本發(fā)明屬于醫(yī)學診斷治療
技術領域：
，具體地，本發(fā)明涉及來自DcR3的多肽及其衍生物在敗血癥治療中的應用及應用這一治療所需的血中DcR3作為一種新的敗血癥診斷指標。
背景技術：
：敗血癥是致病菌入血的嚴重感染性疾病。入血的致病菌以每20分鐘一代的驚人速度繁殖生長，快速擴散，可在數(shù)小時內發(fā)展為感染性休克、彌散性血管內凝血(DIC)和多器官衰竭,死亡率達25-46％，故為臨床急重癥。早期正確診斷及有效治療是搶救患者的關鍵。敗血癥的病理生理機制是致病菌及其毒素入血后激活炎癥反應細胞(免疫細胞、血管內皮細胞、血小板等)，使其大量釋放炎癥介質而引起的強烈的全身應激反應。已明確，病原體可激發(fā)大量的炎癥介質，如IL1-b,IL6(白細胞介素),TNF-a(腫瘤壞死因子-a)，F(xiàn)asL,LIGHT和TL1A(TNF-likemolecule1A)，IFN-r(干擾素-r),CRP(C反應蛋白),花生四烯酸代謝產物，PAF(血小板活化因子)，蛋白酶，凝血惡烷和氧自由基等促炎和促凋亡因子，這些因子直接導致畏冷，發(fā)熱，心跳加快，呼吸急促，血壓降低等臨床癥狀。全身炎癥反應綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)是因非感染病因(如燒傷、創(chuàng)傷、手術、胰腺炎以及缺血一再灌注等多種因素)作用于機體而引起的機體失控的自我持續(xù)放大和自我破壞的全身無菌性炎癥反應。敗血癥和SIRS臨床癥狀極為相似，都有高熱、心跳、呼吸加快、血壓下降等，但是在治療方面有所不同，敗血癥最重要的是要用抗菌素控制感染及生物制劑控制機體的過度反應，在感染沒有控制前不能用激素(以防加重感染)，而SIRS則應使用激素，因此二者治療上的截然不同決定了鑒別診斷非常重要。目前敗血癥的實驗室診斷的金標準是細菌培養(yǎng)，但細菌培養(yǎng)需時間較長，不能滿足對急危重敗血癥診療的需要。C反應蛋白(CRP)和IL-6亦用于敗血癥的輔助診斷，但二者在SIRS時也都明顯增高，難以區(qū)分感染性和非感 染性的。因此，本領域迫切需要開發(fā)高特異性和靈敏度的鑒別感染和非感染性炎癥的標志物，并找到更有效的治療感染性炎癥，尤其是敗血癥的藥物。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明第一方面，提供了一種分離的多肽或其藥學上可接受的鹽，所述的多肽具有下式所示的結構：[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xaa10]-[Xaa11]-[Xaa12]-[Xaa13]-[Xaa14]-[Xaa15]-[Xaa16]-[Xaa17]-[Xaa18]-[Xaa19]-[Xaa20]-[Xaa21]-[Xaa22]-[Xaa23]-[Xaa24]-[Xaa25]-[Xaa26]-[Xaa27]-[Xaa28]-[Xaa29]-[Xaa30]-[Xaa31]-[Xaa32]-[Xaa33]-[Xaa34]-[Xaa35]-[Xaa36]-[Xaa37]-[Xaa38]-[Xaa39]-[Xaa40]Xaa0是無，或1-3個氨基酸構成肽段；Xaa1是選自下組的氨基酸：Tyr、Trp、Phe、Thr或Ser；Xaa2是選自下組的氨基酸：Leu、Ile、Val、Met、Ala或Phe；Xaa3是選自下組的氨基酸：Glu或Asp；Xaa4是選自下組的氨基酸：Arg、Lys、Gln或Asn；Xaa5是選自下組的氨基酸：Arg或Lys；Xaa6是選自下組的氨基酸：Arg、Lys、Gln或Asn；Xaa7是選自下組的氨基酸：Arg或Lys；Xaa8是選自下組的氨基酸：Cys或Ser；Xaa9是選自下組的氨基酸：Asn、Gln、His、Lys或Arg；Xaa10是選自下組的氨基酸：Val、Ile、Leu、Met、Phe或Ala；Xaa11是選自下組的氨基酸：Leu、Ile、Val、Met、Ala或Phe；Xaa12是選自下組的氨基酸：Cys或Ser；Xaa13是選自下組的氨基酸：Gly、Pro或Ala；Xaa14是選自下組的氨基酸：Gly或Ala；Xaa15是選自下組的氨基酸：Arg、Lys、Gln或Asn；Xaa16是選自下組的氨基酸：Arg或Lys；Xaa17是選自下組的氨基酸：Glu或Asp；Xaa18是選自下組的氨基酸：Glu或Asp；Xaa19是選自下組的氨基酸：Ala、Val、Leu或Ile；Xaa20是選自下組的氨基酸：Arg、Lys、Gln或Asn；Xaa21是選自下組的氨基酸：Arg或Lys；Xaa22是選自下組的氨基酸：Cys或Ser；Xaa23是選自下組的氨基酸：His、Asn、Gln、Lys或Arg；Xaa24是選自下組的氨基酸：Ala、Val、Leu或Ile；Xaa25是選自下組的氨基酸：Thr或Ser；Xaa26是選自下組的氨基酸：His、Asn、Gln、Lys或Arg；Xaa27是選自下組的氨基酸：Asn、Gln、His、Lys或Arg；Xaa28是選自下組的氨基酸：Arg、Lys、Gln或Asn；Xaa29是選自下組的氨基酸：Arg或Lys；Xaa30是選自下組的氨基酸：Cys或Ser；Xaa31是選自下組的氨基酸：Arg、Lys、Gln或Asn；Xaa32是選自下組的氨基酸：Arg或Lys；Xaa33是選自下組的氨基酸：Arg、Lys、Gln或Asn；Xaa34是選自下組的氨基酸：Arg或Lys；Xaa35是選自下組的氨基酸：Gly、Pro或Ala；Xaa36是選自下組的氨基酸：Gly或Ala；Xaa37是選自下組的氨基酸：Phe、Leu、Val、Ile、Ala或Tyr；Xaa38是選自下組的氨基酸：Ala、Val、Leu或Ile；Xaa39是選自下組的氨基酸：His、Asn、Gln、Lys或Arg；Xaa40是無，或1-3個氨基酸構成肽段。