本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及由嵌合aβ1-m肽的諾如病毒衣殼p蛋白形成的重組p顆粒，其中所述重組p顆粒形成了一種有序且重復(fù)的抗原陣列，其中m為選自6-15的整數(shù)。

背景技術(shù)：

阿爾茨海默癥(alzheimer’sdisease,ad)又稱老年癡呆病，是一種漸行性的神經(jīng)退行性疾病，其主要臨床特征是逐漸出現(xiàn)記憶力減退、認知功能障礙和行為異常，最終喪失獨立生活能力，發(fā)病后10～20年因并發(fā)癥死亡。目前這種最為常見的神經(jīng)退行性疾病尚不能治愈，也沒有有效的延緩手段，嚴重危害老年人的身心健康和生活質(zhì)量。

研究者們普遍認為大腦組織中的淀粉樣-β蛋白(amyloid-βprotein，簡稱aβ)是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及認知功能障礙的主要致病物質(zhì)。aβ來源于其前體物質(zhì)β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloidprecursorprotein,簡稱βapp)。βapp是一種跨膜蛋白，在體內(nèi)各種組織中廣泛存在，在腦組織中的表達量最高。βapp在淀粉樣剪切途徑中，能夠被切割成為長度為38至43個氨基酸不等的aβ蛋白，其中aβ1-42蛋白是形成淀粉樣沉積的主要類型。

目前，以刺激機體產(chǎn)生aβ抗體從而清除大腦內(nèi)aβ1-42沉積為目的的aβ主動免疫疫苗，是治療阿爾茨海默癥的重要方法。aβ1-42多肽疫苗作為ad疫苗的先驅(qū)，在ad轉(zhuǎn)基因鼠模型中表現(xiàn)出了良好的延緩記憶減退的治療效果。然而，在aβ1-42多肽疫苗的臨床實驗中，6％的ad患者出現(xiàn)了腦膜炎的副反應(yīng)，且患者產(chǎn)生的aβ1-42抗體水平較低。研究表明aβ1-42多肽疫苗雖然可以引起抗體反應(yīng)，但是由于其攜帶了大量t細胞表位，會使接種患者的腦神經(jīng)細胞產(chǎn)生自身免疫性t細胞反應(yīng)從而引發(fā)腦膜炎。相比于aβ1-42，只包含aβ多肽n端前15個氨基酸的多肽aβ1-15，只含有b細胞表位而不含有t細胞表位，并且該多肽類疫苗能夠刺激人體產(chǎn)生針對aβ1-42蛋白的特異性免疫反應(yīng)，并在人體試驗中表現(xiàn)出良好的安全性。因此，aβ1-15成為了一種非常有研究潛力的抗原肽。但aβ1-15肽作為一種半抗原，其免疫效果以及誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的持續(xù)性不是很好。因此，亟需一種安全性較高且具有良好免疫效果的阿爾茲海默癥的疫苗。

在現(xiàn)有技術(shù)中，通常優(yōu)選分別合成病毒樣顆粒和aβ多肽，然后將兩者偶聯(lián)以獲得高免疫原性的疫苗。然而，通過偶聯(lián)等方法得到的疫苗，難以對插入表位的數(shù)量進行控制，并且也難以對疫苗進行有效的純化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對于aβ1-m(m為選自6-15的整數(shù))肽而言，諾如病毒的衣殼p蛋白是非常理想的抗原展示平臺。將不同拷貝數(shù)，不同長度的aβ1-m(m為選自6-15的整數(shù))肽編碼序列插入到編碼諾如病毒衣殼p蛋白的dna序列的環(huán)狀結(jié)構(gòu)區(qū)域(loop)中時，aβ1-m能夠被展示于重組p蛋白形成的重組p顆粒的最表面，從而有利于最大程度地刺激機體產(chǎn)生針對aβ1-42蛋白的特異性免疫反應(yīng)。本發(fā)明的重組p顆粒制備方法簡單，插入表位數(shù)量可控，純化過程簡單，制造成本低，安全性好，免疫原性高且誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體滴度高。

本發(fā)明利用基因工程手段，將多個拷貝的編碼抗原肽aβ1-m(m為選自6-15的整數(shù))的dna插入到編碼p蛋白的loop1、loop2和/或loop3的dna中。通過重組蛋白的體外表達和自我組裝，形成能夠充分展示aβ1-m(m為選自6-15的整數(shù))抗原表位的重組p顆粒，從而有利于增強疫苗免疫的有效性、持續(xù)性和安全性。

第一方面，本發(fā)明提供了一種由嵌合aβ1-m肽的諾如病毒p蛋白形成的重組p顆粒，其中m為選自6-15的整數(shù)。在本發(fā)明的實施方案中，m可以為6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。所述重組p顆粒形成了一種有序且重復(fù)的抗原陣列。其中至少一個所述aβ1-m肽的氨基酸序列嵌入到所述諾如病毒衣殼p蛋白的loop1、loop2和/或loop3中。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，諾如病毒衣殼p蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示。在重組p顆粒中，n1個aβ1-m肽序列嵌入到選自以下的一個或多個氨基酸位點之后：seqidno:1的第70位-第74位氨基酸，即i70、a71、g72、t73和q74；n2個aβ1-m肽序列嵌入到選自以下的一個或多個氨基酸位點之后：seqidno:1的第148位-第151位氨基酸，即，t148、s149、n150和d151；n3個aβ1-m肽序列嵌入到選自以下的一個或多個氨基酸位點之后：seqidno:1的第168位-第171位氨基酸，即，d168、g169、s170和t171；其中n1、n2和n3為各自獨立地選自0-40的整數(shù)，并且n1+n2+n3≥1。具體地，n1、n2和n3各自獨立地選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40，并且n1+n2+n3≥1。

“aβ1-m肽序列嵌入到一個氨基酸位點之后”意指所述aβ1-m肽序列的n端直接 與該氨基酸殘基的c端通過肽鍵相連或通過氨基酸接頭與該氨基酸相連。在優(yōu)選的實施方案中，所述氨基酸接頭為(gly)n，優(yōu)選n為1-10，更優(yōu)選n＝3。

插入至seqidno:1中的多個連續(xù)aβ1-m肽序列之間可以直接相連也可通過氨基酸接頭相連。在優(yōu)選的實施方案中，所述氨基酸接頭為(gly)n，優(yōu)選n為1-10，更優(yōu)選n＝3。

在本發(fā)明中，aβ1-m肽序列意指完整aβ1-42蛋白n端的前m個氨基酸組成的多肽，其中m為選自6-15的整數(shù)。例如，本發(fā)明中的aβ1-m肽可以是完整aβ1-42蛋白n端的1-6位，1-7位，1-8位，1-9位，1-10位，1-11位，1-12位，1-13位，1-14位或1-15位氨基酸組成的多肽。

本發(fā)明的aβ1-m肽序列可以是人、小鼠、靈長類、兔、光滑爪蟾、大鼠、豚鼠的aβ1-m肽。人、小鼠、靈長類、兔、光滑爪蟾、大鼠、豚鼠的aβ1-15肽的氨基酸序列分別為seqidno:2-seqidno:8所示。根據(jù)這些序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定本發(fā)明的aβ1-m肽(m為選自6-15的整數(shù))。優(yōu)選地，所述aβ1-m肽為人aβ1-m肽。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述嵌合aβ1-m肽的諾如病毒衣殼p蛋白的氨基酸序列為seqidno:15-141。更優(yōu)選地，所述嵌合aβ1-m肽的諾如病毒衣殼p蛋白的氨基酸序列選自seqidno:24、seqidno:39、seqidno:40、seqidno:57、seqidno:73、seqidno:92、seqidno:117、seqidno:132、seqidno:133和seqidno:134。

第二方面，本發(fā)明還提供了編碼形成第一方面中的重組p顆粒的嵌合aβ1-m肽的諾如病毒衣殼p蛋白的核苷酸序列，其中m為選自6-15的整數(shù)。在本發(fā)明的實施方案中，m可以為6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。所述核苷酸序列包含編碼諾如病毒衣殼p蛋白的核苷酸序列和至少一個拷貝的編碼aβ1-m肽的核苷酸序列，其中所述至少一個拷貝的編碼aβ1-m肽的核苷酸序列插入至編碼諾如病毒衣殼p蛋白環(huán)狀區(qū)域的核苷酸序列中，其中所述插入的編碼aβ1-m肽的核苷酸序列不會引起諾如病毒p蛋白的移碼突變。

