本發(fā)明涉及PAQR3多肽片段、其藥物組合物及其用途。

背景技術(shù)：

中國(guó)是癌癥的高發(fā)區(qū)，發(fā)病率及死亡率均高于世界平均水平[Ferlay J，Shin HR，Bray F，F(xiàn)orman D，Mathers C和Parkin DM，(2010)Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008，Int J Cancer 127(12):2893-917]。癌癥是一種復(fù)雜的、多步驟、病因不明的疾病。在癌癥的分子生物學(xué)方面的研究證明PI3K/Akt、MAPK/Erk信號(hào)通路的激活有利于癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖及轉(zhuǎn)移[An S，Yang Y，Ward R，Liu Y，Guo XX和Xu TR，(2015)Raf-interactome in tuning the complexity and diversity of Raf function.FEBS J 282(1):32-53；Pal I，(2012)Mandal M.PI3K and Akt as molecular targets for cancer therapy:current clinical outcomes，Acta Pharmacol Sin 33(12):1441-58]。

申請(qǐng)人前期的結(jié)果證明，PAQR(Progestin and AdipoQ Receptor，孕酮及脂聯(lián)素受體)家族中的蛋白PAQR3能夠結(jié)合PI3K的催化亞基p110及Raf激酶，從而抑制PI3K/Akt和MAPK/Erk信號(hào)通路[Feng,L.，Xie,X.，Ding,Q.，Luo,X.，He,J.，F(xiàn)an,F.，Liu,W.，Wang,Z.和Chen,Y.，(2007)Spatial regulation of Raf kinase signaling by RKTG，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104,14348-53；Wang,X.，Wang,L.，Zhu,L.，Pan,Y.，Xiao,F.，Liu,W.，Wang,Z.，Guo,F.，Liu,Y.，Thomas,W.G.和Chen,Y，(2013)PAQR3 modulates insulin signaling by shunting phosphoinositide 3-kinase p110a to the Golgi apparatus，Diabetes 62(2):444-56]。

我們近期的研究發(fā)現(xiàn)PAQR3發(fā)揮其阻斷p110α與p85結(jié)合、Raf與MEK結(jié)合的重要功能區(qū)域在PAQR3蛋白的N端。根據(jù)PAQR3與p110及Raf的結(jié)合位點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì)并合成含有PAQR3蛋白的N端片段，研究證明該片段能夠 有效地阻斷p110α與p85，Raf-1與MEK的結(jié)合作用，從而抑制這兩條信號(hào)通路的下游蛋白Akt及Erk的磷酸化水平，以此抑制胃癌細(xì)胞中這兩條通路的活化，顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種分離的氨基酸序列，該分離的氨基酸序列含有SEQ ID NO:1的片段，其中，該片段位于SEQ ID NO:1第1位到第70位之間，長(zhǎng)至少40個(gè)氨基酸殘基。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，該片段長(zhǎng)至少45個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸殘基。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，該片段含有SEQ ID NO:1第6位到第55位氨基酸殘基。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，該片段位于SEQ ID NO:1第3位到第65位氨基酸殘基之間。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，該片段位于SEQ ID NO:1第5位到第60位氨基酸殘基之間。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，該分離的氨基酸序列由SEQ ID NO:1的所述片段組成。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，該分離的氨基酸序列還含有促進(jìn)穿膜的肽。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述促進(jìn)穿膜的肽選自：RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:10)、YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:11)、KQAIPVAK-酰胺(SEQ ID NO:12)、RRRRNRTRRNRRRVR-酰胺(SEQ ID NO:13)、寡精氨酸(R₉－R₁₂)、KLTRAQRRAAARKNKRNTRGC(SEQ ID NO:14)、ALWKTLLKKVLKAPKKKRKVC(SEQ ID NO:15)、RKKRRQRRR(SEQ ID NO:16)、DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE(SEQ ID NO:17)、GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-酰胺(SEQ ID NO:18)、AGYLLGKINLKALAALAKKIL-酰胺(SEQ ID NO:19)、YTAIAWVKAFIRKLRK-酰胺(SEQ ID NO:20)等。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述分離的氨基酸序列由促進(jìn)穿膜的肽與SEQ ID NO:1的所述片段組成。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述分離的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本發(fā)明還提供編碼所述分離的氨基酸序列的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供核酸構(gòu)建物，該核酸構(gòu)建物含有本發(fā)明編碼所述分離的氨基酸序列的核苷酸序列，用于表達(dá)所述分離的氨基酸序列。