在另一優(yōu)選例中，Xaa40為Cys。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽具有下式所示的結構：[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xaa10]-[Xaa11]-[Xaa12]-[Xaa13]-[Xaa14]-[Xaa15]-[Xaa16]-[Xaa17]-[Xaa18]-[Xaa19]-[Xaa20]-[Xaa21]-[Xaa22]-[Xaa23]-[Xaa24]-[Xaa25]-[Xaa26]-[Xaa27]-[Xaa28]-[Xaa29]-[Xaa30]-[Xaa31]-[Xaa32]-[Xaa33]-[Xaa34]-[Xaa35]-[Xaa36]-[Xaa37]-[Xaa38]-[Xaa39]-[Xaa40]Xaa0是無，或1-3個氨基酸構成肽段；Xaa1是選自下組的氨基酸：Tyr或Phe； Xaa2是選自下組的氨基酸：Leu或Ile；Xaa3是選自下組的氨基酸：Glu或Asp；Xaa4是選自下組的氨基酸：Arg或Lys；Xaa5是選自下組的氨基酸：Cys或Ser；Xaa6是選自下組的氨基酸：Arg或Lys；Xaa7是選自下組的氨基酸：Tyr或Phe；Xaa8是選自下組的氨基酸：Cys或Ser；Xaa9是選自下組的氨基酸：Asn或Gln；Xaa10是選自下組的氨基酸：Val或Leu；Xaa11是選自下組的氨基酸：Leu或Ile；Xaa12是選自下組的氨基酸：Cys或Ser；Xaa13是選自下組的氨基酸：Gly或Ala；Xaa14是選自下組的氨基酸：Glu或Asp；Xaa15是選自下組的氨基酸：Arg或Lys；Xaa16是選自下組的氨基酸：Glu或Asp；Xaa17是選自下組的氨基酸：Glu或Asp；Xaa18是選自下組的氨基酸：Glu或Asp；Xaa19是選自下組的氨基酸：Ala或Val；Xaa20是選自下組的氨基酸：Arg或Lys；Xaa21是選自下組的氨基酸：Ala或Val；Xaa22是選自下組的氨基酸：Cys或Ser；Xaa23是選自下組的氨基酸：His或Arg；Xaa24是選自下組的氨基酸：Ala或Val；Xaa25是選自下組的氨基酸：Thr或Ser；Xaa26是選自下組的氨基酸：His或Arg；Xaa27是選自下組的氨基酸：Asn或Gln；Xaa28是選自下組的氨基酸：Arg或Lys；Xaa29是選自下組的氨基酸：Ala或Val；Xaa30是選自下組的氨基酸：Cys或Ser；Xaa31是選自下組的氨基酸：Arg或Lys；Xaa32是選自下組的氨基酸：Cys或Ser；Xaa33是選自下組的氨基酸：Arg或Lys；Xaa34是選自下組的氨基酸：Thr或Ser；Xaa35是選自下組的氨基酸：Gly或Ala；Xaa36是選自下組的氨基酸：Phe或Leu；Xaa37是選自下組的氨基酸：Phe或Leu；Xaa38是選自下組的氨基酸：Ala或Val；Xaa39是選自下組的氨基酸：His或Arg；Xaa40是無，或1-3個氨基酸構成肽段。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽為SEQIDNO.:1所示的多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽為SEQIDNO.:1經過1-8個(較佳地1-5個、更佳地1-3個，最佳地1-2個)氨基酸的取代、缺失或添加形成的,且具有抑制感染性炎癥活性衍生多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽為SEQIDNO.:1經過1-3個氨基酸的取代；和/或經過1-2個氨基酸的缺失；和/或所述多肽的兩端分別經過1-3個氨基酸的添加形成的，且具有抑制感染性炎癥活性的衍生多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽選自下組：(a)具有SEQIDNO.:1所示氨基酸序列的多肽，且所述多肽的長度為32-48個氨基酸；(b)將SEQIDNO.:1所述的氨基酸序列經過1-8個(較佳地1-5個、更佳地1-3個，最佳地1-2個)氨基酸的取代、缺失或添加形成的，具有抑制感染性炎癥活性的衍生多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的衍生多肽與SEQIDNO:1的相同性≥80％，較佳地≥90％；更佳地≥95％。在另一優(yōu)選例中，所述的衍生多肽保留了≥70％的SEQIDNO:1的所示多肽的抑制感染性炎癥活性。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽如SEQIDNO.:1(YLERCRYCNVLCGEREEEARACHATHNRACRCRTGFFAH)或2所示(Ac-YLERCRYCNVLCGEREEEARACHATHNRACRCRTGFFAHC-NH2)。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽包括修飾和未修飾的多肽。在另一優(yōu)選例中，所述多肽為經修飾的多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的修飾包括經酰胺化或乙?；Ｔ诹硪粌?yōu)選例中，所述的修飾包括在所述多肽的C端經酰胺化(NH2)修飾；和/或在所述多肽的N端經乙?；?Ac)修飾。在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明還提供了由式I多肽構成的、具有二聚體本發(fā)明第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸編碼本發(fā)明第一方面所述的多肽。本發(fā)明第三方面，提供了本發(fā)明第一方面所述多肽或其衍生多肽的用途，用于制備治療感染性炎癥的藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述多肽為天然或非天然多肽在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物含有安全有效量的本發(fā)明第一方面所述多肽和藥學上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物還可含有抗感染活性成分，如抗生素及炎癥抑制因子。在另一優(yōu)選例中，所述的感染性炎癥包括全身感染性炎癥、或局部感染性炎癥。在另一優(yōu)選例中，所述全身感染性炎癥包括敗血癥。本發(fā)明第四方面，提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物含有本發(fā)明第一方面所述的多肽或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物還含有抗感染活性成分。在另一優(yōu)選例中，所述的抗感染活性成分包括抗生素或炎癥抑制因子。在另一優(yōu)選例中，所述的炎癥抑制因子包括TNF-α抑制劑。在另一優(yōu)選例中，所述TNF-α抑制劑包括Pentoxifylline。本發(fā)明第五方面，提供了誘捕受體3(DcR3)或其檢測試劑的用途，用于制備判斷感染性疾病預后的試劑或試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述感染性疾病包括敗血癥。在另一優(yōu)選例中，當樣本中測定的DcR3表達量較低，則說明感染性疾病的預后好；當樣本中測定的DcR3表達量較高，則說明感染性疾病的預后差。在另一優(yōu)選例中，所述的樣本為血液樣本。在另一優(yōu)選例中，所述的DcR3來源于哺乳動物，較佳地，來源于人類、小鼠或大鼠。本發(fā)明第六方面，提供了誘捕受體3(DcR3)以及降鈣素原(PCT)或其檢測試 劑的用途，用于(I)鑒別診斷SIRS與敗血癥；和/或(II)診斷敗血癥的試劑或試劑盒。本發(fā)明第七方面，提供了一種敗血癥檢測試劑盒，所述的試劑盒含有：(i)誘捕受體3的檢測試劑；(ii)降鈣素原的檢測試劑；和(iii)使用說明書。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還可含有內毒素檢測試劑。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測試劑為定性或定量檢測試劑。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有誘捕受體3和/或降鈣素原作為陽性對照。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還可含有白介素-6、急性反應蛋白、細菌、真菌等能夠反映病原體入侵血中的檢測試劑。在另一優(yōu)選例中，提供了一種診斷感染性炎癥和/或鑒別感染與非感染性炎癥的方法，包括步驟：(I)測定樣品中的DcR3和PCT含量，并與正常值進行比較；(II)當樣品中DcR3和PCT的含量顯著高于正常值，則說明提供該樣品的對象患有感染性炎癥。應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1顯示血中DcR3在正常人極低，SIRS(全身炎癥反應綜合征)時輕、中度升高，敗血癥時高度升高。圖2顯示血中DcR3對診斷敗血癥的價值及與PCT、IL-6及CRP的相關與比較。圖3顯示血中DcR3對敗血癥與SIRS鑒別診斷的價值及與PCT、IL-6及CRP的相關與比較。圖4顯示血中DcR3的升高與敗血癥的嚴重性(APACHEIIScore)相關性。圖5顯示盡管血中DcR3在多數(shù)情況下，與PCT變化動向是一致的，但在 一些敗血癥患者，PCT并不升高時血中DcR3已經明顯升高，說明二者聯(lián)合應用可防止漏診。圖6顯示血中DcR3在某些病人(約10％)與PCT不一致時，DcR3比PCT更能夠反映病情的動態(tài)變化，DcR3與臨床病情(以體溫變化為證)較為一致。圖7顯示敗血癥死亡患者血中DcR3的二種動態(tài)變化。血中DcR3在死亡患者中的二種變化狀況：圖7A為不斷升高；或圖7B為一度極高，而后降低，但仍維持高水平。血中DcR3水平與病情嚴重程度及轉歸正相關。圖8顯示用BiaCore測定DcR3-P1多肽與DcR3配體FasL有親和力。結果表明，在20ng/ml濃度可見與配體的結合。DcR3與FasL結合的Kd值為271.4+24.4nM28。由此可推測，DcR3-P1有一定的與促凋亡的Fas受體競爭其FasL的生物活性，從而可阻斷FasL的誘導凋亡功能。FasL在敗血癥時大量產生，是敗血癥病理過程的關鍵因素，阻斷其功能可望減輕敗血癥癥狀。圖9A顯示DcR3-P1多肽能夠減輕LPS誘導的敗血癥癥狀，并降低敗血癥死亡率，其中生理鹽水對照鼠DIC表現(xiàn)：鼻面部微血管堵塞、淤血、發(fā)腫發(fā)藍、萎靡、少動，5只鼠均死于24小時，而實驗鼠精神，無DIC表現(xiàn)，仍有2/6存活到>60小時(P＝0.024)。圖9B顯示DcR3-P1多肽能夠減輕LPS誘導的敗血癥DIC(disseminatedintravascularcoagulation，彌散性血管內凝血，尾巴、足部發(fā)紫)癥狀。圖10顯示DcR3-P1多肽與抗TNF-a的Pentoxifylline聯(lián)合應用時，敗血癥的生存率比二者單用的效果更好，呈協(xié)同作用。圖11顯示DcR3-P1多肽通過同時拮抗三個重要凋亡因子(FasL、LIGHT及TL-1A)與它們的凋亡受體結合而誘導細胞死亡，從而產生抗敗血癥DIC(彌漫性血管內凝血)的生物活性功能。具體實施方式本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，來源于DcR3的多肽作為DcR3的活性部位，能夠有效地阻斷DcR3與其配體的結合，從而達到有效抗感染性炎癥的作用。此外，DcR3還是一個高度特異性、靈敏地指示感染性炎癥的標志物。實驗發(fā)現(xiàn)，當同時采用DcR3和PCT作為標志物時，對感染性炎癥的診斷特異性和靈敏度具有協(xié)同作用，可強化早期診斷、避免誤診。在此基礎上，完成了本發(fā)明。誘捕受體3(DcR3)誘捕受體3(DecoyReceptor3，簡稱DcR3)就是一種體內極為重要應對外來病原菌而激發(fā)的抗凋亡因子。DcR3是腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員。它有受體的膜外配體結合部位，但缺乏跨膜區(qū)，是一種分泌型的蛋白，雖然能結合配體，但不能像其它TNFR膜受體-樣轉導信號和產生效應(如誘導凋亡)，因而稱誘捕受體。DcR3的最大特點是它能夠在細胞外競爭性地結合至少三種TNF超家族配體：FasL、LIGHT和TL1A，阻止這些因子與它們各自的跨膜受體(Fas，HVEM/LTβR,DR3)結合從而抑制它們誘導細胞凋亡的作用。有文獻報道多種生物因子(如TNFa，IL6,EBV病毒等)均可上調DcR3的表達。活性多肽在本發(fā)明中，術語“本發(fā)明多肽”、“DcR3活性多肽”、“DcR3活性小肽”、“短肽DcR3”或“肽DcR3”可互換使用，都指具有感染性疾病抑制活性的肽DcR3氨基酸序列(YLERCRYCNVLCGEREEEARACHATHNRACRCRTGFFAH，如SEQIDNO:1所示)的蛋白或多肽。此外，所述術語還包括具有抑制感染性疾病功能的、SEQIDNO：1序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)：1-8個(通常為1-5個，較佳地為1-3個或1-2個，更佳地1個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數(shù)個(通常為3個以內，較佳地為2個以內，更佳地為1個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的結構和功能，優(yōu)選地，SEQIDNO.:2所示的多肽即為將SEQIDNO.:1所示的多肽在C末端添加了Cys形成的活性衍生多肽(YLERCRYCNVLCGEREEEARACHATHNRACRCRTGFFAHC)。此外，所述術語還包括單體和多聚體形式本發(fā)明多肽。該術語還包括線性以及非線性的多肽(如環(huán)肽)。本發(fā)明還包括DCR3多肽的活性片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持抑制感染性疾病功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或幾個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，或(ii)在一個或 多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)DCR3-P1多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(與前導序列、分泌序列或6His等標簽序列融合而形成的然后蛋白)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。一類優(yōu)選的活性衍生物指與式I的氨基酸序列相比，有至多3個，較佳地至多2個，更佳地至多1個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產生。表1最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Lys；ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro；AlaAlaHis(H)Asn；Gln；Lys；ArgArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；PheLeuLeu(L)Ile；Val；Met；Ala；PheIleLys(K)Arg；Gln；AsnArgMet(M)Leu；Phe；IleLeuPhe(F)Leu；Val；Ile；Ala；TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr；PheTyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；SerPheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；AlaLeu發(fā)明還提供DcR3活性多肽的類似物。這些類似物與天然DcR3活性多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括：體內或體外的多肽的化學衍生形式 如乙?；Ⅴ０坊螋然?。一種更優(yōu)選的方式是將SEQIDNO.:1所示的多肽，在C端進行酰胺化，和/或在N端進行乙?；?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。本發(fā)明多肽還可以以由藥學上或生理學可接受的酸或堿衍生的鹽形式使用。這些鹽包括(但不限于)與如下酸形成的鹽：氫氯酸、氫溴酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富馬酸、馬來酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羥乙磺酸。其他鹽包括：與堿金屬或堿土金屬(如鈉、鉀、鈣或鎂)形成的鹽，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常規(guī)的“前體藥物”的形式。編碼序列本發(fā)明還涉及編碼DcR3活性多肽及其衍生多肽(如P1多肽)的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。本發(fā)明的DcR3活性多肽核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或DcR3活性多肽編碼序列經基因工程產生的宿主細胞。另一方面，本發(fā)明還包括對DcR3活性多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。制備方法本發(fā)明多肽可以是重組多肽或合成多肽。本發(fā)明的多肽可以是化學合成的，或重組的。相應地，本發(fā)明多肽可用常規(guī)方法人工合成，也可用重組方法生產。一種優(yōu)選的方法是使用液相合成技術或固相合成技術，如Boc固相法、Fmoc 固相法或是兩種方法聯(lián)合使用。固相合成可快速獲得樣品，可根據(jù)目的肽的序列特征選用適當?shù)臉渲d體及合成系統(tǒng)。例如，F(xiàn)moc系統(tǒng)中優(yōu)選的固相載體如連接有肽中C端氨基酸的Wang樹脂，Wang樹脂結構為聚苯乙烯，與氨基酸間的手臂是4-烷氧基芐醇；用25％六氫吡啶/二甲基甲酰胺室溫處理20分鐘，以除去Fmoc保護基團，并按照給定的氨基酸序列由C端逐個向N端延伸。合成完成后，用含4％對甲基苯酚的三氟乙酸將合成的相關肽從樹脂上切割下來并除去保護基，可過濾除樹脂后乙醚沉淀分離得到粗肽。將所得產物的溶液凍干后，用凝膠過濾和反相高壓液相層析法純化所需的肽。當使用Boc系統(tǒng)進行固相合成時，優(yōu)選樹脂為連接有肽中C端氨基酸的PAM樹脂，PAM樹脂結構為聚苯乙烯，與氨基酸間的手臂是4-羥甲基苯乙酰胺；在Boc合成系統(tǒng)中，在去保護、中和、偶聯(lián)的循環(huán)中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保護基團Boc并用二異丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽鏈縮合完成后，用含對甲苯酚(5-10％)的氟化氫(HF),在0℃下處理1小時，將肽鏈從樹脂上切下，同時除去保護基團。以50-80％乙酸(含少量巰基乙醇)抽提肽，溶液凍干后進一步用分子篩SephadexG10或Tsk-40f分離純化，然后再經高壓液相純化得到所需的肽?？梢允褂秒幕瘜W領域內已知的各種偶聯(lián)劑和偶聯(lián)方法偶聯(lián)各氨基酸殘基，例如可使用二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，羥基苯駢三氮唑(HOBt)或1,1,3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)進行直接偶聯(lián)。對于合成得到的短肽，其純度與結構可用反相高效液相和質譜分析進行確證。在一優(yōu)選例中，本發(fā)明多肽DcR3活性多肽，按其序列，采用固相合成的方法制備，行高效液相色譜純化，獲得高純度目的肽凍干粉，-20℃貯存。另一種方法是用重組技術產生本發(fā)明多肽。通過常規(guī)的重組DNA技術，可利用本發(fā)明的多核苷酸可用來表達或生產重組的DcR3-P1多肽。一般來說有以下步驟：(1).用本發(fā)明的編碼DcR3活性多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化活性多肽。重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的活性多肽。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于： 常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。由于本發(fā)明多肽較短，因此可以考慮將多個多肽串聯(lián)在一起，重組表達后獲得多聚體形式的表達產物。如果需要可通過酶切等方法形成所需的小肽。DcR3活性多肽及其衍生多肽本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，SEQIDNO.:1所示的多肽是DcR3的功能性活性肽區(qū)。它能夠在細胞外競爭性地結合至少三種TNF超家族配體：FasL、LIGHT和TL1A(TNF-likeligand1A)，阻止這些因子與它們各自的促凋亡跨膜受體(Fas，HVEM/LTR,DR3)結合，從而抑制各種細胞(體細胞、淋巴細胞、內皮細胞)的凋亡(圖11)。而對SEQIDNO.:1序列進行進一步改進和修飾后的SEQIDNO.:2(DcR3-P1)所示序列，不僅能夠起到SEQIDNO.:1所示多肽相似的活性，其純化更簡單，更穩(wěn)定，活性更強。敗血癥時，凋亡因子大量表達，與敗血癥的病理過程及癥狀發(fā)展有密切關系。DcR3活性多肽及其衍生肽通過競爭性結合FasL、LIGHT和TL1A，阻斷這些凋亡因子與其各自凋亡受體結合，進而減輕多種細胞凋亡，降低機體對入侵病原體的反應強度，從而減輕臨床癥狀。藥物組合物和施用方法另一方面，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有(a)安全有效量的本發(fā)明多肽或其藥學上可接受的鹽；以及(b)藥學上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明多肽的數(shù)量通常為10微克-100毫克/劑，較佳地為100-1000微克/劑。為了本發(fā)明的目的，有效的劑量為給予個體約0.01毫克/千克至50毫克/千克，較佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克體重的本發(fā)明多肽。此外，本發(fā)明的多肽可以單用，也可與其他治療劑一起使用(如配制在同一藥物組合物中)。優(yōu)選地，所述的治療劑為抗感染性炎癥的活性成分，例如抗生素、TNF-α抑制劑、等。藥物組合物還可含有藥學上可接受的載體。術語“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體。該術語指這樣一些藥劑載體：它們本身不誘導產生對接受該組合物的個體有害的抗體，且給藥后沒有過分的毒性。這些載體是本領域普通技術人員所熟知的。在Remington’sPharmaceuticalSciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到關于藥學上可接受的賦形劑的充分討論。這類載體包括(但并不限于)：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐劑及其組合。治療性組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質等。通常，可將治療性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。一旦配成本發(fā)明的組合物，可將其通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)：肌內、靜脈內、皮下、皮內或局部給藥。待預防或治療的對象可以是哺乳動物；尤其是人。當本發(fā)明的藥物組合物被用于實際治療時，可根據(jù)使用情況而采用各種不同劑型的藥物組合物。較佳地，可以例舉的有靜脈注射劑。這些藥物組合物可根據(jù)常規(guī)方法通過混合、稀釋或溶解而進行配制，并且偶爾添加合適的藥物添加劑，如賦形劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、稀釋劑、緩沖劑、等滲劑(isotonicities)、防腐劑、潤濕劑、乳化劑、分散劑、穩(wěn)定劑和助溶劑，而且該配制過程可根據(jù)劑型用慣常方式進行。例如，眼藥水的配制可這樣進行：將短肽DCR3-P1或其藥學上可接受的鹽與基本物質一起溶解于無菌水(在無菌水中溶解有表面活性劑)中，調節(jié)滲透壓和酸堿度至生理狀態(tài)，并可任意地加入合適的藥物添加劑如防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、等滲劑、抗氧化劑和增粘劑，然后使其完全溶解。本發(fā)明的藥物組合物還可以緩釋劑形式給藥。例如，短肽DcR3-P1或其鹽可被摻入以緩釋聚合物為載體的藥丸或微囊中，然后將該藥丸或微囊通過手術植入待治療的組織。此外，短肽DcR3-P1或其鹽還可通過插入預先涂有藥物的眼內透鏡而得以應用。作為緩釋聚合物的例子，可例舉的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羥基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，較佳地可例舉的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。當本發(fā)明的藥物組合物被用于實際治療時，作為活性成分的短肽DCR3-P1或其藥學上可接受的鹽的劑量，可根據(jù)待治療的每個病人的體重、年齡、性別、癥狀程度而合理地加以確定。例如，當皮下、肌肉或靜脈注射時，可采用 2-1000mg/kg的劑量，優(yōu)選為20-500mg/kg，更優(yōu)選為50-200mg/kg，使用時間為疑似感染性疾病開始時，每天1-2次。當然，具體應用本發(fā)明藥物組合物的方案也應當由個體病情變化(體溫、脈搏、呼吸、血生化指標，DcR3/PCT變化)，不斷調整治療方案，以達最佳抗感染療效。本發(fā)明的主要優(yōu)點如下：(1)本發(fā)明提供用抗凋亡的DcR3活性多肽及其衍生多肽治療敗血癥的新方法；(2)本發(fā)明中所述抗凋亡的DcR3活性多肽及其衍生多肽治療敗血癥的新方法可與其它抗敗血癥的藥物(如TNFa拮抗劑，抗菌素、抗炎藥物等)協(xié)同，提高敗血癥的搶救效果；(3)本發(fā)明提出最佳診斷敗血癥的方法應為組合監(jiān)測，如DcR3及PCT、血培養(yǎng)病原體、內毒素等的聯(lián)合監(jiān)測，以達到互補效果，提高敗血癥早期診斷的準確率及臨床治療療效判斷的及時性及正確性。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。實施例1DcR3活性多肽及其P1衍生多肽的合成、分離純化及鑒定DcR3活性多肽及其P1衍生多肽由商業(yè)化多肽合成公司按常規(guī)方法合成，用HPLC常規(guī)分離純化，經質譜及HPLC鑒定分子量及純度。純度>98％為合格產品，冰凍干燥保存?zhèn)溆谩cR3活性多肽在液體中可由Cys形成二硫鍵，形成二聚體，經鑒定后純化二聚體。實施例2DcR3-P1多肽親和力實驗使用BiaCore系統(tǒng)的SPR生物傳感技術鑒定所純化的DcR3活性多肽及DcR3活性多肽二聚體對FasL配體的親和力。用氨基交聯(lián)試劑盒將FasL共價交聯(lián)到CM5 反應片上的金質表面，再讓DcR3二聚體以每5ul/分鐘速度在10分鐘內流過金質表面，洗掉未結合者，通過測定plasmonresonance信號(responseunits,RU)及生物信息分析方法(BIA)評估計算出Kd(解離常數(shù)，nM)。結果(圖8)表明，在20ng/ml濃度可見與配體的結合。DcR3與FasL結合的Kd值為271.4+24.4nM28。由此可推測，DcR3-P1能夠與促凋亡的Fas受體競爭其配體FasL的生物活性，從而可阻斷FasL的誘導凋亡功能。FasL在敗血癥時大量產生，是敗血癥病理過程的關鍵因素，阻斷其功能可望減輕敗血癥癥狀。實施例3DcR3-P1多肽對敗血癥的抑制作用在細胞水平證實DcR3-P1有一定的抗凋亡功能后，本實驗對之進行了小鼠LPS敗血癥的拮抗的預實驗?？紤]到吸收及發(fā)揮作用時間，DcR3-P10mg/ml(對照組)或10mg/kg/0.2ml鹽水(實驗組)i.v.注入BALB/c小鼠(6只/組，少量初試)，10分鐘后，LPS(2mg/kg,E.coli0111:B4,Sigma)腹腔注入各組小鼠，然后觀察敗血癥發(fā)展變化。對照組小鼠在數(shù)小時內出現(xiàn)全身毛發(fā)豎立，萎靡，少動，不食，眼睛無神，微血管堵塞淤血，類似DIC(彌散性血管內凝血)癥狀明顯：鼻面部、耳朵、四肢、尾巴明顯青紫，頭面部發(fā)腫，與實驗組鼠的紅潤、毛發(fā)平順、面尖，眼睛有神相比，明顯不同。對照組于6小時開始死亡,14小時剩一半，24小時全死，而實驗組在22小時仍有一半存活，有2只能夠熬過“cytokninestorm”而不死(P<0.024，圖9)。此實驗重復2次，結果相似。結論：在用LPS造成的小鼠敗血癥模型上，DcR3功能性多肽能夠增強小鼠對LPS的耐受，減少LPS引起的死亡。與此同時，實驗發(fā)現(xiàn)DcR3功能性多肽(10mg/kg)與抗TNFa的藥物(Pentoxifylline，PTX，50mg/kg)聯(lián)合使用比DcR3功能性多肽或PTX單獨使用有更強的抗LPS誘導對敗血癥死亡效果(30％or60％vs.100％存活，圖10，P<0.05)。這一協(xié)同作用的發(fā)現(xiàn)為可提高抗敗血癥療效，降低LPS引起的死亡提供新途徑。DcR3抗敗血癥的機理與其能夠同時拮抗三個重要凋亡因子(FasL、LIGHT及TL-1A)與它們的凋亡受體結合而誘導的細胞死亡，從而產生抗敗血癥及其DIC(彌漫性血管內凝血)的生物學功能(如圖11所示)。實施例4衍生多肽的制備和鑒定根據(jù)SEQIDNO.:1的序列，按實施例1中的方法，制備了如下衍生多肽(表2)，并經分離純化并鑒定后獲得高純度的SEQIDNO.:3-12多肽。