在具體的實施方案中，所述至少一個拷貝的編碼aβ1-m肽的核苷酸序列可插入至編碼諾如病毒衣殼p蛋白同一環(huán)狀區(qū)域的核苷酸序列中或插入至編碼諾如病毒衣殼p蛋白不同的環(huán)狀區(qū)域的核苷酸序列中。例如，當(dāng)諾如病毒衣殼p蛋白的核苷酸序列為seqidno:9時，loop1對應(yīng)第208-222位核苷酸，loop2對應(yīng)第442-453位核苷酸，loop3對應(yīng)第502–513位核苷酸。

在本發(fā)明的具體實施方案中，插入loop1、loop2和loop3的編碼aβ1-m肽的 核苷酸序列的數(shù)目分別為n1、n2和n3；n1、n2和n3各自獨立地選自0-40的整數(shù)，并且n1+n2+n3≥1。具體地，n1、n2和n3各自獨立地選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40，并且n1+n2+n3≥1。

在本發(fā)明的具體實施方案中，所述編碼aβ1-m肽的核苷酸序列的5’端核苷酸通過3’,5’-磷酸二酯鍵直接與編碼諾如病毒衣殼p蛋白環(huán)狀區(qū)域的核苷酸相連或者通過dna接頭與編碼諾如病毒衣殼p蛋白環(huán)狀區(qū)域的核苷酸相連。所述插入無論是直接插入還是通過dna接頭插入，均不會在核苷酸序列的翻譯中引起移碼。在優(yōu)選的實施方案中，所述dna接頭為(gga)n或(ggg)n或(ggc)n，優(yōu)選n為1-10，更優(yōu)選n＝3。

在本發(fā)明的具體實施方案中，插入至編碼諾如病毒衣殼p蛋白的核苷酸序列中的多個連續(xù)的編碼aβ1-m肽的核苷酸序列之間通過3’,5’-磷酸二酯鍵直接相連或者通過dna接頭相連。所述插入無論是直接插入還是通過dna接頭插入，均不會在核苷酸序列的翻譯中引起移碼。在優(yōu)選的實施方案中，所述dna接頭為(gga)n或(ggg)n或(ggc)n，優(yōu)選n為1-10，更優(yōu)選n＝3。

優(yōu)選地，所述aβ1-m肽核苷酸序列為編碼人、小鼠、靈長類、兔、光滑爪蟾、大鼠、豚鼠的aβ1-m肽的核苷酸序列。更優(yōu)選地，所述aβ1-m肽核苷酸序列為編碼人aβ1-m肽的核苷酸序列。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述編碼嵌合aβ1-m肽的諾如病毒衣殼p蛋白的核苷酸序列為seqidno:142-268。更優(yōu)選地，所述編碼嵌合aβ1-m肽的諾如病毒衣殼p蛋白的核苷酸序列選自：seqidno:151、seqidno:166、seqidno:167、seqidno:184、seqidno:200、seqidno:219、seqidno:244、seqidno:259、seqidno:260和seqidno:261。

第三方面，本發(fā)明還提供了一種可用于預(yù)防或治療阿爾茲海默癥的藥物組合物，其包含本發(fā)明第一方面的重組p顆粒和可藥用載體。所述藥物組合物優(yōu)選用于哺乳動物，更優(yōu)選用于人。優(yōu)選地，所述藥物組合物是疫苗組合物，更優(yōu)選地，所述疫苗組合物還包含佐劑。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述佐劑是cpg。在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，所述佐劑是鋁佐劑。所述疫苗組合物優(yōu)選通過皮下或鼻腔途徑免疫，更優(yōu)選通過皮下途徑免疫。

第四方面，本發(fā)明還提供了本發(fā)明第一方面的重組p顆粒用于制備用于治療或預(yù)防阿爾茲海默癥的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述藥物是疫苗。所述藥物優(yōu)選用于哺乳動物，更優(yōu)選用于人。

第五方面，本發(fā)明還提供了一種用于制備本發(fā)明第一方面的重組p顆粒的方法，所述方法包括以下步驟：

i)獲得含有編碼嵌合aβ1-m肽的諾如病毒衣殼p蛋白的核酸的表達載體，其中m為6-15的整數(shù)；

ii)將所述表達載體轉(zhuǎn)入受體細胞；

iii)表達所述嵌合aβ1-m肽的諾如病毒衣殼p蛋白并在自組裝成重組p顆粒，

優(yōu)選地，所述方法還包括分離和純化步驟。

在一個具體的實施方案中，可以使用陽離子交換色譜法和/或疏水層析色譜法進行純化。

附圖說明

圖1示出了各重組pet26b質(zhì)粒構(gòu)建體的圖譜。

a為已經(jīng)構(gòu)建好的pet26b-pprotein質(zhì)粒示意圖；

b為帶有突變得到的meagi酶切位點的pet26b-pprotein-meagi質(zhì)粒示意圖；

c為帶有突變得到的meagi和mkpni酶切位點的pet26b-pprotein-meagi&mkpni質(zhì)粒示意圖；

d為pet26b-pprotein-10copy-aβ1-6-loop1g72質(zhì)粒示意圖，在mkpni酶切位點和sali酶切位點間搭載目的基因片段pprotein-10copy-aβ1-6-loop1g72；

e為pet26b-pprotein-1copy-aβ1-6-loop2s149質(zhì)粒示意圖，在meagi酶切位點和sali酶切位點間搭載目的基因片段pprotein-1copy-aβ1-6-loop2s149；

f為pet26b-pprotein-10copy-aβ1-6-loop2s149質(zhì)粒示意圖，在meagi酶切位點和sali酶切位點間搭載目的基因片段pprotein-10copy-aβ1-6-loop2s149；

g為pet26b-pprotein-20copy-aβ1-6-loop3g169質(zhì)粒示意圖，在meagi酶切位點和sali酶切位點間搭載目的基因片段pprotein-20copy-aβ1-6-loop3g169；

h為pet26b-pprotein-10copy-aβ1-15-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149質(zhì)粒示意圖，在meagi酶切位點和mkpni酶切位點間搭載目的基因片pprotein-10copy-aβ1-15-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149；

i為pet26b-pprotein-3copy-aβ1-12-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169質(zhì)粒示意圖，在meagi酶切位點和mkpni酶切位點間搭載目的基因片段pprotein-3copy-aβ1-12-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169；

j為pet26b-pprotein-1copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop3g169質(zhì)粒示意 圖，在meagi酶切位點和mkpni酶切位點間搭載目的基因片段pprotein-1copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop3g169；

k為pet26b-pprotein-1copy-aβ1-6-loop1g72-1copy-aβ1-6-loop2s149-1copy-aβ1-6-loop3g169質(zhì)粒示意圖，在meagi酶切位點和mkpni酶切位點間搭載目的基因片段pprotein-1copy-aβ1-6-loop1g72-1copy-aβ1-6-loop2s149-1copy-aβ1-6-loop3g169。

l為pet26b-pprotein-3copy-aβ1-6-loop1g72-3copy-aβ1-6-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169質(zhì)粒示意圖，在meagi酶切位點和mkpni酶切位點間搭載目的基因片段pprotein-3copy-aβ1-6-loop1g72-3copy-aβ1-6-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169。

m為pet26b-pprotein-10copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149-10copy-aβ1-6-loop3g169質(zhì)粒示意圖，在meagi酶切位點和mkpni酶切位點間搭載目的基因片

pprotein-10copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149-10copy-aβ1-6-loop3g169。

