中采用的超濾膜的 孔徑為0.001~O.Olym，操作壓力可為0.1~0.2MPa。3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述離子交換樹(shù)脂 柱的填充物為陰離子交換樹(shù)脂D201和陽(yáng)離子交換樹(shù)脂001-7。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述填充物的串聯(lián)順序?yàn)殛?yáng)離子交換樹(shù)脂 001-7-陰離子交換樹(shù)脂D201;和/或，所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂001-7和所述陰離子交換樹(shù)脂 D201的體積比為(0.5~2.5):1。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，進(jìn)樣流速為(0.5~ 3·0)mL/min〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述凝膠過(guò)濾層析 的條件為下述1)_4)中的至少一種：1)凝膠層析柱的高徑比為（15~35):1 ;2)進(jìn)樣體積為1 ~9 %的柱床體積;3)米用水進(jìn)彳丁洗脫;4)洗脫速度為0.3~1.2mL/min，洗脫體積為1.0~ 3.0倍柱床體積。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:所述方法在所述凝膠過(guò)濾層析 后還包括得到木糖和木三糖的步驟。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:所述方法在所述凝膠過(guò)濾層析 之后，通過(guò)如下步驟確定各組分:采用HPLC檢測(cè)收集液中的成分，通過(guò)對(duì)比樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的 出峰時(shí)間確定各組分。9. 根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:第0.8~1.2倍柱床體積的洗脫 液為木二糖。10. 根據(jù)權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：第1.2~1.4倍柱床體積的洗 脫液為木糖;第〇. 5~0.7倍柱床體積的洗脫液為木三糖。
【文檔編號(hào)】C07H1/06GK106046066SQ201610357554
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月25日
【發(fā)明人】馮家勛, 趙帥, 蔣隨新
【申請(qǐng)人】廣西大學(xué)