本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種t淋巴細(xì)胞、一種慢病毒、一種轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞、一種構(gòu)建體、一種用于治療癌癥的治療組合物和一種提高淋巴細(xì)胞活性的方法。

背景技術(shù)：

腫瘤可以避免免疫監(jiān)視，腫瘤細(xì)胞通過誘導(dǎo)免疫抑制性受體的表達(dá)，而關(guān)閉其受到免疫反應(yīng)。在免疫調(diào)節(jié)機(jī)制方面,激活的細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctls)表達(dá)負(fù)調(diào)控的監(jiān)管機(jī)制,即在細(xì)胞表面表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子，其中，一種主要的免疫檢查點(diǎn)分子——程序性細(xì)胞死亡受體1(pd1)表達(dá)在活化ctls上，其與腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的程序性死亡配體1(pd-l1b7-h1)相互作用,可以抑制抗腫瘤t細(xì)胞反應(yīng)。許多腫瘤,包括淋巴瘤、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺腫瘤,表達(dá)pd-l1。pd-l1與其配體pd1的結(jié)合，會導(dǎo)致t淋巴細(xì)胞增生性反應(yīng)的下調(diào),細(xì)胞因子的分泌減少,和t細(xì)胞的無能或凋亡。細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞抗原4(ctla4)是另一個t細(xì)胞的關(guān)鍵負(fù)面調(diào)節(jié)因子，其可抑制t細(xì)胞活化，抑制機(jī)制是通過與表達(dá)在抗原遞呈細(xì)胞上的配體b7.1、b7.2(cd80和cd86)在相互作用實現(xiàn)。

t細(xì)胞攻擊并摧毀腫瘤的潛力一直是公認(rèn)的。過繼t細(xì)胞療法是將來自體內(nèi)的t細(xì)胞在體外活化、擴(kuò)張，隨后回輸入體內(nèi)進(jìn)行自身免疫治療的一種療法。

然而，過繼t細(xì)胞療法仍有待進(jìn)一步開發(fā)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。

本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：

cd19靶向性的嵌合抗原受體t細(xì)胞可有效地殺傷cd19⁺的惡性b細(xì)胞。但許多cd19⁺惡性b細(xì)胞淋巴瘤患者，仍然對于cd19靶向性的嵌合抗原受體t細(xì)胞療法沒有反應(yīng)。本發(fā)明針對上述問題，提出了一種攜帶沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的核酸分子和編碼cd19靶向性的嵌合抗原受體的核酸分子的構(gòu)建體和以此構(gòu)建體導(dǎo)入后形成的轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞，本發(fā)明提出的構(gòu)建體和轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞用于過繼t細(xì)胞的免疫治療，可以大大提高t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，尤其對cd19⁺惡性b細(xì)胞淋巴瘤或白血病 的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷效果顯著增強(qiáng)。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種t淋巴細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默；以及表達(dá)嵌合抗原受體，其中，所述嵌合抗原受體包括：胞外區(qū)，所述胞外區(qū)包括單鏈抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述單鏈抗體特異性識別抗原cd19；跨膜區(qū)，所述跨膜區(qū)與所述胞外區(qū)相連，并且嵌入到所述t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜中；胞內(nèi)區(qū)，所述胞內(nèi)區(qū)與所述跨膜區(qū)相連，并且所述胞內(nèi)區(qū)包括cd28的胞內(nèi)段以及cd3ζ鏈。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明提出的t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對腫瘤細(xì)胞殺傷能力顯著增強(qiáng)，尤其對cd19⁺惡性b細(xì)胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷效果大大提高。

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種慢病毒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述慢病毒攜帶下列核酸分子：編碼嵌合抗原受體的核酸分子，所述嵌合抗原受體具有seqidno：1所示的氨基酸序列，所述編碼嵌合抗原受體的核酸分子具有seqidno：2所示的核苷酸序列；以及沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的核酸分子，所述沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的核酸分子的核苷酸序列為選自seqidno：3～68的至少之一。

mlllvtslllcelphpafllipdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitgstsgsgkpgsgegstkgevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvssaaafvpvflpakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrnkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno：1)。

atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgc ttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcattcgtgccggtcttcctgccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaccacaggaacaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa(seqidno：2)。

