本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種造血干細胞培養(yǎng)方法。

背景技術：

造血干細胞是血液系統(tǒng)中的成體干細胞，是一個異質性的群體，具有長期自我更新的能力和分化成各類成熟血細胞的潛能。它是研究歷史最長且最為深入的一類成體干細胞，對研究各類干細胞，包括腫瘤干細胞，具有重要指導意義。由于造血干細胞具有多向分化的潛能，將造血干細胞移植到體內(nèi)是治療白血病、淋巴瘤等惡性腫瘤、代謝性疾病、自身免疫性疾病及先天免疫缺陷等嚴重危害人類健康疾病的有效方法，可以有效的減輕患者的痛苦。但是，由于造血干細胞在體內(nèi)的數(shù)量極少，大大的限制了造血干細胞在臨床中的應用。

骨髓、外周血和臍血是造血干細胞的重要來源。與骨髓和外周血造血干細胞相比，臍帶血造血干細胞更為原始，自我增殖能力最強，且臍帶血具有富含更早期的造血干細胞、采集方便，造血干細胞免疫原性弱、對異源性抗原產(chǎn)生的抗體少、移植過程中不需要嚴格配型、成熟性t細胞較少、采集和保存容易、無腫瘤細胞污染、對供者無損傷及副作用、cd34⁺cd38-與cd34+cd33-的比例較高等優(yōu)點，因而臍帶血造血干細胞具有極大的臨床應用價值。但是，單份臍血的造血干細胞含量低，在臨床中很難用于正常體重成人患者的移植。因此，造血干細胞在移植前需要進行體外擴增。

目前，造血干細胞的體外增殖途徑主要有兩種，一種是通過基質的灌注進行體外培養(yǎng)，第二種是通過添加細胞因子進行體外培養(yǎng)。但采用上述方法培養(yǎng)的造血干細胞方法培養(yǎng)的造血干細胞大多存在活性和增殖能力較差的問題，且造血干細胞易分化。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的上述不足，提供一種造血干細胞培養(yǎng)方法，該方法能使造血干細胞長久處于增殖不分化狀態(tài)，可顯著提高造血干細胞的擴增率和細胞活性，使造血干細胞能夠保持其干細胞特性。

本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn)：

一種造血干細胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

（1）采集臍帶血，加入pbs稀釋后，得到臍帶血稀釋液；往臍帶血稀釋液中加入甲基纖維素溶液，混勻后，沉降臍帶血中的紅細胞，并吸出上清液；將上清液離心后棄掉所得的上清液，加入pbs重懸細胞，得細胞懸液；往細胞懸液加入淋巴細胞分離液，靜置，離心，棄掉上清液后，添加紅細胞裂解液于收集到的下層的單個核細胞中；加入pbs洗滌并再次重懸細胞，得細胞重懸液；

（2）調(diào)整單個核細胞密度為1-2×10⁸個/ml，往細胞重懸液加入cd34⁺抗體，所述cd34⁺抗體的添加量為100μl/ml細胞重懸液，混勻，室溫下孵育15–25min，加入cd34⁺免疫磁珠混勻，所述cd34⁺免疫磁珠的添加量為50μl/ml細胞重懸液，室溫孵育下15-25min，用細胞洗滌液洗滌后置于磁場中，靜置后棄掉上清液，得到造血干細胞cd34⁺細胞；

（3）：將造血干細胞cd34⁺細胞，將細胞接種于造血干細胞培養(yǎng)基，調(diào)整造血干細胞cd34⁺細胞密度為1×10⁵-2×10⁵/ml，置于37℃，5%co²飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-7天后，收獲細胞。

甲基纖維素的分子結構中有較多的親水、非極性基團，可使紅細胞互快速沉降，其結構穩(wěn)定，易保存，在體外可作為細胞培養(yǎng)的支持劑，使用安全，操作方便，且對設備無特殊要求。

優(yōu)選地，所述造血干細胞培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基和添加于基礎培養(yǎng)基中的添加劑，按終濃度計，所述添加劑包括以下含量的組分：fbs100-200mg/ml、亞硒酸鈉0.02-0.03μmol/ml、卡介菌多糖核酸5-10mg/ml、千金藤素50-100μmol/ml、海藻糖50-100ng/ml、維生素c40-80ng/ml、第一細胞因子緩釋微囊1.5-2.5mg/ml、第二細胞因子緩釋微囊25-50mg/ml。

