本發(fā)明涉及一種H9N2禽流感疫苗的活性肽，屬于獸醫(yī)生物制品技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

禽流感每年都會(huì)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失和慘重后果。新的重組病毒株層出不窮，流感病毒已突破種間屏障，感染宿主范圍不斷擴(kuò)大。自20世紀(jì)以后，流感的流行已剝奪了上千萬人的生命，給全人類的公共健康造成了巨大的威脅。鑒于變異快，目前臨床上使用的疫苗已不能應(yīng)對不同的病毒亞型，徹底防控流感病毒更是難上加難，因此如何誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效持久的免疫保護(hù)應(yīng)答是相關(guān)科研工作人員迫切需要解決的現(xiàn)實(shí)問題。

疫苗免疫不僅是當(dāng)前畜禽傳染病防制的主要措施，而且也是我國動(dòng)物疫病防控規(guī)劃的重要舉措。臨床上使用的大多數(shù)疫苗配合佐劑才能發(fā)揮良好的功效。因此，安全、無殘留、有效的新型免疫增強(qiáng)劑研究及技術(shù)創(chuàng)新已成為養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種廉價(jià)、高效、安全的促進(jìn)疫苗免疫效果的新型活性肽。

一種促進(jìn)H9N2禽流感疫苗的活性肽BP4，其氨基酸序列為：5’-Gly Glu Arg Ala-NH2-3’

本發(fā)明所述的活性肽BP4在制備預(yù)防H9N2禽流感的藥物中的應(yīng)用。

一種預(yù)防H9N2禽流感的免疫組合物，包含H9N2禽流感疫苗及所述的活性肽BP4。

所述的活性肽BP4優(yōu)選以50ug/mL劑量存在于免疫組合物中。

本發(fā)明通過濃縮、純化500克家禽法氏囊提取物，再經(jīng)分子篩、高效液相分離、收集各種組分。將各組分以一定濃度與雜交瘤細(xì)胞相互作用，發(fā)現(xiàn)了其中一種組分具有較好的促進(jìn)抗體產(chǎn)生作用，將該組分進(jìn)行氨基酸測序，發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列為COOH-GERA-NH2(即5’-Gly Glu Arg Ala-NH2-3’，序列1)，并命名為法氏囊多肽(BP4)。在小鼠免疫中，添加50ug/mL和250ug/mL劑量BP4的實(shí)驗(yàn)組疫苗免疫效力顯著高于未加該組分的疫苗對照組。在雞免疫中，添加50ug/mL劑量BP4的實(shí)驗(yàn)組疫苗免疫效力顯著高于未加該組分的疫苗對照組。

1.法氏囊多肽BP4的制備

利用超濾濃縮技術(shù)，回收分子量小于1000Da成分，真空干燥濃縮后，用反向高效液相色譜(RP-HPLC)分離、純化多種法氏囊中的活性成分。收獲的各種組分經(jīng)MODIL-TOF質(zhì)譜分析，測定該法氏囊活性肽的分子量為431.213(m/z)，并獲得完整的氨基酸序列，即GERA。通過人工合成BP4，以一定濃度進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2.法氏囊多肽BP4促進(jìn)H9N2禽流感疫苗實(shí)驗(yàn)

(1)將免疫活性肽BP4，按照不同劑量添加到H9N2禽流感疫苗中進(jìn)行聯(lián)合接種小鼠；免疫后的小鼠的抗體水平、細(xì)胞因子水平高于疫苗組，且T細(xì)胞亞型發(fā)生了變化。

(2)將免疫活性肽BP4，按照50ug/mL添加到H9N2禽流感疫苗中進(jìn)行聯(lián)合接種75日齡雞；免疫后的雞的抗體水平、細(xì)胞因子水平高于疫苗組。

附圖說明

圖1法氏囊四肽的分離和純化。反向高效液相色譜圖中，箭頭所指，BP4的洗脫峰15.72min。

圖2：MALDI-TOF-MS分析。

圖3：免疫后4周，小鼠H9抗體水平，用不同字母標(biāo)記的各組之間差異顯著(p<0.05)，NS代表無顯著性差異。

圖4：免疫后3周，小鼠T淋巴細(xì)胞亞型CD3+CD4+,CD3+CD8+比例，用不同字母標(biāo)記的各組之間差異顯著(p<0.05)，NS代表無顯著性差異。

圖5免疫后2周和4周，雞H9抗體水平，用不同字母表示各組之間差異顯著(P<0.05)。

圖6免疫后雞血清中IL-4和IFN-γ水平，用不同字母表示各組之間差異顯著(P<0.05)。

本發(fā)明有益效果：

本發(fā)明涉及一種促進(jìn)H9N2禽流感疫苗的免疫活性肽。本發(fā)明所述的活性肽是一種來源于法氏囊的小分子多肽，具有促進(jìn)廣泛的免疫增強(qiáng)作用，對多種畜禽具有刺激抗體生成、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和提高疫苗免疫效力作用，該多肽的氨基酸序列為：COOH-GERA-NH2。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的實(shí)施例為進(jìn)一步描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1

