專利名稱：有效抗腫瘤的副粘病毒的制作方法
有效抗腫瘤的副粘病毒本發(fā)明涉及通過給予活動物副粘病毒來治療腫瘤。所述病毒具有殺死人腫瘤細胞 但在相同劑量下不殺死人正常分化細胞和人正常增殖細胞的選擇性。通過基因改造，該病 毒得以修飾從而一或多個基因被相關副粘病毒的同源基因取代。任選這些同源基因作為其 他轉基因插入病毒基因組。通過所述方法，產(chǎn)生的嵌合病毒的抗腫瘤活性與親代病毒相比 是提高的。基因工程的方法也允許修飾腫瘤細胞中表達的酶識別的F蛋白裂解位點。本領域已知，溶瘤病毒可用作癌癥治療劑。常用于治療腫瘤的溶瘤病毒在 Chiocca, 2002 中描述。溶瘤病毒列表見于 Vaha-Koskela，Heikkila，and Hinkkanen，2007。 這些病毒屬于各種病毒種類和科。已經(jīng)作為溶瘤藥劑檢測過的副粘病毒科的病毒包括麻疹病毒(例如(Peng et al.，2001)，新城疫病毒(例如 Sinkovics and Horvath，2000)，Tupaia 畐 Ij 粘病毒 (Springfeld et al.，2005)，腮腺炎病毒(例如 Myers et al.，2005)，猿猴病毒 5 (例如 Parks et al.，2002)和仙臺病毒(例如 Kinoh et al. ,2004)。在Stojdl et al.，2003中描述了所有檢測的腫瘤細胞系中有80%中在水泡性口 炎病毒(VSV)感染之后的干擾素反應中存在缺陷。推定相似百分比的腫瘤細胞系將對NDV 感染敏感，這是由于VSV和NDV都是單負病毒目的成員。還顯示NDV在腫瘤細胞中選擇性 復制的機制基于抗病毒細胞干擾素反應的缺陷(見例如WO 99/18799)。在EP-A-0702085中，描述了涉及重組副粘病毒的內(nèi)容基因操縱的感染性復制 型非分節(jié)負鏈RNA病毒突變體，包含位于開放讀框內(nèi)的插入和/或缺失，病毒基因組的 pseudogen 區(qū)或基因間(intergenic)區(qū)域。另外，在W099/66045中描述了基因修飾的NDV病毒，其得自病毒基因組的全長 cDNA分子。WO 00/62735中描述了腫瘤治療方法，包括給予干擾素敏感型有復制能力的克隆 RNA病毒，諸如NDV。此外還描述了禽副粘病毒2的用途。此外，沒有關于APMV2具有溶瘤 活性的支持性數(shù)據(jù)。WO 01/20989 (PCT/US00/26116)中描述了利用重組溶瘤副粘病毒治療腫瘤患者的 方法。所述腫瘤通過給予有復制能力的副粘病毒而減小。描述了多種可用于改造病毒基因 組以改善溶瘤性質(zhì)的方法。此外，WO 03/005964中描述了包含編碼細胞因子的核酸的重組VSV。US 6，699，479中描述了 NDV突變體，其表達降低水平的V蛋白并包含位于編輯基 因座中的核苷酸取代。US 2004/0170607中描述了通過給予并非常見人病原體的病毒治療黑素瘤。W02006/50984中描述了重組NDV病毒，其具有編碼抗腫瘤蛋白的基因。具體是重 組RNA病毒，優(yōu)選副粘病毒，優(yōu)選新城疫病毒(NDV)，用于治療疾病，尤其是用于溶瘤性腫瘤 治療。還描述了產(chǎn)生這樣的重組病毒，其編碼結合蛋白(抗體，錨蛋白重復分子，肽等)，前 藥轉化酶和/或蛋白酶，并導致病毒感染的腫瘤細胞中這些分子的選擇性表達。這些結合