本發(fā)明還提供一種藥物組合物，所述藥物組合物含有本發(fā)明所述分離的氨基酸序列和藥學(xué)上可接受的載體。

本發(fā)明還提供所述分離的氨基酸序列在制備用于治療或預(yù)防PI3K/Akt和/或MAPK/Erk信號(hào)通路介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述用途為制備用于治療或預(yù)防PI3K/Akt和/或MAPK/Erk信號(hào)通路介導(dǎo)的癌癥或癌癥轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述癌癥包括胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、皮膚癌和腎癌。

在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述癌癥是黑色素瘤。

附圖說(shuō)明

圖1顯示PAQR3的多肽能夠抑制PI3K/Akt及MAPK/ErK信號(hào)通路。

圖2顯示PAQR3的片段能夠抑制AGS細(xì)胞的遷移能力。

圖3顯示MTT及克隆形成實(shí)驗(yàn)證明，PAQR3的片段能夠抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。圖中，day0、day1、day2、day3、day4分別指第0、1、2、3和4天。

圖4顯示PAQR3的片段能夠抑制AGS細(xì)胞的皮下瘤生長(zhǎng)。圖中，day1、day3、day4、day7、day9、day11分別指第1、3、5、7、9和11天。

圖5顯示PAQR3的片段能夠抑制黑色素瘤細(xì)胞A375的生長(zhǎng)(A、B和C)、遷移(D和E)以及A375細(xì)胞中Akt及Erk的磷酸化水平(F)。圖中，day0、day1、day2、day3、day4分別指第0、1、2、3和4天；“對(duì)照肽-1”、“對(duì)照肽-4”、“對(duì)照肽-20”以及“PAQR3肽-1”、“PAQR3肽-4”和“PAQR3肽-20”分別至濃度為1、4和20μg/ml的對(duì)照肽和PAQR3肽。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明涉及分離的氨基酸序列，該序列為SEQ ID NO:1的片段，該片段位于SEQ ID NO:1第1位到第70位之間，且長(zhǎng)至少40個(gè)氨基酸殘基。

如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的?！胺蛛x的氨基酸序列”是指該氨基酸序列基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。

術(shù)語(yǔ)“片段”指僅由完整的全長(zhǎng)多肽序列和結(jié)構(gòu)的一部分組成的多肽。本發(fā)明涉及PAQR3的片段。PAQR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。尤其是，本發(fā)明涉及PAQR3的N端片段，具體是位于SEQ ID NO:1第1位氨基酸殘基到第70位氨基酸之間的片段，優(yōu)選長(zhǎng)至少40個(gè)氨基酸殘基，例如至少45個(gè)氨基酸殘基、至少48個(gè)氨基酸殘基、至少50個(gè)氨基酸殘基、至少53個(gè)氨基酸殘基等。

優(yōu)選的，所述片段至少含SEQ ID NO:1第6位到第55位氨基酸殘基。因此，所述片段可以起始于SEQ ID NO:1的第1、2、3、4或5位氨基酸殘基，并終止于SEQ ID NO:1第55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70位氨基酸殘基，即第1－55、1－56、2－55、2－56，諸如此類。優(yōu)選的，所述片段由SEQ ID NO:1第6－55位氨基酸殘基組成。

