技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分離的多肽、編碼小菌素S(microcinS)多肽的分離的核酸分子以及與所述核酸分子雜交的引物和探針。本發(fā)明還涉及包含所述核酸分子的質(zhì)粒和細(xì)胞、與所述多肽結(jié)合的抗體、組合物以及用于產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于治療或預(yù)防微生物感染、功能性胃腸疾病(functionalgastrointestinaldisorders)或治療腫瘤的醫(yī)療用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于保藏食物的方法和用于涂覆敷料材料的方法。
背景技術(shù)：
：：小菌素是核糖體合成的具有低分子量的抗微生物肽。由腸桿菌(enterobacteria)(主要是大腸桿菌(Escherichiacoli))產(chǎn)生的小菌素合成在應(yīng)激條件(如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的限制)下被急劇活化。小菌素針對(duì)近緣物種(closelyrelatedspecies)發(fā)揮強(qiáng)有力的抗微生物/抗菌活性，其提供在腸道菌群中的高度競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)(Baquero，F(xiàn).，Bouanchaud，D.，Martinez-Perez，M.C.&Fernandez，C.(1978)JBacteriol135，342-347)。小菌素生產(chǎn)者對(duì)它們產(chǎn)生的小菌素具有抗性，其由位于一個(gè)基因簇內(nèi)的至少一個(gè)抗性賦予基因介導(dǎo)。14種已知的小菌素中的大多數(shù)是質(zhì)粒編碼的，但是也已經(jīng)描述了染色體編碼的抗微生物/抗菌多肽。益生菌菌株大腸桿菌Nissle1917(EcN)產(chǎn)生小菌素M和H47(Patzer，S.I.，Baquero，M.R.，Bravo，D.，Moreno，F(xiàn).&Hantke，K.(2003)Microbiology149，2557-2570.)。益生菌被定義為活微生物，其在以一定數(shù)量攝入時(shí)發(fā)揮超過(guò)本身基本營(yíng)養(yǎng)的健康益處。對(duì)使菌株能夠成為益生菌的機(jī)制了解很少。然而，小菌素的抗微生物活性可以積極影響腸道平衡。假設(shè)不存在致病因素以及充分證實(shí)是臨床安全的，產(chǎn)生小菌素的菌株顯然滿足益生菌的定義。與腸細(xì)菌小菌素相比，食源性乳酸菌產(chǎn)生包含羊毛硫氨酸的肽抗生素。革蘭氏陽(yáng)性菌的所謂的羊毛硫抗生素(lantibiotic)已經(jīng)用于食物保藏(Kuipers，A.，Rink，R.&Moll，G.N.(2011)ProkaryoticAntimicrobialPeptides：FromGenestoApplications(原核生物的抗微生物肽：從基因到應(yīng)用)(SpringerScience+BusinessMedia，Berlin))。作為抗腫瘤劑(Hetz，C.，Bono，M.R.，Barros，L.F.&Lagos，R.(2002)ProcNatlAcadSciUSA99，2696-2701)或作為在感染性疾病中傳統(tǒng)抗生素的替代物(Dicks，L.M.T.，Heunis，T.D.J.，vanStaden，D.A.，Brand，A.，SutyakNoll，K.&Chikindas，M.L.(2011)ProkaryoticAntimicrobialPeptides：FromGenestoApplications(原核生物的抗微生物肽：從基因到應(yīng)用)(SpringerScience+BusinessMedia，Berlin)，Gillor，O.，Kirkup，B.C.&Riley，M.A.(2004)Adv.ApplMicrobiol54，129-146)的用途是細(xì)菌素的兩種進(jìn)一步討論的應(yīng)用。自從數(shù)十年前以來(lái)和在目前，細(xì)菌感染的治療主要是基于傳統(tǒng)抗生素的。然而，對(duì)這些傳統(tǒng)抗生素有耐藥性的病原體的出現(xiàn)構(gòu)成了巨大的問(wèn)題。因此，剩余的治療選擇甚至是更受限的。這種負(fù)面影響也見(jiàn)于其它經(jīng)濟(jì)上重要的行業(yè)，例如食品行業(yè)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：技術(shù)問(wèn)題基于以上所描述的現(xiàn)有技術(shù)和基于在人類和獸醫(yī)醫(yī)學(xué)中新的抗菌劑和預(yù)防劑的不斷增長(zhǎng)的需求，完成了本發(fā)明。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)菌株的治療越來(lái)越具有挑戰(zhàn)性。本發(fā)明的目的是提供新的抗微生物小菌素多肽，其能夠被用作常規(guī)抗生素的替代物并且因此用作控制致病微生物(其是ESBL生產(chǎn)者)的替代物。就此而言，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供能夠在致病性革蘭氏陰性菌的治療中使用的新的抗微生物小菌素多肽，所述致病性革蘭氏陰性菌包括產(chǎn)生ESBL的大腸桿菌，并且此外還包括高毒性腸出血性大腸桿菌(EHEC)菌株(最近在德國(guó)的大爆發(fā)的致病病原體)(Frank，C.等人(2011)NEnglJMed10.1056/NEJMoa1106483；Mellmann，A.等人(2011)PLoSONE6(7)：e22751.doi：10.1371)。利用某些抗生素治療使EHEC細(xì)胞釋放較高量的志賀毒素(Shigatoxin)。因此，病人的抗生素治療經(jīng)討論是禁忌的。在EHEC和腸致病性大腸桿菌(EPEC)感染的治療和預(yù)防中，新的小菌素多肽應(yīng)該是有效的。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供在功能性胃腸疾病、尤其是成人和兒童中腸易激綜合征(irritablebowelsyndrome)的治療中使用的新的抗微生物小菌素多肽。本發(fā)明的另一個(gè)的目的是提供包含產(chǎn)生用于所述醫(yī)療用途的新的小菌素多肽的細(xì)胞的新的新的小菌素多肽。本發(fā)明的目的還提供能夠在癌癥的治療中使用的、能夠在食物的保藏中使用的以及能夠在敷料材料的涂覆中使用的新的小菌素多肽。本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容為了解決該問(wèn)題，本發(fā)明在一方面特點(diǎn)為分離的多肽，其中所述多肽：a)包含與SEQIDNO：6或SEQIDNO：7的氨基酸序列具有至少50％以上的同一性的氨基酸序列；b)由包含核苷酸序列的核酸分子編碼，所述核苷酸序列與包含SEQIDNO：1、2、3、4或5或其互補(bǔ)序列中任何一個(gè)核苷酸序列的核苷酸序列具有至少50％以上的同一性；c)由與包含SEQIDNO：1、2、3、4或5或其互補(bǔ)序列中任何一個(gè)核苷酸序列的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交的核酸分子編碼；或者d)包含含有SEQIDNO：6或SEQIDNO：7的氨基酸序列的多肽的自然存在的等位基因變體。具體而言，描述了分離的多肽，其中所述多肽：a)包含與SEQIDNO：6或SEQIDNO：7的氨基酸序列具有至少70％以上同一性的氨基酸序列，所述多肽包含具有抗微生物活性的所述氨基酸序列；b)由包含核苷酸序列的核酸分子編碼，所述核苷酸序列與包含SEQIDNO：1、2、3、4或5或其互補(bǔ)序列中任何一個(gè)核苷酸序列的核苷酸序列具有至少70％以上同一性，所述核苷酸序列包含編碼具有至少抗微生物活性或小菌素S自身免疫活性或小菌素S轉(zhuǎn)運(yùn)活性的多肽的SEQIDNO：1，所述核苷酸序列包含編碼具有抗微生物活性的多肽的SEQIDNO：2，所述核苷酸序列包含編碼具有小菌素S自身免疫活性的多肽的SEQIDNO：3，所述核苷酸序列包含編碼具有對(duì)小菌素S轉(zhuǎn)運(yùn)活性的多肽的SEQIDNO：4，以及所述核苷酸序列包含編碼具有對(duì)小菌素S轉(zhuǎn)運(yùn)活性的多肽的SEQIDNO：5；c)由與包含SEQIDNO：1、2、3、4或5或其互補(bǔ)序列中任何一個(gè)核苷酸序列的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交的核酸分子編碼，所述核苷酸序列包含編碼具有至少抗微生物活性或小菌素S自身免疫活性或小菌素S轉(zhuǎn)運(yùn)活性的多肽的SEQIDNO：1，所述核苷酸序列包含編碼具有抗微生物活性的多肽的SEQIDNO：2，所述核苷酸序列包含編碼具有小菌素S自身免疫活性的多肽的SEQIDNO：3，所述核苷酸序列包含編碼具有對(duì)小菌素S轉(zhuǎn)運(yùn)活性的多肽的SEQIDNO：4，以及所述核苷酸序列包含編碼具有對(duì)小菌素S轉(zhuǎn)運(yùn)活性的多肽的SEQIDNO：5；或者d)包含含有SEQIDNO：6或SEQIDNO：7的氨基酸序列的多肽的自然存在的等位基因變體，所述多肽包含具有抗微生物活性的所述氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)“抗微生物活性”應(yīng)理解為由小菌素、特別是由小菌素S引起的抗微生物活性。在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，編碼小菌素S多肽的分離的核酸分子是可用的，其中所述核酸分子：a)包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO：1、2、3、4或5或其互補(bǔ)序列中的任何一個(gè)具有至少50％以上的同一性，b)包含與包含SEQIDNO：1、2、3、4或5或其互補(bǔ)序列中任何一個(gè)核苷酸序列的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交的核酸分子；c)包含編碼包含與SEQIDNO：6或SEQIDNO：7的氨基酸序列具有至少50％以上的同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；或者d)包含編碼包含SEQIDNO：6或SEQIDNO：7的氨基酸序列的多肽的自然存在的等位基因變體的核酸分子。更具體而言，描述了分離的核酸分子，其編碼小菌素S多肽、具有小菌素S自身免疫活性的多肽或具有對(duì)小菌素S轉(zhuǎn)運(yùn)活性的多肽，其中所述核酸分子：a)包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO：1、2、3、4或5或其互補(bǔ)序列中的任何一個(gè)具有至少70％以上同一性，所述核酸分子包含編碼具有至少抗微生物活性或小菌素S自身免疫活性或小菌素S轉(zhuǎn)運(yùn)活性的多肽的SEQIDNO：1，所述核酸分子包含編碼具有抗微生物活性的多肽的SEQIDNO：2，所述核酸分子包含編碼具有小菌素S自身免疫活性的多肽的SEQIDNO：3，所述核酸分子包含編碼具有對(duì)小菌素S轉(zhuǎn)運(yùn)活性的多肽的SEQIDNO：4，以及所述核酸分子包含編碼具有對(duì)小菌素S轉(zhuǎn)運(yùn)活性的多肽的SEQIDNO：5；b)包含與包含SEQIDNO：1、2、3、4或5或其互補(bǔ)序列中任何一個(gè)核苷酸序列的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交的核酸分子，所述核酸分子包含編碼具有至少抗微生物活性或小菌素S自身免疫活性或小菌素S轉(zhuǎn)運(yùn)活性的多肽的SEQIDNO：1，所述核酸分子包含編碼具有抗微生物活性的多肽的SEQIDNO：2，所述核酸分子包含編碼具有小菌素S自身免疫活性的多肽的SEQIDNO：3，所述核酸分子包含編碼具有對(duì)小菌素S轉(zhuǎn)運(yùn)活性的多肽的SEQIDNO：4，以及所述核酸分子包含編碼具有對(duì)小菌素S轉(zhuǎn)運(yùn)活性的多肽的SEQIDNO：5；c)包含編碼包含與SEQIDNO：6或SEQIDNO：7的氨基酸序列具有至少70％以上同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有抗微生物活性；或者d)包含編碼包含SEQIDNO：6或SEQIDNO：7的氨基酸序列的多肽的自然存在的等位基因變體的核酸分子，所述多肽具有抗微生物活性。