ggccaggatggttcttagact(seqidno：3)。

ggatttccagtggcgagagaa(seqidno：4)。

gccuguguucucuguggacuaug(seqidno：5)。

ggugcugcuagucuggguccugg(seqidno：6)。

gacagagagaagggcagaagugc(seqidno：7)。

cagcuucuccaacacaucggaga(seqidno：8)。

ccgugucacacaacugcccaacg(seqidno：9)。

uaugccaccauugucuuuccuag(seqidno：10)。

ugcuaaacugguaccgcaugagc(seqidno：11)。

gugacagagagaagggcagaagu(seqidno：12)。

cugaggauggacacugcucuugg(seqidno：13)。

aucggagagcuucgugcuaaacu(seqidno：14)。

ggcaacggaacccagatttat(seqidno：15)。

ggaacccaaattacgtgtact(seqidno：16)。

gaacccaaattacgtgtacta(seqidno：17)。

gggagaagactatattgtaca(seqidno：18)。

gacgtttatagccgaaatgat(seqidno：19)。

gacactaatacaccaggtaga(seqidno：20)。

accucacuauccaaggacugagg(seqidno：21)。

augaguugaccuuccuagaugau(seqidno：22)。

ggggaaugaguugaccuuccuag(seqidno：23)。

cucuggauccuugcagcaguuag(seqidno：24)。

cuccucuggauccuugcagcagu(seqidno：25)。

uuugugugugaguaugcaucucc(seqidno：26)。

caccuccaguggaaaucaaguga(seqidno：27)。

cacgggacucuacaucugcaagg(seqidno：28)。

uucugacuuccuccucuggaucc(seqidno：29)。

aagucugugcggcaaccuacaug(seqidno：30)。

ggtcggtcagaatgcctatct(seqidno：31)。

gccaatgacttacgggactct(seqidno：32)。

gcagagggaattcgctcagaa(seqidno：33)。

ggaaattcgggcacatcatat(seqidno：34)。

gattaagagatgactggacta(seqidno：35)。

gagatgactggactaggtcta(seqidno：36)。

aggaaauucgggcacaucauaug(seqidno：37)。

gacugaugaaagggaugugaauu(seqidno：38)。

gccacugauuuucaaagagaucu(seqidno：39)。

agcagaguuuucccauuuucaga(seqidno：40)。

aacuuaaacaggcaugucauugc(seqidno：41)。

uucagaagauaaugacucacaug(seqidno：42)。

gccucuguauuuaagccaacaga(seqidno：43)。

ugcucaugugauuguggaguaga(seqidno：44)。

auguuuucacaucuucccuuuga(seqidno：45)。

gagagacuucacugcagccuuuc(seqidno：46)。

gattgcctctactcatcacta(seqidno：47)。

uccuaaugacaaugggucauacc(seqidno：48)。

aagacauugccugccaugcuugg(seqidno：49)。

gucauaccgcuguucugcaaauu(seqidno：50)。

cuccuguauaguuuacuuccuuu(seqidno：51)。

uaccgcuguucugcaaauuuuca(seqidno：52)。

aaaacaaaccaggcauuguuuau(seqidno：53)。

aacuagaaugcccugugaaauac(seqidno：54)。

gugacuuggugcaagcucaaugg(seqidno：55)。

auccaugggaaagaaucauguga(seqidno：56)。

uggugcaagcucaauggaacaac(seqidno：57)。

gctgctcacccttatgaacct(seqidno：58)。

aggacauggugguggacgagugc(seqidno：59)。

ugcucuuccugcacgauaucagu(seqidno：60)。

accucuacugguuccuguacauc(seqidno：61)。

cccuccaacucugcuccucuagg(seqidno：62)。

cccugaguggacagucgucuucg(seqidno：63)。

cugcuccagggaagcuucuaugg(seqidno：64)。

cgcucaagguccuguaugccacc(seqidno：65)。

gaguucaccaagcucaacauuua(seqidno：66)。

ugcugcugcucacccuuaugaac(seqidno：67)。

cccaucuccgugcucuucuuuga(seqidno：68)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，將本發(fā)明的慢病毒導(dǎo)入淋巴細(xì)胞所得的轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞，該t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對腫瘤細(xì)胞殺傷能力大大提高，尤其對cd19⁺惡性b細(xì)胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷效果尤為顯著。

在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種慢病毒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述慢病毒攜帶含有seqidno：69所示的核苷酸序列。

agatctactagttctagaatgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatcta ccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaaaagcttggtaccctcgagcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgggtcgaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacacctccccaggcgcagatcaaagagagttcaagagactctctttgatctgcgccttttttagctatcgatatc(seqidno： 69)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，將本發(fā)明實施例的慢病毒導(dǎo)入淋巴細(xì)胞所得的轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞，該轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力大大提高，尤其對cd19⁺惡性b細(xì)胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷效果尤為顯著。

在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種慢病毒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述慢病毒攜帶含有seqidno：70所示的核苷酸序列。

agatctactagttctagaatgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaaaagcttggtacc ctcgagcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgggtcgaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacacctccccgcatcacttgggattaatattcaagagatattaatcccaagtgatgctttttagctatcgatatc(seqidno：70)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，將本發(fā)明實施例的慢病毒導(dǎo)入淋巴細(xì)胞所得的轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞，該轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力大大提高，尤其對cd19⁺惡性b細(xì)胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷效果尤為顯著。

在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種慢病毒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述慢病毒攜帶含有seqidno：71所示的核苷酸序列。

atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcattcgtgccggtcttcctgccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatc tacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaccacaggaacaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaatcctactgcgtcgacttcgaactcgagcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgggtcgaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacacctccccaggcgcagatcaaagagagttcaagagactctctttgatctgcgccttttttagctatcgatatcgatagctaaaaagcatcacttgggattaatatctcttgaatattaatcccaagtgatgcggggaagatctgtggtctcatacagaacttataagattcccaaatccaaagacatttcacgtttatggtgatttcccagaacacatagcgacatgcaaatattgcagggcgccactcccctgtccctcacagccatcttcctgccagggcgcacgcgcgctgggtgttcccgcctagtgacactgggcccgcgattccttggagcgggttgatgacgtcagcgttcgaattgtcgac(seqidno：71)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，將本發(fā)明實施例的慢病毒導(dǎo)入淋巴細(xì)胞所得的轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞，該轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力大大提高，尤其對cd19⁺惡性b細(xì)胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷效果尤為顯著。

在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了一種轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默；以及表達(dá)嵌合抗原受體，其中，所述嵌合抗原受體包括：胞外區(qū)，所述胞外區(qū)能夠與抗原特異性結(jié)合；跨膜區(qū)；以及胞內(nèi)區(qū)，所述胞內(nèi)區(qū) 包括免疫共刺激分子胞內(nèi)段，所述抗原是腫瘤抗原，所述胞外區(qū)包括抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述抗體結(jié)合所述抗原，所述抗體為單鏈抗體，所述抗原為cd19。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默和表達(dá)特異性結(jié)合cd19的嵌合抗原受體的淋巴細(xì)胞，該淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷能力大大提高。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞還可以具有下列附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)獨(dú)立地選自ctla4、pd1、tim3、btla、lag3至少之一。上述分子具有負(fù)向調(diào)控和減弱細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用。在本發(fā)明中，細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的成功沉默，進(jìn)一步提高了轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞，該轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對腫瘤細(xì)胞殺傷能力進(jìn)一步加強(qiáng)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默是通過shrna、反義核酸、核酶、顯性負(fù)突變和鋅指核酸酶至少之一實現(xiàn)的。根據(jù)本發(fā)明的實施例，細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的成功沉默，進(jìn)一步提高了轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力進(jìn)一步加強(qiáng)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述免疫共刺激分子胞內(nèi)段獨(dú)立地選自4-1bb、ox-40、cd40l、cd27、cd30、cd28以及他們的衍生物的至少一種。免疫共刺激分子胞內(nèi)段的表達(dá)和細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的沉默的聯(lián)合具有正向調(diào)控和增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞對腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)是ctla4或pd1。根據(jù)本發(fā)明的時候例，細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)ctla4或pd1被沉默，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對腫瘤細(xì)胞殺傷能力更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默是通過shrna實現(xiàn)的。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明所提出的shrna具有高效、特異性的沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的作用，細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的成功沉默，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對腫瘤細(xì)胞殺傷能力進(jìn)一步提高，對腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述免疫共刺激分子胞內(nèi)段是4-1bb或cd28的胞內(nèi)段。本發(fā)明中的轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的嵌合抗原受體的免疫共刺激分子胞內(nèi)段是cd28或者4-1bb的胞內(nèi)段。根據(jù)本發(fā)明的實施例，免疫共刺激分子胞內(nèi)段是cd28或者4-1bb的胞內(nèi)段，顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的定向殺傷作用。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細(xì)胞是cd3⁺t淋巴細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞或自然殺傷t細(xì)胞。在本發(fā)明中，上述淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默和表達(dá)嵌合抗原受體，使得上述淋巴細(xì)胞的細(xì)胞免疫作用靶向性更強(qiáng)，該t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對腫瘤細(xì)胞殺傷能力進(jìn)一步提高，對腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