應(yīng)理解，在基因克隆操作中，常常需要設(shè)計(jì)合適的酶切位點(diǎn)，這勢(shì)必在所表達(dá)的氨基酸序列末端引入了一個(gè)或多個(gè)不相干的殘基，而這并不影響目的序列的活性。又如為了構(gòu)建融合蛋白、促進(jìn)重組蛋白的表達(dá)、獲得自動(dòng)分泌到宿主細(xì)胞外的重組蛋白、或利于重組蛋白的純化，常常需要將一些氨基酸添加至重組蛋白的N-末端、C-末端或該蛋白內(nèi)的其它合適區(qū)域內(nèi)，例如，包括但不限于，適合的接頭肽、信號(hào)肽、前導(dǎo)肽、末端延伸等。本發(fā)明氨基酸序列的氨基端或羧基端還可含有一個(gè)或多個(gè)多肽片段，作為蛋白標(biāo)簽。任何合適的標(biāo)簽都可以用于本發(fā)明。例如，所述的標(biāo)簽可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。這些標(biāo)簽可用于對(duì)蛋白進(jìn)行純化。下表列出了其中的一些標(biāo)簽及其序列。

本發(fā)明的氨基酸序列還可在所述片段的N端含有促進(jìn)穿膜的肽段。本領(lǐng)域周知這類肽段，例如，可參見(jiàn)Siegmund Reissmann，Cell penetration:scope and limitations by the application of cell-penetrating peptides，J.Pept.Sci.2014；20:760–784。本文將其全部?jī)?nèi)容以引用的方式納入本文。尤其是，適用于本發(fā)明的促進(jìn)穿膜的肽段包括上述文獻(xiàn)表1所列的編號(hào)為第1－92的序列。本文在此不一一列舉。還可用于本發(fā)明的促進(jìn)穿膜的肽段包括RKKRRQRRR。

因此，本發(fā)明的分離的氨基酸序列可由SEQ ID NO:1的所述片段組成，或者可由SEQ ID NO:1所述的片段以及合適的蛋白標(biāo)簽組成，或者可由SEQ ID NO:1的所述片段與促進(jìn)穿膜的序列組成，或者可由SEQ ID NO:1的所述片段、蛋白標(biāo)簽以及促進(jìn)穿膜的序列組成。

本發(fā)明的氨基酸序列可以是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或是使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、絲狀真菌、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生的重組多肽。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO:2所示的cDNA序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本文所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼本發(fā)明的氨基酸序列，但與如SEQ ID NO:2所示的序列有差別的核酸序列。

術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。

本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。

本發(fā)明的核苷酸序列通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。

一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。

此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。

目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明氨基酸序列的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。

本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。優(yōu)選的，本發(fā)明的載體是表達(dá)載體。

通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)本發(fā)明的氨基酸序列。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟：

(1)用本發(fā)明的多核苷酸或其簡(jiǎn)并的變異體，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；

(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；

(3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。

可將本發(fā)明的多核苷酸序列插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體。只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、 標(biāo)記基因和翻譯控制元件。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含本發(fā)明核酸序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的核酸序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有：大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。

此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。

包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。

宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；絲狀真菌細(xì)胞、或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母、絲狀真菌、植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。

本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。

本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。

用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl₂法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl₂。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿 孔、脂質(zhì)體包裝等。

獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。

在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。

如前所述，前期的研究證明，PAQR3能夠結(jié)合PI3K的催化亞基p110及Raf激酶，從而抑制PI3K/Akt和MAPK/Erk信號(hào)通路。而本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，PAQR3發(fā)揮其阻斷p110α與p85結(jié)合、Raf與MEK結(jié)合的重要功能區(qū)域在PAQR3蛋白的N端，即本發(fā)明所述的SEQ ID NO:1的片段。

因此，本發(fā)明的氨基酸序列可用于治療或預(yù)防已知PAQR3能治療或預(yù)防的各種疾病，尤其是PI3K/Akt和/或MAPK/Erk信號(hào)通路介導(dǎo)的各種疾病。更具體而言，本發(fā)明的氨基酸序列可用于治療或預(yù)防PI3K的催化亞基p110α與p85的結(jié)合和/或Raf(尤其是Raf-1)與MEK的結(jié)合所介導(dǎo)的各種疾病。

