用于治療腦損傷或中風的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明關(guān)于一種用于治療腦損傷或中風的方法或試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]缺血性中風是殘疾和死亡的一個主要原因。預防和有效治療缺血性中風極為重要。缺血性腦損傷會造成一系列的病理反應(yīng)，包括局部嚴重炎癥的積累、自由基，和不可逆的神經(jīng)細胞死亡。于缺血半影區(qū)的細胞凋亡的進展是可逆的。在缺血半影區(qū)的神經(jīng)細胞大多是功能受損的，但若能及時治療是可修復的。目前對于中風的預防或治療并無有效的藥物或藥物療法。
[0003]中風是由于供應(yīng)大腦的血管阻塞或出血引起的(Kriz，J.andLalancette-Hebert, Μ.2009.Acta Neuropathol.(Berl).117,497-509 ；Lakhan, S.Ε.etal.2009.Journal of Translat1nal Medicine 7，97.Review)，是全世界第二常見的死因(Donnan GA et al.2008.Stroke Lancet.10 ；371 (9624):1612-23.Review)。缺血性中風占所有中風案例的 80 % 以上(Candelar1-Jalil, E.2009.Current Opin1n inInvestigat1nal Drugs 10,644-654)。缺血性腦損傷會誘發(fā)一連串的分子事件，其導致腦損傷，包括興奮性胺基酸毒性、活性氧生成、發(fā)炎和細胞凋亡的分子反應(yīng)(Lakhan，S.E.etal.2009.Journal of Translat1nal Medicine 7, 97.Review) o 大腦缺血性中風后，可根據(jù)損傷區(qū)的剩余血液供應(yīng)量，區(qū)分兩大損害區(qū)域。腦損傷的核心區(qū)將完全無血液供應(yīng)且會有幾乎完全性的能量衰竭，因而導致壞死。另一稱半影區(qū)，圍繞核心區(qū)域，傳統(tǒng)上定義為在閉塞期間輕度至中度腦血流量減少的區(qū)域(Lo，E.H.2008.Nat.Med.14，497-500)。因此，臨床醫(yī)生會以半影區(qū)當作標的進行介入療法，用以拯救腦組織和減少中風后殘疾(Lakhan, S.E.et al.2009.Journal of Translat1nal Medicine 7, 97.Review)0 盡管有眾多專注于神經(jīng)保護的候選藥物的研宄，但因為體內(nèi)毒性或缺乏療效，還沒有任何一種藥物通過所有階段的臨床試驗(Green, A.R.and Shuaib, A.Drug Discov.Today.2006Aug ；
11(15-16)，681-93.Review)。尤其是，明顯缺乏保護大腦免受中風后惡化的療法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明是基于一不可預期的發(fā)現(xiàn)，一個用以采樣大腦中目標分析物的傳統(tǒng)診斷工具一腦微透析一能有效地減少梗塞體積，促進大腦中動脈閉塞(middle cerebral arteryocclus1n, MCAo)造成的腦缺血實驗鼠的行為恢復。另一方面，酸性纖維母細胞生長因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)，一種神經(jīng)保護和神經(jīng)再生的神經(jīng)系統(tǒng)的因子，也被發(fā)現(xiàn)能劑量依賴性地降低了缺血誘發(fā)的腦梗塞和改善MCAo老鼠的功能恢復。
[0005]因此，在一方面，本發(fā)明提供一種用于治療有其需求的個體的腦損傷或中風的方法，包含:植入一微透析探針于該個體的受損或受傷核心，并以溶于生理上可接受緩沖液的滲透壓劑灌注該探針，其中該微透析探針包含一帶有截留分子量低于該滲透壓劑的分子量的透析膜。
[0006]另一方面，上述方法可以進一步包含:施予個體溶栓藥物以及/或神經(jīng)保護劑，如酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)。
[0007]另一方面，本發(fā)明提供一種用于治療腦損傷或中風的試劑盒，包含:一瓶灌流緩沖液，其包含一生理上可接受緩沖液及一溶于其中的滲透壓劑；以及一微透析探針，包含一透析膜，其截留分子量低于該滲透壓劑的分子量。
【附圖說明】
[0008]連同附圖閱讀能幫助了解前面的概述以及接下來的詳細描述，在附圖中:
[0009]圖1 (A)示意一個典型的微透析探針放置在腦缺血鼠的受損核心區(qū)。圖1 (B)中提供在缺血再灌流后2、4、6小時于缺血腦中進行治療性微透析療法的方法。
[0010]圖2㈧至圖2 (C)顯示治療性微透析治療腦缺血大鼠的腦梗塞的時間間隔和持續(xù)時間的功效；其中圖2(A)提供缺血的腦組織的TTC染色影像的代表影像(腦損傷后4小時，開始進行或沒有開始進行微透析治療)，其中TTC染色陽性表示存活的大腦組織；以及圖2(B)及圖2(C)分別提供腦缺血老鼠的梗塞體積(mm3)及梗塞面積/腦面積的大小百分比(各兩只老鼠)；其中該腦缺血老鼠于受損2小時或4小時后被植入微透析探針，并灌流含有或不含有aCSF土BSA的溶液三小時。老鼠在微透析實驗一天后被犧牲。