3蛋白、前藥轉化酶和/或蛋白酶的活性增加病毒的抗腫瘤效果。在W02006/50984中，描述 了所述修飾的病毒的制備以及治療癌癥的用途。NDV可利用反向遺傳技術如EP-A-O 702 085所述進行遺傳操作。例如，已知可 制備重組NDV構建體，其包含另外的核酸，所述核酸編碼分泌的堿性磷酸酶(Zhao and Peeters，2003)，綠色熒光蛋白(Engel-Herbert et al.，2003)，傳染性法氏囊病病毒的VP2 蛋白(Huang et al.，2004)，流感病毒血凝素(Nakaya et al.，2001)和氯霉素乙酰轉移酶 (Huang et al. ,2001) (Krishnamurthy, Huang, and Samal，2000)o 這些重組 NDV 均沒有被 構建為用于治療人疾病。重組NDV用于研究NDV的基本病毒學或用于開發(fā)禽類的疫苗株。 親代病毒株作為NDV的緩發(fā)型毒株。這些菌株沒有明顯的溶瘤性質(zhì)。即使對于已知的病毒系統(tǒng)和方法，仍亟需可選擇性用于治療癌癥尤其是腫瘤并且 優(yōu)于已知病毒種類的那些病毒。此外，目前沒有已知數(shù)據(jù)顯示APMV3-9可用于制備治療癌癥具體是腫瘤的藥物。目前吃驚地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的選擇性病毒種類(衍生自副粘病毒科，衍生自APMV3-9 亞種類)可用于腫瘤治療中，并且與現(xiàn)有技術中的種類相比具有令人吃驚的有效活性?，F(xiàn)有技術中沒有關于本發(fā)明的副粘病毒具有抗腫瘤效果的描述。選自副粘病毒科的腫瘤是例如禽副粘病毒3 (APMV3)，禽副粘病毒4 (APMV4)，禽副 粘病毒5 (APMV5)，禽副粘病毒6 (APMV6)，禽副粘病毒7 (APMV7)，禽副粘病毒8 (APMV8)和禽 副粘病毒9 (APMV9,以及Mapuera病毒禾口 Fer-de-Lance病毒。病毒APMV3-9 描述于(Alexander，2003)。本發(fā)明還包括通過分子生物學組合不同病毒的遺傳元件制備嵌合病毒的方法。具 體地，本發(fā)明包括選自 APMV3，APMV4, APMV5, APMV6, APMV7, APMV8, APMV9, Mapuera 病毒和 Fer-de-Lance病毒的組的副粘病毒在制備用于治療癌癥具體是腫瘤的藥物中的用途。癌癥和腫瘤的治療指抑制腫瘤生長，優(yōu)選殺死腫瘤細胞或阻斷感染期間的增長。 所述副粘病毒在腫瘤細胞中選擇性復制。具體地，所述用途包括制備用于治療增生性疾病具體是增生過度性疾病的藥物。 優(yōu)選新生物可用所述病毒治療，優(yōu)選選自肺癌、結腸癌、前列腺癌、乳腺癌和腦癌的組的癌 癥可被治療。更優(yōu)選本發(fā)明涉及本發(fā)明的病毒在制備用于治療實體瘤和轉移瘤的藥物中的用 途。更優(yōu)選可治療具有低增生率的腫瘤。具有低增生率的腫瘤的實例是前列腺癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，黑素瘤，宮頸癌， 膀胱癌，膠質(zhì)母細胞瘤和纖維肉瘤。另一選擇的方面，本發(fā)明涉及所述病毒在制備用于治療腦腫瘤和膠質(zhì)母細胞瘤的 藥物中的用途。本發(fā)明的另一方面是在RNA水平具有超過80%序列相同性的緊密相關的副粘病 毒。所述病毒可為新發(fā)現(xiàn)的副粘病毒。本發(fā)明的病毒還可為重組的并被進一步修飾以表達一或多個源自APMV1-9的其 他基因，優(yōu)選其被修飾以表達一或多個源自APMVl (新城疫病毒)的其他基因。本發(fā)明的病毒還可被修飾以包含編碼結合蛋白的基因(見W02006/050984)。