在本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構(gòu)建體包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)；以及第二核酸分子，所述第二核酸分子編碼嵌合抗原受體，其中，所述細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)和所述嵌合抗原受體如前所述。根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述構(gòu)建成功導(dǎo)入上述淋巴細(xì)胞并成功沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)和表達(dá)嵌合抗原受體后，使得淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對腫瘤細(xì)胞殺傷能力大幅提高，對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述構(gòu)建體還可以進(jìn)一步包括下列附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，其特征在于所述第一核酸分子與所述第二核酸分子被設(shè)置在前面所述的淋巴細(xì)胞中沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)和表達(dá)所述嵌合抗原受體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，成功設(shè)置上述第一核酸分子和第二核酸分子的淋巴細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤殺傷效果。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構(gòu)建體進(jìn)一步包括：第一啟動子，所述第一啟動子與所述第一核酸分子可操作地連接；以及第二啟動子，所述第二啟動子與所述第二核酸分子可操作地連接。根據(jù)本發(fā)明的實施例，第一和第二啟動子的引入，使得第一核酸分子和第二核酸分子分別獨(dú)立的表達(dá)，有效沉默了細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)和保證了嵌合抗原受體的生物學(xué)作用，使得淋巴細(xì)胞靶向作用更強(qiáng)，對腫瘤的定向殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述第一啟動子和所述第二啟動子分別獨(dú)立地選自u6，h1，cmv,ef-1,rsv啟動子。根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述啟動子具有啟動效率高的特點(diǎn)，從而保證了細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的高效沉默和嵌合抗原受體的高效表達(dá)，使得淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對腫瘤細(xì)胞殺傷能力大大提高，對腫瘤的定向殺傷效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構(gòu)建體載體是非致病性病毒。非致病性病毒載體的引入大大提高了構(gòu)建體在淋巴細(xì)胞中的復(fù)制和擴(kuò)增效率，從而大大提高了細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的沉默和嵌合抗原受體在淋巴細(xì)胞中的高效表達(dá)，使得淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對腫瘤細(xì)胞殺傷能力大大提高，淋巴細(xì)胞的靶向作用進(jìn)一步增強(qiáng)，對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更加顯著

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述非致病性病毒載體選自反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體和腺關(guān)聯(lián)病毒載體的至少之一。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的病毒的載體在病毒包裝和感染過程中，病毒感染范圍廣泛，既可感染終末分化細(xì)胞，又可感染處于分裂期的細(xì)胞，既可整合到宿主染色體，又可游離在宿主染色體之外，實現(xiàn)廣譜而高效的感染效率，從而細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被高效沉默和嵌合抗原受體在淋巴細(xì)胞中的高效表達(dá)，使得淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對腫瘤細(xì)胞殺傷能力大大提高，淋巴細(xì)胞的靶向作用進(jìn)一步增強(qiáng)，對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更加顯著。

在本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明提出了一種制備前面所述的t淋巴細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因淋巴 細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：將前面所述的構(gòu)建體或者前面所述的慢病毒引入到淋巴細(xì)胞中或者t淋巴細(xì)胞。所述構(gòu)建體或慢病毒成功引入上述淋巴細(xì)胞或者t淋巴細(xì)胞中，實現(xiàn)了淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查被沉默和特異性結(jié)合抗原cd19的嵌合抗原受體的表達(dá)，從而使得所得淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對腫瘤細(xì)胞殺傷能力大大提高，淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞對cd19⁺腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用更強(qiáng)。

在本發(fā)明的第九方面，本發(fā)明提出了一種用于治療癌癥的治療組合物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述治療組合物包括：上述構(gòu)建體、慢病毒、t淋巴細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞。上述任意一種治療組合物的組成均可實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的沉默和特異性結(jié)合抗原cd19的嵌合抗原受體在轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞中的高效表達(dá)，從而使得所得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對腫瘤細(xì)胞殺傷能力大大提高，轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞對cd19⁺腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用更強(qiáng)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述治療組合物還可以進(jìn)一步包括下列附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述癌癥包括選自b細(xì)胞淋巴瘤和b細(xì)胞白血病的至少之一。細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的沉默和嵌合抗原受體在轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞中的高效表達(dá)，使得所得淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞對b細(xì)胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用更強(qiáng)。

在本發(fā)明的第十方面，本發(fā)明提出了一種提高淋巴細(xì)胞活性的方法，根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細(xì)胞攜帶嵌合抗原受體，其特征在于，所述方法包括：使所述淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默，所述細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)、所述淋巴細(xì)胞和所述嵌合抗原受體是如前所定義的，所述淋巴細(xì)胞活性包括所述淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子的分泌能力和所述淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞能力的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實施例，淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默，細(xì)胞因子分泌增多，對腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用更強(qiáng)。

需要說明的是，本發(fā)明中所使用的術(shù)語“細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)”是一種淋巴細(xì)胞表面的膜蛋白，它是一種負(fù)調(diào)控的監(jiān)管機(jī)構(gòu)，其與腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的配體相互作用，可以抑制抗腫瘤淋巴細(xì)胞反應(yīng)。本發(fā)明中所提到的“細(xì)胞因子分泌增多”是細(xì)胞生理功能增強(qiáng)的表現(xiàn)。

附圖說明

圖1是根據(jù)本發(fā)明實施例的共表達(dá)cd19抗原特異性的嵌合抗原受體和沉默人細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的慢病毒載體的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是根據(jù)本發(fā)明實施例的共表達(dá)cd19抗原特異性的嵌合抗原受體和沉默pd1的淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的結(jié)果圖；以及

圖3是根據(jù)本發(fā)明實施例的共表達(dá)cd19抗原特異性的嵌合抗原受體和沉默pd1的淋巴細(xì)胞分泌干擾素-γ的結(jié)果圖。

具體實施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例，下面描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

t淋巴細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種t淋巴細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默；以及表達(dá)嵌合抗原受體，其中，所述嵌合抗原受體包括：胞外區(qū)，所述胞外區(qū)包括單鏈抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述單鏈抗體特異性識別抗原cd19；跨膜區(qū)，所述跨膜區(qū)與所述胞外區(qū)相連，并且嵌入到所述t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜中；胞內(nèi)區(qū)，所述胞內(nèi)區(qū)與所述跨膜區(qū)相連，并且所述胞內(nèi)區(qū)包括cd28的胞內(nèi)段以及cd3ζ鏈。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明提出的t淋巴細(xì)胞殺傷能力顯著增強(qiáng)，尤其對cd19⁺惡性b細(xì)胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷效果大大提高。