[0011]圖3(A)至圖3(C)顯示于受損后2小時，開始治療性微透析可有效地降低缺血誘發(fā)的腦梗塞，其中圖3(A)提供MCAo老鼠于受損I周后的腦切片的代表性TTC染色影像；其中陰性TTC染色區(qū)域代表于缺血腦中的梗塞區(qū)域；以及圖3(B)及圖3(C)分別提供于I周再灌流后的缺血腦組織的梗塞體積(_3)及梗塞面積/腦面積(％);其中該梗塞面積/腦面積)代表于腦缺血老鼠中損傷體積相較于全大腦的比率。資料是以平均值土SEM表示。(a:P<0.001，假處理 vs.aCSF/BSA ；b:P<0.001，aCSF vs.aCSF-BSA 以單因子變異數(shù)分析法(one way ANOVA)及Bonferroni t測試法進行分析)。
[0012]圖4㈧至圖4(C)顯示以治療性微透析截取MCAo鼠腦所釋放的谷胺酸及乳酸至透析液中的功效，以及受損I周后大腦的蛋白質(zhì)表達情形，其中圖4(A)提供MCAo老鼠于腦受損后2-5小時間于微透析液中的谷胺酸濃度；其中微透析液是每15分鐘收集一次，收集3小時；圖4(B)顯示MCAo老鼠于腦受損后2-5小時間的微透析液中乳酸釋放情形；及圖4(C)顯示于腦缺血受損I周后的鼠腦切片的western blot分析結(jié)果，其中MAP-2 (微管相關(guān)蛋白 2 (microtubule associated protein 2)的簡稱)為一神經(jīng)元指標、EDI (CD68)代表活化的微膠細胞/巨.細胞、GAP43(亦稱神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(neuromodulin))代表新生合成的神經(jīng)突、GFAP(膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein)的簡稱)為一星狀膠質(zhì)細胞指標、及MBP (髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein)的簡稱)為髓鞘形成寡突細胞的指標。**:P<0.0LaCSF vs.aCSF-BSA以單因子變異數(shù)分析法(one way ANOVA)及Bonferroni t測試法于相同間隔進行分析。
[0013]圖5(A)至圖5(B)顯示治療性微透析治療可改善MCAo老鼠的行為功能，其中圖5(A)提供經(jīng)腦缺血中風后存活I(lǐng)周的老鼠的神經(jīng)缺損分數(shù)，是以神經(jīng)缺損評分法使用五點計分方式評估；以及圖5 (B)提供MCAo老鼠的握力，藉由握力試驗評估MCAo老鼠的右前肢(未受影響側(cè))及左前肢(中風影響側(cè))的功能。資料是以平均值土SEM表示(η代表每組的老鼠數(shù)目；a:P<0.05，假處理 vs.aCSF/BSA ；b:P<0.05，aCSF vs.aCSF/BSA 以單因子變異數(shù)分析法(one way AN0VA)及Bonferroni t測試法進行分析)。
[0014]圖6 (A)至圖 6(D)顯不人類血清白蛋白(human serum albumin，HSA)與 BSA —樣有效可作為滲透壓劑，用于MCAo老鼠的治療性微透析；其中圖6㈧及圖6(B)分別提供經(jīng)再灌流I周后的缺血腦組織的梗塞體積(_3)及梗塞體積/腦(％ );其中該梗塞體積/腦(％)意指受損體積相較于全大腦的比率，使用MCAo+假處理作為100%;圖6(C)提供神經(jīng)缺損分數(shù)；以及圖6(D)提供握力，其是以握力試驗評估MCAo老鼠的右前肢(未受影響側(cè))及左前肢(中風影響側(cè))。資料是以平均值土 SEM表示(η代表每組的老鼠數(shù)目；a:Ρ〈0.05，假處理 vs.aCSF-BSA ；b:P<0.05，aCSF vs.aCSF-BSA 以單因子變異數(shù)分析法(oneway ANOVA)及Bonferroni t測試法進行分析)。
[0015]圖7(A)至圖7(H)為觀察到的皮質(zhì)區(qū)域影像，其中有標記缺血邊界區(qū)域(中間梗塞區(qū)域)。NeuN免疫反應(yīng)性(immunoreactive，IR)細胞代表神經(jīng)元細胞；ED_1，一種活化的微膠細胞/巨噬細胞指標。圖7(A)至圖7(D)為缺血核心區(qū)域附近的腦切片，以抗NeuN抗體進行免疫染色，其中圖7 (A)為源自MCAo+假處理組的腦切片、圖7 (B)為源自MCAo+aCSF組的腦切片、圖7(C)為源自MCAo+aCSF-BSA組的腦切片、及圖7(D)為源自MCAo+aCSF-HSA組的腦切片、及圖7(E)至圖7(H)為使用抗EDl進行免疫染色的腦切片；其中圖7(E)為源自MCAo+假處理組的腦切片、圖7(F)為源自MCAo+aCSF組的腦切片、圖7(G)為源自MCAo+aCSF-BSA組的腦切片、及圖7(H)為源自MCAo+aCSF-HSA組的腦切片。
[0016]圖8 (A)至圖8 (D)顯示于受損6小時后使用治療性微透析介入療法可有效降低缺血誘發(fā)的腦梗塞，其中圖8(A)顯示于再灌流I周后的缺血腦組織中所評估的梗塞體積；圖8(B)顯示梗塞體積/大腦體積(％)，指出損傷體積相較全大腦的比率，以MCAo+假處理作為100% ;圖8(0顯示神經(jīng)缺損分數(shù)；圖8(D)提供大腦缺血性中風老鼠的握力。握力是以握力試驗評估MCAo老鼠的右前肢(未受影響側(cè))及左前肢(中風影響側(cè))。資料是以平均值土SEM表示，每組超過11只老鼠。林: