本發(fā)明涉及一種發(fā)菜中藻藍(lán)蛋白的提取純化方法，屬于天然活性物質(zhì)制備技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

藻膽蛋白是藻類吸收、傳遞光能，進(jìn)行光合作用的重要輔助色素，其種類繁多，可以分類為藻紅蛋白(PE)、藻藍(lán)蛋白(PC)、別藻藍(lán)蛋白(APC)和藻紅藍(lán)蛋白(PEC)四種，其中PE和PC是人們研究比較多的蛋白種類。光譜學(xué)特性是藻膽蛋白的重要特征之一。經(jīng)過(guò)光譜掃描，能夠根據(jù)測(cè)定的OD值計(jì)算出藻膽蛋白的純度以及含量，為藻膽蛋白的鑒定提供重要的依據(jù)。PE在564-568nm處有最大特征吸收峰，最大熒光發(fā)射峰在575nm-580nm之間。PC在615-620nm處有最大特征吸收峰，最大熒光發(fā)射峰在635-647nm之間。

藻膽蛋白的用途極為廣泛，不僅可以作為天然色素應(yīng)用于化妝品、紡織品等工業(yè)，也可作為重要生理活性物質(zhì)應(yīng)用于保健品、藥品等醫(yī)療保健領(lǐng)域等，而且在探索光合作用的原初反應(yīng)機(jī)理方面也具有重要的研究?jī)r(jià)值，并且可以作為生物體內(nèi)的熒光示蹤物質(zhì)，應(yīng)用于臨床診斷、免疫標(biāo)記及生物醫(yī)學(xué)工程等領(lǐng)域的研究。

發(fā)菜是發(fā)狀念珠藻的簡(jiǎn)稱，隸屬藍(lán)藻門(mén)，念珠藻科，念珠藻屬，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的食用性藍(lán)藻，廣泛分布于干旱、半干旱地區(qū)。 發(fā)菜細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中向細(xì)胞外分泌大量的膠狀物質(zhì)，其主要成分為多糖。藥理試驗(yàn)研究表明，發(fā)菜多糖能阻斷病毒對(duì)寄主細(xì)胞的吸附，阻止病毒在寄主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，對(duì)流感病毒、人巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒等多種具封套的病毒均具有抗病毒作用。從藻細(xì)胞中分離得到的藻藍(lán)蛋白的最大吸收峰位于615nm，熒光發(fā)射峰位于649nm，由α和β兩個(gè)亞基組成，其分子質(zhì)量分別為18000.0和19100.0Da。

目前藻膽蛋白釋放方法的主要有溶脹法、超聲波法、反復(fù)凍融法等，蛋白的提取方法主要有鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法、結(jié)晶法、超濾法等。藻膽蛋白粗提液經(jīng)過(guò)離子交換柱層析，羥基磷灰石柱層析，凝膠過(guò)濾層析相結(jié)合的方法進(jìn)行純化。專利CN101240009A采用紅藻為原料，溶脹法提取藻膽蛋白后，經(jīng)硫酸銨沉淀后陰離子交換層析吸附并梯度洗脫制備藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白，缺點(diǎn)是由于藻膽蛋白為胞內(nèi)蛋白，采用溶脹法提取得率低且耗時(shí)。專利CN104292327A公開(kāi)了一種從螺旋藻中提取藻膽蛋白的方法，超聲法處理螺旋藻細(xì)胞懸液，破壁后上清通過(guò)不同孔徑濾膜進(jìn)行微濾和超濾，收集300KD和100KD分子段的濾液并干燥制得藻膽蛋白粉，該方法雖便捷，但制得的藻膽蛋白粗品純度底，不能滿足制備醫(yī)藥級(jí)以上高附加值產(chǎn)品的需求。專利CN101343310A采用磷酸緩沖液為提取劑，將藻細(xì)胞破碎后，經(jīng)硫酸銨分級(jí)鹽溶、鹽析、透析得到藻膽蛋白粗提物，再經(jīng)羥基磷灰石柱層析，磷酸鹽緩沖液梯度洗脫制得高純度藥品級(jí)藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白。不足在于化學(xué)試劑提取易使藻膽蛋白變性，羥基磷灰石柱填料顆粒太細(xì)，易堵塞層析柱，只能使用短小柱子純化，因而只適于實(shí)驗(yàn)室小型 規(guī)模，不易大規(guī)模操作。正由于藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，但同時(shí)其提取純化成本高，時(shí)間長(zhǎng)，產(chǎn)率底使得該類蛋白的價(jià)格一直居高不下。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種從發(fā)菜中制備高純度藻藍(lán)蛋白的分離純化方法。

