Cathepsin L在制備治療缺血性腦損傷藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及化合物化th巧sinL的新用途，尤其設(shè)及化th巧sinL在制備治療缺 血性腦損傷藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 本發(fā)明人通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CathepsinL有抗缺血性腦損傷、抗腦缺血/再灌 注損傷的藥理作用，具有預(yù)防或者治療缺血性腦損傷的醫(yī)藥用途。 W03] 本發(fā)明設(shè)及的化合物化th巧sinL是一個(gè)2014年發(fā)表度aileyMiller，etal. ,TheMarineCyanobacterialMetaboliteGallinamideAIsaPotentand SelectiveInhibitorofHumanCathepsinL.J.化t.Prod. 2014, 77, 92-99.)的新化合 物，該化合物擁有全新的骨架類(lèi)型度aileyMiller,etal.,TheMarine切anobacterial MetaboliteGallinamideAIsaPotentandSelectiveInhibitorofHumanCathepsin L.J.化t.Prod. 2014, 77, 92-99.)，對(duì)于本發(fā)明設(shè)及的化th巧sinL在制備治療缺血性腦損 傷藥物中的用途屬于首次公開(kāi)，由于屬于全新的結(jié)構(gòu)類(lèi)型，而且其對(duì)于缺血性腦損傷的治 療作用活性強(qiáng)得意想不到，不存在由其他化合物給出任何啟示的可能，具備突出的實(shí)質(zhì)性 特點(diǎn)，同時(shí)用于缺血性腦損傷的防治顯然具有顯著的進(jìn)步。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有化thepsinL研究中未發(fā)現(xiàn)其具有治療缺血性腦損傷 的報(bào)道的現(xiàn)狀，提供了化thepsinL在制備治療缺血性腦損傷藥物中的應(yīng)用。
[0005] 所述化合物化th巧sinL結(jié)構(gòu)如式（I)所示：
[0006]
[0007] 所述化th巧sinL在制備治療缺血性腦損傷藥物中的應(yīng)用，CathepsinL減少腦 缺血后腦組織水腫，縮小梗死體積，提高SOD活性，降低MDA含量，減輕自由基反應(yīng)對(duì)腦組織 的損害。
[0008] -種治療缺血性腦損傷藥物，由化thepsinL為活性成分添加輔料制備而成，制備 方法為取5克化合物化thepsinL加入糊精195克，混勻，常規(guī)壓片制成1000片。
[0009] -種治療缺血性腦損傷藥物，由化thepsinL為活性成分添加輔料制備而成，制備 方法為取5克化合物化th巧sinL加入淀粉195克，混勻，裝膠囊制成1000粒。
[0010] 本發(fā)明設(shè)及的化thepsinL在制備治療缺血性腦損傷藥物中的用途屬于首次公 開(kāi)，由于骨架類(lèi)型屬于全新的骨架類(lèi)型，而且其對(duì)于缺血性腦損傷的作用強(qiáng)得意想不到，不 存在由其他化合物給出任何啟示的可能，具備突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)，同時(shí)用于治療缺血性腦 損傷顯然具有顯著的進(jìn)步。
[0011] 本發(fā)明人通過(guò)【具體實(shí)施方式】中的實(shí)驗(yàn)證明了化thepsinL具有治療或預(yù)防缺血性 腦損傷的作用。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 本發(fā)明所設(shè)及化合物化th巧sinL的制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)度aileyMiller， etal. ,TheMarineCyanobacterialMetaboliteGallinamideAIsaPotentand SelectiveInhibitorofHumanCathepsinL.J.Nat.Prod. 2014, 77, 92-99.)