在多個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的質(zhì)粒并且涉及包含根據(jù)本發(fā)明的核酸分子和/或多肽和/或質(zhì)粒的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及選擇性結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的多肽的抗體。本發(fā)明的進(jìn)一步的方面涉及包含以下各項(xiàng)的組合物a)根據(jù)本發(fā)明的多肽；和/或b)根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞。還公開(kāi)了用于治療或預(yù)防的本發(fā)明的多肽、細(xì)胞和組合物。一方面，本發(fā)明的多肽、細(xì)胞和組合物用于治療或預(yù)防微生物感染，微生物感染優(yōu)選包括腸致病性和/或腸出血性大腸桿菌(EPEC、EHEC)的感染或者微生物感染優(yōu)選包括溶血性尿毒癥綜合征(hemolytic-uremicsyndrome，HUS)，優(yōu)選腸病性溶血性尿毒癥綜合征(enteropathichemolytic-uremicsyndrome)。另一方面，本發(fā)明的多肽、細(xì)胞和組合物用于治療胃腸疾病，優(yōu)選功能性胃腸疾病。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明的多肽、細(xì)胞和組合物用于治療腫瘤。本發(fā)明特點(diǎn)為用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，所述方法包括：使用根據(jù)本發(fā)明的核酸分子、核酸引物或探針、質(zhì)?；蛘呒?xì)胞，或者，借助溶液相或固相肽合成技術(shù)合成本發(fā)明的多肽。能夠通過(guò)所述用于產(chǎn)生多肽的方法來(lái)產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的分離的多肽。在額外的方面，提供用于鑒定對(duì)小菌素S敏感的細(xì)菌的體外方法，其中所述方法包括使用根據(jù)本發(fā)明的多肽；核酸分子、核酸引物或探針、細(xì)胞、抗體或者組合物。本發(fā)明還涉及用于保藏食物的方法，所述方法包括：向食物中加入至少一種天然抗微生物劑，其中所述試劑是a)根據(jù)本發(fā)明的多肽；b)根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞；和/或c)根據(jù)本發(fā)明的組合物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及用于涂覆敷料材料的方法，其中敷料材料用以下各項(xiàng)涂覆：a)根據(jù)本發(fā)明的多肽；和/或b)根據(jù)本發(fā)明的組合物。發(fā)明的有利效果也就是說(shuō)，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了多肽小菌素S(其為一種新的、而非之前描述的小菌素)，其核苷酸和氨基酸序列是獨(dú)特的。已經(jīng)鑒定了造成小菌素S的效果的基因并且已經(jīng)在功能上表征了它們的效果。發(fā)明人已經(jīng)令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，與大多數(shù)傳統(tǒng)β-內(nèi)酰胺抗生素相比，小菌素S表現(xiàn)出EHEC的抑制效應(yīng)，所述EHEC包括產(chǎn)生ESBL的O104：H4爆發(fā)菌株以及O128：H2和O157：H7EHEC分離株(圖5)。因此，已經(jīng)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，小菌素S在腸出血性大腸桿菌(EHEC)和腸致病性大腸桿菌(EPEC)感染的治療中是有效的。因此，小菌素S可被用作常規(guī)抗生素并且因此用于控制致病微生物的替代物。此外，用于食物保藏的用途是可能的，并且由此完成本發(fā)明。已經(jīng)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，由質(zhì)粒pSYM1(圖1)編碼的大腸桿菌G3/10小菌素S(MccS)基因簇(SEQIDNO：1)由四種成簇基因(clusteredgene)組成：mcsS(SEQIDNO：2)、mcsI(SEQIDNO：3)、mcsA(SEQIDNO：4)和mcsB(SEQIDNO：5)。因?yàn)榇竽c桿菌G3/10是用于例如胃腸疾病的治療的充分證實(shí)的益生菌，小菌素S不必從菌株中純化。有利地MccS應(yīng)當(dāng)在體內(nèi)有效。優(yōu)點(diǎn)是，小菌素S是無(wú)毒的，不會(huì)引起過(guò)敏，并且致病微生物難以對(duì)其形成抗性。根據(jù)以下詳細(xì)描述、以及根據(jù)權(quán)利要求，本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)是顯而易見(jiàn)的。附圖的簡(jiǎn)要描述圖1是編碼MccS操縱子的大質(zhì)粒(megaplasmid)pSYM1的載體圖。圖2是編碼小菌素S前體的基因mcsS的氨基酸序列的示意圖(上面板)。可能的前導(dǎo)肽用下劃線標(biāo)出。星號(hào)表示可能涉及對(duì)II類小菌素來(lái)說(shuō)典型的二硫鍵的形成的半胱氨酸(Cys)。在大質(zhì)粒pSYM1上的小菌素S基因簇MccS(下面板)由四種成簇基因組成：mcsS、mcsI、mcsA和mcsB。圖3描繪了在利用大腸桿菌菌株MDS42和G4/9(野生型)以及適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒互補(bǔ)突變體預(yù)培養(yǎng)之后EPECE2348/69進(jìn)入人類腸上皮細(xì)胞的附著效率。所使用的星號(hào)的含義：*p≤0.01。圖4描繪了在利用不同的小菌素表達(dá)和非表達(dá)菌株預(yù)培養(yǎng)之后EPECE2348/69野生型和質(zhì)粒互補(bǔ)突變體對(duì)人類腸上皮細(xì)胞的附著效率。所使用的星號(hào)的含義：*p≤0.01，**p≤0.05。pAZ8[mcsA、mcsB、mcsI]，pAZ13[mcsI]，pAZ14[mcsI，截短的]。圖5示出了在利用EcN或大腸桿菌G3/10預(yù)培養(yǎng)之后的EHEC菌株86-24血清型O157：H7(A)、在德累斯頓分離的EHECO104：H4(B)和在法蘭克福(奧得河)分離的EHECO104：H4(C)和O128：H2(D)進(jìn)入人類腸上皮細(xì)胞的附著效率。所使用的星號(hào)的含義：*p≤0.01(與陰性對(duì)照相比)。圖6說(shuō)明了使用多重PCR和作為抑制對(duì)照的基因recA的mcsS篩選的結(jié)果。序列表的簡(jiǎn)要描述SEQIDNO：1是大腸桿菌G3/10的小菌素S操縱子的核苷酸序列。SEQIDNO：2是大腸桿菌G3/10的基因mcsS的核苷酸序列。SEQIDNO：3是大腸桿菌G3/10的基因mcsI的核苷酸序列。SEQIDNO：4是大腸桿菌G3/10的基因mcsA的核苷酸序列。SEQIDNO：5是大腸桿菌G3/10的基因mcsB基因的核苷酸序列。SEQIDNO：6是包括前導(dǎo)序列的大腸桿菌G3/10的小菌素S前體多肽的氨基酸序列。SEQIDNO：7是不含前導(dǎo)肽的大腸桿菌G3/10的小菌素S多肽的氨基酸序列。SEQIDNO：8-26是用來(lái)擴(kuò)增包含在小菌素S操縱子(SEQIDNO：1)中的基因的寡核苷酸引物或者是用來(lái)篩選編碼小菌素S多肽的mcsS基因(SEQIDNO：2)的探針。發(fā)明詳述定義除非另外定義，在本文中所使用的所有技術(shù)與科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同的含義。在相抵觸的情況下，將會(huì)以本說(shuō)明書(shū)(包括定義)為準(zhǔn)。在本文中不論何時(shí)使用時(shí)，冠詞“一個(gè)”、“一種”或“所述”涉及“一個(gè)”或“若干個(gè)”，即其含義為“一個(gè)”、“至少一個(gè)”或“一個(gè)或多個(gè)”。例如，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)細(xì)胞”可以指單個(gè)細(xì)胞也可以指多個(gè)細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“包含”也包括在其中術(shù)語(yǔ)“包含”是指“由……組成”的實(shí)施方式。如在本文中所使用的，氨基酸或核酸分子“同一性(identity)”等價(jià)于氨基酸或核酸分子“同源性(homology)”。短語(yǔ)“嚴(yán)格條件”是指在探針核酸分子將會(huì)與其靶核酸分子序列(通常在核酸分子的復(fù)雜混合物中)雜交但不與其它序列雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的并且將會(huì)在不同的環(huán)境中而不同。較長(zhǎng)的序列在較高溫度特異性雜交。核酸雜交參數(shù)可以發(fā)現(xiàn)于匯編此類方法的參考文獻(xiàn)中，例如《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，J.Sambrook等人編，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989(MolecularCloning：ALaboratoryManual，J.Sambrook，etal.，eds.，SecondEdition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork，1989)，或者《分子生物學(xué)的當(dāng)前方案》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，F(xiàn).M.Ausubel等人編，JohnWiley&Sons，Inc.，紐約。一般來(lái)說(shuō)，選取嚴(yán)格條件為在限定的離子強(qiáng)度pH下比特定序列的熱熔點(diǎn)(Tm)低約5-10℃。Tm是(在限定的離子強(qiáng)度、pH、和核酸濃度下)50％的與靶互補(bǔ)的探針在平衡狀態(tài)與靶序列雜交的溫度(因?yàn)榘行蛄羞^(guò)量存在，在Tm，50％的探針在平衡狀態(tài)被占據(jù))。嚴(yán)格條件將會(huì)是這樣的，其中鹽濃度小于約1.0M鈉離子，通常約在pH7.0至8.3下0.01至1.0M鈉離子離子濃度(或其它鹽)并且溫度對(duì)于短探針(例如，10至50個(gè)核苷酸)來(lái)說(shuō)至少約30℃和對(duì)于長(zhǎng)探針(例如，大于50個(gè)核苷酸)來(lái)說(shuō)至少約60℃。還可以利用加入去穩(wěn)定劑如甲酰胺實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格條件。對(duì)于高嚴(yán)格雜交來(lái)說(shuō)，正信號(hào)是至少兩倍背景、優(yōu)選10倍背景雜交。示例性的高嚴(yán)格或嚴(yán)格雜交條件包括：50％甲酰胺，5xSSC和1％SDS在42℃培養(yǎng)或5xSSC和1％SDS在65℃培養(yǎng)，在0.2xSSC和0.1％SDS中在65℃洗滌。如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)多肽的“類似小菌素的活性”的意思是多肽發(fā)揮針對(duì)近緣物種的強(qiáng)效的抗微生物/抗菌活性。它進(jìn)一步的意思是小菌素生產(chǎn)者對(duì)它們產(chǎn)生的小菌素具有抗性，其由位于一個(gè)基因簇內(nèi)的至少一個(gè)抗性賦予基因介導(dǎo)。