表2多肽SEQIDNO.:序列DcR3-P23Ac-PIERCRYCNVLCGEREEEARACHATHNRACRCRTGFFAHC-NH2DcR3-P34Ac-YLDKSRYCNVLCGEREEEARACHATHNRACRCRTGFFAHC-NH2DcR3-P45Ac-YLERCRYCNVICGDKEEEARACHATHNRACRSRTGFFAHC-NH2DcR3-P56Ac-YLERCRYCNVLCGEREEEAKVCHATHNRACRCRTGFFAHC-NH2DcR3-P67Ac-YLERCRYCGVLCGEREEEARACHATHGRACRCRTGFFAHC-NH2DcR3-P78Ac-YLERCRYCNVLCGEREEEARACHATHNRACRCRTALLGHC-NH2DcR3-P89Ac-YLERCRYCNVLCGEREEEARACHATHNRACRCRTGFFAHC-NH2DcR3-P910Ac-YLERCRYCNVLCGEREEEARACHATHNRASKSKSGFFAHC-NH2DcR3-P1011Ac-ERCRYCNVLCGEREEDARACHATHNRACRCRTGFFAHC-AcylDcR3-P1112Ac-YLERCRFSNVLCGEREEEARACHATHNRACRCRTGFFAHC-Acyl實施例5衍生多肽對敗血癥的抑制作用方法同實施例3，結果可見在5-10mg/kg的劑量下，本發(fā)明衍生多肽均能夠增強小鼠對LPS的耐受，減少LPS引起的死亡。實施例6DcR3與PCT的診斷協(xié)同作用采用ELISA法測定DcR3與PCT聯(lián)用對敗血癥的診斷作用結果：血中DcR3可在降鈣素原(PCT)升高之前升高(表3)，可與PCT協(xié)同診斷敗血癥；表3病例檢測時間DcR3PCT1血培養(yǎng)日2.0420.072培養(yǎng)后13天1.0010.073血培養(yǎng)日3.470.034血培養(yǎng)日1.2880.075培養(yǎng)前1天7.6430.036培養(yǎng)前1天1.1670.026血培養(yǎng)日2.8280.057血培養(yǎng)日2.3650.027培養(yǎng)后8天8.6210.038血培養(yǎng)日1.2010.029血培養(yǎng)日2.0790.0710血培養(yǎng)日1.7790.0611血培養(yǎng)日1.3410.0512培養(yǎng)后4天2.3290.0712培養(yǎng)后5天0.8780.0413One培養(yǎng)前天1.1670.0314血培養(yǎng)日2.3970.0415培養(yǎng)后9天1.0230.0616培養(yǎng)后2天2.7350.0716培養(yǎng)后4天3.0420.0616培養(yǎng)后6天2.7940.0317培養(yǎng)前2天1.7330.0218培養(yǎng)前1天2.4320.051.血中DcR3的升高可以因內毒素先于病原體入血而檢測陽性，有別于正常人及全身炎癥反應綜合征(SIRS)(圖1)，與現(xiàn)有敗血癥的指標如PCT、急性反應蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)有好的相關性(圖2，圖3)，為敗血癥早期診斷的新指標；2.血中DcR3在無病原體入血前的一般無菌性炎癥(如SIRS等)含量較低，一旦病原體入血，則血中DcR3明顯升高，可提示SIRS向sepsis(敗血癥)的轉化(圖1，圖3)，對臨床從使用激素到使用抗菌素有重要指導意義；3.在約90％的敗血癥患者，血中DcR3含量的動態(tài)變化與PCT有較好一致性(圖5)。有約10％的敗血癥患者，血中DcR3含量的動態(tài)變化與PCT不一致，其臨床癥狀變化可與DcR3變化一致。4.動態(tài)檢測血中DcR3含量，可提示病情的嚴重性、治療效果的好壞。血中DcR3降低可提示病情輕、療效好；反之，病情重、療效差(圖4，表4)，對臨床及時調整用藥有指導意義；病情發(fā)展加重時，血中DcR3含量不斷升高，為；或血中DcR3含量極度升高但而后又下降。這些變化均可為死亡前奏(表4，圖7)，提示臨床應采取積極的、較強的治療措施；表4通過建立的DcR3-ELISA檢測了134多例細菌培養(yǎng)陽性的敗血癥血漿標本，結果表明：1)敗血癥時患者血漿中DcR3明顯升高，升高幅度較CRP和IL6明顯，與臨床上常用的降鈣素原(PCT)相關性為0.98；2)DcR3在敗血癥時升高比非感染性SIRS的增高時更為明顯，有可能用于二者的鑒別診斷；3)初步動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，DcR3的變化能夠比PCT更好地反映敗血癥病情變化，可用于療效判定及病情跟蹤，因而對臨床診斷和治療有重要指導意義。除了有診斷價值之外，還發(fā)現(xiàn)根據(jù)DcR3晶體衍射結構顯示的功能區(qū)域設計合成的DcR3功能性多肽能夠減輕小鼠LPS引起的敗血癥的癥狀，降低死亡率。DcR3小分子多肽(40個氨基酸)使用比DcR3大分子蛋白有其優(yōu)勢：1)結構穩(wěn)定，不易因加熱、反復凍融、酶降解而失去其有效結構及功能；2)容易保存，保存期長；2)生產價格低，容易大量生產，可推廣使用。DcR3的多肽衍生物在敗血癥治療上有臨床實用價值。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。當前第1頁1 2 3