1. BP4的分離及鑒定

取健康4～6周齡雞的法氏囊(AA肉雞，上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院附屬養(yǎng)殖場)500克，用1000ml生理鹽水碾碎，凍融三次，14000g低溫離心60分鐘。上清經(jīng)1000Da超濾、凍干。凍干樣品稀釋后，0.22um濾膜過濾，然后反向高效液相純化分析，收獲滯留時(shí)間為15.72min分鐘的活性峰(見圖1)。收獲的洗脫液經(jīng)MALDI-TOF-MS分析，分子量為431.213，氨基酸序列GERA(見圖2)。

實(shí)施例2

1.人工合成BP4

委托商業(yè)化多肽合成公司按照COOH-GERA-NH2氨基酸

序列(序列1)合成多肽，要求純度≧97％。

2.疫苗

禽流感滅活疫苗(H9N2亞型F株，購自南京梅里亞動(dòng)物保健有限公司)

3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將50只BALB/C小鼠隨機(jī)分為五組，每組10只：(1)禽流感滅活疫苗免疫組(每只免疫滅活疫苗0.2ml)；(2～4)滅活疫苗+BP4組(BP4濃度分別為10、50、250ug/mL，免疫劑量均為0.2ml)；PBS對照組(每只免疫0.2ml PBS)，免疫兩次，間隔2周。

4.樣品采集

二次免疫后2周，每周眼眶采血，8000×g離心10min分離血清，測定抗體效價(jià)；并于二免后1周采血分離血清，檢測和細(xì)胞因子表達(dá)水平，同時(shí)采血檢測T細(xì)胞亞型，所有檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1小鼠免疫程序

5.結(jié)果

(1)抗體水平檢測結(jié)果

特異性抗體水平通過紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)(HI試驗(yàn))進(jìn)行檢測，如圖3所示，二免后2 周，滅活疫苗+BP4組的禽流感病毒(H9)抗體水平均高于滅活疫苗組1個(gè)滴度以上，且滅活疫苗+50ug/ml BP4組的抗體水平最高。

(2)細(xì)胞因子水平測定結(jié)果

通過采集血清，用ELISA試劑盒(RD,USA，按其說明書使用)對各組小鼠血清中的細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果見圖4。實(shí)驗(yàn)表明，與滅活疫苗組或PBS對照組相比，在二免后1周，

滅活疫苗+BP4組可檢測到細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ水平顯著升高(p<0.05，或p<0.01)，并且隨著BP4劑量的增加，細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的水平上升。BP4不僅能提高代表Th1類型免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子IFN-γ的水平，同時(shí)能顯著提高代表Th2類型的細(xì)胞因子IL-4的水平。結(jié)果表明，滅活疫苗+BP4組免疫小鼠產(chǎn)生較高水平的細(xì)胞因子應(yīng)為BP4所致。

(3)T細(xì)胞亞型結(jié)果

二免后1周，無菌取小鼠脾臟細(xì)胞，采用PE、FITC和PE-Cy5標(biāo)記的CD3、CD4和CD8單抗(eBioscience，USA)三色的流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)檢測T細(xì)胞CD3+CD4+和CD3+CD8+百分率，結(jié)果見圖5。實(shí)驗(yàn)表明，與滅活疫苗組或PBS對照組相比，滅活疫苗+BP4組的T細(xì)胞CD3+CD4+和CD3+CD8+百分率顯著高于滅活疫苗組或PBS對照組(p<0.05，或p<0.01)，其中10ug/ml BP4組的CD3+CD4+百分率最高，50ug/ml BP4組的CD3+CD8+百分率最高。

實(shí)施例3

1.人工合成BP4

委托商業(yè)化多肽合成公司按照COOH-GERA-NH2氨基酸，純度≧97％。

2.疫苗

禽流感滅活疫苗(H9N2亞型F株，購自南京梅里亞動(dòng)物保健有限公司)

3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將45只75日齡雞(白航雞，購自青龍山養(yǎng)殖場)隨機(jī)分為三組，每組15只：(1)禽流感滅活疫苗免疫組(每只免疫滅活疫苗0.5ml)；(2)滅活疫苗+BP4組(BP4濃度為50ug/mL，免疫劑量為0.5ml)；PBS對照組(每只免疫0.5ml PBS)。

4.樣品采集

免疫后第2,4周，每只雞翅靜脈采抗凝血采血，8000×g離心10min分離血清，測定抗體效價(jià)和細(xì)胞因子表達(dá)水平，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表2雞免疫程序

5.結(jié)果

(1)抗體水平測定結(jié)果

特異性抗體水平通過紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)(HI試驗(yàn))進(jìn)行檢測，如圖6所示，免疫后2和4周，滅活疫苗+BP4組的禽流感病毒(H9)抗體水平開始顯著高于滅活疫苗組(p<0.05)，且,滅活疫苗+BP4組的抗體水平高于滅活疫苗組1個(gè)滴度以上。

(2)細(xì)胞因子水平測定結(jié)果

通過采集血清，用ELISA試劑盒(Invitrogen公司)對各組雞血清中的IL-4和IFN-γ細(xì)胞因子進(jìn)行了檢測，結(jié)果見圖7。實(shí)驗(yàn)表明，與滅活疫苗組或PBS對照組相比，免疫后3周，滅活疫苗+BP4組可檢測到較高水平的IL-4和IFN-γ，且差異顯著(p<0.05)。BP4能同時(shí)提高代表Th1和Th2免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的水平。結(jié)果表明，滅活疫苗+BP4組免疫雞產(chǎn)生較高水平的細(xì)胞因子應(yīng)為BP4所致。