如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“質(zhì)粒”是指能夠在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的核酸分子并且可將另一個(gè)核酸分子與其可操作連接以導(dǎo)致附加片段的復(fù)制。能夠指導(dǎo)編碼主題多肽的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)的質(zhì)粒在本文中被稱為“表達(dá)質(zhì)粒”。如在本文中所使用的，短語(yǔ)“可操作連接”的意思是將主題核酸分子附加至質(zhì)粒上因此由核酸分子形成的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)受質(zhì)粒的控制。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)序列”意在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如，多聚腺苷化信號(hào))。在本文中，術(shù)語(yǔ)“接合型質(zhì)?！笔侵冈诮雍线^(guò)程中能夠從一個(gè)細(xì)胞向另一個(gè)細(xì)胞移動(dòng)的質(zhì)粒。如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”意圖是指用于將外源核酸(例如，DNA)引入至宿主細(xì)胞中的多種本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(lipofection)、或電穿孔。如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“益生菌”是指活微生物，其在以一定數(shù)量攝入時(shí)發(fā)揮超過(guò)本身基本營(yíng)養(yǎng)的健康益處。如在本文中所使用的，“藥物組合物”是指在本文中所描述的活性成分中的一種或多種的制劑，即根據(jù)本發(fā)明的多肽(或其藥學(xué)上可接受的鹽)或者根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞連同其它化學(xué)組分如生理學(xué)上和藥學(xué)上可接受的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進(jìn)將化合物給予生物體。在下文中，可以互換使用的短語(yǔ)“生理學(xué)上可接受的載體”和“藥學(xué)上可接受的載體”指的是不引起對(duì)生物體的顯著刺激并且不消除被給予化合物的生物學(xué)活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。包含在藥學(xué)上可接受的載體中的一種成分可以是例如聚乙二醇(PEG)，一種具有在有機(jī)介質(zhì)和水性介質(zhì)二者中的大范圍溶解度的生物相容性聚合物(Mutter等人(1979))。在本文中術(shù)語(yǔ)“賦形劑”是指加入至藥物組合物中以進(jìn)一步促進(jìn)給予活性成分的惰性物質(zhì)。賦形劑的實(shí)例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖類、多種類型的淀粉、纖維素衍生物、膠質(zhì)、植物油和聚乙二醇。如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療”是指預(yù)防、治愈、逆轉(zhuǎn)、減弱、緩解、最小化、抑制或阻止疾病過(guò)程的有害影響。如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“受試者”是指可以從本發(fā)明受益的受試者，如動(dòng)物或哺乳動(dòng)物(犬、貓、羊、豬、馬、牛、人類)，優(yōu)選人類受試者。在本文中，術(shù)語(yǔ)“功能性胃腸疾病(functionalgastrointestinaldisorder)”包括多種單獨(dú)的特發(fā)性病癥(idiopathicdisorder)，其影響胃腸道的不同的部位。多肽本發(fā)明的小菌素S多肽的特征在于其氨基酸殘基序列和新的功能特性。能夠使用在本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法分離的多肽。也就是說(shuō)，能夠通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)的適當(dāng)純化方案從細(xì)胞或組織來(lái)源中分離自然存在的或通過(guò)重組產(chǎn)生的小菌素S多肽。然而，小菌素S多肽可以自然存在于細(xì)胞中或者可以通過(guò)重組DNA技術(shù)或重組表達(dá)替代物產(chǎn)生，能夠使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)合成小菌素S多肽。在本文中，小菌素S多肽被歸類為大腸桿菌小菌素，在表現(xiàn)型上已經(jīng)將其表征并命名為小菌素S。圖2在上面板中示出了小菌素S前體的氨基酸序列。雙甘氨酸前導(dǎo)肽用下劃線標(biāo)出。星號(hào)表示可能涉及對(duì)II類小菌素來(lái)說(shuō)典型的二硫鍵的形成的半胱氨酸。氨基酸序列描繪了具有雙甘氨酸切割位點(diǎn)的富含甘氨酸的肽。在本文中所描述的方法中可以使用具有SEQIDNO：6或SEQIDNO：7的氨基酸序列的多肽或者具有SEQIDNO：6或SEQIDNO：7的氨基酸序列的生物學(xué)活性變體。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，多肽包含與SEQIDNO：6的氨基酸序列或與SEQIDNO：7的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高的同一性的氨基酸序列或者由其組成。為了確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序列的百分比同一性，出于最佳的比較目的進(jìn)行序列比對(duì)(例如，為了最佳的比對(duì)可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一個(gè)或二者中引入空位)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，多肽由包含核苷酸序列或由其組成的核酸分子編碼，所述核苷酸序列與包含SEQIDNO：1、2、3、4或5或其互補(bǔ)序列中任何一個(gè)核苷酸序列的核苷酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高的同一性。然后比較在對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上的殘基，并且當(dāng)在一個(gè)序列中的位點(diǎn)被與在另一個(gè)序列中的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)相同的殘基占據(jù)時(shí)，那么分子在所述位點(diǎn)上是相同的。因此，兩個(gè)序列之間的百分比同一性是由兩個(gè)序列共享的相同位點(diǎn)數(shù)量的函數(shù)(即，％同一性＝相同位點(diǎn)數(shù)量/總位點(diǎn)數(shù)量x100)。兩個(gè)序列之間的百分比同一性是由兩個(gè)序列共享的相同位點(diǎn)數(shù)量的函數(shù)，將空位的數(shù)量、以及每個(gè)空位的長(zhǎng)度計(jì)入，為了兩個(gè)序列的最佳的比對(duì)將它們引入。可以利用數(shù)學(xué)算法完成序列的比較和兩個(gè)序列之間的百分比同一性的測(cè)定。用于序列的比較的數(shù)學(xué)算法的非限制性實(shí)例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264的算法，如在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873中修改的。將這種算法結(jié)合至Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)中?？梢岳肗BLAST程序得分＝100、詞長(zhǎng)＝12進(jìn)行BLAST核苷酸搜索以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列?？梢岳肵BLAST程序、得分＝50、詞長(zhǎng)＝3進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得出于比較目的的空位比對(duì)(gappedalignment)，可以使用如在Altschul等人(1997)NucleicAcidsResearch25(17)：3389中描述的空位BLAST。當(dāng)使用BLAST和空位BLAST程序時(shí)，可以使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。參見(jiàn)http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列的比較的算法的另一個(gè)優(yōu)選的、非限制性實(shí)例是Myers和Miller，CABIOS(1989)的算法。將這種算法結(jié)合至ALIGN程序(版本2.0或2.OU)，其為GCG序列比對(duì)軟件包的一部分。當(dāng)使用用于比較氨基酸序列的ALIGN程序時(shí)，可以使用PAM120加權(quán)殘基表、12的空位長(zhǎng)度罰分、和4的空位罰分。用于序列分析的額外的算法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，并且包括在Torelli和Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.10：3中描述的ADVANCE和ADAM；和在Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85∶2444中描述的FASTA。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，多肽具有類似小菌素的、抗微生物、抗菌或抗腫瘤活性。多肽是細(xì)菌多肽，優(yōu)選細(xì)菌小菌素S。進(jìn)一步來(lái)說(shuō)，多肽抑制細(xì)菌附著至人類腸上皮細(xì)胞。也就是說(shuō)，應(yīng)理解的是多肽提供了針對(duì)近緣物種的抗微生物/抗菌活性而與此同時(shí)多肽不發(fā)揮針對(duì)其生產(chǎn)者(對(duì)它產(chǎn)生的小菌素具有抗性)的抗微生物/抗菌活性。因此，多肽抑制近緣細(xì)菌物種附著至人類腸上皮細(xì)胞。優(yōu)選地，多肽可獲得自大腸桿菌菌株，更優(yōu)選地，可獲得自大腸桿菌G3/10。在其它實(shí)施方式中，大腸桿菌G3/10是大腸桿菌G3/10DSM16443。進(jìn)一步優(yōu)選的是，多肽是可生物降解的。核酸分子使用“焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)”技術(shù)對(duì)益生菌大腸桿菌菌株G3/10的基因組進(jìn)行完全測(cè)序，接著自動(dòng)注釋并進(jìn)一步手動(dòng)編輯。大腸桿菌G3/10具有4935403bp基因組和六個(gè)具有在1.3kb至50kb之間大小的質(zhì)粒。被稱為pSYM1的50kb質(zhì)粒中的40kb與來(lái)自尿道致病性大腸桿菌(uropathogenicE.coli)的pMAS2027幾乎完全相同(99％同源性)(Ong，C.L.，Beatson，S.A.，McEwan，A.G&Schembri，M.A.(2009)ApplEnvironMicrobiol75，6783-6791)。其余10kb包含不具有與存儲(chǔ)在NCBI和ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)中核苷酸和氨基酸序列的同源性或僅具有低同源性的閱讀框。這些基因中的四個(gè)編碼頑完全新的、而非之前描述的大腸桿菌小菌素IIa類，包括免疫和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。