腫瘤可以避免免疫監(jiān)視，通過刺激免疫抑制性受體的表達(dá)而關(guān)閉免疫反應(yīng)。作為免疫負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制,激活的細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctls)表達(dá)負(fù)調(diào)控的監(jiān)管機(jī)構(gòu),即細(xì)胞表面的免疫檢查點(diǎn)分子。程序性細(xì)胞死亡1受體(pd1)表達(dá)在活化ctls上，其與腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的程序性死亡配體1(pd-l1b7-h1)相互作用,可以抑制抗腫瘤t細(xì)胞反應(yīng)。許多腫瘤,包括淋巴瘤、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺腫瘤,表達(dá)pd-l1。pd-l1與其配體pd1的結(jié)合，導(dǎo)致ctls增生性反應(yīng)的下調(diào),細(xì)胞因子的分泌減少,和t細(xì)胞的無能或凋亡。細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞抗原4(ctla4)是另一個t細(xì)胞的關(guān)鍵負(fù)面調(diào)節(jié)因子，其可抑制t細(xì)胞活化，其通過與表達(dá)在抗原遞呈細(xì)胞上的配體b7.1、b7.2(cd80和cd86)的相互作用而抑制t細(xì)胞的活化。因此，本發(fā)明中提出的t淋巴細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)被沉默，t淋巴細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力以及細(xì)胞因子的分泌能力顯著提高。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗體為單鏈抗體。單鏈抗體可去除非特異性反應(yīng)的競爭性表面蛋白，同時單鏈抗體更易滲透腫瘤組織增加藥物治療濃度。本發(fā)明提出的轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞表達(dá)單鏈抗體的嵌合抗原受體，大大提高了轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞對靶向腫瘤細(xì)胞的定向殺傷作用。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗原為cd19。因此所述轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞針對表達(dá)抗原cd19的細(xì)胞具有定向性殺傷作用，抗原抗體的特異性結(jié)合作用更強(qiáng)，大大提高了本發(fā)明的轉(zhuǎn)基 因淋巴細(xì)胞對cd19抗原表達(dá)腫瘤細(xì)胞的定向殺傷作用。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)獨(dú)立地選自ctla4、pd1、tim3、btla、lag3至少之一。上述分子能夠與腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的抗原特異性結(jié)合，負(fù)向調(diào)控和減弱細(xì)胞免疫應(yīng)答。在本發(fā)明中，細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的成功沉默，進(jìn)一步提高了轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的定向殺傷作用進(jìn)一步加強(qiáng)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默是通過shrna、反義核酸、核酶、顯性負(fù)突變和鋅指核酸酶至少之一實現(xiàn)的。

小發(fā)夾rna或短發(fā)夾rna(shrna)是sirna(小干擾rna)的導(dǎo)入形式，sirna是一種小rna分子(由21～25個核苷酸組成)，由dicer(rnaaseⅲ家族中對雙鏈rna具有特異性剪切作用的酶)加工而成；sirna在rna沉默通路中起中心作用，對特定信使rna(mrna)進(jìn)行降解，為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控。

反義核酸包括反義rna和反義dna，反義rna是指能和mrna完全互補(bǔ)的一段小分子rna或寡聚核苷酸片段，反義dna是指能與基因dna雙鏈中的有義鏈互補(bǔ)結(jié)合的短小dna分子，反義rna和反義dna主要是通過mrna的翻譯和基因dna的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用的；反義核酸一方面通過與靶mrna結(jié)合形成空間位阻效應(yīng)，阻止核糖體與mrna結(jié)合，另一方面其與mrna結(jié)合后激活內(nèi)源性rna酶或核酶，進(jìn)而降解mrna；反義dna與基因dna雙螺旋的調(diào)控區(qū)特異結(jié)合形成dna三聚體，或與dna編碼區(qū)結(jié)合，終止正在轉(zhuǎn)錄的mrna鏈的延長；反義核酸還可抑制轉(zhuǎn)錄后mrna的加工修飾，如5'端加帽、3'端加尾、中間剪接和內(nèi)部堿基甲基化等，并阻止成熟mrna由細(xì)胞核向細(xì)胞漿內(nèi)運(yùn)輸，因此，反義rna是一種有效的沉默目的基因的技術(shù)。

核酶是具有催化功能的rna分子，是生物催化劑，可降解特異的mrna序列，核酶通過催化轉(zhuǎn)磷酸酯和磷酸二酯鍵水解反應(yīng)參與rna自身剪切、加工過程，與一般的反義rna相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到rna酶的攻擊，更重要的是，核酶在切斷mrna后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結(jié)合和切割其它的mrna分子。

顯性負(fù)性突變是指某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白突變后不僅自身無功能，還能抑制或阻斷同一細(xì)胞內(nèi)的野生型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的作用，其主要通過和野生型蛋白形成二聚物的方式實現(xiàn)，這種突變毒性作用大，能顯著抑制或阻斷細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的作用。

鋅指核酸酶由一個dna識別域和一個非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成，dna識別域是由一系列cys2-his2鋅指蛋白串聯(lián)組成(一般3～4個)，每個鋅指蛋白識別并結(jié)合一個特異的三聯(lián)體堿基，鋅指蛋白形成α-β-β二級結(jié)構(gòu)，其中α螺旋的16氨基酸殘基決定鋅指的dna結(jié)合特異性，骨架結(jié)構(gòu)保守，對決定dna結(jié)合特異性的氨基酸引入序列的改變可以獲得新的dna結(jié)合特異性，從而可以針對不同的目的基因設(shè)計不同的氨基酸引入序列，實現(xiàn)不同 目的基因的特異性沉默。

綜上所述，shrna、反義核酸、核酶、顯性負(fù)突變、crispr、鋅指核酸酶為特異性沉默目標(biāo)基因的有效手段，沉默基因的手段不受特別限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)具體的實驗?zāi)康暮蜅l件選擇，如本發(fā)明實施例所采用的shrna、反義核酸、核酶、顯性負(fù)突變，或鋅指核酸酶的至少之一，實現(xiàn)目的基因的特異性沉默。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默優(yōu)選采用shrna實現(xiàn)。shrna所攜帶的sirna分子通常是一個長度在10和30之間的堿基對的雙重區(qū)域。本發(fā)明實施例的pd1或ctla4sirna被設(shè)計為同源于pd1或ctla4mrna的編碼區(qū)域，通過mrna的降解來抑制基因表達(dá)。sirna關(guān)聯(lián)于被稱為誘導(dǎo)rna沉默復(fù)合物(risc)的多重蛋白復(fù)合物，在此期間正義鏈被酶裂解。被激活的risc中基于序列同源性，指引risc到對應(yīng)的mrna；相同的核酸酶切割靶向pd1或ctla4mrna，產(chǎn)生特定基因pd1或ctla4沉默，抑制特定基因pd1或ctla4的表達(dá)。sirna以shrna的形式導(dǎo)入細(xì)胞(shrna包含大約18-23的核苷酸sirna序列，后跟一個9-15長度的核苷酸環(huán)和一個sirna序列的反向補(bǔ)充)，shrna的設(shè)計較好的避免了在3’utr細(xì)胞基因中的匹配點(diǎn)；確保了適當(dāng)?shù)逆溸x擇。一個單一sirna分子可被重復(fù)應(yīng)用于多靶向mrna分子的分裂。rnai(rna干擾)可通過引入合成sirna的方式被誘導(dǎo)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的shrna不斷產(chǎn)自細(xì)胞內(nèi)，因此其效果更加持久，從而延長shrna周期，本發(fā)明實施例采用的shrna具有高效、特異性的沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的作用，細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的成功沉默，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞具有顯著的抵抗腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制的特性，對腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述免疫共刺激分子胞內(nèi)段獨(dú)立地選自4-1bb、ox-40、cd40l、cd27、cd30、cd28以及他們的衍生物的至少一種。免疫共刺激分子胞內(nèi)段的表達(dá)和細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的沉默的聯(lián)合具有正向調(diào)控和增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞對腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)是ctla4或pd1。根據(jù)本發(fā)明的時候例，細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)ctla4或pd1被沉默，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力得到進(jìn)一步提高，對腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