圖2示出了目的基因片段結(jié)構(gòu)示意圖。

a為p蛋白三個環(huán)狀結(jié)構(gòu)—loop1、loop2、loop3位置示意圖以及定點突變位點和p蛋白基因自帶酶切位點；

b為loop1上，位點g72后嵌合有十個拷貝的aβ1-6基因的p顆粒目的基因片段示意圖，簡稱pprotein-10copy-aβ1-6-loop1g72；

c為loop2上，位點s149后嵌合有一個拷貝的aβ1-6基因的p顆粒目的基因片段示意圖，簡稱pprotein-1copy-aβ1-6-loop2s149；

d為loop2上，位點s149后嵌合有十個拷貝的aβ1-6基因的p顆粒目的基因片段示意圖，簡稱pprotein-10copy-aβ1-6-loop2s149；

e為loop3上，位點g169后嵌合有二十個拷貝的aβ1-6基因的p顆粒目的基因片段示意圖，簡稱pprotein-20copy-aβ1-6-loop3g169；

f為loop1上，位點g72后嵌合有十個拷貝的aβ1-15基因，loop2上，位點s149后嵌合有十個拷貝的aβ1-6基因的p顆粒目的基因片段示意圖，簡稱pprotein-10copy-aβ1-15-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149；

g為loop2上，位點s149后嵌合有三個拷貝的aβ1-12基因，loop3上，位點g169后嵌合有三個拷貝的aβ1-6基因的p顆粒目的基因片段示意圖，簡稱pprotein-3copy-aβ1-12-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169

h為loop1上，位點g72后嵌合有一個拷貝的aβ1-6基因，loop3上，位點g169 后嵌合有十個拷貝的aβ1-6基因的p顆粒目的基因片段示意圖，簡稱pprotein-1copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop3g169

i為loop1上，位點g72后嵌合有一個拷貝的aβ1-6基因，loop2上，位點s149后嵌合有一個拷貝的aβ1-6基因，loop3上，位點g169后嵌合有一個拷貝的aβ1-6基因的p顆粒目的基因片段示意圖，簡稱pprotein-1copy-aβ1-6-loop1g72-1copy-aβ1-6-loop2s149-1copy-aβ1-6-loop3g169。

j為loop1上，位點g72后嵌合有三個拷貝的aβ1-6基因，loop2上，位點s149后嵌合有三個拷貝的aβ1-6基因，loop3上，位點g169后嵌合有三個拷貝的aβ1-6基因的p顆粒目的基因片段示意圖，簡稱pprotein-3copy-aβ1-6-loop1g72-3copy-aβ1-6-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169

k為loop1上，位點g72后嵌合有十個拷貝的aβ1-6基因，loop2上，位點s149后嵌合有十個拷貝的aβ1-6基因，loop3上，位點g169后嵌合有十個拷貝的aβ1-6基因的p顆粒目的基因片段示意圖，簡稱pprotein-10copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149-10copy-aβ1-6-loop3g169

圖3示出了10種重組p顆粒示意圖。a為pprotein-10copy-aβ1-6-loop1g72示意圖；b為pprotein-1copy-aβ1-6-loop2s149示意圖；c為pprotein-10copy-aβ1-6-loop2s149示意圖；d為pprotein-20copy-aβ1-6-loop3g169示意圖；e為pprotein-10copy-aβ1-15-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149示意圖；f為pprotein-3copy-aβ1-12-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169示意圖；g為pprotein-1copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop3g169示意圖；h為pprotein-1copy-aβ1-6-loop1g72-1copy-aβ1-6-loop2s149-1copy-aβ1-6-loop3g169示意圖；i為pprotein-3copy-aβ1-6-loop1g72-3copy-aβ1-6-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169示意圖；j為pprotein-10copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149-10copy-aβ1-6-loop3g169示意圖；

圖4示出了重組p顆粒純化與性質(zhì)的表征。a為pp-10copy-aβ1-6-loop1g72蛋白sds-page和非變性蛋白電泳圖譜，以及電鏡照片；b為pp-1copy-aβ1-6-loop2s149蛋白sds-page和非變性蛋白電泳圖譜，以及電鏡照片；c為pp-10copy-aβ1-6-loop2s149蛋白sds-page和非變性蛋白電泳圖譜，以及電鏡照片d為pp-20copy-aβ1-6-loop3g169蛋白sds-page和非變性蛋白電泳圖譜，以及電鏡照片；e為pp-10copy-aβ1-15-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149蛋白sds-page和非變性蛋白電泳圖譜，以及電鏡照片；f為pp-3copy-aβ1-12-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169蛋白sds-page和非變性蛋白電 泳圖譜，以及電鏡照片；g為pp-1copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop3g169蛋白sds-page和非變性蛋白電泳圖譜，以及電鏡照片；h為pp-1copy-aβ1-6-loop1g72-1copy-aβ1-6-loop2s149-1copy-aβ1-6-loop3g169蛋白sds-page和非變性蛋白電泳圖譜，以及電鏡照片；i為pp-3copy-aβ1-6-loop1g72-3copy-aβ1-6-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169蛋白sds-page和非變性蛋白電泳圖譜，以及電鏡照片；j為pp-10copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149-10copy-aβ1-6-loop3g169蛋白sds-page和非變性蛋白電泳圖譜，以及電鏡照片。

圖5示出了pp-10copy-aβ1-6-loop2s149蛋白疫苗在c57bl/6j小鼠模型中的最佳免疫劑量和最適免疫佐劑的確定。a為以不同劑量和不同免疫佐劑刺激的pp-10copy-aβ1-6-loop2s149蛋白疫苗免疫后，小鼠免疫血清抗aβ42抗體的檢測。b為以不同形式的pp-10copy-aβ1-6-loop2s149蛋白疫苗免疫后，小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生t細胞反應(yīng)情況檢測。

圖6示出了三種不同形式的蛋白疫苗免疫小鼠后，小鼠免疫血清抗aβ42抗體elisa檢測以及不同免疫組別aβ42抗體水平的比較。a為pbs皮下免疫組四次免疫結(jié)果統(tǒng)計圖；b為pbs鼻腔免疫組四次免疫結(jié)果統(tǒng)計圖；c為cpg皮下免疫組四次免疫結(jié)果統(tǒng)計圖；d為cpg鼻腔免疫組四次免疫結(jié)果統(tǒng)計圖。e為pp-1copy-aβ1-6-loop2s149以cpg為佐劑皮下免疫組四次免疫結(jié)果統(tǒng)計圖；f為pp-1copy-aβ1-6-loop2s149以cpg為佐劑鼻腔免疫組四次免疫結(jié)果統(tǒng)計圖；g為pp-10copy-aβ1-6-loop2s149以cpg為佐劑皮下免疫組四次免疫結(jié)果統(tǒng)計圖；h為pp-10copy-aβ1-6-loop2s149以cpg為佐劑鼻腔免疫組四次免疫結(jié)果統(tǒng)計圖；i為pp-3copy-aβ1-6-loop1g72-3copy-aβ1-6-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169為佐劑皮下免疫組四次免疫結(jié)果統(tǒng)計圖；j為pp-3copy-aβ1-6-loop1g72-3copy-aβ1-6-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169為佐劑鼻腔免疫組四次免疫結(jié)果統(tǒng)計圖；k為各組第四次免疫后結(jié)果對比圖，pp-3copy-aβ1-6-loop1g72-3copy-aβ1-6-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169以cpg為佐劑皮下免疫組免疫效果最佳。

序列表說明

seqidno:1為諾如病毒p蛋白的氨基酸序列。

seqidno:2-8分別為人、小鼠、靈長類、兔、光滑爪蟾、大鼠、豚鼠的aβ1-15肽的氨基酸序列。

seqidno:9為編碼諾如病毒p蛋白的核苷酸序列。

seqidno:10為編碼人aβ1-15肽的核苷酸序列。

seqidno:11為獲得pet26b-pprotein-meagi質(zhì)粒過程中所使用的定點突變正向引物。

seqidno:12為獲得pet26b-pprotein-meagi質(zhì)粒過程中所使用的定點突變反向引物。

seqidno:13為獲得pet26b-pprotein-meagi&mkpni質(zhì)粒過程中所使用的定點突變正向引物。

seqidno:14為獲得pet26b-pprotein-meagi&mkpni質(zhì)粒過程中所使用的定點突變反向引物。

seqidno:15-seqidno:141為編碼本發(fā)明實施例中制備的嵌合aβ1-m肽的諾如病毒衣殼p蛋白的核酸序列。

seqidno:142-seqidno:151為構(gòu)建表達優(yōu)選的10種重組p蛋白的重組質(zhì)粒的過程中，合成的目的dna片段的核苷酸序列，分別對應(yīng)10copy-aβ1-6-loop1g72、1copy-aβ1-6-loop2s149、10copy-aβ1-6-loop2s149、20copy-aβ1-6-loop3g169、

3copy-aβ1-12-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169、

10copy-aβ1-15-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149、

1copy-aβ1-6-loop1-g72-10copy-aβ1-6-loop3g169、

1copy-aβ1-6-loop1g72-1copy-aβ1-6-loop2s149-1copy-aβ1-6-loop3g169、

3copy-aβ1-6-loop1g72-3copy-aβ1-6-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169、

10copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149-10copy-aβ1-6-loop3g169。

具體實施方式

定義：

除了另有說明以外，本發(fā)明中所有科技術(shù)語均使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的含義。

