本發(fā)明涉及紫甘薯多糖的提取方法及其用途，具體地說，涉及紫甘薯多糖的提取方法以及該多糖在制備抗氧化的功能性食品中的用途。

背景技術(shù)：
紫甘薯(IpomoeabatatasPoir)又稱川山紫，原產(chǎn)于美洲熱帶地區(qū)，屬于甘薯的一種，旋花科甘薯屬蔓生草本植物，生長環(huán)境范圍廣、容易栽培。紫甘薯富含各種微量元素、氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖等成分，具有抗突變和抗氧化，緩解肝功能障礙及抗腫瘤等保健功能，紫甘薯水提液具有一定的抗突變和抗氧化能力，其中多糖具有廣泛的藥理作用，如作為免疫調(diào)節(jié)劑,激活巨噬細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子生成，抗病毒、抗感染、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等，其中關(guān)于多糖抗腫瘤活性的研究主要是通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來證明的，對(duì)于其抗腫瘤的分子機(jī)制還未見報(bào)道。目前國內(nèi)外已經(jīng)進(jìn)行了大量紫甘薯色素提取研究，但對(duì)紫甘薯多糖(polysaccharidefrompurplesweetpotato,PPSP)的提取研究未見報(bào)道。OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)最初是在研究與骨相關(guān)的一些疾病如骨質(zhì)疏松癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中被發(fā)現(xiàn)的，而RANKL在破骨細(xì)胞形成和骨質(zhì)吸收中起中心作用。最近有文獻(xiàn)報(bào)道，該系統(tǒng)在導(dǎo)致乳腺癌轉(zhuǎn)移的過程中起重要作用，而RANKL是促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的重要因素之一。RANKL的生物活性主要是以三聚體的狀態(tài)存在，如果紫甘薯多糖與RANKL作用后改變了RANKL的聚集狀態(tài)就會(huì)影響RANKL與RANK的結(jié)合，從而影響OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)，進(jìn)一步影響乳腺癌轉(zhuǎn)移，有利于從分子機(jī)制上闡明紫甘薯多糖的抗腫瘤活性，為治療癌轉(zhuǎn)移和研發(fā)新藥提供可能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供紫甘薯多糖及其提取方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該紫甘薯多糖在制備抗氧化的功能性食品中的用途。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所說的紫甘薯多糖的提取，采用的提取方法包括如下步驟：1).將紫甘薯烘干粉碎成粉末，顆粒直徑為60～140目；2).將步驟1)得到的紫甘薯粉末，加入木聚糖酶，用8倍質(zhì)量于紫甘薯粉末的水懸浮，在50℃～60℃下，160～180r/min震蕩1小時(shí)，之后于75℃～80℃恒溫水浴5～15min讓酶失活，制成懸浮液Ⅰ；3).將步驟2)得到的懸浮液Ⅰ2000～4000r/min離心5～10min，取上清，向上清液中加入3倍體積的無水乙醇，0～4℃放置8小時(shí)以上，然后2000～4000r/min離心5～10min，取沉淀，將沉淀用蒸餾水制成懸浮液Ⅱ；4).