本發(fā)明中的淋巴細(xì)胞是cd3⁺淋巴細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞或自然殺傷t細(xì)胞。cd3⁺淋巴細(xì)胞是總t細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞是免疫細(xì)胞的一種，非特異性性識別靶細(xì)胞，自然殺傷t細(xì)胞是具有t細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞受體的t細(xì)胞亞群。上述淋巴細(xì)胞中免疫共刺激分子被沉默和表達(dá)嵌合抗原受體，使得上述淋巴細(xì)胞的細(xì)胞免疫作用靶向性更強(qiáng)，對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用效果更加顯著。

慢病毒或構(gòu)建體

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種慢病毒或構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述慢病毒或構(gòu)建體攜帶下列核酸分子：編碼嵌合抗原受體的核酸分子，所述嵌合抗原受體具有seqidno：1所示的氨基酸序列，所述編碼嵌合抗原受體的核酸分子具有seqidno：2所示的核苷酸序列；以及沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的核酸分子，所述沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的核酸分子的核苷酸序列為選自seqidno：3～68的至少之一。其中，seqidno：3～14是人類程序性細(xì)胞死亡受體1(pd1)sirna的核苷酸序列，seqidno：15～30是人類細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞抗原4(ctla4)sirna的核苷酸序列，seqidno：31～46是人類t細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白分子3(tim3)sirna的核苷酸序列，seqidno：47～57是人類t淋巴細(xì)胞衰減因子(btla)sirna的核苷酸序列，seqidno：58～68是人類淋巴細(xì)胞活化基因3蛋白(lag3)sirna的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實施例，將本發(fā)明的慢病毒或構(gòu)建體導(dǎo)入淋巴細(xì)胞所得的轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞，其細(xì)胞表面的免疫檢查點(diǎn)pd1、ctla4、tim3、btla、lag3被特異性沉默，特意向結(jié)合抗原cd19的嵌合抗原受體高效表達(dá)，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞抗調(diào)亡能力和增殖能力增強(qiáng)、定向殺傷能力顯著提高，從而使得基因淋巴細(xì)胞對cd19⁺惡性b細(xì)胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷效果尤為顯著。

根據(jù)本發(fā)明地實施例，本發(fā)明提出的慢病毒或構(gòu)建體攜帶含有seqidno：69、70或71所示的核苷酸序列。其中，seqidno：69是共表達(dá)抗cd19嵌合抗原受體和沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)pd-1的核酸分子(cd19-car/ipd1)，seqidno：70是共表達(dá)抗cd19嵌合抗原受體和沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)ctla4的核酸分子(cd19-car/ictla4)，seqidno：71是共表達(dá)抗cd19嵌合抗原受體和沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)pd-1和ctla4的核酸分子(cd19-car/ipd1/ictla4)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，將本發(fā)明的慢病毒導(dǎo)入淋巴細(xì)胞所得的轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞，其細(xì)胞表面的免疫檢查點(diǎn)pd1、ctla4被特異性沉默，抗cd19的嵌合抗原受體高效表達(dá)，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞抗調(diào)亡能力和增殖能力增強(qiáng)、定向殺傷能力顯著提高，從而使得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞對cd19⁺惡性b細(xì)胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷效果尤為顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，發(fā)明人是通過如下方式實現(xiàn)上述細(xì)胞嵌合抗原受體以及細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)shrna分別獨(dú)立地表達(dá)的，其中，需要說明的是，此處的表達(dá)既指蛋白的表達(dá)又指rna轉(zhuǎn)錄。

啟動子：第一啟動子，所述第一啟動子與編碼嵌合抗原受體的核酸分子可操作地連接；以及第二啟動子，所述第二啟動子與沉默免疫檢查點(diǎn)的核酸分子可操作地連接。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述第一啟動子和所述第二啟動子分別獨(dú)立地選自u6，h1，cmv,ef-1,rsv啟動子，第一和第二啟動子的引入，使得編碼嵌合抗原受體的核酸分子和沉默細(xì)胞表面免 疫檢查點(diǎn)的核酸分子分別獨(dú)立的表達(dá)，有效沉默了細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)和保證了嵌合抗原受體的高效表達(dá)，使得淋巴細(xì)胞的靶向作用更強(qiáng)，對腫瘤的定向殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，也可進(jìn)一步引入第三啟動子，第三啟動子與沉默細(xì)胞表面的免疫檢查點(diǎn)的核酸分子可操作的連接，第三啟動子和第二啟動子所連接的沉默細(xì)胞表面的免疫檢查的核酸分子不同，第三啟動子和第二啟動子分別啟動沉默不同免疫檢查點(diǎn)的shrna。

通過上述第一、第二啟動子或進(jìn)一步第三啟動子的的引入，使得免疫檢查點(diǎn)被高效沉默和嵌合抗原受體高效地表達(dá)在上述轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞膜上，從而高效抑制了免疫檢查點(diǎn)的免疫負(fù)調(diào)控和保證了嵌合抗原受體的生物學(xué)作用，從而使得淋巴細(xì)胞靶向殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構(gòu)建體的載體是非致病性病毒載體。非致病性病毒載體的引入大大提高了構(gòu)建體在淋巴細(xì)胞中的復(fù)制和擴(kuò)增效率，使得淋巴細(xì)胞的靶向作用進(jìn)一步增強(qiáng)，對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述非致病性病毒載體選自反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體和腺病毒關(guān)聯(lián)病毒載體的至少之一。根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述構(gòu)建體病毒感染范圍廣泛，既可感染終末分化細(xì)胞，又可感染處于分裂期的細(xì)胞，既可整合到宿主染色體，又可游離在宿主染色體之外，實現(xiàn)廣譜而高效的感染效率，從而細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被高效沉默和抗cd19的嵌合抗原受體在淋巴細(xì)胞中的高效表達(dá)，使得淋巴細(xì)胞的靶向作用進(jìn)一步增強(qiáng)，對cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，以構(gòu)建一個慢病毒載體為例，發(fā)明人為了構(gòu)建一個慢病毒載體，在某些病毒序列的位置，將目的核酸插入到病毒基因組中，從而產(chǎn)生復(fù)制缺陷的病毒。為了產(chǎn)生病毒體，發(fā)明人進(jìn)而構(gòu)建包裝細(xì)胞系(包含gag，pol和env基因，但不包括ltr和包裝成分)。發(fā)明人將含有目的基因的重組質(zhì)粒，連同慢病毒ltr和包裝序列，一起引入包裝細(xì)胞系中。包裝序列允許重組質(zhì)粒rna轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被包裝到病毒顆粒中，然后被分泌到培養(yǎng)基中。進(jìn)而發(fā)明人收集包含重組慢病毒的基質(zhì)，有選擇性地濃縮，并用于基因轉(zhuǎn)移。慢載體可以感染多種細(xì)胞類型，包括可分裂細(xì)胞和不可分裂細(xì)胞。

