本發(fā)明涉及干細胞培養(yǎng)轉化
技術領域：
，尤其涉及一種誘導間充質干細胞轉分化為皮膚干細胞的方法。
背景技術：
：脂肪間充質干細胞(Adipose-derivedstemcell，AD-MSCs)的主要來源白色脂肪(whiteadiposetissue，WAT)在體內分布廣泛，儲量豐富，是一種成體間充質干細胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)，這類間充質干細胞廣泛分布于不同的組織，如骨髓、骨骼肌、脂肪、心肌及肝臟等不同部位。研究發(fā)現MSCs具有如下特征：(1)脂肪組織中數量巨大，50ml脂肪組織可以產生大約5×105間充質干細胞，大約是骨髓中獲取干細胞數量的500倍；(2)取材安全簡便，在局麻下即可獲取大量細胞，體外擴增和自我更新能力很強；(3)可以向多種細胞系分化：脂肪、骨、軟骨、骨骼肌、平滑肌、心肌、內皮、肝細胞、造血細胞以及神經元細胞，AD-MSCs是真正意義上的具有多向分化潛能的干細胞；(4)可以分泌多種細胞因子，參與皮膚組織的修補、更新和重塑；(5)脂肪組織中AD-MSCs數量不隨供者年齡增加而減少。AD-MSCs體外擴增和自我更新能力強，原代培養(yǎng)約5-7天后，細胞融合超過90％，能較穩(wěn)定傳代20代以上。AD-MSCs具有間充質干細胞的特異性表面標記，表達大量的粘附分子：AD-MSCs持續(xù)性表達CD9、整合素β1(CD29)和α4(CD49d)、細胞間粘附分子1(ICAM-1，即CD54)、CD105、血管細胞粘附分子(VCAM，即CD106)和活化淋巴細胞粘附分子(ALCAM，即CD166)，表達I類組織相容性蛋白HLA-ABC。AD-MSCs不表達造血細胞表面標志CD14、CD15、CD33，CD34或CD45，不表達II類組織相容性抗原HLA-DR及內皮細胞標志CD31，不表達共刺激因子B7-1(CD80)、B7-2(CD86)和CD40。脂肪間充質干細胞(AD-MSCs)具有定向分化為組織修復所需要的終末分化細胞的能力，為組織修復以及構建組織工程皮膚提供充足的細胞來源。在體外將AD-MSCs定向誘導分化為表皮細胞的方法較多：研究表明用皮膚勻漿液處理AD-MSCs，單獨培養(yǎng)或與熱休克損傷的HeCat細胞共培養(yǎng)，誘導AD-MSCs向表皮細胞定向分化表達CK10、CK14、CK19，其誘導分化效率高于單純使用表皮生長因子EGF。一些試驗結果指出利用EGF以及維甲酸等成分誘導AD-MSCs分化，10天后細胞出現鋪路石改變，細胞表達CK19，向上皮細胞分化，表達上皮細胞早期的表面標記-角蛋白CK18，不再表達波形蛋白等間充質干細胞標志。另組研究人員將 AD-MSCs在角質細胞條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，發(fā)現AD-MSCs向角質形成細胞分化，表達CK5和CK14。但是總的來說，這些方法誘導轉化為皮膚細胞的效率較低、所需時間教長，細胞均一性較差。尤其是怎樣誘導高效轉分化為皮膚干細胞的關鍵問題沒有解決。AD-MSCs除了可分化為多種細胞外，還可以分泌多種細胞因子如VEGF，粒系/巨噬細胞系集落刺激因子M-CSF，基質來源因子SDF-1α，HGF，IGF-1，KGF以及bFGF。動物創(chuàng)傷模型顯示，ADSCs-CM中的TGF-β1[29]通過增加透明質酸酶HAS-1以及HAS-2表達，促進透明質酸合成；ADSCs-CM還可以上調細胞外基質I、III型膠原、纖連蛋白的mRNA水平，下調MMP-9的mRNA水平，增強HDF分泌I型膠原，刺激膠原合成和成纖維細胞遷移，在體內促進傷口愈合。局部注射AD-MSCs到糖尿病缺血模型創(chuàng)面，提高血漿和組織中VEGF的含量，明顯縮小創(chuàng)面面積，局部新生血管增加，加快愈合速度，改善創(chuàng)面愈合后質量?？