本發(fā)明的方法包括以下步驟：

1、將新鮮的或干燥的發(fā)菜制成發(fā)菜粉；

2、按發(fā)菜粉和緩沖溶液以1∶5～20的質(zhì)量/體積比混合，加入的磷酸鹽緩沖液的濃度為0.02～0.2M，優(yōu)選為0.02～0.1M，pH值為6.5，加入的果膠酶的含量為10～100U/g剛毛藻粉，綜合處理使藻藍(lán)蛋白滲出得破壁液。

3、將破壁液離心取蛋白粗提液，粗提液上活性炭柱三柱串聯(lián)處理，收集柱下清液。所用活性炭為柱狀果殼活性炭，目數(shù)為20～100目，優(yōu)選為40～80目；上柱速度為0.5～1BV/h，柱下清液與上柱溶液透光率基本一致時(shí)開(kāi)始串珠處理，收集柱下在280nm有吸光度值的溶液，吸附飽和的炭柱用0.5～5％的氫氧化鈉溶液再生，再生液上柱速率1～1.5BV/h。

4、活性炭柱下清液使用20～70％的硫酸銨分兩級(jí)鹽溶、鹽析。在活性炭處理液中加入固體硫酸銨至濃度為20～35％，靜置2～3h，離心去除雜蛋白收集上清液，繼續(xù)加入硫酸銨至濃度為55～70％，靜置2～3h，離心收集沉淀。

5、沉淀使用0.01～0.2M磷酸鹽緩沖液溶解后，電滲析脫鹽處理。所用電滲析膜為截留分子量小于10KD的離子交換膜，藻藍(lán)蛋白在電滲析脫鹽過(guò)程中基本無(wú)損失。

6、脫鹽后清液用一種弱堿性陰離子樹(shù)脂上柱處理，使用0.02～0.2M磷酸鹽緩沖液分梯度洗脫分別收集藻藍(lán)蛋白溶液。使用的弱堿性陰離子樹(shù)脂為D301、D311、LS300、LS200中的任意一種。上柱速率為1～1.5BV/h，先使用pH5.0的0.01～0.1M磷酸鹽緩沖液洗脫，解吸速率為0.5～1.0BV/h，柱下收集在280nm有吸光度值的藍(lán)色溶液，得到純化的藻藍(lán)蛋白溶液。

7、藻藍(lán)蛋白溶液使用截留分子量為10～15KD的超濾膜濃縮，操作壓力0.2～0.4MPa，濃縮倍數(shù)2～4倍。濃縮后的藻藍(lán)蛋白溶液A615/A280＞3.5。

綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1、針對(duì)藻細(xì)胞中除藻藍(lán)蛋白之外雜質(zhì)較多，在進(jìn)行陰離子樹(shù)脂吸附梯度洗脫前，對(duì)蛋白粗提液進(jìn)行多次除雜操作。在進(jìn)行弱堿性陰離子樹(shù)脂吸附時(shí)，會(huì)提高樹(shù)脂的吸附容量和弱化雜質(zhì)蛋白的影響。

2、在硫酸銨鹽析沉淀前，為提高鹽析收率，使用活性炭柱串聯(lián)處理蛋白粗提液，去除了大部分多糖、色素及少部分雜質(zhì)蛋白。

3、硫酸銨鹽析后使用電滲析脫鹽處理，比之透析處理，處理效率高，使用截留分子量小于10KD的離子交換膜，藻藍(lán)蛋白在電滲析脫鹽過(guò)程中基本無(wú)損失。

4、陰離子樹(shù)脂處理后，使用不同截留分子量的超濾膜濃縮蛋白溶液，進(jìn)一步提高藻藍(lán)蛋白的濃度和純度。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的方法進(jìn)一步說(shuō)明，但并不因此而限制本發(fā)明，還應(yīng)包括：在不偏離本發(fā)明范圍條件下，對(duì)公開(kāi)的方案進(jìn)行本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)各種改變。