本發(fā)明將千金藤素添加到造血干細胞培養(yǎng)基中，和卡介菌多糖核酸相配合，相對于普通培養(yǎng)基，其能夠顯著提高造血干細胞增殖率，使造血干細胞具有干性強、活性高的特點；維生素c和海藻糖不僅能夠具有抗氧化作用，而且能夠降低造血干細胞的氧分壓，使造血干細胞在增殖的過程中處于低氧環(huán)境中，有利于造血干細胞的增殖。

優(yōu)選地，所述第一細胞因子緩釋微囊的制備方法包括以下步驟：

a、將il-3、il-6、gm-csf、聚乙二醇加入預先添加有甘露醇和硫酸鋅的水溶液中，攪拌均勻后，得到混合物a，所述混合物a中il-3、il-6、gm-csf的濃度均為1-2wt％，聚乙二醇的濃度為6-10wt％；所述甘露醇的濃度為2-4wt％，碳酸鋅的濃度為1-3wt％；

b、將聚羥基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，攪拌均勻后，得到混合物b，所述混合物b中聚羥基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇的濃度為12-18wt％；

c、將混合物a加入到混合物b中，攪拌均勻后，得到混合物c，所述混合物a和混合物b的體積比為1:1-2；

d、將聚乙烯醇、殼聚糖和氯化鈉加入水中，攪拌均勻后，得到混合物d；所述混合物d中聚乙烯醇的濃度為1-2wt%，殼聚糖的濃度為0.5-1wt%，氯化鈉的濃度為1-2wt%；

e、將混合物c加入混合物d中，攪拌進行溶劑揮發(fā)，經(jīng)洗滌、離心分離、真空冷凍干燥，制得第一細胞因子緩釋微囊。

優(yōu)選地，所述第一細胞因子緩釋微囊的粒徑為50-90μm。

優(yōu)選地，所述聚乙烯醇由質量比為1:0.5-2的無規(guī)聚乙烯醇和間規(guī)聚乙烯組成。

優(yōu)選地，所述無規(guī)聚乙烯醇的聚合度為600-1000，所述間規(guī)聚乙烯的聚合度為1800-2500。

優(yōu)選地，所述第二細胞因子緩釋微囊的制備方法包括以下步驟：

s1、將干細胞因子、fms樣酪氨酸激酶-3配體、聚乙二醇加入預先添加有葡聚糖和季戊四醇鋅鹽的水溶液，攪拌均勻后，得到混合物ⅰ，所述混合物a中干細胞因子的濃度為2-4wt％，fms樣酪氨酸激酶-3配體的濃度為2-4wt％、聚乙二醇的濃度為4-8wt％；

s2、將聚乳酸-聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，攪拌均勻后，得到混合物ⅱ，所述混合物ⅱ中聚乳酸-聚乙二醇的濃度為13-20wt％；

s3、將混合物ⅰ加入到混合物ⅱ中，攪拌均勻后，得到混合物ⅲ，所述混合物ⅰ和混合物ⅱ的體積比為1:1-2；

s4、將聚乙烯醇、殼聚糖和海藻酸鈉加入水中，攪拌均勻后，得到混合物ⅳ；所述混合物ⅳ中聚乙烯醇的濃度為1-2wt%，殼聚糖的濃度為0.5-1wt%，海藻酸鈉的濃度為2-4wt%；

s5、將混合物ⅲ加入混合物ⅳ中，攪拌進行溶劑揮發(fā)，經(jīng)洗滌、離心分離、真空冷凍干燥，制得第二細胞因子緩釋微囊。

優(yōu)選地，所述第二細胞因子緩釋微囊的粒徑為60-100μm。

優(yōu)選地，所述混合物ⅰ中，所述葡聚糖的濃度為4-6wt％，季戊四醇鋅鹽的濃度為2-4wt％。

優(yōu)選地，所述第二細胞因子緩釋微囊采用的聚乙烯醇與第一細胞因子緩釋微囊相同。

本發(fā)明將間規(guī)聚乙烯醇、無規(guī)聚乙烯醇和殼聚糖復合，作為凝膠的原料，提高了凝膠的熱學性能和機械性能，同時為細胞提供充足的生長空間和支持細胞間聯(lián)系的空間結構，獲得的細胞的活性更強。聚乙烯醇、殼聚糖以及氯化鈉相配合，可增強聚乙烯醇分子間和分子鏈的交聯(lián)，優(yōu)化凝膠的性能，提高制備緩釋微球的效率，從而更有利于cd34⁺細胞的生長，增加cd34⁺細胞的擴增倍數(shù)，避免各細胞因子濃度減少過快，濃度差異大，影響細胞增殖速率和細胞性狀的穩(wěn)定性。