已經(jīng)分離出了這種由四種成簇基因(clusteredgene)mcsS(SEQIDNO：2)、mcsI(SEQIDNO：3)、mcsA(SEQIDNO：4)和mcsB(SEQIDNO：5)組成的小菌素S基因簇(SEQIDNO：1)。在基因型上對(duì)這種小菌素表征并將其命名為小菌素S。MccS的兩個(gè)輸出基因是mcsA和mcsB(圖2)?；騧csA是大腸桿菌溶血素HlyD家族的成員并且顯示出與大腸桿菌素分泌蛋白cvaA的低同源性?；騧csB編碼具有兩個(gè)區(qū)域的跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)肽酶結(jié)構(gòu)域的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。MccS的兩個(gè)輸出基因(mcsA和mcsB)編碼負(fù)責(zé)將小菌素S從細(xì)胞、尤其是細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞外空間轉(zhuǎn)運(yùn)的多肽。可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)和在本文中所提供的序列信息來(lái)分離本發(fā)明的核酸分子，例如，具有SEQIDNO：1至5的任何一個(gè)的或SEQIDNO8至26中任何一個(gè)核苷酸序列或者它們的一部分的核酸分子。例如，使用全部或部分SEQIDNO：1至5的任何一個(gè)的或SEQIDNO8至26中的任何一個(gè)的核酸序列作為雜交探針，可以使用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)來(lái)分離小菌素S核酸分子(例如，如在Sambrook，J.等人《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989中描述的)?？梢允褂胏DNA、mRNA或可替代地基因組DNA作為模板和適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋锔鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)來(lái)擴(kuò)增本發(fā)明的核酸。在以下本文中描述了進(jìn)一步可用的引物?？梢詫⑷绱藬U(kuò)增的核酸克隆至適當(dāng)?shù)妮d體并通過(guò)DNA序列分析描述其特征。此外，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)合成的技術(shù)(例如，使用自動(dòng)DNA合成儀)制備與小菌素S核苷酸序列相對(duì)應(yīng)的寡核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸分子包含與SEQIDNO：1、2、3、4或5或其互補(bǔ)序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高的同一性的核苷酸序列或者由其組成。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸分子包含編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含與SEQIDNO：6的氨基酸序列或與SEQIDNO：7的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高的同一性的氨基酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，核酸分子編碼細(xì)菌多肽，優(yōu)選細(xì)菌小菌素S。優(yōu)選地，核酸分子可獲得自大腸桿菌菌株，更優(yōu)選地，可獲得自大腸桿菌G3/10。在具體的實(shí)施方式中，核酸分子可獲得自大腸桿菌G3/10DSM16443。核酸引物或探針由小菌素S基因的克隆測(cè)定的核苷酸序列使得能夠產(chǎn)生被設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增本發(fā)明的小菌素S基因和/或在其它物種中鑒定小菌素S基因的探針和引物。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了作為引物或探針的核酸分子，其包含在嚴(yán)格條件下與根據(jù)本發(fā)明的核酸分子雜交的序列。這種核酸引物或探針包含至少15個(gè)連續(xù)堿基的序列。核酸引物或探針通常包含基本上純化的寡核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸引物或探針與SEQIDNO：1、2、3、4或5或其互補(bǔ)序列中的任何一個(gè)或者SEQIDNO：1、2、3、4或5中的任何一個(gè)自然存在的等位基因變體或突變體的正義序列至少約12或15個(gè)、優(yōu)選約20或25個(gè)、更優(yōu)選約30、35、40、45、50、55、60、65、75、或100個(gè)連續(xù)核苷酸雜交。在一個(gè)實(shí)施方式中，核酸引物或探針在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO：1、2、3、4或5或其互補(bǔ)序列中的任何一個(gè)核苷酸序列雜交。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸引物或探針包含SEQIDNO：8至SEQIDNO：26中的至少一個(gè)。在表1中示出了典型的核酸引物或探針的序列。表1：寡核苷酸(由德國(guó)Biomers合成)使用根據(jù)本發(fā)明的核酸引物或探針以擴(kuò)增或篩選根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。因此，可以擴(kuò)增核酸分子或它們的部分，例如，通過(guò)PCR或其它在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的擴(kuò)增技術(shù)，并且可以通過(guò)在本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法對(duì)擴(kuò)增的核酸分子或它們的部分測(cè)序。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是擴(kuò)增核酸的方法，其包括核酸的變性、退火和延伸，并且在退火過(guò)程期間發(fā)生探針與靶核酸的雜交?？梢愿鶕?jù)探針與靶核酸之間的同源性程度來(lái)改變PCR的條件。當(dāng)在給定的PCR條件下提高退火溫度時(shí)，非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)量降低，然而，當(dāng)降低退火溫度時(shí)，非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)量增加。參見(jiàn)，例如J.Sambrook和DavidW.Russell：《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(2000)。在本文中所公開(kāi)的探針可以進(jìn)一步用來(lái)檢測(cè)在多種細(xì)胞類型中的本發(fā)明的核酸分子。例如，根據(jù)本發(fā)明的核酸引物或探針可以利用多重PCR來(lái)篩選根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。多重PCR使得能夠在同一反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增不同的意圖擴(kuò)增的基因。也就是說(shuō)，能夠擴(kuò)增它們各自靶序列的不同引物組被放置在一個(gè)反應(yīng)器中，并且在單一PCR反應(yīng)中同時(shí)進(jìn)行靶序列的擴(kuò)增(參見(jiàn)例如WittwerC.T.等人，實(shí)時(shí)多重PCR測(cè)定(Real-timemultiplexPCRassays).Methods(方法)25(4)：430-442，(2001)；MarkoulatosP.等人，多重PCR：在常規(guī)熱循環(huán)器中的快速DNA循環(huán)(MultiplexPCR：rapidDNAcyclinginaconventionalthermalcycler).J.Clin.Lab.Anal.17(4)：108-112，(2003)；O.Henegariu等人，多重PCR：臨界參數(shù)和分步方案(MultiplexPCR：CriticalParametersandStep-by-StepProtocol).BioTechniques(生物技術(shù))23：504-511，(1997)；以及MarkoulatosP.等人，多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：實(shí)用方法(Multiplexpolymerasechainreaction：apracticalapproach).J.Clin.Lab.Anal.16(1)：47-51，(2002))。質(zhì)粒質(zhì)粒是一種類型的載體，指的是可以將額外的DNA片段連接至其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。某些質(zhì)粒能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，它們出現(xiàn)在宿主細(xì)胞中或者被引入至宿主細(xì)胞中(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌質(zhì)粒和游離型哺乳動(dòng)物載體)。此外，某些質(zhì)粒能夠指導(dǎo)與它們可操作連接的基因的表達(dá)。在本文中此類載體被稱為“表達(dá)質(zhì)?！?。大腸桿菌G3/10具有六個(gè)具有在1.3kb至50kb之間大小的質(zhì)粒。被稱為pSYM1的50kb質(zhì)粒中的40kb(圖1)與來(lái)自尿道致病性大腸桿菌的pMAS2027幾乎完全相同(99％同源性)。其余10kb包含不具有與存儲(chǔ)在NCBI和ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)中核苷酸和氨基酸序列的同源性或僅具有低同源性的閱讀框。這些基因中的四個(gè)編碼完全新的、而非之前描述的大腸桿菌小菌素IIa類，包括免疫和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。已經(jīng)分離出了這種由四種成簇基因(clusteredgene)mcsS(SEQIDNO：2)、mcsI(SEQIDNO：3)、mcsA(SEQIDNO：4)和mcsB(SEQIDNO：5)組成的小菌素S基因簇(SEQIDNO：1)。因此，質(zhì)?？梢园景l(fā)明的核酸分子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，質(zhì)粒是表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒包含適合核酸分子在細(xì)胞中表達(dá)的形式的本發(fā)明的核酸，這意味著自然存在的或重組表達(dá)載體包含基于待用于表達(dá)的宿主細(xì)胞而選擇的一種或多種調(diào)節(jié)序列，其可操作連接至待表達(dá)的核酸序列。因此，進(jìn)一步優(yōu)選的是，質(zhì)粒的調(diào)節(jié)元件可操作連接至本發(fā)明的核酸分子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，質(zhì)粒是接合型質(zhì)粒。在表2中示出了在本文中所使用的質(zhì)粒：表2.使用的質(zhì)粒細(xì)胞細(xì)胞可以是宿主細(xì)胞，其可以是任何原核或真核細(xì)胞。例如，可以在細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌(在本文中優(yōu)選的)、昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或COS細(xì)胞)中表達(dá)小菌素S多肽。