向步驟3)得到的懸浮液Ⅱ中加入0.25倍體積的sevage液脫蛋白，反復(fù)洗脫3-5次，每次30min，充分振蕩，靜止30min或2000～4000r/min離心5～10min，取上層液體，即多糖水溶液Ⅰ；5).向步驟4)得到的多糖水溶液Ⅰ中加入活性炭脫色，脫色條件為振蕩20～30min，4000～6500r/min離心8～10min，脫色完成后，以不低于12000r/min的轉(zhuǎn)速離心8～10min取上清液，得到脫色后的多糖水溶液，即多糖水溶液Ⅱ；6).將步驟5)得到的多糖水溶液Ⅱ干燥，即得到紫甘薯多糖；其中，步驟4)所述的sevage液由4倍體積的氯仿和1倍體積的正丁醇混合而成。優(yōu)選地，步驟2)所述加入的木聚糖酶質(zhì)量是所述紫甘薯粉末質(zhì)量的0.6％，活力單位為1～15萬IU。優(yōu)選地，步驟5)所述的活性炭的質(zhì)量按照所述多糖水溶液Ⅰ質(zhì)量的3％加入，用前要烘干數(shù)天。優(yōu)選地，步驟5)所述的脫色為反復(fù)脫兩次至溶液清亮透徹。優(yōu)選地，在步驟6)中所述的將多糖水溶液Ⅱ干燥之前，將所述多糖水溶液Ⅱ用陰離子交換層析法純化，用濃度為0.3～2M的NaCL溶液洗脫，流速控制在1.0ml/min，洗脫完成后去除NaCL，然后再進(jìn)行所述的干燥。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述洗脫用NaCL溶液的濃度為0.3～0.8M，所述去除NaCL的方法是透析法或色譜分離法。更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述洗脫用NaCL溶液的濃度為0.5M。陰離子交換層析法優(yōu)選地采用的是Cellulose陰離子交換層析柱，所述Cellulose陰離子交換層析柱用pH7.4、50mM磷酸緩沖溶液緩沖液平衡，平衡體積約為柱床體積的3～5倍，流速為1.5ml/min；所述Cellulose陰離子交換層析柱使用前還需要預(yù)處理，依次用含有0.2M氫氧化鈉的8M尿素、含體積百分比為0.5％的tritonX-100的1M醋酸、體積百分比為70％乙醇、0.3M氫氧化鈉淋洗。優(yōu)選地，在步驟6)中所述的干燥為冷凍干燥或噴霧干燥。附圖說明圖1為PPSP的DEAECellulose陰離子交換層析圖；圖2為PPSPⅠ、PPSPⅡ、葡萄糖和Vc對(duì)羥自由基的清除率比較圖；圖3為RANKL蛋白經(jīng)His-tagNi親和層析純化后的SDS-PAGE電泳圖；圖4為經(jīng)DEAE柱純化后PPSPⅡ、PPSPⅢ、PPSPⅣ與RANKL蛋白作用的內(nèi)源熒光圖；圖5為經(jīng)DEAE柱純化后PPSPⅡ、PPSPⅢ、PPSPⅣ與RANKL蛋白作用的ANS熒光圖；圖6為PPSPⅡ與RANKL蛋白作用的內(nèi)源熒光圖譜；圖7為PPSPⅡ與RANKL蛋白作用的ANS熒光圖譜；圖8為苯酚-硫酸法測(cè)糖含量圖；圖9為考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白含量圖；圖10為紫甘薯多糖PPSPⅡ的紅外光譜圖；圖11為紫甘薯多糖PPSPⅡ分子排阻層析圖譜。具體實(shí)施方式現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1紫甘薯多糖的提取方法之一A).紫甘薯多糖的提取將紫甘薯去皮、切片、晾干、粉碎，得到紫薯粉，顆粒直徑為80目；稱量5g的紫甘薯粉末，按紫甘薯粉末質(zhì)量的0.6％加入木聚糖酶，加40mLddH2O；55℃、160r/min于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)1h，之后于75℃恒溫水浴5min讓酶失活，制成懸浮液Ⅰ；將懸浮液Ⅰ2500r/min離心6min取上清，向其中加入3倍體積的無水乙醇，4℃過夜，然后2500r/min離心6min，取沉淀，將沉淀用蒸餾水制成懸