本發(fā)明的第二細胞因子緩釋微囊和第一細胞因子緩釋微囊具有長效緩釋、無毒副作用等優(yōu)點。

優(yōu)選地，所述基礎培養(yǎng)基為dmem培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，所述步驟（1）中，紅細胞裂解液與收集到的下層的單個核細胞的體積比為1：0.5-2，在室溫下裂解3-5min。分離的單個核細胞中，存在一定量的紅細胞。由于紅細胞會使cd34⁺免疫磁珠與單個核細胞孵育時細胞聚集成團，從而影響cd34⁺免疫磁珠與cd34⁺細胞，本發(fā)明很好地解決了上述問題。

本發(fā)明的有益效果在于：

(1)本發(fā)明的造血干細胞細胞培養(yǎng)方法穩(wěn)定有效，使得造血干細胞能夠長久處于增殖不分化狀態(tài)，避免造血干細胞在增殖過程中分泌大量氧化產(chǎn)物促使細胞凋亡的問題，提高了造血干細胞的擴增率和細胞活性，并使造血干細胞能夠保持其干細胞特性，培養(yǎng)后培養(yǎng)液中未檢測未檢出真菌、細菌、支原體，微生物檢測指標符合要求。

(2)本發(fā)明的造血干細胞培養(yǎng)基各成分相互協(xié)調(diào)，共同作用，性能穩(wěn)定，能提供細胞生長增殖所需的充足營養(yǎng)與良好環(huán)境，顯著提高免疫細胞的擴增速度，在造血干細胞培養(yǎng)基中添加第二細胞因子緩釋微囊和第一細胞因子緩釋微囊，利用其緩釋特性使生長因子在培養(yǎng)基中能夠持續(xù)平穩(wěn)、釋放，可防止培養(yǎng)基中各細胞因子濃度變化快給細胞帶來損害，可提高工作效率，使免疫細胞平穩(wěn)擴增，與卡介菌多糖核酸、千金藤素和其他組分相配合，不僅能夠降低大劑量細胞因子帶來的毒副作用，而且能夠提高造血干細胞的增殖率，能較好的保持干細胞的干性。

具體實施方式

結合以下實施例對本發(fā)明作進一步描述。

實施例1

本實施例中，一種造血干細胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

（1）采集臍帶血，加入等體積的pbs稀釋后，得到臍帶血稀釋液；往臍帶血稀釋液中加入濃度為0.5%的甲基纖維素溶液，臍帶血稀釋液與甲基纖維素溶液的體積比為1:0.3混勻后，沉降臍帶血中的紅細胞，并吸出上清液；將上清液離心后棄掉所得的上清液，加入pbs重懸細胞，得細胞懸液；往細胞懸液加入淋巴細胞分離液，靜置，離心，棄掉上清液后，將紅細胞裂解液添加于收集到的下層的單個核細胞中，紅細胞裂解液與收集到的下層的單個核細胞的體積比為1:0.5，在室溫下裂解5min；加入pbs洗滌并再次重懸細胞，得細胞重懸液；

（2）調(diào)整單個核細胞密度為1-2×10⁸個/ml，往細胞重懸液加入cd34⁺抗體，所述cd34⁺抗體的添加量為100μl/ml細胞重懸液，混勻，室溫下孵育20min，加入cd34⁺免疫磁珠混勻，所述cd34⁺免疫磁珠的添加量為50μl/ml細胞重懸液，室溫孵育下20min，用細胞洗滌液洗滌后置于磁場中，靜置后棄掉上清液，得到造血干細胞cd34⁺細胞；優(yōu)選地，所述細胞洗滌液為添加有1％fbs和0.01％edta的pbs溶液；

（3）將造血干細胞cd34⁺細胞，將細胞接種于造血干細胞培養(yǎng)基，調(diào)整造血干細胞cd34⁺細胞密度為1×10⁵-2×10⁵/ml，置于37℃，5%co²飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天后，收獲細胞；