其他基因可編碼酶，具體是前藥轉化酶，編碼抗體或含有具有抗體可變區(qū)的至少 一個免疫球蛋白結構域的融合蛋白(見W02006/050984)。所述修飾導致當給予攜帶腫瘤的人或動物例如裸鼠時，通過抗腫瘤效果測定的更 高的溶瘤能力。本發(fā)明的病毒還編碼另一副粘病毒的F和/或HN蛋白的基因，由此F蛋白可具有 多堿基裂解位點，所述病毒經(jīng)修飾從而一個基因被來自APMV1-9的組的病毒的同源基因取 代?；蛐揎椷€可導致禽類中病毒病原性減弱。本發(fā)明還包括利用所述病毒制備用于治療上述疾病的藥物，所述藥物具有藥學可 接受的載體和稀釋劑。所述載體和稀釋劑描述于Remington' s Pharmaceutical Science, 15th ed. Mack Publishing Company,Easton Pennsylvania(1980)。所用病毒效價根據(jù)治療 指征在如下范圍內(nèi):109-1012pfu 每劑，IO8-IO11Pfu, IO7-IO10Pfu 或 106_109pfu。所述藥學載體和稀釋劑可包含本發(fā)明病毒的乳劑，并可通過吸入、靜脈內(nèi)輸注、皮 下注射、腹腔內(nèi)注射或腫瘤注射給藥。本發(fā)明的另一方面是預防和/或治療增生性疾病具體是癌癥的方法，包括給予需 要的對象藥物有效量的本發(fā)明的藥物組合物。藥物有效量是本發(fā)明病毒的效價，具體是治 愈或抑制疾病的本發(fā)明的病毒。對于治療效果而言，可接受的劑量是不同的，有賴于例如構建體、患者，給藥途徑 和癌癥種類。本發(fā)明還包括本發(fā)明的病毒與化療劑的組合應用。本發(fā)明的病毒可與任何抗腫瘤劑，烷基化劑，抗代謝藥物，植物源性抗腫瘤劑，激 素治療劑，拓撲異構酶抑制劑，喜樹堿衍生物，激酶抑制劑，靶向藥物，抗體，干擾素和/或 生物反應調(diào)節(jié)劑和其他抗腫瘤藥物一起使用。在這方面，以下是可與該發(fā)明的病毒一起使 用的第二種藥劑的非限制性列表 烷化劑包括但不限于氮芥氮氧化物，環(huán)磷酰胺(cyclophophamide)，異環(huán)磷 酰胺，噻替哌，雷莫司汀(ranimustine)，尼莫司汀(nimustine)，替莫唑胺，六甲蜜胺 (altretamine),阿扎丙宗(apaziquone), brostallicin,苯達莫司汀，卡莫司汀，雌莫司 汀，福莫司汀，葡磷酰胺，異環(huán)磷酰胺，馬磷酰胺，苯達莫司汀和二溴衛(wèi)矛醇；鉬配位的烷基 化合物包括但不限于，順鉬，卡鉬，依他鉬，樂鉬，奈達鉬，奧沙利鉬或沙鉬(satrplatin)； 抗代謝藥物包括但不限于，甲氨蝶呤，6-巰基嘌呤核苷，巰基嘌呤，5-氟尿嘧啶單獨或 與甲酰四氫葉酸，替加氟，去氧氟尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，cytarabine ocfosfate，依諾 他濱，吉西他濱，氟達拉濱，5-阿扎胞苷，卡培他濱，克拉屈濱，氯法拉濱，地西他濱，依氟 鳥胺酸，乙炔基胞苷(ethynylcytidine)，阿糖胞苷，羥基脲，馬法蘭，奈拉濱，洛拉曲克， ocfosfite，disodium premetrexed，噴司他丁，pelitrexol，雷替曲塞，triapine，三甲曲 沙，阿糖腺苷，長春新堿，長春瑞濱；激素治療劑，如依西美坦，Lupron，阿那曲唑，度骨化醇 (doxercalciferol)，法倔唑(fadrozole)，福美司坦，11 β -羥脫氫酶1抑制劑，17-α羥化 酶/17，20裂解酶抑制劑，如醋酸阿比特龍，5- α還原酶抑制劑如Bearfina (非那雄胺)和 愛普列特，抗雌激素，如檸檬酸他莫昔芬和氟維司群，Trelstar,托瑞米芬，雷洛昔芬，拉索 昔芬，來曲唑，或抗雄性激素，如比卡魯胺，氟他胺，米非司酮，尼魯米特，康士得(Casodex)，或抗孕酮及其組合；植物源性抗腫瘤活性物質(zhì)，例如包括從有絲分裂抑制劑選出的那些，包 括例如埃博霉素類(印othilone)諸如sagopilone，Ixab印ilone或埃博霉素B，長春堿，長 春氟寧，多烯紫杉醇，紫杉醇，細胞毒性拓撲異構酶抑制劑包括一個或多個選自下組的藥劑阿克拉霉素， 氨萘非特，belotecan,喜樹堿，10-羥基喜樹堿，9_氨基喜樹堿，diflomotecan,伊立替 康(Camptosar)，edotecarin, epimbicin (Ellence)，依托泊昔，依沙替康，gimatecan, lurtotecan,米托惠酉昆，pirambicin, pixantrone,魯比牛寺康，索布佐生，tafluposide,與托 泊替康及其組合；免疫學上(Immunologicals)包括干擾素和許多其它免疫促進劑。