傊?，AD-MSCs能夠改善皮膚組織的微環(huán)境，促進皮膚組織細胞的代謝和更新，調節(jié)細胞外基質沉積以及重塑，修復皮膚的損傷和防止皮膚的衰老。AD-MSCs在實驗室中經過長期傳代或凍存仍然保持干細胞特征，增殖分化能力和相應的免疫原性，無明顯的免疫學特性改變，但多代增殖后有衰老和變形的傾向。向免疫缺陷小鼠靜脈內注射大量的AD-MSCs小鼠存活且無副作用，也無腫瘤發(fā)生。在人體臨床試驗，單次注射1-4×109細胞，隨訪36個月無任何副作用發(fā)生，不會誘導腫瘤發(fā)生。綜上所述，AD-MSCs具有多向分化潛能，促進新生血管形成，加速創(chuàng)面愈合。治療所用的AD-MSCs可來自患者自身的脂肪，因此，有望在不引起任何免疫排斥的情況下修復受損組織和更新和激活衰老的皮膚細胞。由于AD-MSCs來源充足，易于分離，安全無致瘤性，是用于自體干細胞移植防治皮膚疾患和衰老的最佳細胞來源。技術實現要素：為了解決上述技術問題，本發(fā)明的目的是提供一種誘導人體脂肪間充質干細胞轉分化為皮膚干細胞的方法，本發(fā)明的方法解決了現有誘導干細胞轉分化技術中轉化率不高、需要時間長和轉化后皮膚干細胞數量少和純度低等問題。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現的：一種誘導間充質干細胞轉分化為皮膚干細胞的方法，其包括如下步驟：S1，快速分離和純化均質的脂肪間充質干細胞；S2，選擇多種可用于干細胞表觀遺傳調控的小RNA分子；S3，組裝和轉染核酸多肽納米粒；S4，制備誘導間充質干細胞轉分化為皮膚干細胞的培養(yǎng)基；S5，激活多種指導皮膚干細胞自我更新和轉分化的相關基因。作為優(yōu)選的技術方案，步驟S1快速分離，純化均一和無分化長期擴增脂肪間充質干細胞的方法還包括以下步驟：S11，無菌條件下，將機器抽取的細小顆粒人體脂肪組織用PBS液漂洗3次，祛除殘余的血液和組織碎片；S12，將30-60ml碎小的脂肪組織以1∶1比例與0.25％I型膠原酶溶液混合，置于ClinicMACSProtégé組織分離細胞純化機的工作管中，將工作溫度調到37℃，分離細胞純化機的旋轉速度設置為60轉/分，正反轉各轉15分鐘；S13，分離完畢，加入10％FBS低糖DMEM終止消化，接著進行1500轉/分的離心處理，處理時間為10分鐘，取沉淀的細胞顆粒，用PBS清洗2遍；S14，用含5-10％FBS，5ng/mlFGF-b，5ng/mlPDGF-BB，5ng/mlIGF-1，3ng/mlHGF，3ng/mlEGF，3ng/mlVEGF，5ng/mlIL-8，0.5ng/mlTGF-beta，1ng/mlLIF，100uMVc，100U青霉素和100mg/L鏈霉素的低糖DMEM/F12重懸；S15，以差速帖壁方法除去殘留的成纖維細胞，用地塞米松去除殘留的單核血細胞。作為優(yōu)選的技術方案，所述的步驟S2中多種可用于干細胞表觀遺傳調控的小RNA分子是指antisense-24(anti-24)和antisense-29(anti-29)分子的序列，它們的靶分子分別是人miR-24和miR-29，它們可調節(jié)多種與皮膚干細胞和其分化的下游功能細胞有關的基因，尤其是AKT和TCF3/4等。并以干粉重量的0.6∶0.4比例要求進行混合配制。所述的步驟S3組裝和轉染核酸多肽納米粒是指不同的小RNA分子與多肽轉染試劑按一定配比、程序和時間的配制過程(參見具體實施方式部分的四)，通過每天一次共二次的轉染(第一次為消化后轉染，第二次為非消化轉染)和至少4天的培養(yǎng)以達到最佳的誘導轉化效率。作為優(yōu)選的技術方案，所述的步驟S4包括如下步驟：在無血清的高糖DMEM/F12培養(yǎng)基中添加20ng/mlbFGF，20ng/mlEGF，10ng/mlIGF-1，5ng/mlKGF，50ng/mlWNT3a，10ug/mlInsulin、0.5uMRetinoicAcid、20ng/mlDelta1，0.5mMVPA，和100uMVc，以及IV型膠原纖維并形成預結合處理的培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板。