浮液Ⅱ；用氯仿和正丁醇按照體積比為4:1配制sevage溶液，加入0.25倍懸浮液Ⅱ體積的sevage液液脫蛋白，反復(fù)洗脫55次，每次30min，充分振蕩，靜置30min，取上層液體，即多糖水溶液Ⅰ；按照多糖水溶液Ⅰ質(zhì)量的3％加活性炭到多糖水溶液Ⅰ中，振蕩30min，6500r/min離心10min，反復(fù)脫兩次至溶液透徹為止，12000r/min離心10min取上清液，得到脫色后的多糖水溶液，即多糖水溶液Ⅱ；將多糖水溶液Ⅱ用冷凍干燥法干燥，即得到紫甘薯多糖0.411克，經(jīng)測(cè)定，純度為90.7％，計(jì)算得率為8.22％。產(chǎn)物多糖鑒別：苯酚-硫酸試劑反應(yīng)呈陽性。B).紫甘薯多糖抗氧化活性試驗(yàn)i).紫甘薯多糖清除羥自由基能力的測(cè)定用硫酸鐵和雙氧水產(chǎn)生羥自由基，以氧化水楊酸所得產(chǎn)物的吸光值表示羥自由基的多少。反應(yīng)液中加入不同的測(cè)試樣品200uL(質(zhì)量百分比濃度0.21％)，最后加入雙氧水啟動(dòng)反應(yīng)。測(cè)510nm處的吸光值，以(A0一A1)/A0×100％作為羥自由基的清除率，其中A0為對(duì)照，A1為含樣品的吸光值。結(jié)果見表1。表1紫甘薯多糖清除羥自由基能力組分空白對(duì)照Vc紫甘薯多糖A5100.7560.6130.716清除率(％)018.925.29由表1可知，紫甘薯多糖對(duì)羥自由基的清除率為Vc的27.96％。ii).紫甘薯多糖對(duì)鄰苯三酚自氧化的抑制作用的測(cè)定取試樣100uL(質(zhì)量百分比濃度為0.21％)，0.1mol/L的Tris-HClbuffer(pH值8.2，含4mmol/L的EDTA)1.8ml和雙蒸水1.0ml，放入同一試管中，25℃水浴保溫10min，加入同樣溫浴的3mmol/L鄰苯三酚(用10mmoL/L的HCl配制)100uL，迅速混合后每隔30s測(cè)325nm處的吸光值A(chǔ)325，得出A325隨時(shí)間變化的曲線，以回歸方程的斜率作為鄰苯三酚的自氧化速率V(△A/min)。結(jié)果見表2。抑制率(％)＝[(V對(duì)照-V樣本)/V對(duì)照]×100％表2紫甘薯多糖對(duì)鄰苯三酚自氧化的抑制作用組分對(duì)照紫甘薯多糖自氧化速率0.12030.1011抑制率(％)015.96由表2可知，實(shí)驗(yàn)提取的紫甘薯多糖對(duì)臨苯三酚的抑制效果可達(dá)到至少15.96％。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明提供的紫甘薯多糖具有顯著的抗氧化活性，可以用于制備保健藥物和保健食品。實(shí)施例2紫甘薯多糖的提取方法之二將紫甘薯去皮、切片、晾干、粉碎，得到紫薯粉，顆粒直徑為60目；稱量5g的紫甘薯粉末，按紫甘薯粉末質(zhì)量的0.6％加入木聚糖酶，加40mLddH2O；50℃、180r/min于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)1h，之后于75℃恒溫水浴8min讓酶失活，制成懸浮液Ⅰ；將懸浮液Ⅰ2000r/min離心10min取上清，向其中加入3倍體積的無水乙醇，2℃過夜，然后2000r/min離心10min，取沉淀，將沉淀用蒸餾水制成懸浮液Ⅱ；用氯仿和正丁醇按照體積比為4:1配制sevage溶液，加入0.25倍懸浮液Ⅱ體積的sevage液液脫蛋白，反復(fù)洗脫55次，每次30min，充分振蕩，2000r/min離心10min，取上層液體，即多糖水溶液Ⅰ；按照多糖水溶液Ⅰ質(zhì)量的3％加活性炭到多糖水溶液Ⅰ中，振蕩25min，5500r/min離心8min，反復(fù)脫兩次至溶液透徹為止，13000r/min離心10min取上清液，得到脫色后的多糖水溶液，即多糖水溶液Ⅱ；處理陰離子交換柱，配8M尿素和氫氧化鈉100ml打入柱內(nèi)，接著將1M醋酸100ml打入柱內(nèi)，再用70％乙醇洗，除掉色素，用0.3M氫氧化鈉40ml洗20min，蒸餾水過夜；用0.3MHCl40ml洗，蒸餾水洗過夜，用0.3M氫氧化鈉40ml洗20min，蒸餾水過夜，將適量處理好的陰離子交換Cellulose裝柱，先用pH7.450mM磷酸緩沖溶液緩沖液平衡，平衡體積約為柱床體積的3～5倍，流速為1.5ml/min；將多糖水溶液Ⅱ上樣，用0.3MNaCL溶液洗脫，流速控制在1.0ml/min；透析法去除NaCL，噴霧干燥法干燥得紫甘薯多糖0.112克，經(jīng)測(cè)定，純度為95.4％，計(jì)算得率為2.24％。多糖鑒別：苯酚-硫酸試劑反應(yīng)呈陽性。實(shí)施例3紫甘薯多糖的提取方法之三將紫甘薯去皮、切片、晾干、粉碎，得到紫薯粉，顆粒直徑為70目；稱量5g的紫甘薯粉末，按紫甘薯粉末質(zhì)量的0.6％加入木聚糖酶，加40mLddH2O；55℃、170r/min于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)1h，之后于80℃恒溫水浴5min讓酶失活，制成懸浮液Ⅰ；將懸浮液Ⅰ3000r/min離心6min取上清，向其中加入3倍體積的無水乙醇，0℃過夜，然后3000r/min離心8min，取沉淀，將沉淀用蒸餾水制成懸浮液Ⅱ；用氯仿和正丁醇按照體積比為4:1配制sevage溶液，加入0.25倍懸浮液Ⅱ體積的sevage液液脫蛋白，反復(fù)洗脫55次，每次30min，充分振蕩，4000r/min離心5min，取上層液體，即多糖水溶液Ⅰ；按照多糖水溶液Ⅰ質(zhì)量的3％加活性炭到多糖水溶液Ⅰ中，振蕩20min，6500r/min離心8min，反復(fù)脫兩次至溶液透徹為止，12500r/min離心8min取上清液，得到脫色后的多糖水溶液，即多糖水溶液Ⅱ；處理陰離子交換柱，配8M尿素和氫氧化鈉100ml打入柱內(nèi)，接著將1M醋酸100ml打入柱內(nèi)，再用70％乙醇洗，除掉色素，用0.3M氫氧化鈉40ml洗20min，蒸餾水過夜；用0.3MHCL40ml洗，蒸餾水洗過夜，用0.3M氫氧化鈉40ml洗20min，蒸餾水過夜，將適量處理好的陰離子交換Cellulose裝柱，先用pH7.4、50mM磷酸緩沖溶液緩沖液平衡，平衡體積約為柱床體積的3～5倍，流速為1.5ml/min；將多糖水溶液Ⅱ上樣，用0.5MNaCL溶液洗脫，流速控制在1.0ml/min；透析法去除NaCL，用噴霧干燥法干燥得到紫甘薯多糖0.208克，經(jīng)測(cè)定，純度為96.0％，計(jì)算得率為4.16％。多糖鑒別：苯酚-硫酸試劑反應(yīng)呈陽性。實(shí)施例4紫甘薯多糖的提取方法之四將紫甘薯去皮、切片、晾干、粉碎，得到紫薯粉，顆粒直徑為100目；稱量5g的紫甘薯粉末，按紫甘薯粉末質(zhì)量的0.6％加入木聚糖酶，加40mLddH2O；60℃、180r/min于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)1h，之后于80℃恒溫水浴8min讓酶失活，制成懸浮液Ⅰ；將懸浮液Ⅰ2500r/min離心8min取上清，向其中加入3倍體積的無水乙醇，4℃過夜，然后4000r/min離心5min，取沉淀，將沉淀用蒸餾水制成懸浮液Ⅱ；用氯仿和正丁醇按照體積比為4:1配制sevage溶液，加入0.25倍懸浮液Ⅱ體積的sevage液液脫蛋白，反復(fù)洗脫55次，每次30min，充分振蕩，3000r/min離心6min，取上層液體，即多糖水溶液Ⅰ；按照多糖水溶液Ⅰ質(zhì)量的3％加活性炭到多糖水溶液Ⅰ中，振蕩30min，5500r/min離心8min，反復(fù)脫兩次至溶液透徹為止，12000r/min離心9min取上清液，得到脫色后的多糖水溶液，即多糖水溶液Ⅱ；處理陰離子交換柱，配8M尿素和氫氧化鈉100ml打入柱內(nèi)，接著將1