干擾素包括干 擾素α，干擾素a-2a，干擾素a_2b，干擾素β，干擾素Y-Ia或干擾素Y_nl。其他藥劑 包括L19-IL2和其他L19衍生物，非格司亭，香菇多糖，sizofilan, TheraCys,烏苯美司，阿 地白介素，阿侖珠單抗，BAM-002，達卡巴嗪，賽尼哌，地尼白介素，emtuzumab ozogamicin, ibritumomab，咪喹莫特(imiquimod)，來格司亭，香菇多糖，黑素瘤疫苗(Corixa)，莫拉司 亭，沙格司亭，他索那敏，tecleukin，thymalasin，托西莫單抗，Vimlizin，依帕珠單抗，米妥 莫單抗，oregovomab, pemtumomab, Provenge,生物反應調(diào)節(jié)劑是調(diào)節(jié)有生命的生物體的防御機制或生物反應的藥劑，所述生物 反應如生存，生長，或組織細胞分化，以引導其具有抗腫瘤活性。這些藥劑包括云芝多糖 (krestin)，香菇多糖，西左非蘭(sizof iran)，溶鏈菌制劑(picibanil)，ProMune或烏苯美司。促凋亡劑YM155，AMG 的 655，AP02L/TRAIL, CHR-2797?？寡苌苫衔锇ǎ⒕SA，Aflibercept,血管抑素，aplidine，asentar, Axitinib, Recentin,貝伐珠單抗，brivanib alaninat, cilengtide,考布他汀，達斯特， 內(nèi)皮抑素，芬維 A 銨，商夫酮，pazopanib,蘭尼單抗，rebimastat, removab, Revlimid, Sorafenib, Vatalanib，角鯊胺，舒尼替尼，Telatinib，沙利度胺，ukrain, Vitaxin ；鉬配位的化合物包括但不限于，順鉬，卡鉬，奈達鉬，沙鉬或奧沙利鉬；喜樹堿衍生物包括但不限于喜樹堿，10-羥基喜樹堿，9-氨基喜樹堿，依立替康， edotecarin,與托泊替康；抗體包括曲妥珠單抗，西妥昔單抗貝伐珠單抗或利妥昔單抗，ticilimumab, lpilimumab，lumiliximab，catumaxomab, atacicept ；oregovomab，阿倉珠單抗。VEGF抑制劑也可與本發(fā)明的病毒組合。VEGF抑制劑例如索拉非尼，達斯特，貝伐 珠單抗，舒尼替尼，Recentin, Axitinib, Aflibercept, Telatinib, brivanib alaninate, Vatalanib, pazopanib 禾口 Ranibizumab。EGFR(HERl)抑制劑也可與本發(fā)明的病毒組合。EGFR抑制劑例如西妥昔單抗， Panitumumab, Vectibix, Gefitinib, Erlotinib, Zactima0HER2抑制劑也可與本發(fā)明的病毒組合。HER2抑制劑例如Lapatinib，Tratuzumab， Pertuzumab0mTOR抑制劑也可與本發(fā)明的病毒組合。mTOR抑制劑例如Temsirolimus，西羅莫司
/雷帕霉素，依維莫司。cMet抑制劑也可與本發(fā)明的病毒組合。