如前所述，已知PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞增殖和生存的重要調(diào)節(jié)因子。已報(bào)道在許多人癌癥中存在引起PIK3激酶活性增強(qiáng)的PIK3CA基因中的突變，這些癌癥包括結(jié)腸、乳腺、腦、肝、胃和肺部的癌癥〔Pal I，(2012)Mandal M.PI3K and Akt as molecular targets for cancer therapy:current clinical outcomes，Acta Pharmacol Sin 33(12):1441-58〕。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Erk)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路是經(jīng)典的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多重功能，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等密切相關(guān)，在臨床診治中具有重要意義，尤其與消化系腫瘤發(fā)病、演進(jìn)密切相關(guān)〔沈雁等，ERL/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與消化系腫瘤，《胃腸病學(xué)》，2011年，第16卷，第2期〕。

因此，本發(fā)明的氨基酸序列尤其適合用于治療和/或預(yù)防結(jié)腸、乳腺、腦、肝、皮膚、胃和肺部的癌癥，以及這些部位發(fā)生的癌癥向人體其它組織的轉(zhuǎn)移。更具體而言，適用于本發(fā)明氨基酸序列治療的疾病包括但不限于胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、皮膚癌和腎癌。在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述癌癥是胃癌和黑色素瘤。

本發(fā)明因此包括本發(fā)明氨基酸序列在制備用于治療或預(yù)防PI3K/Akt和/或MAPK/Erk信號(hào)通路介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。更進(jìn)一步地，本發(fā)明包括所述氨基酸序列在制備用于治療或預(yù)防PI3K的催化亞基p110α與p85的結(jié)合和/或Raf(尤其是Raf-1)與MEK的結(jié)合所介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。

更具體而言，本發(fā)明包括所述氨基酸序列在制備用于治療或預(yù)防PI3K/Akt和/或MAPK/Erk信號(hào)通路介導(dǎo)的癌癥及癌癥轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。

本發(fā)明還提供一種藥物組合物，該藥物組合物含有本發(fā)明的氨基酸序列和藥學(xué)上可接受的載體。

藥物組合物中可含有治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明氨基酸序列。“有效量”指某成分的用量足以產(chǎn)生所期望的反應(yīng)。具體的有效量取決于多種因素，諸如欲治療的特定病癥、患者的身體條件(如患者體重、年齡或性別)、治療持續(xù)時(shí)間、共同施與的療法(如果有的話)以及所用的具體配方?！坝行Я俊币仓冈谠撚昧肯拢景l(fā)明氨基酸序列的毒性或負(fù)面效果不及于其所帶來(lái)的正面療效。

藥學(xué)上可接受的載體通常是安全、無(wú)毒的，且廣義上可包括制藥產(chǎn)業(yè)中用于制備藥物組合物的任何已知物質(zhì)，如填充劑、稀釋劑、凝結(jié)劑、黏合劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、穩(wěn)定劑、著色劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑等。在選擇適用于投遞合成肽的賦形劑時(shí)，主要需考慮此藥物組合物的給藥方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知此項(xiàng)技術(shù)。

本發(fā)明藥物組合物中所述氨基酸序列的含量為約1–1000μM；較佳為約10–500μM；更優(yōu)秀為約25-250μM。舉例來(lái)說(shuō)，合成肽的濃度可為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μM。

可根據(jù)已知的藥學(xué)程序來(lái)制備上述藥物組合物，譬如《雷明頓制藥科學(xué)》 (Remington’s Pharmaceutical Sciences)(第17版，Alfonoso R.Gennaro編，麥克出版公司(Mack Publishing Company)，伊斯頓，賓夕法尼亞(1985))一書中有詳細(xì)的記載。

本發(fā)明的藥物組合物可以是各種合適的劑型，包括但不限于藥片、膠囊、注射劑等。

本發(fā)明還提供一種疾病治療或預(yù)防方法，包括將本發(fā)明的氨基酸序列或含有該氨基酸序列的藥物組合物給予需要該治療或該預(yù)防的個(gè)體。所述疾病為PI3K/Akt和/或MAPK/Erk信號(hào)通路介導(dǎo)的疾病；更進(jìn)一步地，所述疾病為PI3K的催化亞基p110α與p85的結(jié)合和/或Raf(尤其是Raf-1)與MEK的結(jié)合所介導(dǎo)的疾病。所述個(gè)體通常為哺乳動(dòng)物，更具體而言，為人類。給藥方式可以是本領(lǐng)域已知的各種給藥方式，包括但不限于口服、注射等。