優(yōu)選地，所述造血干細胞培養(yǎng)基包括dmem培養(yǎng)基和添加于dmem培養(yǎng)基中的添加劑，按終濃度計，所述添加劑包括以下含量的組分：fbs150mg/ml、亞硒酸鈉0.025μmol/ml、卡介菌多糖核酸7mg/ml、千金藤素70μmol/ml、海藻糖60ng/ml、維生素c50ng/ml、第一細胞因子緩釋微囊2mg/ml、第二細胞因子緩釋微囊35mg/ml。

優(yōu)選地，所述第一細胞因子緩釋微囊的制備方法包括以下步驟：

a、將il-3、il-6、gm-csf、聚乙二醇加入預先添加有甘露醇和硫酸鋅的水溶液中，攪拌均勻后，得到混合物a，所述混合物a中il-3、il-6、gm-csf的濃度均為1.5wt％，聚乙二醇的濃度為8wt％；所述甘露醇的濃度為3wt％，碳酸鋅的濃度為2wt％；

b、將聚羥基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，攪拌均勻后，得到混合物b，所述混合物b中聚羥基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇的濃度為12-18wt％；

c、將混合物a加入到混合物b中，攪拌均勻后，得到混合物c，所述混合物a和混合物b的體積比為1:1.5；

d、將聚乙烯醇、殼聚糖和氯化鈉加入水中，攪拌均勻后，得到混合物d；所述混合物d中聚乙烯醇的濃度為1.5wt%，殼聚糖的濃度為0.8wt%，氯化鈉的濃度為1.5wt%；

e、將混合物c加入混合物d中，攪拌進行溶劑揮發(fā)，經(jīng)洗滌、離心分離、真空冷凍干燥，制得粒徑為50-90μm的第一細胞因子緩釋微囊。

優(yōu)選地，所述聚乙烯醇由質量比為1:1的無規(guī)聚乙烯醇和間規(guī)聚乙烯組成。所述無規(guī)聚乙烯醇的聚合度為600-1000，所述間規(guī)聚乙烯的聚合度為1800-2500。

優(yōu)選地，所述第二細胞因子緩釋微囊的制備方法包括以下步驟：

s1、將干細胞因子、fms樣酪氨酸激酶-3配體、聚乙二醇加入預先添加有葡聚糖和季戊四醇鋅鹽的水溶液，攪拌均勻后，得到混合物ⅰ，所述混合物a中干細胞因子的濃度為3wt％，fms樣酪氨酸激酶-3配體的濃度為3wt％、聚乙二醇的濃度為6wt％；所述葡聚糖的濃度為5wt％，季戊四醇鋅鹽的濃度為3wt％。

s2、將聚乳酸-聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，攪拌均勻后，得到混合物ⅱ，所述混合物ⅱ中聚乳酸-聚乙二醇的濃度為16wt％；

s3、將混合物ⅰ加入到混合物ⅱ中，攪拌均勻后，得到混合物ⅲ，所述混合物ⅰ和混合物ⅱ的體積比為1:1.5；

s4、將聚乙烯醇、殼聚糖和海藻酸鈉加入水中，攪拌均勻后，得到混合物ⅳ；所述混合物ⅳ中聚乙烯醇的濃度為1.5wt%，殼聚糖的濃度為0.7wt%，海藻酸鈉的濃度為3wt%；

s5、將混合物ⅲ加入混合物ⅳ中，攪拌進行溶劑揮發(fā)，經(jīng)洗滌、離心分離、真空冷凍干燥，制得粒徑為60-100μm的第二細胞因子緩釋微囊。

實施例2

本實施例中，一種造血干細胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

（1）采集臍帶血，加入等體積的pbs稀釋后，得到臍帶血稀釋液；往臍帶血稀釋液中加入濃度為0.4%的甲基纖維素溶液，臍帶血稀釋液與甲基纖維素溶液的體積比為1:0.2混勻后，沉降臍帶血中的紅細胞，并吸出上清液；將上清液離心后棄掉所得的上清液，加入pbs重懸細胞，得細胞懸液；往細胞懸液加入淋巴細胞分離液，靜置，離心，棄掉上清液后，將紅細胞裂解液添加于收集到的下層的單個核細胞中，紅細胞裂解液與收集到的下層的單個核細胞的體積比為1:1，在室溫下裂解4min；加入pbs洗滌并再次重懸細胞，得細胞重懸液；