PI3K-和AKT抑制劑也可與本發(fā)明的病毒組合。CDK抑制劑也可與本發(fā)明的病毒組合。CDK抑制劑的實例是細胞周期蛋白依賴激 酶(roscovitine)禾口 flavopiridol。紡錘體組裝檢控點(Spindle assembly checkpoint)抑制劑和靶向的抗有絲分 裂劑可與本發(fā)明的病毒組合。靶向的抗有絲分裂藥物例如PLK抑制劑，Aurora抑制劑諸如 Hesperadin,檢控點激酶抑制劑和KSP抑制劑。HDAC抑制劑可與本發(fā)明的病毒組合。HDAC抑制劑例如panobinostat， vorinostat, MS275,belinostat 禾口 LBH589。HSP90抑制劑和HSP70抑制劑可與本發(fā)明的病毒組合。蛋白酶體抑制劑可與本發(fā)明的病毒組合。蛋白酶體抑制劑例如硼替佐米和 carfilzomib。絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑可與本發(fā)明的病毒組合。 絲氨酸激酶抑制劑包括MEK抑制劑和Raf抑制劑諸如Sorafenib。本發(fā)明的病毒可與法呢基轉移酶抑制劑例如tipifarnib —起使用。本發(fā)明的病毒可與酪氨酸激酶抑制劑一起使用，所述酪氨酸激酶抑制劑包括 Dasatinib, Nilotibib, DAST, Bosutinib, Sorafenib,貝伐珠單抗，舒尼替尼，AZD2171, Axitinib, Aflibercept, Telatinib,伊馬替尼敏使朗(mesylate), brivanib alaninate, pazopanib, Ranibizumab, Vatalanib, Cetuximab, Panitumumab, Vectibix, Gefitinib, Erlotinib, Lapatinib, Tratuzumab, Pertuzumab 禾口 c_Kit 抑制劑。維生素D受體激動劑可與本發(fā)明的病毒組合。Bcl-2蛋白抑制劑可與本發(fā)明的病毒組合。Bcl-2蛋白抑制劑是obatoclax， oblimersen sodium 禾口 gossypol。分化 20 受體簇拮抗劑(Cluster of Differentiation 20 receptor antagonists)可與本發(fā)明的病毒組合。分化20受體簇拮抗劑例如利妥昔單抗。核糖核苷 酸還原酶抑制劑可與本發(fā)明的病毒組合。核糖核苷酸還原酶抑制劑例如吉西他濱。拓撲異 構酶I和Il抑制劑可與本發(fā)明的病毒組合。拓撲異構酶I和Il抑制劑例如Camptosar (伊 立替康)和多柔比星。腫瘤壞死凋亡誘導配體受體1激動劑可與本發(fā)明的病毒組合。腫瘤壞死凋亡誘導 配體受體1激動劑例如mapatumumab。5-羥色胺受體拮抗劑可與本發(fā)明的病毒組合。5-羥色胺受體拮抗劑例如rEV598， Xaliprode，帕洛諾司瓊鹽酸鹽，格蘭塞隆，Zindol，帕洛諾司瓊鹽酸鹽或AB-1001。整聯(lián)蛋白抑制劑可與本發(fā)明的病毒組合。整聯(lián)蛋白抑制劑例如α 5β 1整聯(lián)蛋白 抑制劑諸如Ε7820，JSM 6425，volociximab或內(nèi)皮抑素。雄激素受體拮抗劑可與本發(fā)明的病毒組合。雄激素受體拮抗劑例如癸酸苯丙酸諾 龍，氟甲睪酮，氟甲睪酮，Android, Prost-aid，Andromustine，比卡魯胺，氟他胺，Apo-環(huán)丙 孕酮，Apo-氟他胺，醋酸氯地孕酮(chlormadinone acetate)，比卡魯胺，色普龍，Tabi，醋酸 環(huán)丙孕酮，環(huán)丙孕酮片，尼魯米特。芳香酶抑制劑可與本發(fā)明的病毒組合。芳香化酶抑制劑的例子有阿那曲唑，來曲 唑，睪內(nèi)酯，依西美坦，福美司坦和氨魯米特?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑可與病毒的發(fā)明。其他抗癌藥物包括阿利維A酸，聚肌胞，阿曲生坦，蓓薩羅丁，硼替佐米，波生坦，骨化三醇，exisulind，非那雄胺，福莫司汀，伊班膦 酸，米替福新，米托蒽醌，L-門冬酰胺，丙卡巴胼，達卡巴嗪，羥基脲，羥基脲，培門冬酶，噴司 itT, tazarotne, VELCADE M^iMU, Canfosfamide darinaparsin $會H￥@|。