實(shí)施例1

1、取50g發(fā)菜干粉，按發(fā)菜粉和緩沖溶液以1∶10的質(zhì)量/體積比混合，加入500mL pH＝6.5的0.05磷酸鹽緩沖液，加入10U/g發(fā)菜粉的果膠酶，綜合處理使藻藍(lán)蛋白滲出得破壁液。

2、將破壁液離心取蛋白粗提液，粗提液上活性炭柱三柱串聯(lián)處理，收集柱下清液。所用活性炭為40～60目柱狀果殼活性炭；上柱速度為0.5BV/h，柱下清液與上柱溶液透光率基本一致時(shí)開(kāi)始串珠處理，收集柱下在280nm有吸光度值的溶液，吸附飽和的炭柱用0.5％的氫氧化鈉溶液再生，再生液上柱速率1BV/h。

3、在活性炭處理液中先加入固體硫酸銨至濃度為20％，靜置2～3h，離心去除雜蛋白收集上清液，繼續(xù)加入硫酸銨至濃度為60％，靜置2～3h，離心收集沉淀。

4、沉淀使用0.01M pH＝6.5磷酸鹽緩沖液溶解后，電滲析脫鹽處理。所用電滲析膜為截留分子量10KD的離子交換膜。

5、脫鹽后清液用一種弱堿性陰離子樹(shù)脂D311上柱處理，使用0.05M磷酸鹽緩沖液分梯度洗脫分別收集藻藍(lán)蛋白溶液。上柱速率為1.0BV/h，解吸時(shí)先使用pH5.0的0.05M磷酸鹽緩沖液洗脫，解吸速率為1.0BV/h，柱下收集在280nm有吸光度值的藍(lán)色溶液，得到純化的藻藍(lán)蛋白溶液。

6、藻藍(lán)蛋白溶液使用截留分子量為10KD的超濾膜濃縮，操作壓力0.3MPa，濃縮倍數(shù)2倍。濃縮后的藻藍(lán)蛋白溶液A615/A280＝3.6。

實(shí)施例2

1、取50g發(fā)菜干粉，按發(fā)菜粉和緩沖溶液以1∶5的質(zhì)量/體積比混合，加入250mL pH＝6.5的0.02磷酸鹽緩沖液，加入50U/g發(fā)菜粉的果膠酶，綜合處理使藻藍(lán)蛋白滲出得破壁液。

2、將破壁液離心取蛋白粗提液，粗提液上活性炭柱三柱串聯(lián)處理，收集柱下清液。所用活性炭為20～40目柱狀果殼活性炭；上柱速度為1.0BV/h，柱下清液與上柱溶液透光率基本一致時(shí)開(kāi)始串珠處理，收集柱下在280nm有吸光度值的溶液，吸附飽和的炭柱用1％的氫氧化鈉溶液再生，再生液上柱速率1BV/h。

3、在活性炭處理液中先加入固體硫酸銨至濃度為25％，靜置2～3h，離心去除雜蛋白收集上清液，繼續(xù)加入硫酸銨至濃度為70％，靜置2～3h，離心收集沉淀。

4、沉淀使用0.05M pH＝6.5磷酸鹽緩沖液溶解后，電滲析脫鹽處理。所用電滲析膜為截留分子量5KD的離子交換膜。

5、脫鹽后清液用一種弱堿性陰離子樹(shù)脂LS300上柱處理，使用0.02M磷酸鹽緩沖液分梯度洗脫分別收集藻藍(lán)蛋白溶液。上柱速率為0.75BV/h，解吸時(shí)先使用pH5.0的0.02M磷酸鹽緩沖液洗脫，解吸速率為0.5BV/h，柱下收集在280nm有吸光度值的藍(lán)色溶液，得到純化的藻藍(lán)蛋白溶液。

6、藻藍(lán)蛋白溶液使用截留分子量為15KD的超濾膜濃縮，操作壓力0.3MPa，濃縮倍數(shù)3倍。濃縮后的藻藍(lán)蛋白溶液A615/A280＝37。