作為優(yōu)選的技術方案，間充質干細胞和皮膚干細胞誘導擴增培養(yǎng)基配方可制造成不同的培養(yǎng)試劑盒，其中包括不同間充質干細胞(如骨髓間充質干細胞，脂肪間充質干細胞，臍帶間充質干細胞)增殖所需要的細胞增殖因子、細胞分化抑制劑。具體配方成分見表1。作為優(yōu)選的技術方案，所述轉分化后的皮膚干細胞培養(yǎng)是指在皮膚干細胞誘導擴增培養(yǎng)基中以1-3×105/ml的細胞密度進行培養(yǎng)至少4天。作為優(yōu)選的技術方案，所述的步驟S5中的相關基因包括Keratin5/14/15/19，Notch-1， p63，α6β4-和α3β1-integrins，ABCtransporters，c-kit/CD117，CD34，stat3，CD49f，sox9，EGFR，IGF-1/IGF-R1，WNT，Myc，TGF-β，Tcf/Lef，BMI-1，Lhx2，IKK-α，IRF6，和NFATc1等，但不局限于這些基因。與現有技術相比，本發(fā)明具有以下的有益效果：1、能夠大規(guī)模(1-3X108-9細胞)并快速(4-6天)地誘導間充質干細胞轉分化成皮膚干細胞。解決了現有誘導干細胞轉分化技術中轉化率不高、需要時間長和轉化后皮膚干細胞數量少和純度低的技術瓶徑問題。2、轉分化后的皮膚干細胞與人體中天然產生的皮膚干細胞一樣，具有自我更新能力和分化為皮膚細胞的潛能，可用于人體改善皮膚特質起到延緩皮膚衰老的作用。使用本發(fā)明的方法獲得的皮膚干細胞，可用于皮膚的燙傷和燒傷，皮膚的美容和抗衰老，以及一些皮膚病的治療和修復。本發(fā)明通過體外多次試驗研究和反復的檢測論證，證明了本發(fā)明在誘導脂肪間充質干細胞向皮膚干細胞轉分化方面有著比目前市場上同類技術更好的效果。附圖說明圖1為本發(fā)明誘導間充質干細胞轉分化為皮膚干細胞的方法的流程框圖；圖2為體外培養(yǎng)脂肪間充質干細胞5代(A)和15代(B)的伊紅染色圖和FACS分析圖(C)；圖3為脂肪間充質干細胞分化成脂肪細胞(a和b)和成骨細胞(c和d)圖；圖4為小RNAs(miR-24和miR-29)以及它們的靶基因(TCF和AKT)和反義核酸(Anti-24和Anti-29)的分子結構序列圖(A)；以及定量PCR分析下，熒光素酶相對表達水平圖(B)和基因表達水平圖(C)；圖5為脂肪間充質干細胞(AD-MSCs：A)轉染誘導后2天(由梭形細胞變成圓形細胞：B)到轉染誘導后4天(多形的皮膚干細胞：C)到轉染誘導后7天(成為扁平的皮膚細胞：D)圖；圖6為脂肪間充質干細胞能轉分化為皮膚干細胞FACS分析圖；圖7為對由AD-MSCs轉分化而來的皮膚干細胞(AD-SSCs)進行特異的標記蛋白免疫染色圖；圖8為Anti-24和Anti-29可誘導脂肪間充質干細胞(例1A-3A)轉分化成皮膚細胞圖；圖9為Anti-24和Anti-29可誘導脂肪間充質干細胞(AD-MSCs)轉分化成皮膚干細胞(AD-SSCs)定量PCR分析圖。具體實施方式下面結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細說明：如圖1所示，一種誘導間充質干細胞轉分化為皮膚干細胞的方法，其包括如下步驟：S1，快速分離和純化均質的脂肪間充質干細胞；S2，選擇多種可用于干細胞表觀遺傳調控的小RNA分子；S3，組裝和轉染核酸多肽納米粒；S4，制備誘導間充質干細胞轉分化為皮膚干細胞的培養(yǎng)基；S5，激活多種指導皮膚干細胞自我更新和轉分化的相關基因。