實施例腫瘤選擇性復制當與人腫瘤細胞諸如HT29結腸癌細胞或HT1080纖維肉瘤細胞一起保溫時，該病 毒能復制并產(chǎn)生子代病毒。在腫瘤細胞中獲得的效價比在人原代正常細胞中獲得的效價高 至少100倍。當檢驗病毒的細胞殺死效應時，殺死原代正常細胞必需的MOI比足以殺死人腫瘤 細胞的MOI高至少100倍，更優(yōu)選1000倍。病毒的產(chǎn)生病毒在具胚禽卵(優(yōu)選雞卵)或人腫瘤細胞系或人腫瘤細胞系衍生物中生長。從卵的尿囊液或從所述細胞上清或從細胞碎片收獲病毒(細胞結合的病毒)。所述病毒利用非連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心濃縮并純化。任選，所述病毒利用切 向流過濾濃縮和純化?？鼓[瘤效果病毒的抗腫瘤效果顯示在小鼠腫瘤模型中。當腫瘤內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥時，所述病毒 導致裸鼠中建立的人異種移植腫瘤的退化。病毒的有效劑量是IO5-IO9Pfu/注射。一些腫 瘤模型中。在2-14天(優(yōu)選7天)中重復給藥是非常有效所需的。病毒的基因改造反向遺傳系統(tǒng)已經(jīng)對于許多副粘病毒公開。其類似地經(jīng)改造適應本發(fā)明的副粘病對病毒基因組進行測序。基于該序列，設計用于克隆的引物，使得其跨病毒基因 組中的獨特限制酶識別位點。通過RT-PCR，病毒基因組的多個片段作為DNA在質(zhì)粒載體如 ρΧ8δΤ中被克隆。利用基因組質(zhì)粒，在DNA水平進行突變、基因交換以及其他類型的基因改造。通過利用輔助質(zhì)粒將基因組質(zhì)粒DNA轉染進入表達Τ7-聚合酶的細胞，可拯救重 組病毒。還可使用拯救病毒的其他方法。例如，Τ7聚合酶的表達可通過細胞與編碼Τ7聚 合酶的表達質(zhì)粒的共轉染來實現(xiàn)。對于相關病毒NDV，還描述了其他轉基因在病毒中的表達(Punier et al. ,2008)。其他轉基因優(yōu)選插入M-F或F-HN之間的基因間區(qū)域。F和HN轉基因可源自任何APMV，優(yōu)選來自自身具有強溶瘤能力的病毒。F和H/HN 轉基因可衍生自除外APMV的其他副粘病毒。為了增加病毒的溶瘤能力，僅表達單獨的F或HN蛋白即可。嵌合病毒為了組合兩種不同病毒的陽性特征或為了去除陰性特征，可用其他病毒的同源片 段替代基因組的片段。所述病毒可為任何相關副粘病毒并且不限于APMV。APMV的F和HN蛋白的內(nèi)源性基因可被來自相關副粘病毒的異源基因取代以改變病毒特異性和腫瘤選擇性。為了允許病毒粒子的正確裝配，所有三個蛋白M，F(xiàn)和HN可用相關病毒的同源基因 片段取代。為了降低禽類的病原性，P/V蛋白的基因被突變或用來自相關病毒的基因取代。相 同的方法也可增加病毒特異性(與正常細胞相比)以殺死人腫瘤細胞。內(nèi)源性L，P和NP蛋白可被交換。這三種蛋白的交換將對病毒的復制特性產(chǎn)生影 響。轉基因為了降低病毒的病原性，禽類干擾素的基因被插入病毒基因組。為了增加病毒的腫瘤穿透力，將編碼細胞外基質(zhì)降解酶諸如松弛素，膠原蛋白酶， MMP等的轉基因插入病毒。為了增加治療能力，將編碼具有抗腫瘤活性的蛋白的轉基因插入所述病毒，所述 蛋白諸如毒素，前藥轉化酶，蛋白酶，抗體等。例如TRAIL及其突變體，MDA-7，IL2，TNF-a， IGF-BP-7。為了顯像目的以及作為生物標記，將編碼報道基因諸如GFP、螢光素酶、NIS或標 記肽如PSA、胰島素C-肽、共同病毒抗原(肽)等的轉基因插入病毒。