有序且重復(fù)的抗原陣列：是指多個aβ1-m肽(m為選自6-15的整數(shù))重復(fù)并且有序地排列在諾如病毒重組p顆粒的表面。

p蛋白(pprotein)：是指諾如病毒的衣殼蛋白中的p蛋白，其能夠在體外自主裝成p顆粒。用于本文時，在基因水平上使用pprotein，意指編碼p蛋白的基因片段、核苷酸序列、質(zhì)粒等；在蛋白質(zhì)水平上使用pprotein，意指p蛋白單體或二聚體。在附圖中，蛋白示意圖均為pprotein，例如圖1、2和3中所示的編碼p蛋白的質(zhì)粒， 以及圖4中變性電泳中所示的p蛋白單體。

p顆粒(pparticle，簡稱pp)：是指諾如病毒中由p蛋白在體外自組裝成的蛋白顆粒，以24聚體形式最為常見。用于本文時，僅在蛋白質(zhì)水平上使用pparticle(pp)，意指多聚體(例如24聚體等)的形式，包括各種應(yīng)用于性質(zhì)檢測的蛋白和用于免疫的蛋白，如圖4中非變性電泳中所示的多聚體形式。

pprotein-n1copy-aβ1-m-loop1ak1-n2copy-aβ1-m-loop2ak2-n3copy-aβ1-m-loop3ak3：意指在p蛋白的loop1環(huán)中第k1位氨基酸后嵌合有n1個拷貝的aβ1-m，在loop2環(huán)中第k2位氨基酸后嵌合有n2個拷貝的aβ1-m，并且loop3環(huán)中第k3位氨基酸后嵌合有n3個拷貝的aβ1-m，并且m為各自獨立地選自1-40的整數(shù)。除非另有說明，aβ1-m與p蛋白之間通過具有三個甘氨酸的多肽接頭連接。例如，pprotein-1copy-aβ1-6-loop2t148-1copy-aβ1-6-loop2s149-1copy-aβ1-6-loop2n150：意指在p蛋白的loop2環(huán)中的第148位的氨基酸后，以及第149位的氨基酸后，以及第150位的氨基酸后分別嵌合有1個拷貝的aβ1-6，并且所有aβ1-6與p蛋白之間通過具有3個由gga編碼的甘氨酸的氨基酸接頭相連。

pprotein-10copy-aβ1-6-loop2s149(gga)0：意指在p蛋白的loop2環(huán)中的第149位的氨基酸后嵌合有10個拷貝的aβ1-6，并且aβ1-6與p蛋白之間不具有接頭，且各個aβ1-6之間不具有氨基酸接頭，即aβ1-6與p蛋白之間及各個aβ1-6之間通過肽鍵直接相連。

pprotein-10copy-aβ1-6-loop2s149(ggc)3：意指在p蛋白的loop2環(huán)中的第149位的氨基酸后嵌合有10個拷貝的aβ1-6，并且aβ1-6與p蛋白之間通過具有3個由ggc編碼的甘氨酸的氨基酸接頭相連，且各個aβ1-6之間通過具有3個ggc編碼的甘氨酸的氨基酸接頭相連。

下面以具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的說明；但本發(fā)明并不限于這些實施例。除非另有說明，本文使用的制劑和設(shè)備均為普通市售品。

本發(fā)明提供了127種在p蛋白的loop1，loop2和/或loop3區(qū)域嵌合有多個拷貝的aβ1-m肽(m為選自6-15的整數(shù))的重組p顆粒，形成所述127種重組p顆粒的重組p蛋白如表1所示。

表1.形成本發(fā)明的127種重組p顆粒的重組p蛋白的氨基酸序列和編碼其的核苷酸序列

以下各表中的組號的重組p蛋白或重組p顆粒分別對應(yīng)表1中相應(yīng)組號的重組p蛋白。

本發(fā)明還提供了制備所述重組p蛋白顆粒的方法，包括以下步驟：

1.人工合成dna片段，其包含編碼嵌合有多拷貝aβ1-m肽的p蛋白loop1、loop2和/或loop3結(jié)構(gòu)域的dna片段；

2.構(gòu)建pet26b-pprotein質(zhì)粒(如圖1a所示)；

3.采用點突變法，在不改變氨基酸序列的前提下，在p蛋白的loop1前和loop3后進行定點突變，獲得新的酶切位點mkpni和meagi(如圖1b所示)；

4.利用編碼p蛋白的核酸上自帶的酶切位點sali以及所獲得的酶切位點mkpni和meagi，根據(jù)不同的構(gòu)建需求，用步驟1中獲得的合成的編碼嵌合有多拷貝aβ1-m肽的p蛋白loop1、loop2和/或loop3結(jié)構(gòu)域的dna片段對多個野生型環(huán)狀結(jié)構(gòu)dna進行整體替換，構(gòu)建多種分別搭載多拷貝aβ1-m肽的重組p蛋白表達質(zhì)粒(如圖1d-1m所示)；

5.將步驟4中獲得的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌內(nèi)，穩(wěn)定表達嵌合有aβ1-m免疫原的p蛋白，并自組裝形成24聚體形式的p顆粒。

此外，本發(fā)明還進行了以下分析驗證實驗：

1.通過粒徑測定和電鏡分析對優(yōu)選的十種蛋白疫苗進行了性質(zhì)表征(如圖4所示)。

2.利用pp-10copy-aβ1-6-loop2s149蛋白疫苗在c57bl/6j小鼠模型中進行了利用不同免疫劑量和不同免疫佐劑的實驗，結(jié)果表明，以cpg為免疫佐劑時，25μg蛋白疫苗可刺激小鼠產(chǎn)生最高滴度的針對于aβ1-42的特異性抗體，同時該蛋白疫苗不會引起小鼠產(chǎn)生針對于aβ1-42的t細胞反應(yīng)(如圖5所示)。

3.以pp-1copy-aβ1-6-loop2s149、pp-10copy-aβ1-6-loop2s149、pp-3copy-aβ1-6-loop1g72-3copy-aβ1-6-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169三種蛋白疫苗為免疫原，以cpg為免疫佐劑，在小鼠模型中比較三種蛋白疫苗的免疫效果，同時分析皮下和鼻腔兩種免疫方式對于蛋白疫苗免疫效果的影響(結(jié)果如圖6所示)。實驗結(jié)果表明，相比于鼻腔免疫，皮下免疫方式更利于蛋白疫苗誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生。

4.用127種候選蛋白進行免疫，比較多種蛋白的免疫效果，篩選出最優(yōu)的候選疫苗。結(jié)果表明：相對于pbs對照組，多種疫苗均可以刺激小鼠產(chǎn)生針對于aβ1-42的特異性抗體；其中10種蛋白pp-10copy-aβ1-6-loopg72、pp-1copy-aβ1-6-loop2s149、pp-10copy-aβ1-6-loop2s149、pp-20copy-aβ1-6-loop3g169、pp-10copy-aβ1-15-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149、pp-3copy-aβ1-12-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169、pp-1copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop3g169、pp-1copy-aβ1-6-loop1g72-1copy-aβ1-6-loop2s149-1copy-aβ1-6-loop3g169、pp-3copy-aβ1-6-loop1g72-3copy-aβ1-6-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169、pp-10copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149-10copy-aβ1-6-loop3g169的免疫效果最佳，其刺激產(chǎn)生的aβ42抗體濃度較高。

實施例1.pet26b-pprotein質(zhì)粒的構(gòu)建

取4μgpet26載體質(zhì)粒(購自novagen公司)，加入ndei酶和xhoi酶(購自takara公司)各1μl，并加入5μl酶切緩沖液(購自takara公司)，最后向體系中加入無菌水使終體積為50μl，37℃，酶切5小時，并對產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用回收柱(購自invetrogen)進行回收，得到具有雙酶切粘性末端的質(zhì)粒載體。

通過基因合成的方法，合成如seqidno:9所示的p蛋白核苷酸序列，利用上述相同的雙酶切方法，對合成的基因片段進行ndei/xhoi雙酶切，并對產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用回收柱進行回收，得到具有雙酶切粘性末端的目的基因片段。

取上述雙酶切后的載體片段和目的片段(摩爾比為1:3，總體積15μl)，混合，加入0.75μl的t4連接酶(購自takara公司)，以及1.5μl連接酶緩沖液(購自takara公司)，16℃連接過夜，得到具有能夠表達p蛋白顆粒的pet26b-pprotein質(zhì)粒，如圖1a所示。