（2）調(diào)整單個核細胞密度為1-2×10⁸個/ml，往細胞重懸液加入cd34⁺抗體，所述cd34⁺抗體的添加量為100μl/ml細胞重懸液，混勻，室溫下孵育15min，加入cd34⁺免疫磁珠混勻，所述cd34⁺免疫磁珠的添加量為50μl/ml細胞重懸液，室溫孵育下25min，用細胞洗滌液洗滌后置于磁場中，靜置后棄掉上清液，得到造血干細胞cd34⁺細胞；優(yōu)選地，所述細胞洗滌液為添加有1.1％fbs和0.08％edta的pbs溶液。

（3）：將造血干細胞cd34⁺細胞，將細胞接種于造血干細胞培養(yǎng)基，調(diào)整造血干細胞cd34⁺細胞密度為1×10⁵-2×10⁵/ml，置于37℃，5%co²飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天后，收獲細胞。

優(yōu)選地，所述造血干細胞培養(yǎng)基包括dmem培養(yǎng)基和添加于dmem培養(yǎng)基中的添加劑，按終濃度計，所述添加劑包括以下含量的組分：fbs100mg/ml、亞硒酸鈉0.03μmol/ml、卡介菌多糖核酸5mg/ml、千金藤素100μmol/ml、海藻糖50ng/ml、維生素c80ng/ml、第一細胞因子緩釋微囊1.5mg/ml、第二細胞因子緩釋微囊50mg/ml。

優(yōu)選地，所述第一細胞因子緩釋微囊的制備方法包括以下步驟：

a、將il-3、il-6、gm-csf、聚乙二醇加入預先添加有甘露醇和硫酸鋅的水溶液中，攪拌均勻后，得到混合物a，所述混合物a中il-3、il-6、gm-csf的濃度均為1wt％，聚乙二醇的濃度為10wt％；所述甘露醇的濃度為2wt％，碳酸鋅的濃度為3wt％。

b、將聚羥基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，攪拌均勻后，得到混合物b，所述混合物b中聚羥基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇的濃度為12wt％；

c、將混合物a加入到混合物b中，攪拌均勻后，得到混合物c，所述混合物a和混合物b的體積比為1:1；

d、將聚乙烯醇、殼聚糖和氯化鈉加入水中，攪拌均勻后，得到混合物d；所述混合物d中聚乙烯醇的濃度為1wt%，殼聚糖的濃度為1wt%，氯化鈉的濃度為1wt%；

e、將混合物c加入混合物d中，攪拌進行溶劑揮發(fā)，經(jīng)洗滌、離心分離、真空冷凍干燥，制得粒徑為50-90μm的第一細胞因子緩釋微囊。

優(yōu)選地，所述聚乙烯醇由質量比為1:0.5的無規(guī)聚乙烯醇和間規(guī)聚乙烯組成。所述無規(guī)聚乙烯醇的聚合度為600-1000，所述間規(guī)聚乙烯的聚合度為1800-2500。

優(yōu)選地，所述第二細胞因子緩釋微囊的制備方法包括以下步驟：

s1、將干細胞因子、fms樣酪氨酸激酶-3配體、聚乙二醇加入預先添加有葡聚糖和季戊四醇鋅鹽的水溶液，攪拌均勻后，得到混合物ⅰ，所述混合物a中干細胞因子的濃度為2wt％，fms樣酪氨酸激酶-3配體的濃度為4wt％、聚乙二醇的濃度為4wt％；所述葡聚糖的濃度為4wt％，季戊四醇鋅鹽的濃度為4wt％。

s2、將聚乳酸-聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，攪拌均勻后，得到混合物ⅱ，所述混合物ⅱ中聚乳酸-聚乙二醇的濃度為13wt％；

