本發(fā)明屬微生物動物細胞系領域，具體涉及一種人胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤細胞系的建立及其建立方法。

背景技術：

研究報道了胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤(placentalsitetrophoblastictumor,pstt)起源于胎盤種植部位的中間型滋養(yǎng)細胞，是一種特殊類型的妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤(gestationaltrophoblasticneoplasia,gtn)；該疾患臨床相對少見，約占妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤的1％～2％。

研究顯示，胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤大多數發(fā)生于生育期年齡，主要癥狀為閉經后不規(guī)則陰道出血或月經過多。根據文獻報道，pstt的臨床病程多為良性，但其中約10％～15％的病例表現為侵襲性。研究顯示，該疾患中大多數病灶局限于子宮，預后較好，但是一旦發(fā)生轉移，盡管接受手術和聯合化療，仍然預后不良；與其他類型的妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤不同，pstt對化療不敏感，相應機制尚未明確，因此手術是目前臨床主要的治療手段，而手術將導致育齡期患者失去自然懷孕的能力的后果；臨床實踐中對這類患者保留生育功能的治療干預方案尚處在探索階段。

因胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤較罕見，目前的文獻報道多為小樣本或個例報道，相關的基礎研究進展相對緩慢，目前僅有1例關于pstt細胞系建立的報道，2002年shih,i.m.等成功建立1例pstt細胞系ist-2；關于該細胞系的后續(xù)應用亦僅見有1篇文獻報道，kobel,m.等應用ist-2探索了mapk通路在pstt侵襲和遷移中的作用。

鑒于腫瘤細胞系的建立在腫瘤的基礎研究中具有重要作用，但是目前世界范圍內尚無通用的pstt細胞株的現狀，本申請的發(fā)明人擬建立胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤細胞系，為進一步探究胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤的病因學、轉移機制、耐藥機理及臨床干預，等。

與本發(fā)明和相關的現有技術有：

1.ajithkumar,t.v.,etal.,placentalsitetrophoblastictumor.obstetgynecolsurv,2003.58(7):p.484-8.

2.behtash,n.andm.karimizarchi,placentalsitetrophoblastictumor.jcancerresclinoncol,2008.134(1):p.1-6.

3.schmid,p.,etal.,prognosticmarkersandlong-termoutcomeofplacental-sitetrophoblastictumours:aretrospectiveobservationalstudy.lancet,2009.374(9683):p.48-55.

4.zhao,j.,etal.,reservationoffertilityforseventeenpatientswithplacentalsitetrophoblastictumor，zhonghuafuchankezazhi,2014.49(4):p.265-9.

5.shih,i.m.,g.singer,andr.j.kurman,establishmentofintermediatetrophoblasticcelllinesfrompsttandcompletehydatidiformmole.modernpathology,2002.15(1):p.210a-210a.

6.kobel,m.,etal.,activationofmitogen-activatedproteinkinaseisrequiredformigrationandinvasionofplacentalsitetrophoblastictumor.amjpathol,2005.167(3):p.879-85.。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是針對目前世界范圍內尚無通用的pstt細胞株以及相關腫瘤細胞系的建立在腫瘤的研究中具有重要作用的現狀，提供一種人胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤細胞系pstt-1，該細胞系可用于胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤疾病的病因學、轉移機制、耐藥機理及臨床干預等的研究。

本發(fā)明提供了人胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤細胞系，命名為pstt-1，已于2015年6月4日由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)保藏，保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏號為no.10882。

本發(fā)明的人胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤細胞系通過下述方法制得，

(一)取材

獲得離體的新鮮的胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤切除標本，病灶組織浸入無菌hanks溶液清洗，并去除結締組織和壞死組織；

(二)原代培養(yǎng)

將腫瘤組織塊接種于t25培養(yǎng)瓶瓶壁，靜置培養(yǎng)，約3周后細胞從組織塊長出；

(三)細胞純化

接種約7周后傳第1代，用0.25％胰蛋白酶消化，將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中，于倒置相差顯微鏡下觀察，見部分細胞貼壁，將細胞懸液倒入另一培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)；按上述方法，重復3次傳代，使腫瘤細胞與成纖維細胞完全分開；

(四)傳代培養(yǎng)

當細胞布滿瓶底時，吸除培養(yǎng)液，pbs緩沖液漂洗，0.25％胰蛋白酶消化，按1:3的比例傳代，目前已傳至30余代；

經生物學特性鑒定獲得人胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤細胞系，命名為pstt-1，保藏號為no.10882。

本發(fā)明中：體外常規(guī)培養(yǎng)條件為含10％fbs、1％丙酮酸鈉、1％l-谷氨酰胺、1％hepes、1％雙抗的rpmi1640細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為37℃，氣體環(huán)境為5％co2/95％空氣，濕度為飽和濕度。

