本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelialcells,E)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes,A)及神經(jīng)元(neurons,N)所形成的原代同源三細(xì)胞四維模型為基礎(chǔ)的腦與脊髓急性缺血/再灌注損傷細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：
腦與脊髓急性缺血性卒中具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率以及高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)，是嚴(yán)重危害人類(lèi)生命與健康的重大醫(yī)學(xué)問(wèn)題。臨床上一直通過(guò)發(fā)病后急性給藥以及對(duì)高危人群預(yù)防給藥的方式來(lái)干預(yù)腦與脊髓急性缺血性卒中，但收效甚微。近年來(lái)，人們對(duì)腦與脊髓急性缺血性卒中及其干預(yù)藥物研究越來(lái)越多，對(duì)其產(chǎn)生與發(fā)展的機(jī)制也越來(lái)越明確，但與已有經(jīng)典藥物相比尚未取得重要突破，也并沒(méi)有任何一種特效藥物對(duì)大多數(shù)腦與脊髓急性缺血性卒中患者適用。實(shí)驗(yàn)室研究中，傳統(tǒng)的體外細(xì)胞藥物研發(fā)模型所篩選的新藥雖然在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)階段具有明顯的作用效果，但在進(jìn)入體內(nèi)實(shí)驗(yàn)后其成功率卻很低，其主要原因是腦與脊髓急性缺血性卒中的發(fā)生發(fā)展過(guò)程是一個(gè)包含了多基因、多因素、多細(xì)胞相互作用的復(fù)雜途徑。目前急性缺血/再灌注損傷的體外研究模型主要為某一細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，相關(guān)的藥物研究模式更是將藥物直接暴露于靶細(xì)胞，如N、A，忽略了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多細(xì)胞間、細(xì)胞與間質(zhì)間相互作用的系統(tǒng)關(guān)系，以及生物體內(nèi)藥物自循環(huán)系統(tǒng)經(jīng)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物代謝途徑，同體內(nèi)真實(shí)情況相差甚遠(yuǎn)，甚至導(dǎo)致所培養(yǎng)細(xì)胞喪失其在體內(nèi)重要的生物學(xué)特性。另一方面，如果不進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，直接進(jìn)入體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，雖然能完整地保留系統(tǒng)的各種特征，但是過(guò)于復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境和大量不可控因素以及動(dòng)物之間的個(gè)體差異等因素將導(dǎo)致相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏差，這將對(duì)研究造成很大的障礙。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者開(kāi)始重視這一問(wèn)題，關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)體外研究模型也在不斷改善，多細(xì)胞共同培養(yǎng)也備受關(guān)注，從最初在一個(gè)平面培養(yǎng)環(huán)境中將幾種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞混合培養(yǎng)，到利用支架材料實(shí)現(xiàn)多細(xì)胞立體化共培養(yǎng)，很多研究者都做了大量的嘗試。在體外培養(yǎng)時(shí)每一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的培養(yǎng)液和培養(yǎng)條件均不相同，如何能優(yōu)化出一種可以提供多種不同細(xì)胞共同生長(zhǎng)且保持原有生物學(xué)狀態(tài)的培養(yǎng)條件是實(shí)現(xiàn)多種不同中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞在一個(gè)空間內(nèi)體外共培養(yǎng)的前提。目前，現(xiàn)有體外共培養(yǎng)模型的細(xì)胞來(lái)源千差萬(wàn)別，有些是來(lái)源于人或動(dòng)物細(xì)胞系，有些是原代細(xì)胞，也有通過(guò)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化，有的是將以上幾大類(lèi)甚至不同種屬的細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。此外，共培養(yǎng)模型的細(xì)胞種類(lèi)也各不相同，目前大多選擇E、A、N以及周細(xì)胞中的兩種或三種。共培養(yǎng)模型的支架材料選擇更是各式各樣，其中一大類(lèi)是insert插件，而目前的研究為了能獲得更好的E緊密連接實(shí)驗(yàn)參數(shù)值，大多研究者選擇孔徑為0.4μm的插件，這對(duì)單純研究E緊密連接沒(méi)有問(wèn)題，但是如果要在插件底外側(cè)面加入A進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)，0.4μm的孔徑是無(wú)法保證A的突起可以順利穿過(guò)的；另一大類(lèi)是微流控裝置，這種方式雖然能通過(guò)較少的細(xì)胞數(shù)量實(shí)現(xiàn)多細(xì)胞共培養(yǎng)，但也正因如此，很多的實(shí)驗(yàn)由于細(xì)胞數(shù)量過(guò)少而無(wú)法完成，更加無(wú)法模擬各種細(xì)胞在體內(nèi)的相對(duì)數(shù)量關(guān)系?？偠灾F(xiàn)有的中樞神經(jīng)系統(tǒng)體外研究模型沒(méi)有一種能更好的適用于腦與脊髓急性缺血/再灌注損傷及其相關(guān)藥物研究。因?yàn)樵诎l(fā)生腦與脊髓急性缺血/再灌注時(shí)不僅僅只是N氧糖剝奪/復(fù)氧糖的變化，這一過(guò)程最重要的還有同N關(guān)系密切的A以及形成血腦屏障的E的狀態(tài)改變。其中在相關(guān)藥物研究中E的作用尤其重要，因?yàn)樵隗w內(nèi)任何一種藥物都需要通過(guò)血液循環(huán)經(jīng)血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而E和E間所形成的緊密連接正是構(gòu)成血腦屏障的重要基礎(chǔ)，而目前神經(jīng)、精神疾病藥物研究的一個(gè)瓶頸就是很多體外研究忽略了這一藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程，這主要是由于現(xiàn)階段腦與脊髓急性缺血/再灌注體外研究模型無(wú)法模擬體內(nèi)重要細(xì)胞相互作用、相互影響、相互制約的真實(shí)情況，而是將要藥物直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶細(xì)胞中，因此而產(chǎn)生的研究結(jié)果和體內(nèi)的真實(shí)情況相差甚遠(yuǎn)，這應(yīng)是為何目前的很多藥物研究無(wú)法實(shí)現(xiàn)從體外研究到體內(nèi)研究的轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要原因?；谏鲜鲈颍壳捌惹行枰⒁环N更加接近于體內(nèi)環(huán)境的腦與脊髓急性缺血/再灌注損傷及其相關(guān)藥物研究用體外模型。CN201310065078.7的發(fā)明專(zhuān)利公開(kāi)“中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物研究的原代同源三細(xì)胞四維模型及構(gòu)建方法”，其按照體內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)E、A和N的相對(duì)空間結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了原代同源EAN三細(xì)胞四維模型。但是按照該模型的構(gòu)建方法所獲得的E的緊密連接程度往往偏低，無(wú)法滿足損傷實(shí)驗(yàn)和藥物研究的要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供了一種以E、A及N所形成的原代同源三細(xì)胞四維模型為基礎(chǔ)的腦與脊髓急性缺血/再灌注損傷細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型。本發(fā)明的再一目的是提供上述腦與脊髓急性缺血/再灌注損傷細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建方法，以原代同源E、A及N三種重要細(xì)胞，按其在體內(nèi)的相對(duì)空間位置及數(shù)量關(guān)系進(jìn)行立體化共培養(yǎng)，利用低氧調(diào)控系統(tǒng)/普通細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和無(wú)糖細(xì)胞培養(yǎng)液/正常細(xì)胞培養(yǎng)液，模擬體內(nèi)腦與脊髓急性缺血/再灌注損傷。本發(fā)明的另一目的是提供上述腦與脊髓急性缺血/再灌注損傷細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型的應(yīng)用，采用經(jīng)插件內(nèi)腔E培養(yǎng)液給藥方式，模擬生物體內(nèi)藥物自循環(huán)系統(tǒng)經(jīng)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物代謝途徑，將該模型作為藥物篩選平臺(tái)應(yīng)用于相關(guān)防治干預(yù)研究，以解決目前研究所存在的上述技術(shù)問(wèn)題。根據(jù)本發(fā)明的腦與脊髓急性缺血/再灌注損傷細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型，其包括原代同源的E、A及N，其中，將原代培養(yǎng)已經(jīng)純化的A進(jìn)行胰酶消化，同時(shí)將長(zhǎng)滿E的插件從培養(yǎng)孔取出倒置放于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，將A懸液植于插件底膜外側(cè)面，之后該無(wú)菌培養(yǎng)皿置于普通細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)孵育；然后，插件翻轉(zhuǎn)插入裝有E完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)孔，同時(shí)在插件內(nèi)加入E完全培養(yǎng)液，待E和A共培養(yǎng)后，將E和A共培養(yǎng)的插件放置于已經(jīng)成熟穩(wěn)定的N培養(yǎng)孔中，既構(gòu)建了基礎(chǔ)EAN細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型，其構(gòu)造如圖1所示：在培養(yǎng)孔中插有Transwell插件，插件外腔有N完全培養(yǎng)液，內(nèi)腔有E完全培養(yǎng)液；N生長(zhǎng)于培養(yǎng)孔底面；所述插件底部?jī)?nèi)側(cè)面涂有膠原蛋白Ⅳ，以模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)E-A間隙基底膜蛋白層；插件底部?jī)?nèi)側(cè)面膠原蛋白Ⅳ上層生長(zhǎng)有E，插件底部外側(cè)面生長(zhǎng)有A，其突起通過(guò)插件底孔穿向E底面；其中，通過(guò)將基礎(chǔ)EAN從普通細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(37℃，5％CO2)中取出，在低氧調(diào)控系統(tǒng)中，在無(wú)糖無(wú)氧E、N培養(yǎng)液中、于37℃，95％N2和5％CO2混合氣條件下實(shí)施氧糖剝奪處理，然后將細(xì)胞模型重新置于普通細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘、3小時(shí)或3天，既細(xì)胞模型進(jìn)入復(fù)氧糖環(huán)境，以模擬腦與脊髓急性缺血后再灌注，復(fù)氧糖的三個(gè)時(shí)間窗分別對(duì)應(yīng)臨床上急性缺血后再灌注的超急性期、急性期和亞急性期。根據(jù)本發(fā)明的腦與脊髓急性缺血/再灌注損傷的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建方法包括以下步驟：1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)原代同源基礎(chǔ)EAN細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型(basalnetworkofthematuredbrain/spinalcapillaryendothelialcells-astrocytes-neurons,BNEAN)的構(gòu)建用現(xiàn)有技術(shù)分別提取SD大鼠大腦皮質(zhì)的E、A、N(其中A和N取自新生24小時(shí)SD大鼠，E取自成年220～280g雄性SD大鼠)并分別進(jìn)行原代培養(yǎng)；將原代培養(yǎng)5-9天已成熟的E種植到已包被膠原蛋白的插件底膜內(nèi)側(cè)面，插件內(nèi)、外腔均為E完全培養(yǎng)液，大約2-6天待E長(zhǎng)滿插件底面并且形成緊密連接(根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室電阻值及熒光素鈉透過(guò)率測(cè)定計(jì)算以及熒光染色形態(tài)學(xué)分析)時(shí)，將原代培養(yǎng)10天左右已經(jīng)純化的A進(jìn)行胰酶消化，同時(shí)將長(zhǎng)滿E的插件從培養(yǎng)孔取出倒置放于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，將A細(xì)胞懸液植于插件底膜外側(cè)面；之后該無(wú)菌培養(yǎng)皿置于普通細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(37℃，5％CO2)孵育3小時(shí)；3小時(shí)后，插件翻轉(zhuǎn)插入裝有E完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)孔，同時(shí)在插件內(nèi)加入E完全培養(yǎng)液。待EA共培養(yǎng)4-5天(A基本長(zhǎng)滿插件底膜外腔面)，將EA共培養(yǎng)的插件放置于生長(zhǎng)1周左右已經(jīng)成熟穩(wěn)定的N培養(yǎng)孔中，既構(gòu)建了BNEAN細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型，其構(gòu)造如圖1所示：在培養(yǎng)孔中插有Transwell插件，插件外腔有N完全培養(yǎng)液，內(nèi)腔有E完全培養(yǎng)液；N生長(zhǎng)于培養(yǎng)孔底面；所述插件底部?jī)?nèi)側(cè)面涂有膠原蛋白Ⅳ，以模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)E-A間隙基底膜蛋白層；插件底部?jī)?nèi)側(cè)面膠原蛋白Ⅳ上層生長(zhǎng)有E，插件底部外側(cè)面生長(zhǎng)有A，其突起通過(guò)插件底孔穿向E底面。2、腦與脊髓急性缺血/再灌注損傷細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型(diseasednetworkofthematuredbrain/spinalcapillaryendothelialcells-astrocytes-neuronsbyoxygenandglucosedeprivation/reoxygenationandrecoveryofglucose,DNEANogd/r)的構(gòu)建根據(jù)三種細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，選擇成功構(gòu)建后1-2天的BNEAN進(jìn)行體外DNEANogd/r的構(gòu)建。本發(fā)明利用具有O2和CO2濃度自動(dòng)監(jiān)測(cè)和調(diào)節(jié)功能的小型低氧調(diào)控系統(tǒng)(美國(guó)，Coy)在體外為細(xì)胞提供無(wú)氧環(huán)境。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前一天，將N和E無(wú)糖培養(yǎng)液置于低氧調(diào)控系統(tǒng)中平衡過(guò)夜，以充分排除液體內(nèi)溶解的O2。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將BNEAN從普通細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(37℃，5％CO2)中取出，在低氧調(diào)控系統(tǒng)中，以無(wú)糖無(wú)氧E、N培養(yǎng)液分別完全置換插件內(nèi)、外腔的E、N完全培養(yǎng)液，再將細(xì)胞置于37℃，95％N2和5％CO2混合氣培養(yǎng)艙中開(kāi)始氧糖剝奪處理2小時(shí)。此時(shí)，整個(gè)細(xì)胞模型處于急性缺氧缺糖環(huán)境中，以模擬腦與脊髓急性缺血時(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的狀態(tài)。急性缺氧缺糖處理完成后，將插件內(nèi)、外腔無(wú)糖細(xì)胞培養(yǎng)液分別更換為正常的E和N完全培養(yǎng)液，同時(shí)將細(xì)胞模型重新置于普通細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘、3小時(shí)或3天，既細(xì)胞模型進(jìn)入復(fù)氧糖環(huán)境，以模擬腦與脊髓急性缺血后再灌注，復(fù)氧糖的三個(gè)時(shí)間窗分別對(duì)應(yīng)臨床上急性缺血后再灌注的超急性期、急性期和亞急性期。本發(fā)明還提供了腦與脊髓急性缺血/再灌注損傷細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型用于藥物干預(yù)(pharmacologicalinterventionoftheDNEANogd/r,PNEANogd/r)、藥物篩選的應(yīng)用。本發(fā)明針對(duì)腦與脊髓急性缺血/再灌注損傷的治療特點(diǎn)，將其藥物研究模式分為兩大類(lèi)：預(yù)處理給藥和損傷后急性給藥。①預(yù)處理給藥：在進(jìn)行體外急性缺血/再灌注前，于E培養(yǎng)液中加入藥物預(yù)處理3小時(shí)，之后進(jìn)行氧糖剝奪/復(fù)氧糖處理；②損傷后急性給藥：按照2中的步驟進(jìn)行氧糖剝奪2小時(shí)，之后在復(fù)氧糖的同時(shí)于E培養(yǎng)液中加入藥物。本發(fā)明中所涉及的藥物相關(guān)研究均采用經(jīng)E培養(yǎng)液給藥模式，以模擬體內(nèi)藥物自循環(huán)系統(tǒng)經(jīng)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征。本發(fā)明首次以來(lái)源于同一種屬動(dòng)物(包括大鼠、小鼠及人等各種高級(jí)動(dòng)物)相同部位(腦/脊髓)的EAN三種原代細(xì)胞按其在體內(nèi)相對(duì)空間位置及數(shù)量關(guān)系進(jìn)行立體化共培養(yǎng)，建立了腦與脊髓急性缺血/再灌注損傷模型。本發(fā)明所涉及的三種基礎(chǔ)細(xì)胞均采用來(lái)自同一種屬的相同部位的原代細(xì)胞按其在體內(nèi)相對(duì)空間位置及數(shù)量關(guān)系進(jìn)行立體化共培養(yǎng)，最大限度地保留了三種基本細(xì)胞在體內(nèi)的生物學(xué)狀態(tài)，能夠更準(zhǔn)確地反映體內(nèi)信息。本發(fā)明利用低氧調(diào)控系統(tǒng)/普通細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和無(wú)糖細(xì)胞培養(yǎng)液/正常細(xì)胞培養(yǎng)液，來(lái)模擬體內(nèi)腦與脊髓急性缺血/再灌注損傷時(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的氧糖剝奪/復(fù)氧糖環(huán)境。本發(fā)明首次提出一種經(jīng)插件內(nèi)腔E培養(yǎng)基給藥的藥物研究模式，而非以往的體外研究將藥物直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的某一或某幾種靶細(xì)胞，更符合生物體本身的藥代動(dòng)力學(xué)，即，藥物自循環(huán)系統(tǒng)經(jīng)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。本發(fā)明既可用于腦與脊髓急性缺血/再灌注損傷產(chǎn)生與發(fā)展機(jī)制的深入研究，亦可作為臨床診斷標(biāo)志物以及藥物(藥物靶點(diǎn)、藥物效應(yīng)、藥物毒副作用、藥代動(dòng)力學(xué)等)研究與評(píng)價(jià)的新細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例BEAN模型構(gòu)造示意圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例BEAN模型構(gòu)建時(shí)間軸示意圖。圖3是BNEAN組加入與藥物體積等量的DMSO后正常培養(yǎng)8h在倒置相差顯微鏡下200倍的細(xì)胞圖片；圖4是DNEANogd/r組加入與藥物體積等量的DMSO3h，糖氧剝奪2h，復(fù)氧糖3h后在倒置相差顯微鏡下200倍的細(xì)胞圖片；圖5是PcNEANogd/r組加入0.1mg/mlGBE預(yù)處理3小時(shí)，糖氧剝奪2h，復(fù)氧糖3h后在倒置相差顯微鏡下200倍的細(xì)胞圖片；圖6是PcNEANogd/r組加入0.4mg/mlGBE預(yù)處理3小時(shí)，糖氧剝奪2h，復(fù)氧糖3h后在倒置相差顯微鏡下200倍的細(xì)胞圖片；圖7是PcNEANogd/r組加入1.6mg/mlGBE預(yù)處理3小時(shí)，糖氧剝奪2h，復(fù)氧糖3h后在倒置相差顯微鏡下200倍的細(xì)胞圖片具體實(shí)施方式實(shí)施例1一、主要試劑的配制1.N完全培養(yǎng)液：將N基礎(chǔ)培養(yǎng)液(Gibco10888022)95％(V/V)、B27(Invitrogen7504044)2％(V/V)、青鏈霉素1％(V/V)和L–谷氨酰胺2mM按照以上的比例進(jìn)行混合，使用前放入37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30分鐘以上。2.N種植培養(yǎng)液：將DMEM高糖培養(yǎng)液(Gibco11960044)90％(V/V)、胎牛血清10％(V/V)、青鏈霉素1％(V/V)和L–谷氨酰胺2mM按照以上的比例進(jìn)行混合，使用前放入37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30分鐘以上。3.N無(wú)糖培養(yǎng)液：將N無(wú)糖基礎(chǔ)培養(yǎng)液(Gibco0050128DJ)95％(V/V)、B272％(V/V)、青鏈霉素1％(V/V)和L–谷氨酰胺2mM按照以上的比例進(jìn)行混合，使用前放入37℃，95％N2、5％CO2低氧調(diào)控系統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12h以上。4.E完全培養(yǎng)液：將87％MCDB131(GibcoM-131-500)(V/V)、1％青鏈霉素(V/V)、1％L–谷氨酰胺(2mM)、10％胎牛血清(V/V)和1％內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(MicrovascularGrowthSupplement,MGS)(GibicoS-005-25)按照上述比例進(jìn)行混合，使用前加入ECGS，放入37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30分鐘以上。