其它適合的宿主細(xì)胞對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。質(zhì)粒DNA可以自然存在于細(xì)胞中或者可以經(jīng)由常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)被引入至原核或真核細(xì)胞中?？梢栽赟ambrook等人(《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989)、以及其它實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中發(fā)現(xiàn)用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的適合的方法。因此，本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸分子、和/或權(quán)利要求1的多肽和/或本發(fā)明的質(zhì)粒的細(xì)胞?？梢詫⒑怂岱肿诱现帘景l(fā)明的細(xì)胞(主題細(xì)胞)的基因組中或，優(yōu)選整合至主題細(xì)胞中的質(zhì)粒中。優(yōu)選的是，主題細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。例如，細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞，優(yōu)選來(lái)自大腸桿菌DSM17252，最優(yōu)選大腸桿菌G3/10細(xì)胞。主題細(xì)胞還可以是重組宿主細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，主題細(xì)胞是益生菌細(xì)胞。那么，細(xì)胞具有抗微生物、抗菌、或抗腫瘤活性。應(yīng)理解的是，細(xì)胞提供了針對(duì)近緣物種的抗微生物活性而與此同時(shí)細(xì)胞不發(fā)揮針對(duì)其生產(chǎn)者(其對(duì)它產(chǎn)生的小菌素具有抗性)的抗微生物活性。因此，主題細(xì)胞抑制細(xì)菌附著至人類腸上皮細(xì)胞。將天然包含本發(fā)明的核酸、多肽或質(zhì)粒的細(xì)胞以及明確不是分離形式的細(xì)胞從本申請(qǐng)的權(quán)利要求中排除?？贵w小菌素S免疫原通常用于通過(guò)利用所述免疫原使適合的受試者(例如，兔子、山羊、小鼠或其它哺乳動(dòng)物)免疫來(lái)制備抗體。適當(dāng)免疫原性制劑可以包含，例如，自然存在的或重組表達(dá)的小菌素S多肽或者化學(xué)合成的小菌素S肽。制劑可以進(jìn)一步包含佐劑，如Freund完全或不完全佐劑，或類似的免疫刺激劑。利用免疫原性小菌素S制劑使適合的受試者免疫誘導(dǎo)了多克隆抗小菌素S抗體應(yīng)答。此類方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。因此，可以按以上所描述的通過(guò)利用小菌素S免疫原使適合的受試者免疫來(lái)制備多克隆抗小菌素S抗體。如果需要的話，可以從哺乳動(dòng)物中(例如，從血液中)分離定向針對(duì)小菌素S多肽的抗體分子并通過(guò)眾所周知的技術(shù)如蛋白A色譜法(proteinAchromatography)進(jìn)一步純化以獲得IgG級(jí)分。在免疫之后適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，例如，當(dāng)抗小菌素S抗體滴度最高時(shí)，可以從受試者獲得產(chǎn)生抗體的細(xì)胞并將其用于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備單克隆抗體，如由Kohler和Milstein(1975)Nature(《自然》)256：495-497最初描述的雜交瘤技術(shù)(還參見(jiàn)Brown等人(1981)J.Immunol127：539-46；Brown等人(1980)J.Biol.Chem.255：4980-83；Yeh等人(1976)Proc.Natl.Acad.Sci.USA76：2927-31；和Yeh等人(1982)Int.J.Cancer29：269-75)、最近的人類B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人(1983)Immunol.Today4∶72)、EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等人(1985)MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy(單克隆抗體與癌癥治療)，AlanR.Liss，Inc.，pp.77-96)或者三源雜交瘤(trioma)技術(shù)。用于產(chǎn)生單克隆抗體雜交瘤的技術(shù)是眾所周知的(一般參見(jiàn)Kenneth，R.H.于MonoclonalAntibodies：ANewDimensionInBiologicalAnalyses(《單克隆抗體：生物學(xué)分析中的新維度》)，PlenumPublishingCorp.，NewYork，NewYork(1980)；Lerner，E.A.(1981)YaleJ.Biol.Med.54：387-402；Gefter，M.L.etal.(1977)SomaticCellGenet.，3：231-36)。簡(jiǎn)而言之，將無(wú)限增殖細(xì)胞系(通常是骨髓瘤)從利用如以上所描述的小菌素S免疫原免疫的哺乳動(dòng)物融合至淋巴細(xì)胞(通常是脾細(xì)胞)中，并篩選得到的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液以鑒定產(chǎn)生特異性結(jié)合至小菌素S多肽的單克隆抗體的雜交瘤。因此，在實(shí)施方式中，也將本發(fā)明描繪成選擇性結(jié)合多肽(小菌素S多肽)的抗體。基于免疫學(xué)交叉反應(yīng)性的充分確立的原理，本發(fā)明因此構(gòu)想了SEQIDNO：6或SEQIDNO：7的多肽的抗原上相關(guān)的變體?！翱乖舷嚓P(guān)的變體”是一種多肽，其包含SEQIDNO：6或SEQIDNO：7的多肽的至少六氨基酸殘基序列部分，并且其能夠誘導(dǎo)與SEQIDNO：6或SEQIDNO：7的多肽免疫反應(yīng)的抗體分子。抗體可以是合成的、單克隆的、或多克隆的，并且可以通過(guò)在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的技術(shù)制備。組合物和藥物組合物可以將本發(fā)明的小菌素S多肽或甚至細(xì)胞結(jié)合至適用于給藥的組合物或藥物組合物中。因此，本發(fā)明構(gòu)想了包含根據(jù)本發(fā)明的多肽或根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的組合物。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物是水性組合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，組合物具有抗微生物、抗菌或抗腫瘤活性。于是，組合物抑制細(xì)菌附著至人類腸上皮細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物是益生菌組合物。優(yōu)選地，益生菌組合物包含益生菌微生物(優(yōu)選大腸桿菌DSM17252)的混合物。例如，組合物包含大腸桿菌G1/2(DSM16441)、G3/10(DSM16443)、G4/9(DSM16444)、G5(DSM16445)、G6/7(DSM16446)和G8(DSM16448)中的至少一種或它們的混合物的細(xì)胞和/或自溶物。組合物可以包含自溶物以及量為3.00x106至2.25x108細(xì)胞/1ml、優(yōu)選1.5-4.5x107細(xì)胞/1ml。優(yōu)選地，組合物包含自溶物以及大腸桿菌細(xì)菌的細(xì)胞和額外的添加劑。因此，本發(fā)明提供了包含細(xì)菌菌株大腸桿菌菌株G1/2(DSM16441)、G3/10(DSM16443)、G4/9(DSM16444)、G5(DSM16445)、G6/7(DSM16446)和G8(DSM16448)(即以上所提到的菌株中的一種或通過(guò)本發(fā)明的方法選擇的任何細(xì)菌菌株)中至少一種的益生菌組合物，其中組合物包含至少1種菌株、優(yōu)選2種至3種菌株、更優(yōu)選2種至4種菌株、甚至更優(yōu)選2種至5種菌株并且最優(yōu)選2種至6種菌株，并且其中每種菌株以0.1％至99.9％、優(yōu)選1％至99％、更優(yōu)選10％至90％的比例存在于所述組合物中。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物包含至少一種本發(fā)明的細(xì)菌菌株連同另一種菌株或菌株的混合物，其中所述混合物包含優(yōu)選2種至6種菌株、更優(yōu)選2種至4種菌株、最優(yōu)選2種至3種菌株，并且其中每種菌株以0.1％至99.9％、優(yōu)選1％至99％、更優(yōu)選10％至90％的比例存在于所述組合物中。本發(fā)明的益生菌組合物優(yōu)選是凍干形式的、冷凍形式或者甚至死亡的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，益生菌組合物包含一種或多種益生菌微生物和發(fā)揮將所述一種或多種益生菌微生物轉(zhuǎn)運(yùn)至胃腸道的功能的載體，所述載體可以包含高直鏈淀粉的淀粉類或它們的混合物形式的改性的或未改性的抗性淀粉。載體發(fā)揮作為用于胃腸道中微生物的生長(zhǎng)或維持介質(zhì)的作用，這樣使得在通過(guò)大腸或胃腸道的其它區(qū)域期間保護(hù)益生菌微生物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物可以進(jìn)一步地是藥物組合物。那么，藥物組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體。藥物組合物可以包含治療有效量的多肽或細(xì)胞以及一種或多種佐劑、賦形劑、載體、和/或稀釋劑?？山邮艿南♂寗⑤d體和賦形劑通常不對(duì)接受者的內(nèi)穩(wěn)態(tài)(例如，電解質(zhì)平衡)造成負(fù)面影響?？山邮艿妮d體包括生物相容的、惰性的或生物可吸收的鹽、緩沖劑、寡糖或多糖、聚合物、粘度增強(qiáng)劑、防腐劑等?？梢栽诶鏡EMINGTON′SPHARMACEUTICALSCIENCES(MaackPublishingCo.，Easton，Pa.)中發(fā)現(xiàn)用于藥物組合物的配制和給藥的技術(shù)的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)。添加劑的實(shí)例包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纖維素或纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸、糖精鈉、滑石、碳酸鎂等?？梢约尤胍蕴峁┫Ｍ念伾⑽兜?、穩(wěn)定性、緩沖能力、分散或其它已知的希望的特點(diǎn)的添加劑的實(shí)例是紅色氧化鐵、硅膠、月桂醇硫酸鈉、二氧化鈦、可食用白色墨水等?？梢允褂妙愃频南♂寗﹣?lái)制造壓制片劑。在實(shí)施方式中，還可以將補(bǔ)充的活性化合物結(jié)合至組合物中?？梢詫⒈景l(fā)明的藥物組合物配制為與預(yù)期的給藥途徑相容。給藥途徑的實(shí)例包括腸胃外，例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口服、經(jīng)皮(局部)、經(jīng)粘膜、和直腸的給藥。用于腸胃外、皮內(nèi)、或皮下用途的溶液或懸浮液可以包括以下組分：無(wú)菌稀釋劑如用于注射的水、鹽水溶液、非發(fā)揮性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶劑；抗菌劑如苯甲醇或?qū)αu苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖液如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和用于調(diào)節(jié)張力(tonicity)的試劑如氯化鈉或葡萄糖。可以利用酸或堿如鹽酸或氫氧化鈉來(lái)調(diào)節(jié)pH?？梢詫⒛c胃外制劑封裝在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多劑量小藥瓶中。適用于注射用途的組合物包含無(wú)菌水性溶液(其中水可溶)或分散液以及用于無(wú)菌可注射溶液或分散液的瞬時(shí)制備的無(wú)菌粉末。對(duì)于靜脈內(nèi)給藥來(lái)說(shuō)，適合的載體包括生理鹽水、抑菌水、CremophorELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況中，組合物必須是無(wú)菌的并且應(yīng)該是流體以達(dá)到存在容易的可注射性(syringeability)的程度。其在制造和儲(chǔ)存條件下必須是穩(wěn)定的并且必須抵抗微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用進(jìn)行保藏。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其包含，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液態(tài)聚乙二醇等)、和它們的適合的混合物?？梢跃S持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性，例如，通過(guò)使用卵磷脂涂層、通過(guò)在分散的情況下維持所需的粒徑、和通過(guò)使用表面活性劑?？梢酝ㄟ^(guò)多種抗菌劑和抗真菌劑實(shí)現(xiàn)微生物作用的預(yù)防，例如，對(duì)羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫汞撒等。在許多情況中，將會(huì)優(yōu)選的是在組合物中包含等滲劑，例如，糖類，多元醇如甘露醇，山梨醇，氯化鈉?？梢酝ㄟ^(guò)在組合物中包含延緩吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來(lái)產(chǎn)生可注射組合物的延長(zhǎng)吸收?？梢砸阅z囊、液體、片劑、丸劑、或延長(zhǎng)釋放制劑的形式進(jìn)行口服給藥。口服組合物一般包含惰性稀釋劑或可食用載體?？梢詫⑺鼈兎庋b在明膠膠囊中或壓制為片劑。出于口服治療給藥目的，活性化合物可以與賦形劑結(jié)合并以片劑、錠劑、或膠囊的形式使用。還可以使用流體載體制備口服組合物，其中口服施加在流體載體中的化合物并漱動(dòng)(swish)然后咳出或咽下。可以包含藥學(xué)上相容的粘結(jié)劑、和/或佐劑材料作為組合物的一部分。口服組合物可以包含任何以下成分、或類似性質(zhì)的化合物：鹽如氯化鈉或硫酸鎂(如硫酸鎂·7H2O)、氯化鉀、氯化鈣(如氯化鈣·2H2O)、氯化鎂(如氯化鎂·6H2O)，純化水，粘合劑如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖，崩解劑如海藻酸、Primogel、或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑(glidam)如膠體二氧化硅；增甜劑如蔗糖或糖精；調(diào)味劑如薄荷、水楊酸甲酯、或桔子調(diào)味劑。對(duì)于通過(guò)吸入給藥來(lái)說(shuō)，化合物以氣霧劑噴霧形式從包含適合的推進(jìn)劑(例如，氣體如二氧化碳)的加壓容器或分配器、或者噴霧器遞送。還可以通過(guò)經(jīng)粘膜或經(jīng)皮方式進(jìn)行全身給藥。對(duì)于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮給藥來(lái)說(shuō)，在制劑中使用適合于待穿透的屏障的滲透劑。此類滲透劑在本領(lǐng)域內(nèi)一般是已知的，并且包括，例如，對(duì)于經(jīng)粘膜給藥來(lái)說(shuō)，去污劑、膽汁鹽、和夫西地酸(fusidicacid)衍生物?？梢酝ㄟ^(guò)使用鼻腔噴霧或栓劑完成經(jīng)粘膜給藥。對(duì)于經(jīng)皮給藥來(lái)說(shuō)，活性化合物被配制為如在本領(lǐng)域內(nèi)一般已知的軟膏、藥膏(salve)、凝膠、或霜?jiǎng)＿€可以以用于直腸遞送的栓劑(例如，具有常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可脂和其它甘油脂)或保留灌腸劑的形式制備化合物。在一種實(shí)施方式中，活性化合物利用將會(huì)針對(duì)從身體快速消除而保護(hù)所述化合物的載體(如受控釋放制劑，包括植入物和微囊化遞送系統(tǒng))制備。可以使用可生物降解的、生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯(polyorthoester)、和聚乳酸。用于此類制劑的制備的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將會(huì)是顯而易見(jiàn)的。還可以從AlzaCorporation和NovaPharmaceuticals，Inc.商業(yè)上獲得這些材料。還可以使用脂質(zhì)體懸浮液(包括針對(duì)具有對(duì)病毒抗原的單克隆抗體的被感染的細(xì)胞的脂質(zhì)體)作為藥學(xué)上可接受的載體。可以根據(jù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)已知的方法來(lái)制備這些脂質(zhì)體懸浮液，例如，如在美國(guó)專利編號(hào)4,522,811中描述的。尤其有利的是，為了給藥方便和劑量均勻以劑量單元形式配制口服組合物。如在本文中所使用的劑量單元形式是指適合作為用于待治療的受試者的單一劑量的物理上不連續(xù)的單元；每個(gè)單元包含經(jīng)計(jì)算以產(chǎn)生希望的治療效果的預(yù)定量的活性化合物連同所需的藥物載體。對(duì)于本發(fā)明的劑量單元形式的技術(shù)規(guī)范由以下決定并直接取決于它們：活性化合物的獨(dú)特特征和將要達(dá)到的具體治療效果、和混合這種用于個(gè)體治療的活性化合物的本領(lǐng)域內(nèi)固有的限制。在替代實(shí)施方式中，組合物可以是用于表面的消毒劑。因此，在本文中也考慮了組合物的用于表面消毒的用途。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，消毒組合物進(jìn)一步包含(在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候)表面活性物質(zhì)(表面活性劑)或物質(zhì)混合物、芳香族物質(zhì)、佐劑和粘合劑。在另一個(gè)實(shí)施方式中，消毒組合物進(jìn)一步包含粘合劑并且可選地包含芳香族和著色物質(zhì)以及佐劑如用于軟化水的物質(zhì)、填料等，并且可以處于液體形式、作為片劑或處于顆粒形式。優(yōu)選地，消毒組合物是食品安全的。消毒組合物進(jìn)一步防范具有抗生素抗性的致病微生物。試劑盒還提供了在一個(gè)或多個(gè)容器中的、包含治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的組合物的試劑盒。試劑盒可以可選地包括用于實(shí)行如在本文中所公開(kāi)的預(yù)期的醫(yī)療用途或者用于實(shí)行所提供的方法的說(shuō)明書(shū)。多肽的醫(yī)療用途、細(xì)胞、組合物與試劑盒因?yàn)槎嚯?；?xì)胞和組合物顯示出抗微生物、抗菌或抗腫瘤活性，本發(fā)明進(jìn)一步涉及它們的在治療或預(yù)防中的醫(yī)療用途。具體而言，它們可以用于治療或預(yù)防微生物感染。進(jìn)一步來(lái)說(shuō)，它們用于治療和預(yù)防胃腸疾病，例如功能性胃腸疾病，在一個(gè)實(shí)施方式中，用于治療和預(yù)防腹瀉。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，微生物感染包括腸致病性和/或腸出血性大腸桿菌(EPEC、EHEC)的感染。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，微生物感染包括溶血性尿毒癥綜合征(HUS)，優(yōu)選腸病性溶血性尿毒癥綜合征。本發(fā)明是，但不限于，由EPEC或EHEC引起的疾病，但是還包括由其它造成類似腹瀉的胃腸疾病的微生物(例如，沙門(mén)菌氏屬物種(Salmonellaspec.)、志賀氏菌屬物種(Shigellaspec.)和耶爾森菌屬物種(Yersiniaspec.))引起的疾病的治療或預(yù)防。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，微生物感染包括腸出血性大腸桿菌(EHEC)感染。即腸出血性大腸桿菌O104：H4爆發(fā)菌株或?qū)π【豐敏感的任何其它EHEC。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，微生物感染包括產(chǎn)生志賀毒素的大腸桿菌感染。產(chǎn)生志賀毒素的大腸桿菌可以是腸出血性大腸桿菌。除了其它毒力因子外，志賀毒素(Stx1；Stx2；Stx1、2)是造成嚴(yán)重的、主要是血性腹瀉(bloodydiarrhea)和溶血性尿毒癥綜合征的發(fā)病的原因。利用某些抗生素治療使EHEC細(xì)胞釋放較高量的志賀毒素。因此，病人的抗生素治療經(jīng)討論是禁忌的。通過(guò)使用本發(fā)明的主題多肽；主題細(xì)胞或者組合物來(lái)治療微生物感染能夠抑制志賀毒素的產(chǎn)生。在其它實(shí)施方式中，微生物感染包括腸致病性大腸桿菌感染。在多個(gè)實(shí)施方式中，微生物感染包括產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的腸桿菌科(enterobacteriaceae)感染。優(yōu)選地，微生物感染包括產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大腸桿菌。在多個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的主題多肽；主題細(xì)胞或者組合物以1∶1000、優(yōu)選1∶500、更優(yōu)選1∶100、甚至更優(yōu)選1∶50、最優(yōu)選1∶20或甚至1∶1至1∶10的比例抑制導(dǎo)致微生物感染的微生物。在替代實(shí)施方式中，本發(fā)明的主題多肽；主題細(xì)胞；組合物或者本發(fā)明的試劑盒用于治療功能性胃腸疾病，優(yōu)選腸易激綜合征。優(yōu)選的是它們用于治療成人和兒童。在另一個(gè)替代實(shí)施方式中，多肽；細(xì)胞；組合物或試劑盒用于治療腫瘤。它們能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，即便程度不同。優(yōu)選地，小菌素S多肽可以誘導(dǎo)在人類細(xì)胞系中的細(xì)胞凋亡。例如，可以利用如在本文中所描述的給藥途徑(例如靜脈內(nèi))將根據(jù)本發(fā)明的多肽、核酸分子、細(xì)胞、或組合物應(yīng)用于受試者。多肽、核酸分子或細(xì)胞可以在腫瘤中累積。如果給予主題細(xì)胞，所述細(xì)胞可以在腫瘤中累積并產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的多肽。多肽也可以由主題核酸分子表達(dá)或者可以從組合物中釋放。小菌素S可以處于腫瘤活性啟動(dòng)子的控制之下。多肽；細(xì)胞或組合物以適用于藥物給藥的生物相容形式給予受試者。多肽；細(xì)胞；組合物或試劑盒應(yīng)該以顯著水平誘導(dǎo)在腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡，而與此同時(shí)不對(duì)正常細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生任何影響。