s3、將混合物ⅰ加入到混合物ⅱ中，攪拌均勻后，得到混合物ⅲ，所述混合物ⅰ和混合物ⅱ的體積比為1:1；

s4、將聚乙烯醇、殼聚糖和海藻酸鈉加入水中，攪拌均勻后，得到混合物ⅳ；所述混合物ⅳ中聚乙烯醇的濃度為1wt%，殼聚糖的濃度為1wt%，海藻酸鈉的濃度為2wt%；

s5、將混合物ⅲ加入混合物ⅳ中，攪拌進行溶劑揮發(fā)，經(jīng)洗滌、離心分離、真空冷凍干燥，制得粒徑為60-100μm的第一細胞因子緩釋微囊。

實施例3

本實施例中，一種造血干細胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

（1）采集臍帶血，加入等體積的pbs稀釋后，得到臍帶血稀釋液；往臍帶血稀釋液中加入濃度為0.3%的甲基纖維素溶液，臍帶血稀釋液與甲基纖維素溶液的體積比為1:0.15混勻后，沉降臍帶血中的紅細胞，并吸出上清液；將上清液離心后棄掉所得的上清液，加入pbs重懸細胞，得細胞懸液；往細胞懸液加入淋巴細胞分離液，靜置，離心，棄掉上清液后，將紅細胞裂解液添加于收集到的下層的單個核細胞中，紅細胞裂解液與收集到的下層的單個核細胞的體積比為1:0.5，在室溫下裂解5min；加入pbs洗滌并再次重懸細胞，得細胞重懸液；

（2）調(diào)整單個核細胞密度為1-2×10⁸個/ml，往細胞重懸液加入cd34⁺抗體，所述cd34⁺抗體的添加量為90μl/ml細胞重懸液，混勻，室溫下孵育25min，加入cd34⁺免疫磁珠混勻，所述cd34⁺免疫磁珠的添加量為52μl/ml細胞重懸液，室溫孵育下15min，用細胞洗滌液洗滌后置于磁場中，靜置后棄掉上清液，得到造血干細胞cd34⁺細胞；優(yōu)選地，所述細胞洗滌液為添加有0.9％fbs和0.12％edta的pbs溶液。

（3）：將造血干細胞cd34⁺細胞，將細胞接種于造血干細胞培養(yǎng)基，調(diào)整造血干細胞cd34⁺細胞密度為1×10⁵-2×10⁵/ml，置于37℃，5%co²飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天后，收獲細胞。

優(yōu)選地，所述造血干細胞培養(yǎng)基包括dmem培養(yǎng)基和添加于dmem培養(yǎng)基中的添加劑，按終濃度計，所述添加劑包括以下含量的組分：fbs200mg/ml、亞硒酸鈉0.02μmol/ml、卡介菌多糖核酸10mg/ml、千金藤素50μmol/ml、海藻糖100ng/ml、維生素c40ng/ml、第一細胞因子緩釋微囊2.5mg/ml、第二細胞因子緩釋微囊25mg/ml。

優(yōu)選地，所述第一細胞因子緩釋微囊的制備方法包括以下步驟：

a、將il-3、il-6、gm-csf、聚乙二醇加入預先添加有甘露醇和硫酸鋅的水溶液中，攪拌均勻后，得到混合物a，所述混合物a中il-3、il-6、gm-csf的濃度均為2wt％，聚乙二醇的濃度為6wt％；所述甘露醇的濃度為4wt％，碳酸鋅的濃度為1wt％；

b、將聚羥基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，攪拌均勻后，得到混合物b，所述混合物b中聚羥基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇的濃度為12-18wt％；

c、將混合物a加入到混合物b中，攪拌均勻后，得到混合物c，所述混合物a和混合物b的體積比為1:2；

d、將聚乙烯醇、殼聚糖和氯化鈉加入水中，攪拌均勻后，得到混合物d；所述混合物d中聚乙烯醇的濃度為2wt%，殼聚糖的濃度為0.5wt%，氯化鈉的濃度為2wt%；

e、將混合物c加入混合物d中，攪拌進行溶劑揮發(fā)，經(jīng)洗滌、離心分離、真空冷凍干燥，制得粒徑為50-90μm的第一細胞因子緩釋微囊。

優(yōu)選地，所述聚乙烯醇由質量比為1:2的無規(guī)聚乙烯醇和間規(guī)聚乙烯組成。所述無規(guī)聚乙烯醇的聚合度為600-1000，所述間規(guī)聚乙烯的聚合度為1800-2500。