實施例2.帶有酶切位點mkpni和meagi的pet26b-pprotein質(zhì)粒的構(gòu)建定點突變方法如下：

1.通過定點突變的方法，利用實施例1已經(jīng)構(gòu)建的pet26b-pprotein質(zhì)粒，將5’ccgccg3’突變成5’cggccg3’以獲得含有meagi酶切位點的pet26b-pprotein-meagi質(zhì)粒，并且不改變氨基酸序列。具體實施方法如下：利用一對包含突變位點的完全互補的雙向引物：

seqidno:11(正向)：5’cgttcacttggctccggccgtggctccaacc3’；

seqidno:12(反向)：5’ggttggagccacggccggagccaagtgaacg3’，

對整個質(zhì)粒進行pcr反應(yīng)，其pcr反應(yīng)體系為kod-plusdna聚合酶體系(購自toyobo公司)，反應(yīng)體系總體積為50μl(緩沖液5μl，dntp0.2mm，硫酸鎂1mm，上下游引物各0.3μm，模板dna50ng，kod酶1μl,加水補充至終體積50μl)按照反應(yīng)體系說明書進行pcr，得到20μlpcr產(chǎn)物，向產(chǎn)物中加入1μldpni酶(購自neb公司)，37℃酶切1h，取10μl酶切產(chǎn)物加入tran1-blue感受態(tài)細胞中(購自北京全式金公司)，冰上放置30min后42℃熱擊45s，冰上放置2min，而后將其加入600μl無抗性的液體lb培養(yǎng)基中，37℃200rpm復(fù)蘇1h。將菌液平鋪于含有卡那霉素(15μg/ml)的lb固體培養(yǎng)板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。得到突變質(zhì)粒的克隆，測序驗證序列正確。pet26b-pprotein-meagi質(zhì)粒如圖1b所示。

2.利用上一步驟構(gòu)建的pet26b-pprotein-meagi重組質(zhì)粒(如圖1b所示)，將5’ggcaca3’突變成5’ggtacc3’以獲得既含有meagi酶切位點又含有mkpni酶切位點的pet26b-pprotein-meagi&mkpni質(zhì)粒，并且不改變氨基酸序列，其具體實施方法如下：利用一對包含突變位點的完全互補的雙向引物：

seqidno:13(正向)：5’ggtgtcctgctcggtaccacccagctctcacc3’，

seqidno:14(反向)：5’ggtgagagctgggtggtaccgagcaggacacc3’，利用與上述相同的構(gòu)建方法，得到pet26b-pprotein-meagi&mkpni質(zhì)粒，測序驗證序列正確。pet26b-pprotein-meagi&mkpni質(zhì)粒如圖1c所示。

實施例3.嵌合有人aβ1-m基因的p顆粒環(huán)狀結(jié)構(gòu)目的基因片段的合成

此步驟共有3種不同的合成方案：

第一種為嵌合位于mkpni酶切位點和sali酶切位點間的人aβ1-m基因的p蛋白環(huán)狀結(jié)構(gòu)目的基因片段，即僅在loop1上嵌合n1個拷貝的aβ1-m基因，此方法制備的p蛋白簡稱pprotein-n1copy-aβ1-m-loop1；

第二種為嵌合位于sali酶切位點和meagi酶切位點間的人aβ1-m基因的p蛋白環(huán)狀結(jié)構(gòu)目的基因片段，即(1)僅在loop2上嵌合n2個拷貝的aβ1-m基因，此方法制備的p蛋白簡稱pprotein-n2copy-aβ1-m-loop2；(2)僅在loop3上嵌合n3個拷貝的aβ1-m基因，此方法制備的p蛋白簡稱pprotein-n3copy-aβ1-m-loop3；(3)在loop2上嵌合n2個拷貝的aβ1-m基因并且在loop3上嵌合n3個拷貝的aβ1-m基因，此方法制備的p蛋白簡稱pprotein-n2copy-aβ1-m-loop2-n3copy-aβ1-m-loop3。其中m為各自獨立地選自1～40的整數(shù)。

第三種為位于mkpni酶切位點和meagi酶切位點間的嵌合人aβ1-m基因的p蛋白環(huán)狀結(jié)構(gòu)目的基因片段，即(1)在loop1上嵌合n1個拷貝的aβ1-m基因，并且在loop2上嵌合n2個拷貝的aβ1-m基因，此方法制備的p蛋白簡稱pprotein-n1copy-aβ1-m-loop1-n2copy-aβ1-m-loop2；(2)在loop1上嵌合n1個拷貝的aβ1-m基因，并且在loop3上嵌合n3個拷貝的aβ1-m基因，此方法制備的p蛋白簡稱pprotein-n1copy-aβ1-m-loop1-n3copy-aβ1-m-loop3；(3)在loop1上嵌合n1個拷貝的aβ1-m基因，并且在loop2上嵌合n2個拷貝的aβ1-m基因，并且在loop3上嵌合n3個拷貝的aβ1-m基因，此方法制備的p蛋白簡稱pprotein-n1copy-aβ1-m-loop1-n2copy-aβ1-m-loop2-n3copy-aβ1-m-loop3。其中m為各自獨立地選自1～40的整數(shù)。

以下舉例說明上述三種合成方案。

3.1方案一：

3.1.1

pprotein-10copy-aβ1-6-loop1g72的嵌合有編碼10個拷貝的aβ1-6肽的dna的loop1基因片段的合成(如圖2b所示)，合成的基因片段序列如seqidno:269所示。

3.2方案二：

3.2.1

pprotein-1copy-aβ1-6-loop2s149的嵌合有編碼1個拷貝的aβ1-6肽的dna的loop2基因片段的合成(如圖2c所示)，合成的基因片段序列如seqidno:270所示。

3.2.2

pprotein-10copy-aβ1-6-loop2s149的嵌合有編碼10個拷貝的aβ1-6肽的dna的loop2基因片段的合成(如圖2d所示)，合成的基因片段序列如seqidno:271所示。

3.2.3

pprotein-20copy-aβ1-6-loop3g169的嵌合有編碼20個拷貝的aβ1-6肽的dna的loop3基因片段的合成(如圖2e所示)，合成的基因片段序列如seqidno:272所示。

3.2.4

pprotein-3copy-aβ1-12-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169的嵌合有編碼3個拷貝的aβ1-12肽的dna的loop2和編碼3個拷貝的aβ1-6肽的dna的loop3的基因片段的合成(如圖2g所示)，合成的基因片段序列如seqidno:273所示。

3.3方案三：

3.3.1

pprotein-10copy-aβ1-15-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149的分別嵌合有編碼10個拷貝的aβ1-15肽的dna的loop1和編碼10個拷貝的aβ1-6肽的dna的loop2的基因片段(如圖2f所示)，合成的基因片段序列如seqidno:274所示。

3.3.2

pprotein-1copy-aβ1-6-loop1-g72-10copy-aβ1-6-loop3g169的分別嵌合有編碼1個拷貝的aβ1-6肽的dna的loop1和編碼10個拷貝的aβ1-6肽的dna的loop3的基因片段的合成(如圖2h所示)，合成的基因片段序列如seqidno:275所示。

3.3.3

pprotein-1copy-aβ1-6-loop1g72-1copy-aβ1-6-loop2s149-1copy-aβ1-6-loop3g169的分別嵌合有編碼1個拷貝的aβ1-6肽的dna的loop123基因片段的合成(如圖2i所示)，合成的基因片段序列如seqidno:276所示。

3.3.4

pprotein-3copy-aβ1-6-loop1g72-3copy-aβ1-6-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169的分別嵌合有編碼3個拷貝的aβ1-6肽的dna的loop1、loop2、loop3基因片段的合 成(如圖2j所示)，合成的基因片段序列如seqidno:277所示。

3.3.5

pprotein-10copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149-10copy-aβ1-6-loop3g169的分別嵌合有編碼10個拷貝的aβ1-6肽的dna的loop1、loop2、loop3基因片段的合成(如圖2k所示)，合成的基因片段序列如seqidno:278所示。

此外，除了上述10種重組p蛋白之外，還有其他117種重組p蛋白的合成方法分別使用上述三種方案，具體如表2所示：

表2.本發(fā)明的127種重組p蛋白的合成方法和127種表達重組p蛋白的質(zhì)粒的構(gòu)建方法

實施例4.穩(wěn)定表達嵌合有aβ1-m免疫原的p蛋白的pet26b載體的構(gòu)建

與實施例3相對應(yīng)，此步驟共有3種不同的合成方案：

第一種針對實施例3的方案一，為位于mkpni酶切位點和sali酶切位點間的嵌合人aβ1-m基因的p顆粒環(huán)狀結(jié)構(gòu)目的基因片段，即僅在loop1上嵌合n1個拷貝的aβ1-m基因，此方法制備的p蛋白簡稱pprotein-n1copy-aβ1-m-loop1；

第二種針對實施例3的方案二，為位于sali酶切位點和meagi酶切位點間的嵌合人aβ1-m基因的p顆粒環(huán)狀結(jié)構(gòu)目的基因片段，即(1)僅在loop2上嵌合n2個拷貝的aβ1-m基因，此方法制備的p蛋白簡稱pprotein-n2copy-aβ1-m-loop2；(2)僅在loop3上嵌合n3個拷貝的aβ1-m基因，此方法制備的p蛋白簡稱pprotein-n3copy-aβ1-m-loop3；(3)在loop2上嵌合n2個拷貝的aβ1-m基因并且在loop3上嵌合n3個拷貝的aβ1-m基因，此方法制備的p蛋白簡稱pprotein-n2copy-aβ1-m-loop2-n3copy-aβ1-m-loop3。

第三種針對實施例3的合成嵌合有aβ1-m免疫原的p蛋白的方案三，

為位于mkpni酶切位點和meagi酶切位點間的嵌合人aβ1-m基因的p顆粒環(huán)狀結(jié)構(gòu)目的基因片段，(1)在loop1上嵌合n1個拷貝的aβ1-m基因，并且在loop2上嵌合n2個拷貝的aβ1-m基因，此方法制備的p蛋白簡稱pprotein-n1copy-aβ1-m-loop1-n2copy-aβ1-m-loop2；(2)在loop1上嵌合n1個拷貝的aβ1-m基因，并且在loop3上嵌合n3個拷貝的aβ1-m基因，此方法制備的p蛋白簡稱pprotein-n1copy-aβ1-m-loop1-n3copy-aβ1-m-loop3；(3)在loop1上嵌合n1個拷貝的aβ1-m基因，并且在loop2上嵌合n2個拷貝的aβ1-m基因，并且在loop3上嵌合n3個拷貝的aβ1-m基因，此方法制備的p蛋白簡稱pprotein-n1copy-aβ1-m-loop1-n2copy-aβ1-m-loop2-n3copy-aβ1-m-loop3。

以下舉例說明上述三種合成方案。

4.1方案一：

利用突變而得的mkpni酶切位點和序列自帶的sali酶切位點，對實施例2獲得的pet26b-pprotein-meagi-mkpni質(zhì)粒載體進行sali/kpni雙酶切，切除原有的loop1區(qū)域，回收質(zhì)粒作為載體。

同時對實施例3中合成的含有多個拷貝的人aβ1-m序列的重組loop1dna片段進行sali/kpni雙酶切，得到目的dna片段。

將所述酶切目的dna片段連接到酶切載體上，得到能夠表達嵌合有aβ1-m免疫原的重組p蛋白的pet26b質(zhì)粒。最后測序驗證序列是否正確，得到正確的質(zhì)粒。

4.1.1表達pp-10copy-aβ1-6-loop1g72蛋白的質(zhì)粒載體的構(gòu)建

取4μg實施例2中獲得的pet26b-pprotein-meagi-mkpni質(zhì)粒載體，加入sali酶和kpni酶(購自takara公司)各1μl，并加入5μl酶切緩沖液(購自takara公司)，最后向體系中加入無菌水使終體積為50μl，37℃，酶切5小時，并對酶切后對產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，并用膠回收試劑盒(購自天根生化技術(shù)有限公司)對產(chǎn)物進行回收，得到具有粘性末端的質(zhì)粒載體。

同時，對實施例3中合成的dna片段10copy-aβ1-6-loop1g72，以同樣的方法進行sali/kpni雙酶切，得到目的基因片段。

將酶切后的載體與目的片段混合，加入t4連接酶(購自takara公司)0.75μl，并加入1.5μl連接酶緩沖液(購自takara公司)，16℃，連接過夜，得到表達pp-10copy-aβ1-6-loop1g72蛋白的質(zhì)粒載體，測序后質(zhì)粒正確，如圖1d所示。

4.2方案二：

利用突變而得的meagi酶切位點和序列自帶的sali酶切位點，對實施例2獲得的pet26b-pprotein-meagi-mkpni質(zhì)粒載體進行sali/eagi雙酶切，切除原有的loop2和loop3區(qū)域，回收質(zhì)粒作為載體。

同時對實施例3中合成的含有多個拷貝的人aβ1-m序列的重組loop2和loop3dna片段進行sali/eagi雙酶切，得到目的dna片段。

將所述酶切目的dna片段連接到酶切載體上，得到能夠表達嵌合有aβ1-m免疫 原的重組p蛋白的pet26b質(zhì)粒。最后測序驗證序列是否正確，得到正確的質(zhì)粒。

4.2.1表達pp-1copy-aβ1-6-loop2s149蛋白的質(zhì)粒載體的構(gòu)建

取4μg實施例2中獲得的pet26b-pprotein-meagi-mkpni質(zhì)粒載體，加入sali酶和eagi酶(購自takara公司)各1μl，并加入適宜的酶切緩沖液(購自takara公司)，最后向體系中加入無菌水使終體積為50μl，37℃，酶切5小時，并對酶切后對產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，并用膠回收試劑盒(購自天根生化技術(shù)有限公司)對產(chǎn)物進行回收，得到具有粘性末端的質(zhì)粒載體。

同時對實施例3中合成的dna片段1copy-aβ1-6-loop2s149，以同樣的方法進行sali/kpni雙酶切，得到目的基因片段。

將酶切后的載體與目的片段混合，加入t4連接酶(購自takara公司)0.75μl，并加入1.5μl連接酶緩沖液(購自takara公司)，16℃，連接過夜，得到表達pp-1copy-aβ1-6-loop2s149蛋白的質(zhì)粒載體,測序后質(zhì)粒正確，如圖1e所示。

4.2.2表達pp-10copy-aβ1-6-loop2s149蛋白的質(zhì)粒載體的構(gòu)建

使用與4.2.1相同的方法，構(gòu)建表達pp-10copy-aβ1-6-loop2s149蛋白的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒如圖1f所示。

4.2.3表達pp-20copy-aβ1-6-loop3g169蛋白的質(zhì)粒載體的構(gòu)建

使用與4.2.1相同的方法，構(gòu)建表達pp-20copy-aβ1-6-loop3g169蛋白的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒如圖1g所示。

4.2.4表達pp-3copy-aβ1-12-loops149-3copy-aβ1-6-loop3g169蛋白的質(zhì)粒載體的構(gòu)建

使用與4.2.1相同的方法，構(gòu)建表達pp-3copy-aβ1-12-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169蛋白的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒如圖1i所示。

4.3方案三：

利用突變而得的meagi酶切位點和突變而得的mkpni酶切位點，對實施例2獲得的pet26b-pprotein-meagi-mkpni質(zhì)粒載體進行mkpni/meagi雙酶切，切除原有的loop1、loop2和loop3區(qū)域，回收質(zhì)粒作為載體。

同時對實施例3中合成的含有多個拷貝的人aβ1-m序列的重組loop1，loop2和loop3dna片段進行mkpni/meagi雙酶切，得到目的dna片段。

將所述酶切目的dna片段連接到酶切載體上，得到能夠表達嵌合有aβ1-m免疫原的重組p蛋白的pet26b質(zhì)粒。最后測序驗證序列是否正確，得到正確的質(zhì)粒。

4.3.1表達pp-3copy-aβ1-6-loop1-g72-3copy-aβ1-6-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169蛋白的質(zhì)粒載體的構(gòu)建

取4μg實施例2中獲得的pet26b-pprotein-meagi-mkpni質(zhì)粒載體，加入kpni酶和eagi酶(購自takara公司)各1μl，并加入適宜的酶切緩沖液(購自takara公司)，最后向體系中加入無菌水使終體積為50μl，37℃，酶切5小時，對產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，并用膠回收試劑盒(購自天根生化技術(shù)有限公司)對酶切后產(chǎn)物進行回收，得到具有粘性末端的質(zhì)粒載體。

同時對實施例3中合成的dna片段3copy-aβ1-6-loop1g72-3copy-aβ1-6-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169，以同樣的方法進行eagi/kpni雙酶切，得到目的基因片段。

將酶切后的載體與目的片段混合，加入t4連接酶(購自takara公司)0.75μl，并加入1.5μl連接酶緩沖液(購自takara公司)，16℃，連接過夜，得到表達pp-1copy-aβ1-6-loop2s149蛋白的質(zhì)粒載體，測序后質(zhì)粒正確，如圖1l所示。