M醋酸100ml打入柱內(nèi)，再用70％乙醇洗，除掉色素，用0.3M氫氧化鈉40ml洗20min，蒸餾水過夜；用0.3MHCL40ml洗，蒸餾水洗過夜，用0.3M氫氧化鈉40ml洗20min，蒸餾水過夜，將適量處理好的陰離子交換Cellulose裝柱，先用pH7.4、50mM磷酸緩沖溶液緩沖液平衡，平衡體積約為柱床體積的3～5倍，流速為1.5ml/min；將多糖水溶液Ⅱ上樣，用0.8MNaCL溶液洗脫，流速控制在1.0ml/min；色譜分離法去除NaCL，用冷凍干燥法干燥得紫甘薯多糖0.295克，經(jīng)測(cè)定，純度為95.8％，計(jì)算得率為5.90％。多糖鑒別：苯酚-硫酸試劑反應(yīng)呈陽性。實(shí)施例5紫甘薯多糖的提取方法之五將紫甘薯去皮、切片、晾干、粉碎，得到紫薯粉，顆粒直徑為90目；稱量5g的紫甘薯粉末，按紫甘薯粉末質(zhì)量的0.6％加入木聚糖酶，加40mLddH2O；55℃、160r/min于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)1h，之后于80℃恒溫水浴5min讓酶失活，制成懸浮液Ⅰ；將懸浮液Ⅰ4000r/min離心5min取上清，向其中加入3倍體積的無水乙醇，2℃過夜，然后2500r/min離心10min，取沉淀，將沉淀用蒸餾水制成懸浮液Ⅱ；用氯仿和正丁醇按照體積比為4:1配制sevage溶液，加入0.25倍懸浮液Ⅱ體積的sevage液液脫蛋白，反復(fù)洗脫55次，每次30min，充分振蕩，靜止30min，取上層液體，即多糖水溶液Ⅰ；按照多糖水溶液Ⅰ質(zhì)量的3％加活性炭到多糖水溶液Ⅰ中，振蕩20min，6500r/min離心8min，反復(fù)脫兩次至溶液透徹為止，13000r/min離心10min取上清液，得到脫色后的多糖水溶液，即多糖水溶液Ⅱ；處理陰離子交換柱，配8M尿素和氫氧化鈉100ml打入柱內(nèi)，接著將1M醋酸100ml打入柱內(nèi)，再用70％乙醇洗，除掉色素，用0.3M氫氧化鈉40ml洗20min，蒸餾水過夜；用0.3MHCl40ml洗，蒸餾水洗過夜，用0.3M氫氧化鈉40ml洗20min，蒸餾水過夜，將適量處理好的陰離子交換Cellulose裝柱，先用pH7.4、50mM磷酸緩沖溶液緩沖液平衡，平衡體積約為柱床體積的3～5倍，流速為1.5ml/min；將多糖水溶液Ⅱ上樣，用2.0MNaCL溶液洗脫，流速控制在1.0ml/min；透析法去除NaCL，用噴霧干燥法干燥得紫甘薯多糖0.397克，經(jīng)測(cè)定，純度為96.3％，計(jì)算得率為7.94％。多糖鑒別：苯酚-硫酸試劑反應(yīng)呈陽性。實(shí)施例6紫甘薯多糖抗氧化活性試驗(yàn)A).紫甘薯多糖的提取和檢測(cè)1).紫甘薯多糖的提取將紫甘薯去皮、切片、晾干、粉碎，得到紫薯粉，顆粒直徑為60目；稱量5g的紫甘薯粉末，按紫甘薯粉末質(zhì)量的0.6％加入木聚糖酶，加40mLddH2O；60℃、160r/min于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)1h，之后于75℃恒溫水浴10min讓酶失活，制成懸浮液Ⅰ；將懸浮液Ⅰ3000r/min離心5min取上清，向其中加入3倍體積的無水乙醇，0℃過夜，然后4000r/min離心5min，取沉淀，將沉淀用蒸餾水制成懸浮液Ⅱ；用氯仿和正丁醇按照體積比為4:1配制sevage溶液，加入0.25倍懸浮液Ⅱ體積的sevage液液脫蛋白，反復(fù)洗脫55次，每次30min，充分振蕩，2500r/min離心8min，取上層液體，即多糖水溶液Ⅰ；按照多糖水溶液Ⅰ質(zhì)量的3％加活性炭到多糖水溶液Ⅰ中，振蕩30min，4000r/min離心10min，反復(fù)脫兩次至溶液透徹為止，13000r/min離心10min取上清液，得到脫色后的多糖水溶液，即多糖水溶液Ⅱ；處理陰離子交換柱，配8M尿素和氫氧化鈉100ml打入