能夠通過(guò)使用多肽；細(xì)胞；組合物或試劑盒治療的疾病或病癥的非限制性實(shí)例是普通腫瘤，特別是結(jié)腸直腸癌(colon-rectalcancer)、肝癌、膠質(zhì)瘤(glioma)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma)、口腔鱗狀細(xì)胞癌(squamocellularoralcarcinoma)、淋巴瘤(lymphoidtumor)、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胸膜和腹膜癌。在本文中所描述的一些實(shí)施方式中，可以將多肽；細(xì)胞或組合物以腸胃外形式給予受試者，例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口服、經(jīng)皮(局部)、經(jīng)粘膜、和直腸形式，優(yōu)選以口服形式?？梢詫⒍嚯?；細(xì)胞或組合物以藥學(xué)上有效量給予受試者。給予藥學(xué)上有效量的本發(fā)明的多肽；細(xì)胞或組合物被定義為在達(dá)到希望的結(jié)果所需要的劑量下和在達(dá)到希望的結(jié)果所需要的時(shí)間段內(nèi)有效的量。例如，藥學(xué)上有效量的多肽；細(xì)胞或組合物可以根據(jù)多種因素變化，如疾病狀態(tài)，個(gè)體的年齡、性別、和體重，以及多肽；細(xì)胞或組合物誘發(fā)個(gè)體希望的反應(yīng)的能力?？梢哉{(diào)整劑量方案以提供最佳的治療反應(yīng)。例如，可以每天給予若干次分開(kāi)的劑量或者可以根據(jù)治療情況的緊迫性所表明的按比例降低劑量。為了優(yōu)化治療功效，在不同的時(shí)間點(diǎn)以不同的給藥方案來(lái)給予小菌素S多肽?？梢越o予受試者單一藥學(xué)上有效的劑量或多個(gè)藥學(xué)上有效的劑量，例如，2、3、4、5、6、7、或更多。具體而言，可以一天給予受試者單一藥學(xué)上有效的劑量2、3、4、5、6、7、或更多次。具體而言，可以給予受試者5-15滴的水性組合物的劑量。更優(yōu)選地，將會(huì)給予10滴的劑量。在這種實(shí)施方式中，1ml包含約14滴。藥學(xué)上有效量(藥學(xué)上有效的劑量)的范圍從約0.001至30mg/kg體重，優(yōu)選約0.01至25mg/kg體重、更優(yōu)選約0.1至20mg/kg體重、并且甚至更優(yōu)選約1至10mg/kg、2至9mg/kg、3至8mg/kg、4至7mg/kg、或5至6mg/kg體重。給予多個(gè)劑量可以以數(shù)小時(shí)、數(shù)天、數(shù)周、或數(shù)月的間隔分開(kāi)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，將它們隨餐在水中一天給予至少一次、兩次或三次，優(yōu)選隨餐在水中一天三次?？梢钥蛇x地在限定的時(shí)間段內(nèi)和/或以限定的劑量數(shù)將它們給予受試者。例如，在一些實(shí)施方式中，可以在例如一年、六個(gè)月、一個(gè)月、或兩周內(nèi)終止對(duì)受試者的給藥(即，不提供進(jìn)一步的給藥)。例如，可以在六個(gè)月之后終止提供的給藥。在慢性疾病中，將周期增加到多達(dá)六個(gè)月可能是必需的。在一些實(shí)施方式中，可以在2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、三周、四周或更長(zhǎng)時(shí)間之后增加劑量。將要給予受試者的劑量可以增加至15-25滴、更優(yōu)選增加至20滴的水性組合物。在兒童中，可以將它們以5-15滴的水性組合物的口服形式給予。更優(yōu)選地，將會(huì)給予兒童10滴。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，將它們隨餐在水中一天給予兒童至少一次、兩次或三次，優(yōu)選隨餐在水中一天一次。在所有醫(yī)療用途實(shí)施方式中，將會(huì)將本發(fā)明的多肽；細(xì)胞；組合物或試劑盒隨餐在水中在治療開(kāi)始時(shí)給予成人10滴(一天三次)并在1周后增加至20滴，而隨餐在水中給予兒童10滴(每天一次)。用于制備小菌素S多肽的方法本發(fā)明的多肽可以是自然純化的產(chǎn)品、或化學(xué)合成過(guò)程的產(chǎn)品、或由原核或真核宿主(例如，借助在培養(yǎng)物中的細(xì)菌、酵母、高級(jí)植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生的。具體而言，可以使用本發(fā)明的細(xì)胞(如在培養(yǎng)物中的原核或真核宿主細(xì)胞)產(chǎn)生(即表達(dá))小菌素S多肽。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供用于利用本發(fā)明的細(xì)胞產(chǎn)生小菌素S多肽的方法。在本文中構(gòu)想了用于產(chǎn)生主題多肽、小菌素S的方法。這種方法包括：使用根據(jù)本發(fā)明的核酸分子、核酸引物或探針、質(zhì)粒或者細(xì)胞，或者借助溶液相或固相肽合成技術(shù)合成根據(jù)本發(fā)明的多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法包括以下步驟：i)提供包含本發(fā)明的核酸分子或本發(fā)明的質(zhì)粒的細(xì)胞，ii)在允許由所述核酸分子表達(dá)多肽的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括步驟(iii)回收產(chǎn)生的多肽。因此通過(guò)所述方法產(chǎn)生了分離的主題多肽。在一些實(shí)施方式中，小菌素S多肽是通過(guò)自然存在的細(xì)胞產(chǎn)生的或者，可替代地，通過(guò)重組DNA技術(shù)。例如，編碼小菌素S多肽的核酸分子可能已經(jīng)由質(zhì)粒編碼或者可以被插入至質(zhì)粒(例如，表達(dá)質(zhì)粒)中。利用質(zhì)粒，可以通過(guò)重組方法將核酸分子引入至細(xì)胞中。當(dāng)在細(xì)胞表達(dá)時(shí)，優(yōu)選在允許小菌素S多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。如果需要的話，可以從細(xì)胞懸浮液中回收小菌素S多肽。如在本文中所使用的，“回收”的意思是將小菌素S多肽從細(xì)胞或培養(yǎng)基(在回收過(guò)程前小菌素S多肽存在于其中)的組分中取出?；厥者^(guò)程可以包括一個(gè)或多個(gè)重折疊或純化步驟。用于誘導(dǎo)變性小菌素S多肽的折疊的緩沖液和方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知?？梢允褂迷诒绢I(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)溶液相或固相技術(shù)來(lái)合成在本發(fā)明的范圍內(nèi)的多肽(例如R.B.Merrifield(1963).″SolidPhasePeptideSynthesis.I.TheSynthesisofaTetrapeptide".(固相肽合成I，四肽的合成)J.Am.Chem.Soc.85(14)：2149-2154)。因此，可以通過(guò)使部分肽或氨基酸縮合來(lái)產(chǎn)生主題多肽。當(dāng)部分肽或氨基酸具有保護(hù)基團(tuán)時(shí)，將保護(hù)基團(tuán)分離由此產(chǎn)生了主題多肽。固相(即樹(shù)脂)合成從其α氨基基團(tuán)和側(cè)鏈官能團(tuán)已經(jīng)被適當(dāng)保護(hù)的氨基酸或肽開(kāi)始。它們?cè)跇?shù)脂上根據(jù)主題多肽的序列通過(guò)本身已知的多種縮合技術(shù)縮合。在一系列反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將肽或受保護(hù)的肽從樹(shù)脂中去除并且將保護(hù)基團(tuán)去除以獲得目標(biāo)多肽。例如，固相合成利用受保護(hù)的氨基酸從肽的羧基端末端開(kāi)始。BOC或FMOC保護(hù)基團(tuán)可以用于所有氨基基團(tuán)，即便其它保護(hù)基團(tuán)是適合的。例如，BOC-lys-OH可以與氯甲基聚苯乙烯樹(shù)脂載體酯化。聚苯乙烯樹(shù)脂載體優(yōu)選是具有0.5至2％作為交聯(lián)劑的二乙烯基苯(其使得聚苯乙烯聚合物在某些有機(jī)溶劑中完全不溶)的苯乙烯共聚物。參見(jiàn)Stewart等人，Solid-PhasePeptideSynthesis(固相肽合成)(1969)，W.H.FreemanCo.，SanFrancisco；和Merrifield，J.Am.Chem.Soc.(1963)85∶2149-2154。還通過(guò)美國(guó)專利編號(hào)3,862,925；3,842,067；3,972,859；和4,105,602舉例說(shuō)明了這些和其它肽合成的方法。可以使用手動(dòng)技術(shù)或者遵照由制造商提供的說(shuō)明手冊(cè)中提供的說(shuō)明、自動(dòng)采用例如AppliedBiosystems403A肽合成儀(FosterCity，California)或BiosearchSAMII肽合成儀(Biosearch，Inc.，SanRafael，California)。用于保藏食物的方法本發(fā)明還涉及用于保藏食物的方法，所述方法包括：向食物中加入至少一種天然抗微生物劑，其中所述劑是a)根據(jù)本發(fā)明的多肽；b)根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞；和/或c)根據(jù)本發(fā)明的組合物。因?yàn)樵谑澄飵缀蹩偸枪餐l(fā)現(xiàn)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌，在本發(fā)明的范圍內(nèi)的多肽、核酸分子、細(xì)胞或組合物表現(xiàn)出針對(duì)細(xì)菌的有效性，例如沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)或李斯特菌屬(Listeria)。更具體的細(xì)菌如鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)、其它物種的大腸桿菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、牙齦擬桿菌(Bacteroidesgingivalis)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)和其它。應(yīng)該理解的是，以足以抑制污染細(xì)菌的量加入所述劑。優(yōu)選地，將多肽、核酸分子、細(xì)胞或組合物加入至食物中以達(dá)到保護(hù)效果。在一種實(shí)施方式中，多肽、細(xì)胞或組合物不影響食物的食用。例如，它們對(duì)人和動(dòng)物是無(wú)味的且無(wú)毒的。因此，在本發(fā)明的范圍內(nèi)的多肽、核酸分子、細(xì)胞或組合物尤其適用于控制和預(yù)防由細(xì)菌病原和其它微生物腐敗生物體引起的未加工成分、加工食品和飲料的污染。它們可以與對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)或降解敏感的食物產(chǎn)品一起使用。潛在的食物相關(guān)的用途包括肉類的處理，尤其是家禽、蛋類、奶酪、乳制品、水果、源自蔬菜的產(chǎn)品、谷物和源自谷物的產(chǎn)品、罐裝食品、沙拉醬、發(fā)酵飲料和海鮮如魚(yú)、或許多其它食品。乳制品的實(shí)例包括，但不限于，奶酪、奶、奶油、和發(fā)酵乳制品如酸奶。肉類的實(shí)例包括，例如，火腿、牛肉、意大利香腸(salami)、雞肉、和火雞肉，包括整體部分或由此制成的加工肉產(chǎn)品。其它食物產(chǎn)品包括加工食物產(chǎn)品，包括速食飯菜、主菜、和肉類、熟食沙拉、蛋黃醬、調(diào)味醬(包括沙拉醬)、醬汁和佐料、意大利面、湯、食用油、魚(yú)和魚(yú)制品、蛋制品、飲料、無(wú)菌包裝食品、以及前述的混合物。其它食物相關(guān)的用途包括食物包裝和操作設(shè)備的處理。進(jìn)一步的用途包括作為食物防腐劑，如在經(jīng)過(guò)加工的奶酪、奶油、奶、乳制品中和在清潔家禽肉、魚(yú)肉、肉類或蔬菜中。