另外，根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的慢病毒是復(fù)合慢病毒，除了常見的慢病毒基因gag，pol和env，還包含有調(diào)控和結(jié)構(gòu)功能的其他基因。慢病毒載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，慢病毒包括：人類免疫缺陷病毒hiv–1，hiv–2和猿猴免疫缺陷病毒siv。慢病毒載體通過多重衰減艾滋病毒致病基因產(chǎn)生，例如全部刪除基因env，vif，vpr，vpu和nef，使慢病毒載體形成生物安全型載體。重組慢病毒載體能夠感染非分裂細(xì)胞，同時可用于體內(nèi)和體外基因轉(zhuǎn)移和核酸序列表達(dá)。例如：在合適的宿主細(xì)胞中，和帶有包裝功能(gag，pol，env，rev和tat)的兩個或更多的載體一起，能夠感染非分裂細(xì)胞。重組 病毒的靶向性，是通過抗體或特定配體(靶向特定細(xì)胞類型受體)與膜蛋白的結(jié)合來實現(xiàn)的。同時，重組病毒的靶向性通過插入一個有效序列(包括調(diào)控區(qū)域)到病毒載體中，連同另一個編碼了特定靶細(xì)胞上的受體的配體的基因，使載體具有了特定的靶向。各種有用的慢病毒載體，以及各種方法和操作等產(chǎn)生的載體，用于改變細(xì)胞的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的慢病毒載體可有效運(yùn)送和共表達(dá)shrna(sirna的轉(zhuǎn)運(yùn)形式)，該小shrna可以有效抑制pd1或ctla4的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的腺關(guān)聯(lián)病毒載體(aav)可使用一種或多種為人熟知的血清類型腺關(guān)聯(lián)病毒載體的dna構(gòu)建。本領(lǐng)域技術(shù)人員構(gòu)建一個合適的腺關(guān)聯(lián)病毒載體，以此攜帶和共表達(dá)小發(fā)夾rna，該小發(fā)夾rna可以抑制pd1或ctla4基因的表達(dá)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的腺關(guān)聯(lián)病毒載體(aav)可使用一種或多種為人熟知的血清類型腺關(guān)聯(lián)病毒載體的dna構(gòu)建。本領(lǐng)域技術(shù)人員構(gòu)建一個合適的腺關(guān)聯(lián)病毒載體，以此攜帶和共表達(dá)小發(fā)夾rna，該小發(fā)夾rna可以抑制pd1或ctla4基因的表達(dá)。

另外，根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的也包含微基因。微基因意味著用組合(選定的核苷酸序列和可操作的必要的相關(guān)連接序列)來指導(dǎo)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)錄和/或基因產(chǎn)物在體內(nèi)或體外的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。應(yīng)用“可操作的連接”序列包含連續(xù)目的基因的表達(dá)控制序列，和作用于反式或遠(yuǎn)距離控制目的基因的表達(dá)控制序列。

另外，本發(fā)明實施例的載體還包括常規(guī)控制元素，在和質(zhì)粒載體一起的細(xì)胞轉(zhuǎn)染或/和病毒載體一起的細(xì)胞感染中，這些元素允許轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)化和/或小發(fā)夾rna的表達(dá)。大量的表達(dá)控制序列(包括天然的，可誘導(dǎo)和/或特定組織的啟動子)可能被使用。根據(jù)本發(fā)明的實施例，表達(dá)shrna的啟動子為rna聚合酶啟動子。同時，根據(jù)本發(fā)明的實施例，啟動子為選自u6,h1,poli,polii和poliii的ran聚合酶啟動子。根據(jù)本發(fā)明的實施例，啟動子為組織特異型啟動子。根據(jù)本發(fā)明的實施例，啟動子為誘導(dǎo)型啟動子。根據(jù)本發(fā)明的實施例，啟動子為選自基于所選載體的啟動子。根據(jù)本發(fā)明的實施例，當(dāng)選擇慢病毒載體時，啟動子為u6,h1,cmvie基因,ef-1α,泛素c,或磷酸甘油激酶(pgk)啟動子。其他常規(guī)表達(dá)控制序列包括可選標(biāo)記或報告基因，包括編碼遺傳霉素，潮霉素，氨芐青霉素或嘌呤霉素耐藥性等的核苷酸序列。載體的其他組件包括復(fù)制起點(diǎn)。

構(gòu)建載體的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，這些技術(shù)包括常規(guī)克隆技術(shù)，例如在本發(fā)明實施例中所使用的shrna、聚合酶鏈反應(yīng)和任何適當(dāng)?shù)奶峁┧璧暮塑账嵝蛄械姆椒ā?/p>

根據(jù)本發(fā)明的實施例，發(fā)明人構(gòu)建了共表達(dá)小發(fā)夾rna(shrna)(用來抑制免疫檢查點(diǎn))以及嵌合抗原受體(car)的病毒載體。本發(fā)明實施例的運(yùn)送沉默pd1或ctla4的sirna的小發(fā)夾rna以及表達(dá)嵌合抗原受體(car)的病毒載體或質(zhì)粒是復(fù)合的，此病毒 載體或質(zhì)?？山Y(jié)合聚合物或其他材料來增加其穩(wěn)定性，或協(xié)助其靶向運(yùn)動。

制備轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的方法

本發(fā)明提出了一種制備前面所述的t淋巴細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：將前面所述的構(gòu)建體或者前面所述的慢病毒引入到淋巴細(xì)胞中或者t淋巴細(xì)胞。引入方式可以選自電轉(zhuǎn)或病毒感染宿主細(xì)胞的方式引入。所述構(gòu)建體或慢病毒成功引入上述淋巴細(xì)胞或者t淋巴細(xì)胞中，實現(xiàn)了淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查被沉默和抗cd19的嵌合抗原受體的表達(dá)，從而使得所得淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用更強(qiáng)。

治療癌癥的治療組合物

本發(fā)明的提出了一種用于治療癌癥的治療組合物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述治療組合物包括：上述構(gòu)建體、慢病毒、t淋巴細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞。上述任意一種治療組合物的組成均可實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的沉默和抗cd19嵌合抗原受體在轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞中的高效表達(dá)，從而使得所得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用更強(qiáng)。

提供給患者的這些治療組合物,較好的應(yīng)用于生物兼容溶液或可接受的藥學(xué)運(yùn)載載體。作為準(zhǔn)備的各種治療組合物被懸浮或溶解在醫(yī)藥上或生理上可接受的載體，如生理鹽水；等滲的鹽溶液或其他精于此道的人的比較明顯的配方中。適當(dāng)?shù)妮d體在很大程度上取決于給藥途徑。其他有水和無水的等滲無菌注射液和有水和無水的無菌懸浮液，是醫(yī)藥上可接受的載體。

足夠數(shù)量的病毒載體被轉(zhuǎn)導(dǎo)入靶向t細(xì)胞中，并提供足夠強(qiáng)度的轉(zhuǎn)基因，沉默pd1或ctla4和表達(dá)特有的抗cd19嵌合抗原受體。治療試劑的劑量主要取決于治療狀況,年齡，體重，病人的健康程度，從而可能造成病人的變異性。