下文將以具體實(shí)施例的方式描述本發(fā)明。本發(fā)明的實(shí)施除非另外說(shuō)明，將使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的化學(xué)、生物化學(xué)、重組DNA技術(shù)和免疫學(xué)的常規(guī)方法。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有完整的解釋。參見(jiàn)，如Sambrook等，《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning:a Laboratory Manual)，第二版，1989等。

材料與方法：

1.1材料：

AGS胃癌細(xì)胞、MKN45胃癌細(xì)胞、PLD1胃癌細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；F12K、DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清購(gòu)自invitrogen生物公司，MTT購(gòu)自Sigma公司，Transwell小室購(gòu)自Corning生物技術(shù)公司，免疫缺陷的裸鼠購(gòu)自斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；本實(shí)驗(yàn)所用抗體：p-Akt(S473)、p-Erk、Akt、Erk購(gòu)自Cell Signaling Technology生物公司，ki67購(gòu)自BD生物公司，β-actin購(gòu)自Santa Cruz生物公司。

1.2方法

1.2.1多肽序列設(shè)計(jì)：根據(jù)我們之前對(duì)PAQR3與P110及Raf-1結(jié)合作用的研究，設(shè)計(jì)PAQR3的多肽，對(duì)照多肽及PAQR3蛋白的多肽序列如下：

對(duì)照肽：RKKRRQRRR(SEQ ID NO:4)；

實(shí)驗(yàn)肽：

RKKRRQRRRLKSAHYIELGSYQYWPVLVPRGIRLYTYEQIPGSLKDNPYITDGYRAYLP(又名PAQR3肽，SEQ ID NO:3)。

上述序列委托商業(yè)公司合成。

1.2.2免疫印跡實(shí)驗(yàn)：提取相應(yīng)的細(xì)胞的蛋白，進(jìn)行進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至PVDF膜后5％的奶粉封閉2h，加入稀釋后的Erk1/2，p-Erk1/2，p-Akt，Akt抗體(以1∶1000稀釋)，4℃過(guò)夜，TBST洗膜后加入二抗HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(以1∶5000稀釋)，室溫孵育1h，TBST洗膜后顯影，以β-actin作為內(nèi)參。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活力：將上述幾株胃癌細(xì)胞取2000-3000個(gè)/孔，接種于96孔板中，分別加入對(duì)照多肽及PAQR3肽濃度為：4μg/mL，20μg/mL，每天換含多肽的新鮮培養(yǎng)基。于0、1、2、3、4天加入MTT檢測(cè)細(xì)胞的活力。

1.2.4克隆形成實(shí)驗(yàn)：取AGS細(xì)胞、MKN45細(xì)胞、PLD1細(xì)胞各400個(gè)，接種于6孔板中，分別加入含對(duì)照多肽及PAQR3肽的培養(yǎng)基，每天換液一次。10天后棄掉孔板中的培養(yǎng)基，4％的多聚甲醛固定10分鐘，后置結(jié)晶紫染液中染色，拍照并統(tǒng)計(jì)克隆數(shù)。

1.2.5遷移實(shí)驗(yàn)：將40000個(gè)AGS細(xì)胞用無(wú)血清的培養(yǎng)基洗三遍后，接種于Transwell小室中，下室加入含10％血清的培養(yǎng)基，并在上下室內(nèi)加入相應(yīng)濃度的對(duì)照多肽及PAQR3肽，24小時(shí)后取出小室，用4％的多聚甲醛固定10分鐘，后置結(jié)晶紫染液中染色，并用棉棒輕輕擦拭上室細(xì)胞，置顯微鏡觀察并拍照細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞的遷移情況。

1.2.6裸鼠皮下瘤及免疫組化實(shí)驗(yàn)：將5×10⁶個(gè)細(xì)胞種入裸鼠皮下，待皮下瘤長(zhǎng)至100mm³后，每天瘤內(nèi)注射對(duì)照多肽及PAQR3肽，每只每天100μg，共 注射12天后取皮下瘤，石蠟包埋并切片，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，利用Ki67標(biāo)記相應(yīng)的增殖細(xì)胞，并拍照分析。

結(jié)果：

1.PAQR3肽能夠抑制PI3K/Akt及MAPK/Raf信號(hào)通路

首先為了驗(yàn)證PAQR3的多肽能夠替代PAQR3的蛋白，抑制PI3K/Akt及MAPK/Raf信號(hào)通路的作用，我們用對(duì)照多肽及PAQR3肽作用AGS細(xì)胞12小時(shí)后，提取各組細(xì)胞的蛋白，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。結(jié)果顯示，PAQR3肽能夠有效地抑制三株細(xì)胞中p-Akt(S473)及p-Erk的水平，間接證明了PAQR3肽可以替代PAQR3蛋白起到抑制胃癌細(xì)胞中PI3K/Akt及MAPK/Raf信號(hào)通路(圖1)。

2.PAQR3肽能夠抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)

為了驗(yàn)證PAQR3的多肽是否能夠替代PAQR3的作用，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，我們通過(guò)MTT及克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，與對(duì)照多肽的作用相比，PAQR3肽能夠有效抑制AGS、MKN45及PLD1細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖3)。圖3A－3C顯示了克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖3D－3F顯示了MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.PAQR3肽抑制AGS細(xì)胞的遷移

胃癌的患者通常會(huì)有轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重加重病情。我們?yōu)榱蓑?yàn)證PAQR3肽是否能夠抑制胃癌細(xì)胞的遷移，我們通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)，結(jié)果顯示PAQR3的多肽能夠有效抑制AGS細(xì)胞的遷移率(圖2)。

4.PAQR3能夠抑制裸鼠皮下瘤的生長(zhǎng)

為了進(jìn)一步證實(shí)PAQR3能夠抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，我們首先建立AGS細(xì)胞的裸鼠皮下瘤模型，待瘤體長(zhǎng)至100mm³后，分為兩組，于瘤內(nèi)每天注射相應(yīng)的對(duì)照多肽及PAQR3肽100μg，隔天測(cè)量裸鼠皮下瘤的體積。12天后取下瘤體測(cè)量并拍照(圖4A)。石蠟包埋各組瘤體，切片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，標(biāo)記細(xì)胞生長(zhǎng)指標(biāo)的Ki67蛋白。結(jié)果顯示PAQR3肽處理后裸鼠皮下瘤生長(zhǎng)受到了 有效的抑制(圖4B－4D)。

另外，申請(qǐng)人的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，所述PAQR3肽能夠通過(guò)抑制PI3K/Akt及MAPK/Erk信號(hào)通路，從而有效抑制人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。具體而言，分別采用MTT法(對(duì)照肽和PAQR3肽的濃度分別為1μg/mL、4μg/mL、20μg/mL)及克隆形成法(對(duì)照肽和PAQR3肽的濃度4μg/mL和20μg/mL)測(cè)試所述PAQR3肽能否抑制A375細(xì)胞的生長(zhǎng)，并采用劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell小室法(對(duì)照肽和PAQR3肽的濃度4μg/mL的20μg/mL)測(cè)試所述PAQR3肽能否抑制A375細(xì)胞的遷移能力。還采用Western blot檢測(cè)在對(duì)照肽及PAQR3肽(對(duì)照肽4μg/mL；PAQR3肽：20μg/mL)處理?xiàng)l件下A375細(xì)胞內(nèi)p-Akt及p-Erk的水平。

結(jié)果顯示在圖5A－5F中。其中，圖5A-5C證明，所述PAQR3肽能夠抑制A375細(xì)胞的生長(zhǎng)。圖5D和5E證明，所述PAQR3肽對(duì)A375細(xì)胞的遷移能力有著抑制作用。圖5F證明，所述PAQR3能夠抑制A375細(xì)胞中Akt及Erk的磷酸化水平。