柱內(nèi)，接著將1M醋酸100ml打入柱內(nèi)，再用70％乙醇洗，除掉色素，用0.3M氫氧化鈉40ml洗20min，蒸餾水過夜；用0.3MHCl40ml洗，蒸餾水洗過夜，用0.3M氫氧化鈉40ml洗20min，蒸餾水過夜，將適量處理好的陰離子交換Cellulose裝柱，先用pH7.4、50mM磷酸緩沖溶液緩沖液平衡，平衡體積約為柱床體積的3～5倍，流速為1.5ml/min；將多糖水溶液Ⅱ上樣，分別用0.3M、0.5M、0.8M、2MNaCL洗脫，流速控制在1.0ml/min，每管10ml，分部收集，分別得到四個(gè)組分即：紫甘薯多糖組分Ⅰ(PPSPⅠ)、PPSPⅡ、PPSPⅢ、PPSPⅣ。2).紫甘薯多糖的檢測(cè)(見圖1)圖1為用苯酚-硫酸法檢測(cè)，以490nm處糖的吸收值為縱坐標(biāo)，洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)繪制的洗脫曲線，由圖可以看出有四個(gè)峰，與紫甘薯多糖粗提液經(jīng)DEAECellulose陰離子交換柱純化所得層析圖譜的出峰情況基本一致，主要得到四個(gè)組分，分別為PPSPⅠ、PPSPⅡ、PPSPⅢ、PPSPⅣ，依次為0.3M、0.5M、0.8M、2MNaCL洗脫。B).紫甘薯多糖抗氧化活性試驗(yàn)i).紫甘薯多糖清除羥自由基能力的測(cè)定用硫酸鐵和雙氧水產(chǎn)生羥自由基，以氧化水楊酸所得產(chǎn)物的吸光值表示羥自由基的多少。反應(yīng)液中加入不同的測(cè)試樣品200uL，最后加入雙氧水啟動(dòng)反應(yīng)。測(cè)510nm處的吸光值，以(A0一A1)/A0×100％作為羥自由基的清除率，其中A0為對(duì)照，A1為含樣品的吸光值。結(jié)果見表3。表3紫甘薯多糖清除羥自由基能力組分空白對(duì)照葡萄糖VcPPSPⅠPPSPⅡA5100.0970.0920.0070.0550.062清除率(％)05.1592.7843.3036.08其中PPSPⅢ和PPSPⅣ清除率為負(fù)值，不納入表格。PPSPⅠ、PPSPⅡ、葡萄糖和Vc對(duì)羥自由基的清除率比較見圖2由圖2可知，實(shí)驗(yàn)提取紫甘薯多糖對(duì)羥自由基的清除率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于葡萄糖，并幾乎可達(dá)到清除率相當(dāng)高的Vc的一半，紫甘薯多糖的清除率為Vc的40-50％。ii).多糖對(duì)鄰苯三酚自氧化的抑制作用的測(cè)定取試樣100uL，0.1mol/L的Tris-HClbuffer(pH值8.2，含4mmol/L的EDTA)1.8ml和雙蒸水1.0ml，放人同一試管中，25℃水浴保溫10min，加入同樣溫浴的3mmol/L鄰苯三酚(用10mmoL/L的HCl配制)100uL，迅速混合后每隔30s測(cè)325nm處的吸光值A(chǔ)325，得出A325隨時(shí)間變化的曲線，以回歸方程的斜率作為鄰苯三酚的自氧化速率V(△A/min)。結(jié)果見表4。抑制率(％)＝[(V對(duì)照-V樣本)/V對(duì)照]×100％表4紫甘薯多糖對(duì)鄰苯三酚自氧化的抑制作用組分對(duì)照PPSPⅠPPSPⅡPPSPⅢPPSPⅣ自氧化速率0.00590.00350.00140.00220.0034抑制率(％)040.6876.2762.7142.37由表4可知，實(shí)驗(yàn)提取的紫甘薯多糖對(duì)臨苯三酚的抑制效果可達(dá)到至少40％。實(shí)施例7紫甘薯多糖潛在的抗腫瘤效能試驗(yàn)A).