如圖2至圖8所示，具體步驟和操作如下：一、人AD-MSC分離、純化和培養(yǎng)：hADSC分離和培養(yǎng)：由于現有的脂肪間充質干細胞的分離和培養(yǎng)方法耗時、費力、純度低、細胞易受損，本發(fā)明研制了更為省時、簡便、分離和純化效率高的技術?，F將這新技術公開，具體描述如下：1)無菌條件下將機器抽取的細小顆粒人體脂肪組織用PBS液漂洗3次，祛除殘余的血液和組織碎片；2)將30-60ml剪碎的脂肪組織與1∶1的0.15％I型膠原酶溶液，置于ClinicMACSProtégé(MiltenyiBiotec公司)組織分離細胞純化機的工作管中，將工作溫度調到37攝氏度，分離純化機的旋轉速度設置為60轉/分，正反轉各15分鐘；3)分離完畢，加入10％FBS低糖DMEM終止消化，繼而1500r/min離心10min，取沉淀的細胞顆粒，用PBS洗2遍；4)用含5-10％FBS，5ng/mlFGF-b，5ng/mlPDGF-BB，5ng/mlIGF-1，3ng/mlHGF，3ng/mlEGF，3ng/mlVEGF，5ng/mlIL-8，0.5ng/mlTGF-beta，1ng/mlLIF，100uMVc，100U青霉素和100mg/L鏈霉素的低糖DMEM/F12重懸；5)以差速帖壁方法除去殘留的成纖維細胞，用地塞米松去除殘留的單核血細胞。繼而，原代AD-MSC接種48h后大部分已貼壁，換液去除非貼壁細胞；72h后可見細胞形態(tài)改變，細胞生長有極性，融合后呈旋渦狀、河流狀。2-3代后，可獲得形態(tài)非常均一的AD-MSCs(圖2A)。20代以內細胞的形態(tài)無明顯變化(圖2B)。通常我們用3或4代的AD-MSCs作為其它實驗的細胞材料。脂肪間充質干細胞表型流式細胞(FACS)檢測：第3代AD-MSC用0.25％胰蛋白酶消化后，用含體積分數為1％小牛血清白蛋白PBS調整細胞濃度至105/ml姨酶消化后制成單細胞懸液。將細胞分裝于1.5mlEP管中，每管1ml，分別加入下列鼠抗人單克隆抗體：CD31-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC、CD33-FITC、CD44-FITC、CD73-FITC、CD90-FITC、CD29-FITC、CD166-FITC、HLA-DR-FITC、IgG1-FITC/PE作為同型陰性對照。4℃避光孵育30min，流細胞儀檢測。CD29和CD90，CD44和CD166，CD73均成陽性表達，陽性率均在95％以上。造血系 統(tǒng)、白細胞、內皮標志物及組織相容性復合物CD31和CD34，CD45和HLA--DR陰性表達(見圖2C)。二、人AD-MSC誘導分化潛能的鑒定：體外誘導AD-MSC向脂肪細胞分化：取第3代AD-MSC，待細胞達90％融合后，改用成脂肪誘導培養(yǎng)基，含高糖DMEM，8％FBS，1umol/L地塞米松，0.5mmol/LIBMX，200umol/L吲哚美辛，10ug/ml胰島素。培養(yǎng)14天后進行油紅染色鑒定脂滴。AD-MSCs經成脂誘導2周后，油紅O染色見脂滴呈紅色(圖3a和3b)，正常對照組陰性。油紅O染色法步驟：(1)細胞爬片用PBS清洗兩次，每次5min；(2)4％多聚甲醛固定15min；(3)PBS漂洗兩次，每次5min；(4)入60％異丙醇漂洗。(5)入油紅O染色15分鐘。60％異丙醇漂洗，雙蒸水漂洗2次，倒置顯微鏡下觀察。體外誘導AD-MSC向成骨細胞分化：取第3代AD-MSC，待細胞達90％融合后，改用成骨誘導基，含高糖DMEM，8％FBS，100nmol/L地塞米松、1mmol/L抗壞血酸，10mmolbeta甘油磷酸鈉。培養(yǎng)3周后進行茜素紅S染色鑒定鈣結節(jié)。茜素紅S染色法操作步驟：(1)誘導第21天，吸去成骨條件培養(yǎng)基，PBS洗滌3次；(2)茜素紅染2min；(3)蒸餾水洗5-10s；(4)分化液洗15s；(5)PBS洗滌3次，然后脫水、透明和封片，顯微鏡下觀察并拍照。