沉默pd1或ctla4或沉默pd1和ctla4和表達(dá)特有的cd19嵌合抗原受體的這些方法是聯(lián)合治療的一部分。這些病毒載體和用于過繼免疫治療的抗腫瘤t細(xì)胞，可以被單獨(dú)或結(jié)合其他治療癌癥的方法一起執(zhí)行。在合適的條件下，一個治療方法的發(fā)明包括使用一個或多個藥物療法。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述癌癥包括選自b細(xì)胞淋巴瘤或b細(xì)胞白血病的至少之一。細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的沉默和抗cd19的嵌合抗原受體在轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞中的高效表達(dá)，使得所得淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對對b細(xì)胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用更強(qiáng)。

提高淋巴細(xì)胞活性的方法

本發(fā)明提出了一種提高淋巴細(xì)胞活性的方法，根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細(xì)胞攜 帶嵌合抗原受體，其特征在于，所述方法包括：使所述淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默，所述細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)、所述淋巴細(xì)胞和所述嵌合抗原受體是如前所定義的，所述淋巴細(xì)胞活性所述淋巴細(xì)胞活性包括所述淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子的分泌能力和所述淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞能力的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實施例，淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默，細(xì)胞因子分泌增多，對腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用更強(qiáng)。

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考j.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1

本發(fā)明實施例中所用到的細(xì)胞系和基本實驗技術(shù)如下所述：

細(xì)胞系

實施例中用到下述細(xì)胞系:oci-ly3細(xì)胞(cd19⁺彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系(dlbcl)),jurkat細(xì)胞(cd19^-t淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞系),和k562(自然殺傷細(xì)胞的靶細(xì)胞)。以上細(xì)胞均都來自于atcc(美國細(xì)胞庫)及dsmz(德國細(xì)胞庫)，并且培養(yǎng)于加有10％或20％胎牛血清和2毫升的左旋谷胺酰胺的rpmi–1640培養(yǎng)基中(購自gibco-brl,sanfrancisco,ca,usa)。

慢病毒的產(chǎn)生和人t淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)

產(chǎn)生復(fù)制缺陷的慢病毒載體，并將慢病毒載體離心收集用于人t淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。下面簡要介紹慢病毒載體的產(chǎn)生、收集的實驗過程：將293t細(xì)胞鋪在底面積為150-平方厘米的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并根據(jù)說明書，使用express-in(購自openbiosystems/thermoscientific,waltham,ma)對293t細(xì)胞進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。每盤細(xì)胞加入15μg的慢病毒轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒、5μg的pvsv-g(vsv糖蛋白表達(dá)質(zhì)粒)、10μg的pcmvr8.74質(zhì)粒(gag/pol/tat/rev表達(dá)質(zhì)粒)和174μl的express-in(濃度為1μg/μl)。分別于24小時和48小時收集上清，并使用超速離心機(jī)在28,000rpm(離心機(jī)轉(zhuǎn)子為beckmansw32ti，購自beckmancoulter,brea,ca)的條件下離心2小時。最后用0.75ml的rpmi-1640培養(yǎng)基對病毒質(zhì)粒沉淀進(jìn)行重懸。

從健康志愿者供體上分離人原代t淋巴細(xì)胞。人t淋巴細(xì)胞培養(yǎng)在rpmi-1640培養(yǎng)基中并使用抗cd3和cd28的單克隆抗體包被的磁珠(購自invitrogen,carlsbad,ca)進(jìn)行刺激激活。人t淋巴細(xì)胞激活后的18～24小時，采用自旋-接種的方法對t淋巴細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo) 過程如下所述：在24-孔板中，每孔鋪有0.5×10⁶t淋巴細(xì)胞，向每孔細(xì)胞中加入0.75ml的上述重懸的病毒上清和polybrene(濃度為8μg/ml)。細(xì)胞和病毒質(zhì)粒的混合液在臺式離心機(jī)(購自sorvallst40；thermoscientific)中離心，離心條件是室溫，2500rpm，時間為90分鐘。人重組白細(xì)胞介素-2(il-2；購自novartis,basel,switzerland)每隔2～3天加入t淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中，il-2的終濃度為100-iu/ml,在t淋巴細(xì)胞培養(yǎng)過程中，保持細(xì)胞的密度為0.5×10⁶～1×10⁶/ml。一旦被轉(zhuǎn)導(dǎo)的t淋巴細(xì)胞出現(xiàn)休眠，例如細(xì)胞生長速度變慢和細(xì)胞變小，其中，細(xì)胞生長速度和大小是通過multisizer3coultercounter(購自beckmancoulter)評估的，或被轉(zhuǎn)導(dǎo)的t淋巴細(xì)胞在某個計劃的時間點(diǎn)上，t淋巴細(xì)胞即可用來做功能分析。

本申請的實施例中所用的流式細(xì)胞儀為bdfacscantoii(購自bdbiosciences)，并且流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)使用flowjoversion7.2.5軟件(購自treestar,ashland,or)進(jìn)行分析。

測定細(xì)胞因子的分泌

在慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞(細(xì)胞個數(shù)是1×10⁶/孔)與oci-ly3淋巴瘤細(xì)胞(oci-ly3細(xì)胞表達(dá)cd19和pd-l1)共培養(yǎng)，實驗過程中改變不同的效靶細(xì)胞比例。應(yīng)用特定的酶聯(lián)免疫吸附測定法(細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附測試劑盒，購自r&dsystems,inc.,minneapolis,mn,usa)檢測細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子的產(chǎn)量。上述細(xì)胞上清液取自培養(yǎng)了24小時、48小時和72小時之后的細(xì)胞的上清，測定結(jié)果用來衡量有代表性的細(xì)胞因子(干擾素-γ)(ifnγ)的產(chǎn)量。

簡要測定過程如下：酶標(biāo)板中加入100微升/孔的作為一系列標(biāo)準(zhǔn)對照的細(xì)胞因子稀釋溶液(如ifnγ)或待測細(xì)胞上清溶液，并將酶標(biāo)板在室溫下放置2小時。2小時后吸棄酶標(biāo)板中溶液并用400微升的洗液潤洗酶標(biāo)板，潤洗四次。潤洗后，向酶標(biāo)板每個孔中加入200微升的酶聯(lián)抗細(xì)胞因子抗體。繼續(xù)在室溫下放置2個小時，之后向每孔中加入200微升的底物溶液。加入底物溶液后，將酶標(biāo)板在室溫下放置30分鐘，之后，向每孔中加入50微升的終止反應(yīng)液。在30分鐘內(nèi)測定酶標(biāo)板每孔的光密度。酶標(biāo)儀設(shè)置在450nm。

鉻釋放實驗

實施例中應(yīng)用4–小時⁵¹鉻釋放法分析評估表達(dá)抗cd19嵌合抗原受體t細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。

具體步驟如下：目標(biāo)測試細(xì)胞用⁵¹cr在37攝氏度下標(biāo)記1小時。標(biāo)記后，用含有10％胎牛血清(fcs)的rpmi培養(yǎng)基潤洗細(xì)胞。潤洗后，將細(xì)胞重懸在相同的培養(yǎng)基中，重懸細(xì)胞的濃度是1×10⁵/ml。轉(zhuǎn)導(dǎo)后t細(xì)胞以不同的效靶細(xì)胞比值(e：t)加入目標(biāo)測試細(xì)胞懸浮液中，并將細(xì)胞種在96-孔中，每孔體積是200微升。將細(xì)胞培養(yǎng)在37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時。4小時后，從每孔中取出30微升的上清放于計數(shù)器的96-微孔板進(jìn)行計數(shù)分析。分析儀 器是頂級計數(shù)nxt微閃爍計數(shù)器(購自packardbioscience)。所有計數(shù)孔中效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)目是基于t細(xì)胞總數(shù)來計算的。被標(biāo)記的目標(biāo)測試細(xì)胞包括oci-ly3(cd19⁺,pd-l1⁺),和jurkat(cd19^–)細(xì)胞.