紫甘薯多糖的提取將紫甘薯去皮、切片、晾干、粉碎，得到紫薯粉，顆粒直徑為80目；稱量5g的紫甘薯粉末，按紫甘薯粉末質(zhì)量的0.6％加入木聚糖酶，加40mLddH2O；55℃、180r/min于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)1h，之后于80℃恒溫水浴5min讓酶失活，制成懸浮液Ⅰ；將懸浮液Ⅰ4000r/min離心6min取上清，向其中加入3倍體積的無水乙醇，4℃過夜，然后3000r/min離心5min，取沉淀，將沉淀用蒸餾水制成懸浮液Ⅱ；用氯仿和正丁醇按照體積比為4:1配制sevage溶液，加入0.25倍懸浮液Ⅱ體積的sevage液液脫蛋白，反復(fù)洗脫55次，每次30min，充分振蕩，4000r/min離心6min，取上層液體，即多糖水溶液Ⅰ；按照多糖水溶液Ⅰ質(zhì)量的3％加活性炭到多糖水溶液Ⅰ中，振蕩30min，4500r/min離心9min，反復(fù)脫兩次至溶液透徹為止，12000r/min離心10min取上清液，得到脫色后的多糖水溶液，即多糖水溶液Ⅱ；處理陰離子交換柱，配8M尿素和氫氧化鈉100ml打入柱內(nèi)，接著將1M醋酸100ml打入柱內(nèi)，再用70％乙醇洗，除掉色素，用0.3M氫氧化鈉40ml洗20min，蒸餾水過夜；用0.3MHCl40ml洗，蒸餾水洗過夜，用0.3M氫氧化鈉40ml洗20min，蒸餾水過夜，將適量處理好的陰離子交換Cellulose裝柱，先用pH7.450mM磷酸緩沖溶液緩沖液平衡，平衡體積約為柱床體積的3～5倍，流速為1.5ml/min；將多糖水溶液Ⅱ上樣，分別用0.3M、0.5M、0.8M、2MNaCL洗脫，流速控制在1.0ml/min，每管10ml，分部收集，分別得到四個(gè)組分即：紫甘薯多糖組分Ⅰ(PPSPⅠ)、PPSPⅡ、PPSPⅢ、PPSPⅣ。B).細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(RANKL)蛋白的提取與分離純化1).活化菌種向6mlLB液體培養(yǎng)基中加入6μl50mg/ml氨芐霉素(工作濃度為50μg/ml)，再接入100μl表達(dá)菌種，于37℃搖床振蕩培養(yǎng)8-12小時(shí)。2).擴(kuò)大培養(yǎng)向300mlLB液體培養(yǎng)基中加入300μl50mg/ml氨芐霉素(工作濃度為50μg/ml)，再加入6ml活化的菌液，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)。3).IPTG誘導(dǎo)加入IPTG(終濃度20mM)16℃160r/min過夜誘導(dǎo)。4).蛋白質(zhì)提取將菌液置于離心管4℃，5000r/m離心10min；棄上清液，向沉淀中加入蒸餾水，用漩渦混合器混勻；4℃，5000r/m離心10min；棄上清，向沉淀中加入裂解液，用漩渦混合器混勻；在冰上進(jìn)行10min(工作時(shí)間為2s，間隔為3s)的超聲波破壁，一共三次，每兩次間間隔5min；4℃，12000rpm，離心10min，取上清，得到RANKL的粗提液。5).蛋白質(zhì)純化上樣：插A280濾光片，調(diào)T值(100)、A值(0)；打開采集器；打開電腦蛋白核酸檢測(cè)系統(tǒng)，保存文檔并開始采集。將粗提液45ml上柱，流速控制約為1ml/min。洗脫：上樣完后，繼續(xù)用PBS緩沖液(pH＝7.4)淋洗。待雜蛋白峰回落走平之后開始用不同梯度的咪唑(40mM、80mM、150mM、200mM)洗脫。在280nm處進(jìn)行連續(xù)紫外檢測(cè)，根據(jù)微電腦記錄儀顯示曲線。分別收集峰值的洗脫液根據(jù)波峰對(duì)每管收集蛋白測(cè)活并留樣、電泳檢測(cè)純化程度。6).SDS-PAGE電泳檢測(cè)(見圖3)由圖3知，第1孔為實(shí)驗(yàn)組上清，可以明顯看到有一強(qiáng)帶，為目標(biāo)蛋白；第2孔中的穿流液為大量除目標(biāo)蛋白以外的雜蛋白，強(qiáng)帶所在的條線上，穿流比粗提液要淺一些，其余條帶顏色的深淺基本上一致；第3至5孔為洗脫液，洗脫之后雜帶大部分消失，目標(biāo)蛋白的強(qiáng)帶顏色較雜帶更深。