對比文件Alexander,D. J. (2003). Newcastle Disease,Other Avian Paramyxoviruses,and Pneumovirus Infections. ISBN 081380423X ed. In" Diseases of Poultry" (Y. M. Saif, Ed.), pp. 63-99. Blackwell Publishing.Chiocca, E.A. (2002). Oncolytic viruses. Nat Rev Cancer 2(12)，938-50.EngeI-Herbert, I. , Werner, 0. , Teifke, J.P., Mebatsion, Τ. , Mettenleiter, T. C. , and Romer-Oberdorfer,A. (2003). Characterization of a recombinant Newcastle disease virus expressing the green fluorescent protein. J Virol Methods 108(1), 19-28.Huang, Ζ. , Elankumaran, S. , Yunus, A. S. , and Samal, S. K. (2004). A recombinant Newcastle disease virus (NDV) expressing VP2 protein of infectious bursal disease virus (IBDV) protects against NDV and IBDV. J Virol 78(18)，10054-63·Huang, Ζ. , Krishnamurthy, S. , Panda, A. , and Samal, S. K. (2001). High-level expression of a foreign gene from the most 3' -proximal locus of a recombinant Newcastle disease virus. J Gen Virol 82 (Pt 7),1729-36.Kinoh, H. , Inoue, M. , Washizawa, K. , Yamamoto, Τ. , Fujikawa, S. , Tokusumi, Y. , lida, A. , Nagai, Y. , and Hasegawa, M. (2004). Generation of a recombinant Sendai virus that is selectively activated and lyses human tumor cells expressing matrixmetalloproteinases. Gene Ther 11 (14),1137-45.Krishnamurthy, S. , Huang,Ζ. ,and Samal,S. K. (2000). Recovery of a virulent strain of newcastle disease virus from cloned cDNA !expression of a foreign gene results in growth retardation and attenuation. Virology 278(1),168-82.Myers,R. ,Greiner,S. ,Harvey,Μ. ,Soeffker,D. ,Frenzke,Μ. ,Abraham,K. ,Shaw,
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10
權利要求