優(yōu)選地，所述第二細胞因子緩釋微囊的制備方法包括以下步驟：

s1、將干細胞因子、fms樣酪氨酸激酶-3配體、聚乙二醇加入預先添加有葡聚糖和季戊四醇鋅鹽的水溶液，攪拌均勻后，得到混合物ⅰ，所述混合物a中干細胞因子的濃度為4wt％，fms樣酪氨酸激酶-3配體的濃度為2wt％、聚乙二醇的濃度為8wt％；所述葡聚糖的濃度為6wt％，季戊四醇鋅鹽的濃度為2wt％；

s2、將聚乳酸-聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，攪拌均勻后，得到混合物ⅱ，所述混合物ⅱ中聚乳酸-聚乙二醇的濃度為20wt％；

s3、將混合物ⅰ加入到混合物ⅱ中，攪拌均勻后，得到混合物ⅲ，所述混合物ⅰ和混合物ⅱ的體積比為1:2；

s4、將聚乙烯醇、殼聚糖和海藻酸鈉加入水中，攪拌均勻后，得到混合物ⅳ；所述混合物ⅳ中聚乙烯醇的濃度為2wt%，殼聚糖的濃度為0.5wt%，海藻酸鈉的濃度為4wt%；

s5、將混合物ⅲ加入混合物ⅳ中，攪拌進行溶劑揮發(fā)，經(jīng)洗滌、離心分離、真空冷凍干燥，制得粒徑為60-100μm的第一細胞因子緩釋微囊。

對比例

對比例采用的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

本實施例中，一種造血干細胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

（1）采集臍帶血，加入等體積的pbs稀釋后，得到臍帶血稀釋液；往臍帶血稀釋液中加入濃度為0.5%的甲基纖維素溶液，臍帶血稀釋液與甲基纖維素溶液的體積比為1:0.3混勻后，沉降臍帶血中的紅細胞，并吸出上清液；將上清液離心后棄掉所得的上清液，加入pbs重懸細胞，得細胞懸液；往細胞懸液加入淋巴細胞分離液，靜置，離心，棄掉上清液后；加入pbs洗滌并再次重懸細胞，得細胞重懸液；

（2）調(diào)整單個核細胞密度為1-2×10⁸個/ml，往細胞重懸液加入cd34⁺抗體，所述cd34⁺抗體的添加量為100μl/ml細胞重懸液，混勻，室溫下孵育20min，加入cd34⁺免疫磁珠混勻，所述cd34⁺免疫磁珠的添加量為50μl/ml細胞重懸液，室溫孵育下20min，用細胞洗滌液洗滌后置于磁場中，靜置后棄掉上清液，得到造血干細胞cd34⁺細胞；所述細胞洗滌液為添加有1％fbs和0.01％edta的pbs溶液；

（3）將造血干細胞cd34⁺細胞，將細胞接種于對照例培養(yǎng)基，調(diào)整造血干細胞cd34⁺細胞密度為1×10⁵-2×10⁵/ml，置于37℃，5%co²飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天后，收獲細胞；對照例培養(yǎng)基與實施例1的造血干細胞培養(yǎng)基相比，添加有干細胞生長因子75ng/ml、人fms樣酪氨酸激酶1配體35ng/ml、il-34ng/ml、il-64ng/ml、白介素-6、gm-csf4ng/ml，未添加卡介菌多糖核酸、千金藤素、第一細胞因子緩釋微囊和第二細胞因子緩釋微囊。

分別取實施例1-4和對照例培養(yǎng)最終獲得的細胞，采用用bectondickinson型流式細胞儀對收獲后的細胞進行計數(shù)，并對擴增前后的細胞進行cd34-fitc抗體檢測，細胞標記方法為：細胞用pbs緩沖鹽溶液洗滌一次，加入cd34-fitc抗體10μl，4℃避光孵育30min；孵育結束后用pbs緩沖鹽溶液再洗滌一次，使用流式細胞儀分析cd34+細胞的含量，檢測結果如表1所示：

表1cd34⁺細胞的流式細胞儀檢測結果

由表1可知，通過本發(fā)明提供的造血干細胞培養(yǎng)方法所獲得的細胞數(shù)量及cd34+細胞比例均顯著提高。

分別取實施例1-3和對照例培養(yǎng)最終獲得的細胞，經(jīng)流式細胞術分析g0/g1期、g2/m期細胞百分比，檢測結果如表2所示：

由表2可知，實施例1-3中處于g0/g1期細胞百分比均大于對照組，表明采用本發(fā)明的造血干細胞培養(yǎng)方法所獲得的活細胞數(shù)量多于對比例；同時實施例1-3處于g0/g1期的細胞百分比遠大于g2/m期，表明采用本發(fā)明的造血干細胞培養(yǎng)方法能夠延長造血干細胞的g0/g1期，使其能夠長期處于增殖狀態(tài)而不分化，從而保持造血干細胞的干細胞特性。

最后應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細地說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質和范圍。