實施例2構(gòu)建共表達(dá)pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的載體

本實施例中，發(fā)明人將編碼有抗人體cd19的單鏈抗體的序列、cd28胞內(nèi)段和t細(xì)胞受體組合的ζ-鏈序列克隆到lv慢病毒載體上，克隆過程中，選擇的限制性酶切是xbai和noti雙酶切,以及noti和xhoi雙酶切,通過酶切、連接、篩選和目的質(zhì)粒的擴(kuò)增，生成連接有編碼抗cd19嵌合抗原受體核苷酸序列的慢病毒質(zhì)粒(lv-cd19car)；u6啟動子和pd1-shrna(shpd1)的序列被克隆進(jìn)上述lv-cd19car的慢病毒質(zhì)粒，生成連接有shpd1序列和編碼抗cd19嵌合抗原受體的核苷酸序列的慢病毒質(zhì)粒(lv-cd19car-shpd1)。載體示意圖如圖1所示。圖1顯示了構(gòu)建相關(guān)lv慢病毒載體的示意圖(包含u6啟動子、編碼人體shpd1的序列和編碼抗cd19嵌合抗原受體序列)。

實施例3共表達(dá)pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞的靶向殺傷能力增強(qiáng)

在本實施例中，外周血淋巴細(xì)胞取自不記名供血者。外周血淋巴細(xì)胞通過梯度離心進(jìn)行分離，梯度離心機(jī)為ficoll-hypaque。t淋巴細(xì)胞與t細(xì)胞激活因子磁珠cd3/cd28(購自invitrogen,carlsbad,ca)在5％co2、37攝氏度下孵育培養(yǎng)72小時，培養(yǎng)基是加有2mmol/l谷氨酰胺,10％高溫滅活的胎牛血清(fcs)(購自sigma-aldrichco.)和100u/ml的青霉素/鏈霉素雙抗的rpmi培養(yǎng)基1640(購自invitrogengibcocat.no.12633-012)。激活培養(yǎng)72小時后，用洗液潤洗細(xì)胞，將磁珠洗去。將t細(xì)胞種在鋪有重組纖連蛋白片段(fnch-296；retronectin)細(xì)胞培養(yǎng)皿上，并用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo),轉(zhuǎn)導(dǎo)載體分別為lv-cd19car-shpd1，lv-cd19car，lv-shpd1或空載(lv-gfp)。轉(zhuǎn)導(dǎo)過程如實施例1所述。轉(zhuǎn)導(dǎo)后的t細(xì)胞培養(yǎng)在rpmi-1640培養(yǎng)基中并用重組人類il-2因子(100ng/ml；購自r&dsystems)進(jìn)行誘導(dǎo)擴(kuò)增7-10天，然后進(jìn)行功能測試實驗。發(fā)明人測量轉(zhuǎn)導(dǎo)了不同慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞對(cd19^-和cd19⁺)淋巴瘤細(xì)胞的殺傷作用，效靶細(xì)胞比例是10：1，測量方法采用標(biāo)準(zhǔn)4–小時⁵¹鉻釋放法，4–小時⁵¹鉻釋放法如實施例1所述。結(jié)果如圖2所示。

如圖2結(jié)果所示,共表達(dá)shpd1和抗cd19嵌合抗原受體的人t細(xì)胞比單獨(dú)表達(dá)抗cd19嵌合抗原受體或shpd1的t細(xì)胞,可更為有效的殺死oci-ly3淋巴瘤細(xì)胞(cd19⁺，pdl1⁺)。單獨(dú)表達(dá)shpd1的t細(xì)胞對cd19⁺淋巴瘤細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒性。表達(dá)抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞或共表達(dá)shpd1和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞對jurkat(cd19^-)淋巴瘤細(xì)胞 沒有顯著殺傷作用?？蛰d質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)t淋巴細(xì)胞(對照t淋巴細(xì)胞)對cd19⁺或cd19^-淋巴瘤細(xì)胞均為明顯殺傷作用。

實施例4共表達(dá)shpd1和抗cd19嵌合抗原受體的t淋巴細(xì)胞具有細(xì)胞因子分泌更的特點(diǎn)

在t淋巴細(xì)胞激活因子磁珠cd3/cd28存在下，被激活的t淋巴細(xì)胞經(jīng)過慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)、體外擴(kuò)增培養(yǎng)，方法如上所述.在慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞(細(xì)胞個數(shù)是1×10⁶/孔)與cd19⁺/pdl1⁺的oci-ly3淋巴瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，3天后，用酶聯(lián)免疫吸附(elisa)法評估細(xì)胞因子的分泌和細(xì)胞的活性，elisa實驗方法如實施例1所述。實驗結(jié)果如圖3所示。圖3結(jié)果表明，轉(zhuǎn)導(dǎo)了lv-cd19car-shpd1的t淋巴細(xì)胞比轉(zhuǎn)導(dǎo)了lv-cd19car或lv-shpd1載體的t淋巴細(xì)胞分泌更多的ifnγ(p<0.05；lv-cd19car-shpd1vs.lv-cd19car)。

實施例5共表達(dá)ctla4-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞和共表達(dá)ctla4-shrna、pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞的靶向殺傷能力增強(qiáng)，并且具有細(xì)胞因子分泌更多的特點(diǎn)

在本實施例中，發(fā)明人還考察共表達(dá)ctla4-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞的靶向殺傷能力、細(xì)胞因子分泌能力，實驗過程與實施例3和實施例4相同，實驗結(jié)論與共表達(dá)pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞類似，即共表達(dá)ctla4-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞比單獨(dú)表達(dá)抗cd19嵌合抗原受體或ctla4-shrna的t細(xì)胞的靶向殺傷能力增強(qiáng)，細(xì)胞因子分泌增多。

發(fā)明人還考察共表達(dá)ctla4-shrna、pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞的靶向殺傷能力、細(xì)胞因子分泌能力，實驗過程與實施例3和實施例4相同，發(fā)現(xiàn)共表達(dá)ctla4-shrna、pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞的靶向殺傷能力和細(xì)胞因子分泌能力強(qiáng)于共表達(dá)ctla4-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞或共表達(dá)pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。