4.3.2表達pp-10copy-aβ1-15-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149蛋白的質(zhì)粒載體的構(gòu)建

使用與4.3.1相同的方法，構(gòu)建表達10copy-aβ1-15-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149蛋白的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒如圖1h所示。

4.3.3表達pp-1copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop3g169蛋白的質(zhì)粒載體的構(gòu)建

使用與4.3.1相同的方法，構(gòu)建表達pp-1copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop3g169蛋白的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒如圖1j所示。

4.3.4表達pp-1copy-aβ1-6-loop1g72-1copy-aβ1-6-loop2s149-1copy-aβ1-6-loop3g169蛋白的質(zhì)粒載體的構(gòu)建

使用與4.3.1相同的方法，構(gòu)建表達pp-1copy-aβ1-6-loop1g72-1copy-aβ1-6-loop2s149-1copy-aβ1-6-loop3g169蛋白的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒如圖1k所示。

4.3.5表達pp-10copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149-10copy-aβ1-6-loop3g169蛋白的質(zhì)粒載體的構(gòu)建

使用與4.3.1相同的方法，構(gòu)建表達pp-10copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s14910copy-aβ1-6-loop3g169蛋白的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒如圖1m所示。

此外，除了上述10種重組p蛋白之外，還有其他117種表達重組p蛋白的質(zhì)粒 的構(gòu)建方法分別使用上述三種方案，具體如表2所示，獲得的重組質(zhì)粒未示出。

實施例5嵌合有人aβ1-m免疫原的p蛋白的表達和純化

5.1重組p顆粒蛋白的表達

分別取上述實施例中制成的重組質(zhì)粒1μl加入100μl大腸桿菌bl21感受態(tài)細胞(購自transgen公司)中，冰浴30min，然后在42℃水浴中，熱激90s后，冰浴2min。向混合物中加入lb培養(yǎng)基600μl，180rpm/min，37℃培養(yǎng)1h。將混合物均勻涂布在含有卡那霉素(15μg/ml)抗性的lb固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24小時，即可獲得可以穩(wěn)定表達重組蛋白的菌株。挑取生長的菌落接種在20mllb培養(yǎng)基中，37℃，220rpm培養(yǎng)，并在培養(yǎng)混合物的od值達到1.0時，用異丙基硫代半乳糖苷(iptg，終濃度0.33mmol/l)進行誘導(dǎo)，16℃，220rpm誘導(dǎo)過夜。誘導(dǎo)完成后，將菌液以4000rpm離心20min，棄上清，用pbs重懸菌體沉淀，再次以4000rpm離心20min，棄上清，得到含有目的蛋白的菌體的沉淀。

5.2重組p顆粒蛋白的提取以及純化

向5.1獲得的菌體沉淀中加入20ml蛋白緩沖液(ph＝8.0，含50mmtris，300mmkcl)重懸，在冰上將菌體超聲30min破碎菌體，將混合物以12000rpm，4℃離心30min，取上清。將上清過0.45μm濾膜后得到蛋白的粗提液。

重組p顆粒蛋白的結(jié)構(gòu)如圖3a-j所示。

利用陽離子交換柱(購自ge公司)對蛋白質(zhì)粗提液進行純化。其具體方案如下：首先用超純水潤洗交換柱，體積約為100ml，然后用ph為5.0的pb溶液平衡交換柱，流速2ml/min，然后將20ml蛋白粗提液以1ml/min的流速加入交換柱，待樣品完全掛柱后，用ph為7.0的pb溶液沖洗交換柱，以除去雜蛋白，然后用含有濃度為1mol/l氯化鈉的pb溶液進行洗脫，收集峰值蛋白，得到目的蛋白。

繼續(xù)用疏水層析柱(購自ge公司)對蛋白進行進一步純化，具體操作方法如下：首先用超純水潤洗柱子，然后用ph為7.0的pb溶液潤洗疏水柱，流速為2ml/min。柱子平衡好之后，注入蛋白樣品，待樣品完全進入柱子后，用ph為7.0的pb與1mol/l氯化鈉溶液進行梯度洗脫，洗脫時長為2小時，氯化鈉濃度從1mol/l下降到0.1mol/l，收獲峰值蛋白。

通過還原性sds-page鑒定10種p顆粒蛋白單體的大小。圖4.a-j的上部圖分別示出pp-10copy-aβ1-6-loop1g72蛋白的大小為45kd；pp-1copy-aβ1-6-loop2s149蛋白的大小為37kd；pp-10copy-aβ1-6-loops149蛋白的大小為45kd；pp-20copy-aβ1-6-loop3g169蛋白的大小為55kd；pp-10copy-aβ1-15-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149蛋白的大小為66kd；pp-3copy-aβ1-12-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169蛋白的大小為38kd；pp-1copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop3g169蛋白的大小為47kd；pp-1copy-aβ1-6-loop1g72-1copy-aβ1-6-loop2 s149-1copy-aβ1-6-loop3g169蛋白的大小為3kd；pp-3copy-aβ1-6-loop1g72-3copy-aβ1-6-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169蛋白的大小為45kd；pp-10copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149-10copy-aβ1-6-loop3g169蛋白的大小為66kd。

然后利用superdex200分子篩(購自ge公司)進一步分離純化p蛋白顆粒的24聚體形式，其操作步驟如下：用超純水潤洗柱子，流速1ml/min，潤洗一個柱體積，然后用體積約120ml的ph5的pb緩沖液再次潤洗柱子，然后將2ml蛋白提取液加入柱子中，用pb緩沖液以1ml/min的流速沖洗，收獲峰值蛋白，得到p顆粒24聚體形式蛋白。并用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測三種蛋白的多聚體結(jié)構(gòu)，如圖4a-j的中間圖所示，10種蛋白條帶均在225kda之上，可知重組p蛋白可以自我組裝成24聚體形式的p蛋白顆粒，并且蛋白純化后，依舊保持了其多聚體的形式。

實施例6嵌合有人aβ1-m免疫原的p蛋白顆粒的性質(zhì)表征

發(fā)明人進一步分析了10種蛋白多聚體的粒徑大小和形態(tài)。粒徑利用納米粒徑儀(購自馬爾文公司)依據(jù)生產(chǎn)商的使用說明進行檢測。分析結(jié)果表明在上述10種重組p顆粒溶液中存在平均直徑在20nm左右的顆粒，如圖4a-j的下部圖所示，pp-10copy-aβ1-6-loop1g72蛋白顆粒的粒徑為27.88nm；pp-1copy-aβ1-6-loop2s149蛋白顆粒的粒徑為17.44nm；pp-10copy-aβ1-6-loop2s149蛋白顆粒的粒徑為27.64nm；pp-20copy-aβ1-6-loop3g169蛋白顆粒的粒為32.55nm；pp-10copy-aβ1-15-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149蛋白顆粒的粒徑為35.88nm；pp-3copy-aβ1-12-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169蛋白顆粒的粒徑為17.02nm；pp-1copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop3g169蛋白顆粒的粒徑為28.92nm；pp-1copy-aβ1-6-loop1g72-1copy-aβ1-6-loop2s149-1copy-aβ1-6-loop3g169蛋白顆粒的粒徑為18.14nm；pp-3copy-aβ1-6-loop1g72-3copy-aβ1-6-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169蛋白顆粒的粒徑為25.56nm；pp-10copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149-10copy-aβ1-6-loop3g169蛋白顆粒的粒徑為36.09nm。同時，電鏡測試結(jié)果表明，重組p蛋白的形態(tài)為近似于球形的顆粒，并為多聚體形式。根據(jù)標(biāo)尺可知，10種蛋白多聚體主要包括20nm左右的顆粒。因此，上述10種重組p蛋白在體外均能自組裝，形成p顆粒24聚體。本發(fā)明的127種p顆粒蛋白的蛋白大小和p顆粒粒徑如表3所示。