本發(fā)明的多肽、核酸分子、細(xì)胞或組合物可以通過(guò)與可摻合的食物產(chǎn)品混合和/或施加在其上來(lái)使用，但是可以通過(guò)浸漬、漂洗、或噴霧來(lái)應(yīng)用于固體食物產(chǎn)品的表面，或者通過(guò)應(yīng)用于此類產(chǎn)品的內(nèi)部(例如通過(guò)注射)。他們也可以被應(yīng)用為腌泡汁、面包屑、調(diào)味涂油(seasoningrub)、蛋漿(glaze)、著色劑混合物等，或作為將與食物產(chǎn)品混合并結(jié)合的成分。在另外其它方面，通過(guò)將組合物應(yīng)用于食物包裝材料(如外罩或膜)，并此后將包裝應(yīng)用于食物表面以使組合物變?yōu)榕c食物外表面接觸，多肽、核酸分子、細(xì)胞或組合物可以間接地處于與食物表面的接觸中。待使用的最佳的量將會(huì)取決于具體的待處理的食物產(chǎn)品和用于將組合物應(yīng)用于食物和/或食物表面的方法，但是能夠通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)法測(cè)定。優(yōu)點(diǎn)是，本發(fā)明的多肽、細(xì)胞或組合物易于消化、無(wú)毒、不會(huì)引起過(guò)敏，并且致病微生物難以對(duì)其形成抗性。用于鑒定對(duì)小菌素S敏感的細(xì)菌的方法：本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于鑒定對(duì)小菌素S敏感的細(xì)菌的體外方法。在這種方法中，可以使用主題多肽；主題核酸分子、主題核酸引物或探針、主題細(xì)胞、主題抗體或主題組合物。在一種實(shí)施方式中，所述方法包括以下步驟：使引起微生物感染的致病細(xì)菌與主題多肽；主題核酸分子、主題核酸引物或探針、主題細(xì)胞、或主題組合物接觸，其中降低所述細(xì)胞對(duì)腸上皮細(xì)胞(腸細(xì)胞(enterocyte))的附著效率指示所述細(xì)胞對(duì)小菌素S的敏感性。應(yīng)理解的是，可以將小菌素S以主題多肽的形式加入至致病細(xì)菌中。然而，也可以加入主題核酸分子(小菌素S由其表達(dá))。進(jìn)一步可能的是，加入產(chǎn)生小菌素S的主題細(xì)胞。最后，可以將包含小菌素S的主題組合物加入至致病細(xì)菌中。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法包括以下步驟：提供第一組細(xì)胞；利用主題多肽；主題核酸分子、主題細(xì)胞、主題抗體或主題組合物預(yù)培養(yǎng)第一組細(xì)胞；提供第二組細(xì)胞；利用引起微生物感染的致病細(xì)菌感染第一組細(xì)胞和第二組細(xì)胞；測(cè)量第一組細(xì)胞和第二組細(xì)胞的附著效率；比較第一組細(xì)胞的附著效率與第二組細(xì)胞的附著效率，其中，當(dāng)?shù)谝唤M細(xì)胞的附著效率低于第二組細(xì)胞的附著效率時(shí)，則第一組細(xì)胞中的細(xì)胞是對(duì)小菌素S敏感的。與第二組細(xì)胞(其中，沒(méi)有以主題多肽；主題核酸分子、主題細(xì)胞或主題組合物的形式加入小菌素S)的相對(duì)應(yīng)的系統(tǒng)相比，第一組細(xì)胞的降低附著效率指示第一組細(xì)胞對(duì)小菌素S的敏感性。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，第一組細(xì)胞和第二組細(xì)胞中的細(xì)胞是人類腸上皮細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于鑒定細(xì)菌的體外方法是改進(jìn)的瓊脂擴(kuò)散測(cè)試。在第一步中，將引起微生物感染的細(xì)菌施加至培養(yǎng)平板。在第二步中，利用主題多肽；主題核酸分子、主題核酸引物或探針、主題細(xì)胞、主題抗體或主題組合物來(lái)浸漬濾紙盤(pán)。然后，將濾紙置于在培養(yǎng)平板上的瓊脂的表面上。這具有小菌素S從濾紙擴(kuò)散至瓊脂中的效果。建立濃度梯度，其中緊鄰所述盤(pán)的小菌素S的濃度是最高的，并且隨著遠(yuǎn)離所述盤(pán)而降低。如果在某些濃度下小菌素S對(duì)細(xì)菌是有效的，在瓊脂中的濃度大于或等于有效濃度處將不會(huì)有菌落生長(zhǎng)。此為抑菌區(qū)。因此，抑菌區(qū)的尺寸是化合物的有效性的量度：濾盤(pán)周圍的澄清面積越大，化合物就越有效。用于涂覆敷料材料的方法：在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是用于涂覆敷料材料的方法，其中敷料材料用以下各項(xiàng)涂覆a)根據(jù)本發(fā)明的多肽；和/或b)根據(jù)本發(fā)明的組合物。因?yàn)楸景l(fā)明的新的小菌素S多肽顯示出抗微生物效果，可以將其用于涂覆敷料材料。應(yīng)該理解的是，用于受試者群體(例如用于一度和二度燒傷的病人)的涂覆敷料是有利的。此類受試者需要防范細(xì)菌感染。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，敷料材料是抗菌敷料。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗菌敷料是貼劑或繃帶。在多個(gè)實(shí)施方式中，涂覆敷料提供了針對(duì)與燒傷創(chuàng)面有關(guān)的病原體銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的防護(hù)。實(shí)施例實(shí)施例1：細(xì)菌菌株和生長(zhǎng)條件在表3中列出了在本文中使用的細(xì)菌菌株。表3：使用的細(xì)菌菌株aDSM17252實(shí)施例2：在大腸菌的G3/10中的編碼小菌素的基因簇的鑒定對(duì)六種大腸桿菌：大腸桿菌G1/2、G3/10、G4/9、G5、G6/7和G8的基因組進(jìn)行了測(cè)序。注釋顯示沒(méi)有已知的在大腸桿菌G3/10內(nèi)的小菌素。大腸桿菌G3/10包含具有50.6kb大小的大型接合型質(zhì)粒pSYM1(圖1)。所述質(zhì)粒與尿道致病性大腸桿菌分離株的質(zhì)粒pMAS2027具有99％的同一性。此外，其包含10kb插入片段，但是BLAST分析僅顯示未表征且未命名的基因。為了鑒定殺菌作用的來(lái)源，試圖由其大質(zhì)粒pSYM1處理(cure)菌株大腸桿菌G3/10。盡管進(jìn)行了許多常見(jiàn)的處理過(guò)程，例如絲裂霉素C(mitomycinC)或熱處理，不能使菌株處理。因此，質(zhì)粒pSYM1通過(guò)接合轉(zhuǎn)移至大腸桿菌G4/9。為了允許接合體的篩選，將第一氨芐青霉素(ampicillin)抗性盒整合至pSYM1，得到pSYM1-ST76An。得到的大腸桿菌G4/9pSYM1-ST76An能夠顯著抑制EPEC附著(圖3)?？梢缘贸鼋Y(jié)論，質(zhì)粒pSYM1攜帶造成所示效果的基因。將質(zhì)粒pSYM1的4.7bp片段克隆至pBR322中，得到質(zhì)粒pAZ6，然后將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌G4/9中。pAZ6使得大腸桿菌G4/9能夠顯著地抑制EPEC附著效率(圖3)，表明pSYM1的4.7kb片段是造成大腸桿菌G3/10的EPEC附著抑制效果的原因(圖2)。自動(dòng)注釋的開(kāi)放閱讀框(ORF)的BLAST分析揭示出顯示與編碼小菌素操縱子關(guān)系的已經(jīng)表征的蛋白或蛋白家族的低同源性。然而，小菌素本身仍沒(méi)有被檢測(cè)出。將三種基因(名為mcsI、mcsA和mcsB)克隆至pBR322，得到pAZ8。將可能是編碼小菌素的基因的這種操縱子的小ORF上游(圖2)克隆至pACYC184并亞克隆至大腸桿菌G4/9pAZ8。利用此步驟，促進(jìn)了可能的小菌素和小菌素輔助蛋白的質(zhì)粒分開(kāi)的編碼。只有包含質(zhì)粒pAZ8和pAZ9的大腸桿菌G4/9顯著地抑制EPEC附著，而G4/9pAZ8影響EPEC附著類似于G4/9野生型(圖3)。命名為mcsS的小基因編碼小菌素，其被稱為小菌素S。實(shí)施例3：小菌素S的功能特征描述與解釋其自身免疫性細(xì)菌附著是許多感染性疾病的關(guān)鍵的第一步。因此，使對(duì)人類腸上皮細(xì)胞的附著的抑制量化的測(cè)試系統(tǒng)適用于證明對(duì)宿主的有益效果。在第一實(shí)驗(yàn)中，利用細(xì)菌測(cè)試菌株EcN、大腸桿菌G3/10、大腸桿菌G4/9或大腸桿菌G4/9pAZ6在大腸桿菌對(duì)宿主細(xì)胞100：1的MOI下預(yù)培養(yǎng)匯合的單層CACO-2或LOVO細(xì)胞。在溫育兩小時(shí)后，洗滌細(xì)胞并利用EPEC對(duì)宿主細(xì)胞100：1的MOI使細(xì)胞被EPECE2348/69感染。大腸桿菌G3/10和大腸桿菌G4/9pAZ6能夠抑制EPEC附著，與EcN類似。顯示EcN附著抑制取決于菌株小菌素活性。以％表示的附著效率被表述為與沒(méi)有任何預(yù)培養(yǎng)(陰性對(duì)照)的附著(其被設(shè)定為100％)相比的EPEC的附著。數(shù)據(jù)是在重復(fù)孔(duplicatewell)中至少三個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。圖4顯示在利用不同的小菌素表達(dá)菌株(大腸桿菌G3/10、G4/9pAZ6和EcN)和非表達(dá)菌株(大腸桿菌G4/9)預(yù)培養(yǎng)之后EPECE2348/69野生型和攜帶mcsI的質(zhì)?；パa(bǔ)突變體對(duì)人類腸上皮細(xì)胞的附著效率。因此，可以毫無(wú)疑問(wèn)地將mcsI確定為小菌素S自身免疫基因。實(shí)施例4：對(duì)腸出血性大腸桿菌的影響腸出血性大腸桿菌附著至腸上皮細(xì)胞。在第二實(shí)驗(yàn)中，利用細(xì)菌測(cè)試菌株在大腸桿菌對(duì)宿主細(xì)胞100∶1的感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，MOI)下預(yù)培養(yǎng)匯合的單層LOVO細(xì)胞。測(cè)試EcN和大腸桿菌G3/10的影響。在溫育兩小時(shí)后，洗滌細(xì)胞并利用EHEC對(duì)宿主細(xì)胞100∶1的MOI使細(xì)胞被EHEC感染。利用體外附著測(cè)定測(cè)試作為指示菌株的三種EHEC分離株。我們使用與HUS相關(guān)的EHEC86-24血清型O157：H7和EHECO104：H4爆發(fā)菌株的兩種不同分離株以及EHECO128：H2病人分離株。因?yàn)镋HECO104：H4分離株是ESBL生產(chǎn)者，醫(yī)學(xué)治療是受限制的。以％表示的附著效率被表述為與沒(méi)有任何預(yù)培養(yǎng)(陰性對(duì)照)的附著(其被設(shè)定為100％)相比的EHEC的附著。數(shù)據(jù)是在重復(fù)孔中三個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。EHEC附著僅由大腸桿菌G3/10抑制，這表明了來(lái)自EcN的MccM/H47和來(lái)自大腸桿菌G3/10的MccS的不同的作用機(jī)制。圖5顯示在利用EcN或大腸桿菌G3/10預(yù)培養(yǎng)之后的EHEC菌株86-24血清型O157：H7(A)、在德累斯頓分離的EHECO104：H4(B)和在法蘭克福(奧得河)分離的EHECO104：H4(C)和O128：H2(D)進(jìn)入人類腸上皮細(xì)胞的附著效率。實(shí)施例5：在多種大腸桿菌和其它腸桿菌科的小菌素S基因mccS的篩選小菌素S的序列在核苷酸和氨基酸數(shù)據(jù)庫(kù)中是未知的。利用多重PCR和作為抑制對(duì)照的基因recA，在38種大腸桿菌、2種志賀氏菌屬和2種沙門(mén)氏菌屬菌株中進(jìn)行MccS基因簇的篩選。被測(cè)試的菌株是不同來(lái)源的常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室菌株、人類臨床分離株和獸醫(yī)分離株。不能在被測(cè)試的42種人類和獸醫(yī)分離株以及實(shí)驗(yàn)室菌株中的任何一種中檢測(cè)出McsS基因。結(jié)果描述于圖6中。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3