AD-MSCs經成骨誘導21天后茜素紅S染色見鈣結節(jié)呈桔紅色，即茜素紅染色陽性(圖3c和3d)，正常對照組陰性。三.小RNAs序列、結構和合成：通過生物信息學技術、小RNA芯片分析和相關的預測軟件(TargetScan)，我們篩選和鑒定了2種miRNAs(見圖4A)。第一個miRNA是miRNA-24和它的反義核酸Anti-24，它們序列相對應的小RNA序列如下：miR-24，5-CUCCGGUGCCUACUGAGCUGAUAUCAGUUCUCAUUUUACACACUGGCUCAGUUCAGCAGGAACAGGAG-3Anti-24，5-GGCUGUUCCUGCUGAACUGAGCCAUU-3。第二個小RNA是miRNA-29，其序列相對應的小RNA序列如下：5-AUGACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAGAGUCAAUAUAAUUUUCUAGCACCAUCUGAAAUCGGUUAU-3。Anti-29，5-GGUAACCGAUUUCAGAUGGUGCUAUU-3。這些miRNAs都可以通過化學合成的方法獲得，為了加強穩(wěn)定性這些小RNA的組成單體可進行全部或部分不同的化學修飾，如甲氧或乙氧修飾。本發(fā)明中的小RNAs活性成分的制備方法如下：將這2種不同的核苷酸單體經RNA/DNA合成儀按特定的設計序列合成2種不同的小RNA單鏈，這些小RNA單鏈序列如上所示。合成好的小RNA單鏈再經過分離純化除去其它成分，進行化學修設形成2個特征的小RNAs。將這2種小RNA分子冷凍濃縮成干粉作為配方中 的小核酸活性成分，在低溫下保存待用。為了檢測Antisense-24和Antisense-29分別對miR-24和miR-29的活性抑制作用，將它們分別與含有TCF和AKT的3‘UTR區(qū)序列的熒光素酶質粒(pRL-TK)共轉染脂肪間充質干細胞，轉染36小時后熒光素酶活性分析結果顯示這些小RNA分子(包括miR-24和miR-29)均能有效的下調各自的靶基因TCF和AKT(見圖4B)。如果和他們的反義核酸共同轉染，定量PCR分析表明這些反義核酸ANTI-24和ANTI-29能有效的抑制他們各自的靶miR-24和miR-29，從而導致TCF和AKT的表達上調(見圖4C)。為了加強小RNA的抑制和誘導效應，我們采用了這2種小RNA的結合戰(zhàn)略，最終的小核酸活性成分是在Anti-24和Anti-29合成后根據干粉重量的0.6∶0.4比例要求加以混合配制。四、人AD-MSC轉分化為皮膚干細胞和皮膚細胞：為了提高脂肪間充質干細胞向皮膚干細胞的轉化效率，本發(fā)明這里公開了一個高效的誘導轉化技術，它的實施方案如下：1)將來源第4代的AD-MSCs培養(yǎng)到匯合度為90％，用胰酶消化，獲得離散的AD-MSCs；2)配制小核酸多肽納米顆粒：1分用DMEM配制的60％的1.2ugAnti-24和40％的0.8ugAnti-29(由上海吉瑪生物科技有限公司合成，www.genepham.com.)的混合液，與10-80份用DMEM配制的80ug穿膜多肽(購買于北京吉利奧生物技術發(fā)展有限公司，www.geno-bio.com.cn)，充分混合后置于37℃孵箱20分鐘；3)將上述小核酸多肽納米粒溶液與1-3X106AD-MSCs充分混合，以1-3×105/ml的細胞密度接種到預結合了IV型膠原的T75培養(yǎng)瓶中；4)加入本發(fā)明研制的特殊誘導擴增培養(yǎng)液中，具體配方見表1。最佳培養(yǎng)液有下述成分組成：10ng/mlbFGF，20ng/m1EGF，10ng/mlIGF-1，5ng/mlKGF，10uMInsulin、0.5uMRetinoicAcid、20ng/mlDeltal，0.5mMVPA，100ng/mlWNT3a，的無血清的高糖DMEM/F12培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)基中進行體外誘導培養(yǎng)；5)第2天再轉染一次，劑量條件與第一次相同，但不用消化和換液，為了達到最佳的誘導轉化效率。