表3.本發(fā)明的127種不同形式的重組p顆粒蛋白大小及p顆粒粒徑

3.重組p顆粒蛋白疫苗的免疫效果

3.1p顆粒蛋白疫苗免疫劑量和佐劑的確定

選取pp-10copy-aβ1-6-loop2s149蛋白疫苗，在6-8周的雌性c57bl/6小鼠(購自北京華阜康生物科技股份有限公司)中進行免疫劑量和免疫佐劑的摸索，免疫劑量分別為12.5μg,25μg,50μg/只，用無菌pbs補至100μl/只，每組選用6只小鼠。免疫途徑采用皮下注射方式，免疫佐劑為鋁佐劑(購自brenntagbiosector公司)和能夠特異性激發(fā)機體產(chǎn)生體液免疫的cpg佐劑(購自takara公司)，其核苷酸序列如下：tgtcgtcgtcgtttgtcgtttgtcgtt。第1天，第15天和第29天共計免疫3次，每次免疫前一天取血，第三次免疫兩周后處死小鼠，檢測重組p顆粒蛋白疫苗誘導(dǎo)小鼠的體液免疫和細胞免疫的免疫應(yīng)答。共分為7個實驗組和3個對照組，每組的免疫劑量、佐劑和免疫抗原如表4所示。

表4.pp-10copy-aβ1-6-loop2s149的免疫方案

3.1.1體液免疫—elisa檢測實驗

每次免疫前一天對小鼠割尾取血，血樣37℃放置2h后，4℃放置1h，3000rpm離心，取上層血清，凍存待用。以aβ1-42(購自上海吉爾生化公司)為抗原，用無菌pbs配制成1mg/ml溶液，用抗原包被液稀釋至1ng/μl，包被96孔板，每孔100μl，4℃包被過夜。每孔用300μlpbst(ph7.4，0.01mol/lpbs，含有0.05％tween-20)洗滌三次后，加入封閉液(ph7.4，0.01mol/lpbs，20％的新生牛血清)，37℃封閉2小時。用pbst洗滌三次，加入不同稀釋梯度(1:200、1:800、1:3200、1:12800、1:51200、1：204800)的抗血清，每孔100μl，37℃，孵育2小時。用pbst洗滌三次，加入0.3μg/ml的hrp(辣根過氧化物酶)山羊抗小鼠二抗(購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，每孔100μl，37℃，孵育1小時。pbst洗滌三次，加入底物四甲基聯(lián)苯胺(tmb)(購自天根生化科技有限公司)，每孔100μl，避光顯色25分鐘，每孔加入2m硫酸50μl，終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀(購自bio-red公司)450nm處檢測吸光度。

實驗結(jié)果如圖5.a所示，以cpg為免疫佐劑，并以25μg為劑量時，或者以50μg為劑量而不使用免疫佐劑時，pp-10copy-aβ1-6-loop2-s149蛋白疫苗在所有所示稀釋倍數(shù)時，都可刺激小鼠產(chǎn)生具有相對較高滴度的針對aβ42的特異性抗體。

3.1.2細胞免疫－elispot檢測

利用細胞因子干擾素γ的單克隆抗體(來自elispot試劑盒，購自bd公司)包被96孔板，濃度5μg/ml，每孔50ul,加蓋4℃包被過夜。棄去包被抗體，用10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基洗滌一次后，在每孔加入該完全培養(yǎng)基200μl，37℃封閉1小時后棄去培養(yǎng)基。拉頸將實驗鼠處死，取其脾細胞，制成細胞濃度為10⁷個/ml細胞懸液，將細胞懸液加入包被好的96孔板中，每孔100ul。每孔加入1μg/ml的特異性抗原aβ1-42抗原100μl，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，刺激、活化細胞。24小時后，用無菌水洗板兩次，無菌pbst(ph7.4，0.01mol/lpbs，含有0.05％tween-20)緩沖液洗滌6次，洗去細胞。每孔加入干擾素γ的抗體(來自elispot試劑盒，購自bd公司)，50μl，抗體濃度為2μg/ml，室溫孵育兩小時。洗滌96孔板，加入辣根過氧化物標(biāo)記的生物素二抗(來自elispot試劑盒，購自bd公司)每孔50ul，室溫培養(yǎng)2h，pbst洗滌四次，pbs洗滌2次后，每孔加入50μlelispot顯色液(aec底物)，避光室溫反應(yīng)5～60分鐘，棄去染色液，用蒸餾水洗滌，過夜干燥后，利用顯微鏡計算出樣品中被激活細胞的數(shù)目。

實驗結(jié)果如圖5b所示，t細胞反應(yīng)陽性對照組aβ42組有較多的斑點數(shù)出現(xiàn)， 證明其有較強的t細胞反應(yīng)。而25μg蛋白+鋁佐劑組也有較多的斑點數(shù)出現(xiàn)，證明鋁佐劑會刺激機體產(chǎn)生一定的t細胞反應(yīng)。而25μgpp-10copy-aβ1-6-loop2-s149+cpg佐劑組和50μg組沒有或有較少的陽性斑點數(shù)，證明其在體內(nèi)無明顯的t細胞反應(yīng)發(fā)生，并且如3.1.1中所述，該免疫策略能夠刺激小鼠產(chǎn)生最高滴度的針對于aβ42的特異性抗體。而出于疫苗的安全性考慮，選擇25μgpp-10copy-aβ1-6-loop2s149+cpg佐劑作為最佳免疫策略。

3.2三種重組p顆粒蛋白疫苗的免疫效果比較

通過蛋白疫苗的免疫劑量和免疫佐劑的確定實驗，申請人接下來首先挑選了三種較有代表性的重組蛋白，采用蛋白疫苗劑量為25μg/只，以cpg為佐劑的策略，利用鼻腔和皮下注射兩種免疫方式來比較三種重組p顆粒蛋白疫苗在6-8周的雌性c57bl/6小鼠中的免疫效果，以對比鼻腔和皮下免疫效果，并確認不同蛋白的免疫效果差異。與3.1.1的方法相似，每2周免疫一次，共免疫4次，每次免疫前對小鼠進行割尾取血，對血清進行elisa檢測。共分為7個實驗組和3個對照組，每組的免疫原和免疫方式如表5所示。

表5.三種代表性p顆粒蛋白的免疫方案

應(yīng)用3.1.1所述的方法，以aβ1-42為抗原，包被于elisa板上，以免疫后小鼠血清為一抗，hrp山羊抗小鼠抗體為二抗，tmb為底物，硫酸為終止液，進行反應(yīng)，終止反應(yīng)后，在450nm處，利用酶標(biāo)儀對吸光度進行檢測，通過吸光度的大小比較血 清中抗體的含量。并以pbs為陰性對照，以商用抗體6e10(購自covance公司)為陽性對照，以三種蛋白免疫小鼠前后的血清為實驗組進行實驗，結(jié)果如圖6所示，三種蛋白都可以刺激小鼠機體產(chǎn)生針對于aβ42的特異性抗體。說明本發(fā)明疫苗具有良好的免疫原性。并用商用抗體6e10為陽性對照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于抗體濃度的計算，免疫效果比較結(jié)果如圖6所示。三種蛋白的兩種免疫方式都能夠產(chǎn)生針對aβ42的特異性抗體，其od值都明顯高于pbs組和cpg組，并隨著免疫次數(shù)的增加，抗體濃度不斷上升，在第四次免疫時，抗體水平能夠達到最高值。通過對比可知，皮下免疫的效果要好于鼻腔免疫。

3.3多種重組p顆粒蛋白疫苗的免疫效果比較

申請人通過蛋白疫苗的免疫劑量和免疫佐劑的確定實驗，以及三種代表性的重組蛋白的免疫試驗，確定采用劑量為25μg/只，免疫方式為皮下注射，測定127種候選疫苗在6-8周的雌性c57bl/6小鼠中的免疫效果。免疫流程和方法如3.2中所述，免疫效果比較結(jié)果如表6所示。

表6.以127種不同形式的p顆粒作為免疫原的蛋白疫苗刺激小鼠產(chǎn)生的aβ42抗體的濃度

其中，pp-10copy-aβ1-6-loop1g72、pp-1copy-aβ1-6-loop2s149、

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pp-10copy-aβ1-6-loop1g72-10copy-aβ1-6-loop2s149-10copy-aβ1-6-loop3g169。這17種p顆粒免疫效果較好，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高濃度的抗體。

根據(jù)陽性抗體6e10制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性擬合曲線為y＝47.692x+0.2964，r²＝0.99。根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線，在線性范圍內(nèi)，可計算誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的濃度，其中pp-3copy-aβ1-6-loop1g72-3copy-aβ1-6-loop2s149-3copy-aβ1-6-loop3g169在第四次免疫后誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體濃度在245.12μg/ml左右。因此，本發(fā)明具有良好的免疫效果，免疫后小鼠血清中抗aβ1-42抗體的濃度較高，具有非常好的治療效果，是一種非常有潛力的治療ad癥的蛋白疫苗。