本發(fā)明的細胞系pstt-1具有以下生物學特性：

1.單層貼壁生長，失去接觸抑制，形態(tài)不均一，呈多突起的星形或紡錘形扁平狀結構；

2.體外培養(yǎng)生長良好，每5天傳代一次，能夠連續(xù)穩(wěn)定傳代，目前已傳至30余代；

3.染色體核型分析結果為正常女性核型：46，xx；

4.pstt-1與腫瘤組織str(shorttandemrepeat)分析結果高度相似，pstt-1免疫細胞化學染色與腫瘤組織免疫組織化學染色結果一致，證實pstt-1來源于腫瘤組織。

本發(fā)明提供一種人胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤細胞系pstt-1，該細胞系可用于胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤疾病的病因學、轉移機制、耐藥機理及臨床干預等的研究。

附圖說明

圖1，pstt-1細胞形態(tài)(倒置相差顯微鏡100×)。

圖2，pstt-1細胞生長曲線。

圖3，pstt-1染色體核型分析。

圖4，pstt-1與腫瘤組織str分析。

圖5，pstt-1與腫瘤組織he染色(100×)。

圖6，pstt-1免疫細胞化學染色(100×)與腫瘤組織免疫組織化學染色(100×)。

具體實施方式

實施例1制備人胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤細胞系pstt-1

(1)取材：2014年9月從復旦大學附屬婦產科醫(yī)院獲得新鮮的胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤切除標本(女，29歲，胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤，病理診斷：{全子宮}子宮胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤)，取病灶組織1cm³浸入無菌hanks溶液清洗，并去除結締組織和壞死組織；

(2)原代培養(yǎng)

將腫瘤組織剪成約1mm³大小的小塊，將組織塊均勻接種于t25培養(yǎng)瓶瓶壁，靜置培養(yǎng)，每3天半量換液1次，約3周后觀察到細胞從組織塊長出；

(3)細胞純化

接種約7周后傳第1代，用0.25％胰蛋白酶消化，將細胞懸液接種于一個培養(yǎng)皿中(培液不含血清)靜置15～20min，于倒置相差顯微鏡下觀察，見部分細胞貼壁，將細胞懸液倒入另一培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。下次傳代時再按上述方法處理，重復3次，可使腫瘤細胞與成纖維細胞完全分開；

(4)傳代培養(yǎng)

當細胞布滿瓶底時，吸除原瓶中的舊培養(yǎng)液，用pbs緩沖液漂洗1遍，用0.25％胰蛋白酶消化，按1:3的比例傳代，目前已傳至30余代；制得人胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤細胞系，命名為pstt-1，已于2015年6月30日由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)保藏，保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏號為no.10882。

本實驗體外常規(guī)培養(yǎng)條件為含10％fbs、1％丙酮酸鈉、1％l-谷氨酰胺、1％hepes、1％雙抗的rpmi1640細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為37℃，氣體環(huán)境為5％co2/95％空氣，濕度為飽和濕度；

(5)生物學特性的鑒定

細胞形態(tài)：倒置相差顯微鏡下觀察，pstt-1細胞單層貼壁生長，失去接觸抑制，胞體較大，呈多突起的星形或紡錘形扁平狀結構，形態(tài)不均一(如圖1所示)；

細胞生長曲線：取對數生長期的細胞，調整細胞密度為2*10^3/ml，混勻后接種于96孔板，設3個復孔；接種后連續(xù)6天在同一時間加入cck-8試劑反應4小時，用酶標儀測定在450nm處的吸光度(od)，以時間為橫軸，od均值為縱軸繪制細胞生長曲線(如圖2所示)；

染色體核型分析：取對數生長期細胞，用0.25μg/ml秋水仙素處理6小時，37℃過夜，采集分裂中期細胞，固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1)固定，標本經胰蛋白酶消化處理后，用giemsa染液染色，于顯微鏡下觀察計數，隨機計數21個細胞，染色體數目均為46條，選取分散良好，染色適中的分裂相進行核型分析，結果為正常女性核型：46，xx(如圖3所示)；

str分析：用axygen試劑盒提取pstt-1細胞與腫瘤組織dna，pcr擴增；選取20個位點(包括性別基因amelogenin)：d13s317、d7s820、d16s539、vwa、th01、amel、tpox、csf1po、d12s391、fga、d2s1338、d21s11、d18s51、d8s1179、d3s1358、d6s1043、pentae、d19s433、pentad，用abi3730xl型遺傳分析儀對str位點進行檢測；結果顯示，腫瘤組織與pstt-1細胞str分析結果高度相似，在amel和d13s317兩個位點的檢測結果不同，其余18個位點完全相同，表明pstt-1來源于腫瘤組織；圖4顯示了其中部分實驗結果；

將手術標本以及單克隆pstt-1細胞用福爾馬林固定，石蠟包埋切片，進行he染色(如圖5所示)；選取ae1/ae3，hcg，hpl對單克隆pstt-1細胞進行免疫細胞化學染色，與腫瘤組織免疫組織化學染色相比對(如圖6所示)，結果表明，免疫細胞化學染色與免疫組織化學染色結果一致，證實其保留了原始腫瘤細胞的分化表型。