選自APMV3，APMV4，APMV5，APMV6，APMV7，APMV8，APMV9，Mapuera病毒和Fer de Lance病毒的組的副粘病毒在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途。
2.權利要求1的用途，其中所述病毒是在RNA水平具有超過80%序列相同性的緊密相 關的副粘病毒。
3.權利要求1的用途，其中所述病毒是重組的。
4.權利要求1的用途，其中所述病毒經(jīng)修飾表達源自APMV1-9的一個其他基因。
5.權利要求1的用途，其中所述病毒經(jīng)修飾表達源自APMV1-9的兩個或更多個其他基因。
6.權利要求4-5任一項的用途，其中所述基因編碼另一種副粘病毒的F和/或HN蛋白。
7.權利要求6的用途，其中所述F蛋白具有多堿基(multibasic)裂解位點。
8.權利要求3的用途，其中所述病毒經(jīng)修飾從而一個基因被選自APMV1-9的組的病毒 的同源基因取代。
9.權利要求3的用途，其中所述基因修飾導致在禽類中的病原性減弱。
10.權利要求3的用途，其中所述基因修飾導致病毒感染腫瘤細胞與非轉化的正常細 胞相比更高的選擇性。
11.權利要求3的用途，其中所述基因修飾導致給藥攜帶腫瘤的裸鼠時通過抗腫瘤效 果測定的更高的溶瘤能力。
12.權利要求1的用途，其中所述病毒是腫瘤內(nèi)給藥的。
13.權利要求1的用途，其中所述病毒是腹腔內(nèi)給藥的。
14.權利要求1的用途，其中所述病毒通過吸入給藥。
15.權利要求1的用途，其中所述病毒是靜脈內(nèi)給藥的。
16.權利要求1的用途，其中所述病毒通過密度梯度超速離心來純化。
17.權利要求1的用途，其中所述病毒通過切向流過濾純化。
18.權利要求1的用途，其中所述腫瘤選自結腸癌，乳腺癌，肺癌，前列腺癌，卵巢癌，黑 素瘤，宮頸癌，膀胱癌，膠質(zhì)母細胞瘤和纖維肉瘤組成的組。
19.權利要求1的用途，其中所述藥物組合物還包含化療劑。
20.權利要求1的用途，其中所述藥物組合物還包含重組治療抗體。
21.權利要求1的用途，其中所述藥物組合物還包含重組治療蛋白。
22.權利要求1的用途，其中所述病毒經(jīng)修飾表達至少一個編碼結合蛋白的其他基因。
23.權利要求1的用途，其中所述病毒經(jīng)修飾表達至少一個編碼酶的其他基因。
24.權利要求1的用途，其中所述病毒經(jīng)修飾表達至少一個編碼前藥轉化酶的其他基因。
25.權利要求1的用途，其中所述病毒經(jīng)修飾表達至少一個編碼抗體的其他基因。
26.權利要求3的用途，其中所述病毒經(jīng)修飾表達至少一個編碼融合蛋白的其他基因， 所述融合蛋白包含具有抗體可變區(qū)的至少一個免疫球蛋白結構域。
27.權利要求1的用途，其中所述腫瘤是轉移瘤。
28.權利要求8的用途，其中2-5個基因被取代，產(chǎn)生具有僅1-4個來源病毒的保留基 因的嵌合病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及選自下組的副粘病毒APMV3，APMV4，APMV5，APMV6，APMV7，APMV8，APMV9，Mapuera病毒和Fer-de-Lance病毒，其可用于制備用于治療腫瘤的病毒。所述病毒具有殺死人腫瘤細胞但在相同劑量不殺死人正常分化細胞和人正常增殖細胞的選擇性。通過基因改造，所述病毒可被修飾從而一或多個基因被加入或由相關副粘病毒的同源基因取代。通過所述方法，產(chǎn)生的嵌合病毒的抗腫瘤活性與親代病毒相比提高。
文檔編號A61K35/76GK101945660SQ200980105182
公開日2011年1月12日 申請日期2009年2月12日 優(yōu)先權日2008年2月14日
發(fā)明者F·普赫勒爾, R·拜爾 申請人:拜耳先靈醫(yī)藥股份有限公司