第三天開始部分細胞由梭形變成不規(guī)則形的皮膚干細胞(圖5a-c)，5-6天后用FACS和熒光免疫分析顯示皮膚干細胞的特征性抗原(圖6和圖7)。同樣以上述方法，我們可以在4-6天內高效地將1-3X108-9AD-MSCs(培養(yǎng)在康寧細胞工廠HYPERStack-12)轉化成皮膚干細胞。這種大規(guī)模和快速的轉分化是本發(fā)明第一次公開。表1.皮膚干細胞誘導擴增培養(yǎng)基配方：成分含量DMEM/F12基礎培養(yǎng)基80-100％(v/v)bFGF0-1μg/mlDelta10-1μg/mlEGF0-1μg/mlIGF0-1μg/mlKGF0-1μg/mlInsulin0-2μg/mlRetinoicAcid0-1μMVPA0-2mMLIF0-1μg/mlTGF-β0-1μg/mlWNT3a0-1μg/mlNAC1-5mM第5天開始細胞逐漸融合成鋪石路樣改變，7天后可見大片的扁平多樣的皮膚細胞(圖5和圖8)。FACS分析結果顯示，CK-5，-15和-19表達陽性，陽性率可分別高達50％，86％和60％(圖6)。AD-MSCs在含有TGFβ1、bFGF等生長因子的誘導培養(yǎng)基中進行體外誘導培養(yǎng)，AD-MSCs誘導7天后，轉錄水平上，多種角質蛋白的mRNA含量為對照組的3倍；免疫熒光結果顯示，與陰性對照組比，誘導組角質蛋白的表達增加(圖7)。結論：這些小RNA分子聯合EGF、bFGF、IGF-1、KGF，WNT3a，Delta1等生長因子可誘導人脂肪間充質干細胞在體外培養(yǎng)，條件下向表皮細胞轉分化。五、轉分化的皮膚干細胞表面標志檢測：五天后對由AD-MSC轉分化成的AD-SSCs進行0.25％胰蛋白酶消化，再用含體積分數為1％小牛血清白蛋白PBS調整細胞濃度至2X105/ml，制成單細胞懸液。將細胞分裝于1.5mlEP管中，每管1ml，分別加入下列鼠抗人單克隆抗體：CK15-FITC、CD34-FITC、CD49f-FITC、CK19-FITC、β1-integrin-FITC、CD71-FITC、IgG1-FITC/PE作為同型陰性對照。4℃避光孵育45分鐘，流細胞儀檢測。CD71，CD90，CD34，CD49f均成陽性表達，陽性率均在95％以上(見圖6)。這些結果指出AD-MSC確實轉分化成AD-SSCs，這些AD-SSCs獲得了皮膚干細胞的表型，丟失了間充質干細胞的表型。六、細胞免疫熒光法鑒定轉化AD-SSC細胞：4％多聚甲醛室溫固定20min，3％過氧化氫去離子水室溫孵育10min。0.5％TritonX-100通透20分鐘。2％BSA和10％血清室溫封閉30min，分別滴加一抗鼠抗人CK15、CK19、鼠抗人63，CD34、CD49f和β1-integrin蛋白克隆抗體，37℃2小時，PBS洗滌3遍。分別滴加含有抗熒光淬滅劑的甘油、封片。光鏡下可見誘導組細胞形態(tài)呈卵圓型，高核漿比例，細胞緊密排列，輪廓清楚，折光性好，并可在5-7天左右可形成全克隆，與皮膚干細胞典型結構相 似，抗體CK19，β1-integrin、CD34及p63染色均呈陽性(圖7B)。正常對照組AD-MSC胞形態(tài)為長梭形，與誘導組細胞形態(tài)有明顯差異，其中抗體CK19染色呈陰性，抗體CD34染陰性(圖7A)。CD166和CD73陽性表達率都高達98％以上。七、實時熒光定量PCR分析顯示誘導前后細胞角質蛋白15/19(CK15/19)、P63、β1-integrin的表達情況：實時熒光定量PCR檢測誘導后AD-MSCs轉化而來的皮膚干細胞(AD-SSCs)細胞相關基因mRNA的表達：Trizol法提取同時間組細胞總RNA。紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度。