注意在原代提取過(guò)程中所使用的培養(yǎng)液，需要添加嘌呤霉素(6μg/ml)和肝素(100μg/ml)，防止內(nèi)皮細(xì)胞片段斷裂成小片段。5.E無(wú)糖培養(yǎng)液：將87％DMEM無(wú)糖培養(yǎng)液(Gibco11966-025)(V/V)、1％青鏈霉素(V/V)、1％L–谷氨酰胺(2mM)、10％胎牛血清(V/V)和1％MGS(GibicoS-005-25)按照上述比例進(jìn)行混合，使用前放入37℃，95％N2、5％CO2低氧調(diào)控系統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12h以上。6.A完全培養(yǎng)基：將95％DMEM高糖培養(yǎng)液(Gibco11960044)(V/V)、1％青鏈霉素(V/V)、1％L–谷氨酰胺(2mM)和10％胎牛血清(V/V)按照上述比例進(jìn)行混合，使用前放入37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30分鐘以上。二、腦與脊髓急性缺血/再灌注損傷的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建1.中樞神經(jīng)系統(tǒng)原代同源基礎(chǔ)EAN細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型(basalnetworkofthematuredbrain/spinalcapillaryendothelialcells-astrocytes-neurons,BNEAN)的構(gòu)建用現(xiàn)有技術(shù)分別提取SD大鼠大腦皮質(zhì)的E、A、N(其中A和N取自新生24小時(shí)SD大鼠，E取自成年220～280g雄性SD大鼠)并分別進(jìn)行原代培養(yǎng)；將原代培養(yǎng)5-9天已成熟的E種植到已包被膠原蛋白的插件底膜內(nèi)側(cè)面，插件內(nèi)、外腔均為E完全培養(yǎng)液，大約2-6天待E長(zhǎng)滿插件底面并且形成緊密連接(根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室電阻值及熒光素鈉透過(guò)率測(cè)定計(jì)算以及熒光染色形態(tài)學(xué)分析)時(shí)，將原代培養(yǎng)10天左右已經(jīng)純化的A進(jìn)行胰酶消化，同時(shí)將長(zhǎng)滿E的插件從培養(yǎng)孔取出倒置放于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，將A細(xì)胞懸液植于插件底膜外側(cè)面；之后該無(wú)菌培養(yǎng)皿置于普通細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(37℃，5％CO2)孵育3小時(shí)；3小時(shí)后，插件翻轉(zhuǎn)插入裝有E完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)孔，同時(shí)在插件內(nèi)加入E完全培養(yǎng)液。待EA共培養(yǎng)4-5天(A基本長(zhǎng)滿插件底膜外腔面)，將EA共培養(yǎng)的插件放置于生長(zhǎng)1周左右已經(jīng)成熟穩(wěn)定的N培養(yǎng)孔中，既構(gòu)建了BNEAN細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型，其構(gòu)造如圖1所示：在培養(yǎng)孔中插有Transwell插件，插件外腔有N完全培養(yǎng)液，內(nèi)腔有E完全培養(yǎng)液；N生長(zhǎng)于培養(yǎng)孔底面；所述插件底部?jī)?nèi)側(cè)面涂有膠原蛋白Ⅳ，以模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)E-A間隙基底膜蛋白層；插件底部?jī)?nèi)側(cè)面膠原蛋白Ⅳ上層生長(zhǎng)有E，插件底部外側(cè)面生長(zhǎng)有A，其突起通過(guò)插件底孔穿向E底面。2.腦與脊髓急性缺血/再灌注損傷細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型(diseasednetworkofthematuredbrain/spinalcapillaryendothelialcells-astrocytes-neuronsbyoxygenandglucosedeprivation/reoxygenationandrecoveryofglucose,DNEANogd/r)的構(gòu)建根據(jù)三種細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，選擇成功構(gòu)建后1-2天的BNEAN進(jìn)行體外DNEANogd/r的構(gòu)建。本發(fā)明利用具有O2和CO2濃度自動(dòng)監(jiān)測(cè)和調(diào)節(jié)功能的小型低氧調(diào)控系統(tǒng)(美國(guó)，Coy)在體外為細(xì)胞提供無(wú)氧環(huán)境。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前一天，將N和E無(wú)糖培養(yǎng)液置于低氧調(diào)控系統(tǒng)中平衡過(guò)夜，以充分排除液體內(nèi)溶解的O2。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將BNEAN從普通細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(37℃，5％CO2)中取出，在低氧調(diào)控系統(tǒng)中，以無(wú)糖無(wú)氧E、N培養(yǎng)液分別完全置換插件內(nèi)、外腔的E、N完全培養(yǎng)液，再將細(xì)胞置于37℃，95％N2和5％CO2混合氣培養(yǎng)艙中開(kāi)始氧糖剝奪處理2小時(shí)。此時(shí)，整個(gè)細(xì)胞模型處于急性缺氧缺糖環(huán)境中，以模擬腦與脊髓急性缺血時(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的狀態(tài)。急性缺氧缺糖處理完成后，將插件內(nèi)、外腔無(wú)糖細(xì)胞培養(yǎng)液分別更換為正常的E和N完全培養(yǎng)液，同時(shí)將細(xì)胞模型重新置于普通細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘、3小時(shí)或3天，既細(xì)胞模型進(jìn)入復(fù)氧糖環(huán)境，以模擬腦與脊髓急性缺血后再灌注，復(fù)氧糖的三個(gè)時(shí)間窗分別對(duì)應(yīng)臨床上急性缺血后再灌注的超急性期、急性期和亞急性期。三、腦與脊髓急性缺血/再灌注損傷的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型監(jiān)測(cè)及陽(yáng)性藥物的藥效評(píng)價(jià)(一)實(shí)驗(yàn)方法1.藥品與試劑選擇的腦與脊髓急性缺血/再灌注損傷陽(yáng)性保護(hù)藥物為銀杏葉提取物(Ginkgobilobaextract，GBE)購(gòu)自NUNC，以DMSO溶解，各樣本的終濃度均以μmol/L表示。實(shí)驗(yàn)用SD大鼠均由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。MTT(Sigma)，Tritonx100(Solarbio)，NaF(Sigma)，LDH試劑盒(自南京建成)，TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒(Roche)生物技術(shù)有限公司，Transwell插件(Millipore)，抗體均購(gòu)自Abcam公司。2.實(shí)驗(yàn)分組(1)正常(BNEAN)組：加入與藥物體積等量的DMSO后正常培養(yǎng)8h。(2)損傷(DNEANogd/r)組：加入與藥物體積等量的DMSO3h，糖氧剝奪2h，復(fù)氧糖3h。(3)陽(yáng)性藥物預(yù)處理(PcNEANogd/r)組：加入GBE(濃度分別為0.1mg/ml、0.4mg/ml和1.6mg/ml)預(yù)處理3小時(shí)，糖氧剝奪2h，復(fù)氧糖3h。3.倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)利用顯微鏡粗調(diào)螺旋調(diào)節(jié)物鏡高度，依次觀察E、A、N基礎(chǔ)狀態(tài)、損傷狀態(tài)以及藥物干預(yù)狀態(tài)下的形態(tài)，顯微鏡相機(jī)拍照(Nikon，日本)。4.長(zhǎng)有E、A插件的電阻值測(cè)定利用電阻儀(MillicellERS-2，美國(guó))測(cè)定insert插件內(nèi)側(cè)面E的電阻值，長(zhǎng)電極在插件外部，短電極在插件內(nèi)部，短電極不能與插件中的半透膜接觸，長(zhǎng)電極需與培養(yǎng)孔中的底部盡量接近但不能接觸。同時(shí)確保兩電極與培養(yǎng)板平面成90°夾角。當(dāng)讀數(shù)穩(wěn)定后，記錄數(shù)值。每個(gè)插件至少測(cè)量三次，并且每次測(cè)量時(shí)都要改變位置。用電阻儀在不同的時(shí)間測(cè)定電阻值，可間接反映E間緊密連接的變化。5.長(zhǎng)有E、A插件的熒光素鈉(NaF)透過(guò)率測(cè)定將模型中插件內(nèi)的E培養(yǎng)液更換為Ring-HepesBuffer(136mMNaCl、0.9mMCaCl2、0.5mMMgCl2、2.7mMKCl、1.5mMKH2PO4、10mMNaH2PO4、25mMglucose、10mMHepes、pH7.4)，同時(shí)加入濃度為25mM的Na-F，設(shè)定6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別為10min、15min、20min、30min、45min、60min。每到一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將insert放入一個(gè)放有新的含有Ring-HepesBuffer的培養(yǎng)孔中。最后收集所有培養(yǎng)孔和插件內(nèi)的Ring-HepesBuffer，利用熒光酶標(biāo)儀分別測(cè)定其中的Na-F的濃度，利用公式進(jìn)行測(cè)定熒光素鈉(NaF)透過(guò)率。公式為Pd(cm/s)＝(Cdow/t)×(1/S)×(Vdow/Vup)；其中：Cdow是下室NaF的濃度，t(s)是時(shí)間間隔，S(cm2)是內(nèi)皮細(xì)胞層的面積，Vdow(m3)是下室溶液體積，Vup是上室NaF濃度。測(cè)定不同狀態(tài)下NaF透過(guò)率，可反映血腦屏障通透性。6.細(xì)胞培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定取不同狀態(tài)下插件內(nèi)、外腔細(xì)胞培養(yǎng)上清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上清中LDH含量，以判斷細(xì)胞損傷程度。7.MTT檢測(cè)細(xì)胞活性棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗，每1ml培養(yǎng)液中加入100μlMTT(MTT用錫紙包裹，加入時(shí)注意避光)，放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)3h后終止培養(yǎng)，將待測(cè)液吸出，加入與MTT等量DMSO，在搖床上震蕩混勻10min待紫色結(jié)晶顆粒充分溶解后，按組別分別加入96孔板中，每孔200ul，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀波長(zhǎng)490nm處測(cè)量各孔的吸光值。8.TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測(cè)取出插件，棄去培養(yǎng)孔中培養(yǎng)液，用PBS漂洗3次，4％多聚甲醛中固定；用0.3％的TritonX-100中處理15min，PBS浸洗二次，每次5min；按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。(二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、相差顯微鏡觀察N形態(tài)變化圖3是BNEAN組加入與藥物體積等量的DMSO后正常培養(yǎng)8h在倒置相差顯微鏡下200倍的細(xì)胞圖片；圖4是DNEANogd/r組加入與藥物體積等量的DMSO3h，糖氧剝奪2h，復(fù)氧糖3h后在倒置相差顯微鏡下200倍的細(xì)胞圖片；圖5是PcNEANogd/r組加入0.1mg/mlGBE預(yù)處理3小時(shí)，糖氧剝奪2h，復(fù)氧糖3h后在倒置相差顯微鏡下200倍的細(xì)胞圖片；圖6是PcNEANogd/r組加入0.4mg/mlGBE預(yù)處理3小時(shí)，糖氧剝奪2h，復(fù)氧糖3h后在倒置相差顯微鏡下200倍的細(xì)胞圖片；圖7是PcNEANogd/r組加入1.6mg/mlGBE預(yù)處理3小時(shí)，糖氧剝奪2h，復(fù)氧糖3h后在倒置相差顯微鏡下200倍的細(xì)胞圖片；從相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)來(lái)看，BNEAN組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，胞體飽滿突起細(xì)長(zhǎng)彎曲，突起數(shù)量較多交織成網(wǎng)狀；DNEANogd/r組的N出現(xiàn)貼壁能力減弱，部分細(xì)胞漂浮，突起皺縮等現(xiàn)象；三個(gè)濃度PNEANogd/r組生長(zhǎng)狀況略好于DNEANogd/r組，N有一定程度的損傷，明顯可見(jiàn)胞體中有空泡產(chǎn)生，且突起減少。2.E緊密連接程度的比較通過(guò)比較BNEAN組、DNEANogd/r組以及不同濃度陽(yáng)性藥物預(yù)處理的PcNEANogd/r組中長(zhǎng)有E、A插件的電阻值和NaF透過(guò)率來(lái)判斷各組間E緊密連接程度的變化。插件上E跨膜電阻和NaF透過(guò)率均是反映整個(gè)模型緊密連接最靈敏的指標(biāo)。其中電阻值越高、NaF透過(guò)率越低，表示E間緊密連接功能越好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1和表2。表1各實(shí)驗(yàn)組中長(zhǎng)有E、A插件的電阻值比較組分藥物濃度(mg/ml)1電阻值(Ω×cm2)BNEAN組171.875±9.561**DNEANogd/r組68.130±8.961PcNEANogd/r組0.181.428±7.4530.4108.873±7.317**1.6109.500±8.455**1電阻值計(jì)算公式：本實(shí)施例選用的是6孔培養(yǎng)板插件，底面積S為cm2**P<0.01vsDNEANogd/r組表2各實(shí)驗(yàn)組中長(zhǎng)有E、A插件的NaF透過(guò)率比較組分藥物濃度(mg/ml)1NaF透過(guò)率(cm/s)BNEAN組9.343±0.649**DNEANogd/r組27.915±1.332PcNEANogd/r組0.122.960±0.6200.414.438±0.699**1.614.620±0.585**1NaF透過(guò)性系數(shù)公式：P總＝VR/(A×CO)×dc/dt，VR＝所測(cè)樣品的總體積(ml)，A＝插件底面積(cm2)，本實(shí)施例選用的是6孔培養(yǎng)板插件，底面積S為cm2；CO＝檢測(cè)物質(zhì)的初濃度(μg/ml)；dc＝所測(cè)樣品的濃度差(μg/ml)；dt＝所測(cè)樣品的時(shí)間差(s)；NaF透過(guò)率＝1/P總值-1/P空白值**P<0.01vsDNEANogd/r組由表1和表2可以看出，糖氧剝奪2h，復(fù)氧糖3h后插件上E跨膜電阻顯著下降，NaF透過(guò)率顯著增加，提示E緊密連接受損；0.4和1.6mg/ml陽(yáng)性藥物預(yù)處理可以明顯保護(hù)糖氧剝奪/復(fù)氧糖對(duì)E緊密連接的損傷。3.細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH測(cè)定分別比較BNEAN組、DNEANogd/r組以及不同濃度陽(yáng)性藥物預(yù)處理的PcNEANogd/r組插件內(nèi)、外腔細(xì)胞培養(yǎng)上清LDH釋放量，以判斷細(xì)胞的損傷程度，結(jié)果見(jiàn)表3。表3各實(shí)驗(yàn)組插件內(nèi)、外腔細(xì)胞培養(yǎng)上清LDH測(cè)定組分藥物濃度(mg/ml)內(nèi)腔LDH(U/L)外腔LDH(U/L)BNEAN組58.980±3.111**60.020±3.462**DNEANogd/r組121.800±6.174177.097±3.462PcNEANogd/r組0.189.070±0.999*144.685±8.2660.470.432±2.031**76.855±3.272**1.669.427±0.9**69.093±3.515***P<0.05vsDNEANogd/r組，**P<0.01vsDNEANogd/r組由表3可以看出，糖氧剝奪2h，復(fù)氧糖3h后插件內(nèi)、外腔細(xì)胞上清LDH釋放量均顯著增加，提示細(xì)胞受損，細(xì)胞膜完整性破壞；不同濃度陽(yáng)性藥物預(yù)處理可以明顯抑制糖氧剝奪/復(fù)氧糖對(duì)E、A、N三細(xì)胞的損傷。4.MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性經(jīng)MTT處理后，分別測(cè)定BNEAN組、DNEANogd/r組以及不同濃度陽(yáng)性藥物預(yù)處理的PcNEANogd/r組N在490nm波長(zhǎng)處光吸收值，以間接反映活細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果見(jiàn)表4。表4各實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元MTT(490nm)吸光值組分藥物濃度(mg/ml)MTT(OD)BNEAN組0.777±0.004**DNEANogd/r組0.207±0.01PcNEANogd/r組0.10.350±0.0270.40.565±0.004**1.60.518±0.002****P<0.01vsDNEANogd/r組由表4可以看出，糖氧剝奪2h，復(fù)氧糖3h后神經(jīng)元MTT(OD)值顯著下降，提示N存活率下降；0.4和1.6mg/ml陽(yáng)性藥物預(yù)處理可以明顯抑制糖氧剝奪/復(fù)氧糖對(duì)N的損傷。四、申請(qǐng)?zhí)朇N201310065078.7與本實(shí)施例細(xì)胞模型在基礎(chǔ)條件、急性缺血/再灌注損傷及陽(yáng)性藥物藥效評(píng)價(jià)的比較(一)實(shí)驗(yàn)方法1.實(shí)驗(yàn)分組同具體實(shí)施方法“三”中的實(shí)驗(yàn)分組操作相同，將本實(shí)施例和申請(qǐng)?zhí)枮镃N201310065078.7的細(xì)胞模型分別分為：(1)正常(BNEAN)組：加入與藥物體積等量的DMSO后正常培養(yǎng)8h。(2)損傷(DNEANogd/r)組：加入與藥物體積等量的DMSO3h，糖氧剝奪2h，復(fù)氧糖3h。(3)陽(yáng)性藥物預(yù)處理(PcNEANogd/r)組：加入GBE(濃度分別為0.1mg/ml、0.4mg/ml和1.6mg/ml)預(yù)處理3小時(shí)，糖氧剝奪2h，復(fù)氧糖3h。分別檢測(cè)不同處理狀態(tài)下兩種細(xì)胞模型的長(zhǎng)有E、A插件的電阻值、NaF透過(guò)率以及N細(xì)胞活性，具體實(shí)驗(yàn)方法同上(二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.兩種細(xì)胞模型E緊密連接程度的比較通過(guò)比較兩種細(xì)胞模型BNEAN組、DNEANogd/r組以及不同濃度陽(yáng)性藥物預(yù)處理的PcNEANogd/r組中長(zhǎng)有E、A插件的電阻值和NaF透過(guò)率來(lái)分別判斷每種細(xì)胞模型各組間以及各種狀態(tài)兩種模型間E緊密連接程度的變化。插件上E跨膜電阻和NaF透過(guò)率均是反映整個(gè)模型緊密連接最靈敏的指標(biāo)。其中電阻值越高、NaF透過(guò)率越低，表示E間緊密連接功能越好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5和表6。表5各實(shí)驗(yàn)組中長(zhǎng)有E、A插件的電阻值比較1電阻值計(jì)算公式：本實(shí)施例選用的是6孔培養(yǎng)板插件，底面積S為cm2**本實(shí)施例模型P<0.01vsDNEANogd/r組#CN201310065078.7模型P<0.05vsDNEANogd/r組##CN201310065078.7模型P<0.01vsDNEANogd/r組&各種狀態(tài)，CN201310065078.7模型P<0.05vs本實(shí)施例模型&&各種狀態(tài)，CN201310065078.7模型P<0.01vs本實(shí)施例模型表6各實(shí)驗(yàn)組中長(zhǎng)有E、A插件的NaF透過(guò)率比較1NaF透過(guò)性系數(shù)公式：P總＝VR/(A×CO)×dc/dt，VR＝所測(cè)樣品的總體積(ml)，A＝插件底面積(cm2)，本實(shí)施例選用的是6孔培養(yǎng)板插件，底面積S為cm2；CO＝檢測(cè)物質(zhì)的初濃度(μg/ml)；dc＝所測(cè)樣品的濃度差(μg/ml)；dt＝所測(cè)樣品的時(shí)間差(s)；NaF透過(guò)率＝1/P總值-1/P空白值**本實(shí)施例模型P<0.01vsDNEANogd/r組#CN201310065078.7模型P<0.05vsDNEANogd/r組##CN201310065078.7模型P<0.01vsDNEANogd/r組&各種狀態(tài)，CN201310065078.7模型P<0.05vs本實(shí)施例模型&&各種狀態(tài)，CN201310065078.7模型P<0.01vs本實(shí)施例模型由表5和表6可以看出，在基礎(chǔ)模型中，本實(shí)施例E緊密連接程度要強(qiáng)于申請(qǐng)?zhí)枮镃N201310065078.7的細(xì)胞模型；兩種模型在相同損傷條件刺激以及藥物干預(yù)下，結(jié)果是完全不同的，主要原因是申請(qǐng)?zhí)枮镃N201310065078.7所公開(kāi)的細(xì)胞模型無(wú)法獲得有理想緊密連接程度的E層，因而在損傷以及藥物干預(yù)處理時(shí)便無(wú)法起到應(yīng)有的屏障功能。2.MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性經(jīng)MTT處理后，分別測(cè)定兩種細(xì)胞模型BNEAN組、DNEANogd/r組以及不同濃度陽(yáng)性藥物預(yù)處理的PcNEANogd/r組N在490nm波長(zhǎng)處光吸收值，以間接反映兩組不同狀態(tài)下N活性，結(jié)果見(jiàn)表7。表7各實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元MTT(490nm)吸光值**本實(shí)施例模型P<0.01vsDNEANogd/r組#CN201310065078.7模型P<0.05vsDNEANogd/r組##CN201310065078.7模型P<0.01vsDNEANogd/r組&各種狀態(tài)，CN201310065078.7模型P<0.05vs本實(shí)施例模型&&各種狀態(tài)，CN201310065078.7模型P<0.01vs本實(shí)施例模型由表7可以看出，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，兩種細(xì)胞模型的N活性沒(méi)有差異，但是在相同損傷條件刺激下，申請(qǐng)?zhí)朇N201310065078.7細(xì)胞模型中的N活性明顯低于本實(shí)施例(P<0.01)，而在三種給藥濃度的干預(yù)下，CN201310065078.7細(xì)胞模型中的N在0.1mg/mlGBE預(yù)處理后，其活性明顯增強(qiáng)，但是隨著藥物濃度的增加其活性逐漸降低，提示在CN201310065078.7細(xì)胞模型中，由于其E的緊密連接程度不夠，因而使得藥物通過(guò)E、A進(jìn)入模型下腔較為容易，從而使得在相同的給藥濃度下，申請(qǐng)?zhí)朇N201310065078.7細(xì)胞模型下腔的實(shí)際藥物濃度要高于本實(shí)施例。