[0013]W下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí) 施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加W限定。
[0014] 實(shí)施例1 :本發(fā)明所設(shè)及化合物化th巧sinL片劑的制備：
[0015] 取5克化合物化th巧sinL加入糊精195克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成1000片。
[0016] 實(shí)施例2 :本發(fā)明所設(shè)及化合物化th巧sinL膠囊劑的制備：
[0017] 取5克化合物化th巧sinL加入淀粉195克，混勻，裝膠囊制成1000粒。
[0018] 下面通過(guò)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明其藥物活性。
[0019] 實(shí)驗(yàn)例1:CathepsinL對(duì)大鼠局部腦缺血損傷的影響
[0020] (1)實(shí)施材料：SD大鼠，雌雄兼用，體重190~210g。陽(yáng)性對(duì)照藥：天保寧，康恩貝 集團(tuán)制藥有限公司生產(chǎn)，每片含銀杏葉精提取物40mg。
[0021] (2)方法與結(jié)果 陽(yáng)02引 1)化th巧sinL對(duì)大鼠中動(dòng)脈血栓（MCA0)模型試驗(yàn)
[0023] 將60只大鼠隨機(jī)分為六組，即假手術(shù)對(duì)照組、MCA0模型組、給藥組3組，天保寧組 (24mg/kg)。造模前灌胃給藥，一日一次，共給藥屯次，假手術(shù)對(duì)照組、MCAT模型組、給予等 量的飲用水（Iml/lOOg)，造模后灌胃給藥一次。大鼠腹腔注射12%水合氯醒溶液（350mg/ kg)麻醉，大鼠右側(cè)邸位固定，在眼外贓和外耳道連線(xiàn)中點(diǎn)作一弧形切口，長(zhǎng)約115cm，夾斷 顛骨，用牙科鉆在觀骨與顛鱗骨接合處靠近口側(cè)1mm處做一直徑215mm骨窗，清理殘?jiān)?，?露大腦中動(dòng)脈（位于嗅束及大腦下靜脈之間）。將吸有50%氯化鐵溶液lOul的小片定量 濾紙敷在此段大腦中動(dòng)脈上30min后，取下濾紙，用生理鹽水沖洗局部組織，逐層縫合，回 籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不滴加氯化鐵溶液外，其余手術(shù)步驟同模型組。MCA0大鼠神經(jīng)癥狀和 梗塞范圍的評(píng)定：在手術(shù)不同時(shí)間化h，24h)，按Bederson等方法并加W改進(jìn)，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行 行為評(píng)分。1.提鼠尾離開(kāi)地面約一尺，觀察前肢屈曲情況。如雙前肢對(duì)稱(chēng)伸向地面，記為0 分；如手術(shù)對(duì)側(cè)前肢出現(xiàn)肩屈曲、時(shí)屈曲、肩內(nèi)旋或既有腕時(shí)的屈曲又有內(nèi)旋者，記為1分。 2.將動(dòng)物置于平滑地面上，分別推雙肩向?qū)?cè)移動(dòng)，檢測(cè)阻力。如雙側(cè)阻力對(duì)等且有力者 記為0分；如向手術(shù)對(duì)側(cè)推動(dòng)時(shí)阻力下降者，記為1分。3.將動(dòng)物兩前肢置一金屬網(wǎng)上，觀 察兩前肢的肌張力。雙側(cè)肌張力對(duì)等且有力者為0分；手術(shù)對(duì)側(cè)前肢肌張力下降記為1分。 4.提鼠尾離開(kāi)地面約一尺，動(dòng)物有不停地向手術(shù)對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)著，記為1分；否則記為0分。根 據(jù)W上標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，滿(mǎn)分為4分，分?jǐn)?shù)越高動(dòng)物的行為障礙越嚴(yán)重。對(duì)行為檢測(cè)打分值進(jìn)行組 間比較，t檢驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表1。動(dòng)物經(jīng)末次行為評(píng)分后，斷頭取腦。去掉嗅球、小腦和低位 腦干，剩余部分在4°C下冠狀切成5片。迅速將腦片置于TTC染液中（每5ml染液中含4% TTC1. 5ml，1MK2HPO4O. 1ml)，37°C避光溫解30min，再取出置于10%甲醒液中避光保存。經(jīng) 染色后非缺血區(qū)為玫瑰紅色，梗塞區(qū)為白色。將白色組織仔細(xì)挖下稱(chēng)重，W梗塞組織重量占 右側(cè)半腦重量的百分比作為腦梗塞范圍。結(jié)果進(jìn)行組間比較，t檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。
[0024] 表1化th巧sinL對(duì)MCA0大鼠腦梗塞范圍及神經(jīng)癥狀的影響（η= 10) 陽(yáng)0巧]
[0026] 注：與模型組相比 *ρ<0. 05, **ρ<0. 01。
[0027] 表2化th巧sinL對(duì)光化學(xué)誘導(dǎo)腦血栓形成大鼠腦梗塞的影響（η= 10)
[0028]
[0029] 注：與模型組相比 *p<0. 05, **p<0. 01。
[0030] 結(jié)果顯示，除假手術(shù)未見(jiàn)行為異常改變，MCAO模型組大鼠在術(shù)后化、24h均出現(xiàn) 偏擁樣癥狀。給藥組與天保寧組的大鼠在術(shù)后化、24h其神經(jīng)癥狀均有不同程度的改善 任<0.01，P<0.05)。術(shù)后2地，除假手術(shù)組未見(jiàn)腦組織異常改變外，模型組相比具有顯著差 異（P<0. 01，P<0. 05)。CathepsinL可減輕梗塞灶，結(jié)果顯示出一定的量效關(guān)系。
[0031] 實(shí)驗(yàn)例2:CathepsinL對(duì)大鼠局部腦缺血/再灌注損傷的影響 陽(yáng)0巧 （1)實(shí)驗(yàn)材料：SD大鼠，雌雄兼用，體重190~210g。MDA，SOD，蛋白定量（考馬斯 亮藍(lán)）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。 陽(yáng)〇3引 似方法與結(jié)果
[0034] 1)實(shí)驗(yàn)方法：120只大鼠隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組、模型組、3個(gè)給藥組，每組25 只。除假手術(shù)組不插線(xiàn)外，其余4組造模（MCA0)。給藥組各劑量組ig每天1次，連續(xù)13d。 術(shù)前比ig再給藥1次。6%水合氯醒（350mg/kg)腹腔麻醉，頸部正中切開(kāi)，分離右側(cè)頸總 動(dòng)脈（CCA)、頸外動(dòng)脈巧CA)、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA)。結(jié)扎頸總動(dòng)脈近屯、端、頸外動(dòng)脈起始端后，在 頸總動(dòng)脈處剪一"V"形小口，沿頸總動(dòng)脈插入線(xiàn)栓（線(xiàn)栓采用直徑為0. 235mm的魚(yú)線(xiàn)，頭端 燒成球狀，并于距線(xiàn)球18. 5mm處作標(biāo)記）經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈向煩內(nèi)插至大腦中動(dòng)脈分支叉處，插 入深度為18~20mm，將線(xiàn)與頸內(nèi)動(dòng)脈一起結(jié)扎。術(shù)中維持體溫（37±015)°C。在灌注時(shí)外 拉線(xiàn)使球端回至ECA，拔除插線(xiàn)，結(jié)扎ECA即可。假手術(shù)組除不插線(xiàn)外，其余步驟同上。大腦 中動(dòng)脈栓塞后化恢復(fù)血供，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分參照Z(yǔ)eaLongaS分制標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)后出現(xiàn)左前肢屈 曲，行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈即視為造模成功，然后保溫常規(guī)飼養(yǎng)，至24h斷頭處死取材。實(shí)驗(yàn)過(guò) 程中，因麻醉意外、MCA0手術(shù)失敗、造模不成功及24h內(nèi)死亡的均棄去不用。
[0035] 腦組織含水量的測(cè)定：大鼠造模24h后斷頭取腦，稱(chēng)量?jī)蓚?cè)半腦濕重。再置于烘箱 中，100°C烘烤24h至恒重，精確稱(chēng)量干重，計(jì)算含水量。腦組織含水量=(濕重-干重）/ 濕重X 100%。
[0036] 腦梗塞體積測(cè)定：斷頭取腦，將大腦作連續(xù)2mm冠狀切片，共5片，然后將腦片放 入2%TTC憐酸鹽緩沖液中37°C恒溫解育30min，正常腦組織染為紅色，梗死灶呈白死。濾 紙吸去表面液體后用刀片小屯、刻取未著色部分的質(zhì)量百分比，W此反應(yīng)梗死體積比。腦組 織勻漿SOD活力、MDA含量的檢測(cè)：右側(cè)半腦稱(chēng)重后按1 :10加入冰生理鹽水制成勻漿，參照 SOD、MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)腦組織中SOD、MDA含量。應(yīng)用SPSS13. 0化rwindows軟件對(duì) 數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；計(jì)量數(shù)據(jù)WX+S表示，各組間比較采用單因素方差分析。
[0037] 。結(jié)果
[0038] 腦組織含水量：左腦組織含水量各組間相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組右腦組織含水 量明顯高于各組（P<〇. 05)，高于假手術(shù)組（P<0. 05)，給藥組各劑量組可降低模型腦組織含 水量（p<〇. 05)(表 3)。
[0039] 表3化th巧sinL對(duì)腦組織含水量、梗死體積、SOD、MDA含量的影響（η=8)
[0040]
[0041] 與模型組相比*ρ<0. 05, *卸<0. 01
[0042] 腦梗塞體積：模型組腦組織腦梗塞體積高于各組（P<0. 05)，給藥組各劑量組可降 低模型腦組織梗死體積（P<〇. 05)。
[0043] 結(jié)論：CathepsinL可減少腦缺血后腦組織水腫，縮小梗死體積，提高SOD活性， 降低MDA含量，減輕自由基反應(yīng)對(duì)腦組織的損害，對(duì)缺血腦組織具有明顯的保護(hù)作用。 化th巧sinL可W用于制備治療缺血性腦損傷藥物。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. Cathepsin L在治療缺血性腦損傷藥物中的應(yīng)用，所述化合物Cathepsin L結(jié)構(gòu)如式 (I )所示：式（I )。2. 如權(quán)利要求1所述Cathepsin L在治療缺血性腦損傷藥物中的應(yīng)用，其特征在于 Cath印sin L減少腦缺血后腦組織水腫，縮小梗死體積，提高SOD活性，降低MDA含量，減輕 自由基反應(yīng)對(duì)腦組織的損害。3. -種治療缺血性腦損傷藥物，其特征在于由權(quán)利要求1所述Cathepsin L為活性成 分添加輔料制備而成，制備方法為取5克化合物Cathepsin L，加入糊精195克，混勻，常規(guī) 壓片制成1000片。4. 一種治療缺血性腦損傷藥物，其特征在于由權(quán)利要求1所述Cathepsin L為活性成 分添加輔料制備而成，制備方法為取5克化合物Cathepsin L，加入淀粉195克，混勻，裝膠 囊制成1000粒。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了Cathepsin？L在制備治療缺血性腦損傷藥物中的應(yīng)用，屬于藥物新用途技術(shù)領(lǐng)域。Cathepsin？L對(duì)治療缺血性腦損傷具有治療作用，因此具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景，屬于首次公開(kāi)，而且其對(duì)于治療缺血性腦損傷活性強(qiáng)。
【IPC分類(lèi)】A61P9/10, A61K31/4015
【公開(kāi)號(hào)】CN105412085
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510902422
【發(fā)明人】田麗華
【申請(qǐng)人】淄博齊鼎立專(zhuān)利信息咨詢(xún)有限公司
【公開(kāi)日】2016年3月23日
【申請(qǐng)日】2015年12月8日