cDNA的合成操作嚴格按反轉錄試劑盒說明書進行，反轉錄反應條件為，30℃10分鐘，45℃20分鐘，99℃5分鐘，5℃5分鐘。按下述成分配制PCR反應體系：10×RNAPCR緩沖液，29；水，18.5；Taq酶，0.5；PCR上游引物和下游引物，均為1。將上述反應成分加到逆轉錄結束后的PCR反應管中，總體積為50ul/樣本，輕輕混勻，按下述條件進行PCR反應；首先95℃預變性2分鐘；然后94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒，共35個循環(huán)；最后72℃7分鐘，以B肌動蛋白為內參照，結果用2地法換算(ACt目的基因一Ct內參基因)。RT-PCR檢測顯示在實驗組AD-SSCs，轉分化的細胞都表達一些關鍵的轉錄因子和其他標志性基因如sox9，stat3，Myc，TGF-β，Tcf/Lef，BMI-1，Lhx2，IKK-α，IRF6，Keratin5/14/15/19，Notch-1，p63，α6β4-和α3β1-integrins，ABCtransporters，c-kit/CD117，CD34，CD49f，EGFR，IGF-1/IGF-R1，Wnt-R，和NFATcl。而對照組和假小RNA組均為陰性。這些結果指出AD-MSC確實轉分化成AD-SSCs，這些AD-SSCs獲得了皮膚干細胞的基因型(圖9)，丟失了間充質干細胞的基因型。進一步的，對附圖做更詳盡的說明如下：圖1為本發(fā)明誘導間充質干細胞轉分化為皮膚干細胞的方法的流程框圖；圖2.體外培養(yǎng)脂肪間充質干細胞5代(A)和15代(B)的伊紅染色。C為FACS分析，顯示這些細胞能表達間充質干細胞的表面標志，不表達造血干細胞和血管內皮細胞的表面標志。圖3.在特定的培養(yǎng)條件下，脂肪間充質干細胞能分化成脂肪細胞(a和b)和成骨細胞(c和d)。圖4.(A)小RNAs(miR-24和miR-29)以及它們的靶基因(TCF和AKT)和反義核酸(Anti-24和Anti-29)的分子結構序列。(B)定量PCR分析再不同條件下，靶基因TCF和AKT的表達水平。不同條件：對照組(Control)，假反義核酸組(Anti24m)和(Anti29m)，和真反義核酸組。圖5.脂肪間充質干細胞(AD-MSCs：A)轉染誘導后2天(由梭形細胞變成圓形細胞：B) 到轉染誘導后4天(多形的皮膚干細胞：C)到轉染誘導后7天(成為扁平的皮膚細胞：D)。圖6.在本發(fā)明研制的特殊培養(yǎng)基和誘導條件下，脂肪間充質干細胞能轉分化為皮膚干細胞，FACS分析指出這些細胞能表達皮膚干細胞的表面標志，而不表達血管內皮細胞和它們來源的脂肪間充質干細胞的表面標志。圖7.對由AD-MSCs轉分化而來的皮膚干細胞(AD-SSCs)進行特異的標記蛋白免疫染色，可見這些AD-SSCs能表達P63，CD49F，CK15和a6整合素。圖8.在上述特定的培養(yǎng)條件下，Anti-24和Anti-29可誘導脂肪間充質干細胞(例1A-3A)轉分化成皮膚細胞(例1B-3B)。圖9.定量PCR分析指出在上述特定的培養(yǎng)條件下，Anti-24和Anti-29可誘導脂肪間充質干細胞(AD-MSCs)轉分化成皮膚干細胞(AD-SSCs)，并明顯表達皮膚干細胞相關的轉錄因子和關鍵基因，而用于對照的假小RNA轉染的脂肪間充質干細胞(AD-MSCm)卻不能發(fā)生這種轉分化。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術領域：
的技術人員在本發(fā)明揭露的技術范圍內，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內。因此，本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書的保護范圍為準。當前第1頁1 2 3