相比之下，40mM咪唑只洗脫下少量的目標(biāo)蛋白，80mM咪唑洗脫的蛋白較純，雖有少量雜帶，但還是目標(biāo)蛋白為主帶，可用，150mM咪唑雖然洗脫下大量目標(biāo)蛋白，但是雜帶也很強(qiáng)，不可用。C).紫甘薯多糖抗?jié)撛诘目鼓[瘤能力試驗(yàn)i).三個(gè)組分與RANKL蛋白作用的內(nèi)源和外源熒光比較(見圖4、圖5)由圖4和圖5可以看出，PPSPⅡ、PPSPⅢ、PPSPⅣ三個(gè)組分相比，PPSPⅡ在內(nèi)源和外源熒光中都對(duì)RANKL蛋白作用更明顯一些，在內(nèi)源圖中，PPSPⅡ作用于RANKL蛋白后遞減的趨勢(shì)最強(qiáng)，表明其對(duì)RANKL蛋白的結(jié)構(gòu)影響最強(qiáng)烈。在外源圖中，PPSPⅡ的遞增趨勢(shì)也是最明顯的，說明其對(duì)RANKL蛋白疏水面的影響最大，因此，本實(shí)驗(yàn)采用PPSPⅡ來進(jìn)一步研究其對(duì)RANKL蛋白的作用。ii).PPSPⅡ與RANKL蛋白作用的內(nèi)源熒光測(cè)定結(jié)果(見圖6)圖6表明隨著PPSPⅡ濃度的增加，反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度呈遞減趨勢(shì)，表明多糖與RANKL作用后對(duì)RANKL的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響。iii).PPSPⅡ與RANKL蛋白作用的ANS熒光測(cè)定結(jié)果(見圖7)圖7顯示，隨著PPSPⅡ濃度的增加，反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度呈遞增的趨勢(shì)，表明RANKL蛋白疏水面變大，推測(cè)可能是多糖與RANKL作用后改變了其單體的構(gòu)象，使其疏水面變大，也有可能是多糖與RANKL作用后使其三聚體的狀態(tài)發(fā)生了改變，解聚成二聚體或單體。D).紫甘薯多糖PPSPⅡ的結(jié)構(gòu)分析i).苯酚-硫酸法測(cè)糖含量(見圖8)ii).考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白含量(見圖9)由圖8和圖9表明：①PPSPⅡ中糖的含量為:10*(0.11-0.0022)/0.5445＝1.9798(mg/ml)；②PPSPⅡ中蛋白含量：20*(0.023-0.0161)/0.0108＝12.7778(μg/ml)＝0.0127778(mg/ml)；③PPSPⅡ中糖與蛋白的比例為：1.9798/0.0127778＝155，說明此組分中主要含糖，蛋白的含量很少，可能不是一種糖蛋白。iii).紫甘薯多糖PPSPⅡ的紅外光譜分析(見圖10)由圖10分析知：842.6cm-1處的峰表明PPSPⅡ?yàn)閍-D-葡萄吡喃糖(855～833)；951.9cm-1處的吸收峰表示PPSPⅡ?yàn)檫拎?930～960)；在1108.6cm-1附近有環(huán)內(nèi)醚C-O伸縮振動(dòng)(1150～1080)；在1400～1200cm-1所看到的吸收峰為C-H的變角振動(dòng)；在1464.6cm-1處存在次甲基C-H變角振動(dòng)(1465)；1643.1cm-1附近有N-H變角振動(dòng)(1650～1500)，無C＝O伸縮振動(dòng)(1740～1680)；在3434.7cm-1附近有O-H伸縮振動(dòng)的強(qiáng)吸收峰(3700～3100)。iv).紫甘薯多糖PPSPⅡ分子排阻層析圖譜分析(AKTApurifier)(見圖11)圖11結(jié)果表明，多糖沒有特征吸收峰，根據(jù)purifier圖譜基本判斷PPSPⅡ?yàn)檩^均一組分，糖苷鏈中存在著氨基酸。