本發(fā)明涉及在體內(nèi)被高度糖基化并高度長效的長效人生長激素NexP-hGH蛋白，及其制備方法。更具體地，本發(fā)明涉及長效人生長激素NexP-hGH蛋白的一種具體同種型，其中人生長激素與高度糖基化的α-1抗胰蛋白酶突變體融合，及其制備方法。該長效人生長激素的制備方法也涉及一種高純度純化NexP-hGH的方法，具體地包括：(a)將包含長效人生長激素NexP-hGH蛋白——其中人生長激素與α-1抗胰蛋白酶突變體融合——的生物流體施加到陰離子交換樹脂色譜；(b)將包含NexP-hGH蛋白的生物流體或步驟(a)中產(chǎn)生的洗脫物施加到疏水樹脂色譜；和(c)將包含該長效人生長激素NexP-hGH蛋白的生物流體或步驟(a)或步驟(b)中產(chǎn)生的洗脫物施加到填充了附著抗-α-1抗胰蛋白酶抗體片段的樹脂的親合色譜柱。

背景技術(shù)：
通常，天然型人生長激素(hGH)由191個(gè)共具有約21500道爾頓的分子量的氨基酸組成。人生長激素從垂體前葉分泌，并且在體內(nèi)促進(jìn)骨和軟骨生長。生長激素缺乏可造成身材矮小、增加心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)、降低肌肉和骨密度等。為治療生長激素缺乏，源自人腦下垂體或通過遺傳工程技術(shù)生產(chǎn)的生長激素自20世紀(jì)50年代起被使用，全球人生長激素市場在2009年已達(dá)到約3萬億韓元。然而，上述生長激素存在缺點(diǎn)，因?yàn)樗鼈儽仨毻ㄟ^每天皮下注射給藥，因而存在改善和增加患者依從度的需求。為滿足此需求，開發(fā)了長效人生長激素，并且為改善其長效性能，使用了緩釋制劑和諸如與蛋白質(zhì)或糖類融合、糖基化技術(shù)等的改造。例如，2007年，Genetech公司(GenentechInc.)推出了作為第一種緩釋人生長激素產(chǎn)品的NutropinLG生命科學(xué)公司(LGLifeSciencesLTD.)(韓國)推出了Declage(韓國專利號(hào)10-0236771和10-0329336)。然而，緩釋治療仍有問題，因?yàn)樗鼈冊隗w內(nèi)引起不希望的免疫應(yīng)答、由于使用相當(dāng)厚的注射器針導(dǎo)致疼痛并具有低產(chǎn)量。特別地，由于與其他第一代產(chǎn)品相比的低效力，Nutropin退出了市場。為改善除了緩釋制劑之外的蛋白的持續(xù)活性，可使用諸如與聚乙二醇融合成聚合物(Sada等人，發(fā)酵生物工程雜志71,137-139,1991)(Sadaetal.,J.FermentBioeng71,137-139,1991)、糖基化改造(美國專利號(hào)7,217,689)和與其他蛋白質(zhì)融合(WO93/15199)的方法以促進(jìn)體內(nèi)吸收、代謝和排出。然而，上述方法未被用作常規(guī)的增加半衰期的方法，這是由于各種原因，包括由于低產(chǎn)量的低成本效益、長期使用中引起免疫應(yīng)答、綴合中使用的化學(xué)物質(zhì)的毒性等。因此，存在用改善其長效性能同時(shí)最小化上述問題的方法開發(fā)長效人生長激素的需求。韓國專利號(hào)10-1183262公開了以作為體內(nèi)蛋白的α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的突變體和人生長激素之間的綴合物的形式開發(fā)長效人生長激素蛋白，嘗試通過蛋白尺寸增加改善半衰期。此外，韓國專利申請公開號(hào)10-2013-0029713公開了通過α-1抗胰蛋白酶上至少一個(gè)突變加入N-糖基，嘗試增加體內(nèi)半衰期的方法。本發(fā)明人使用的α-1抗胰蛋白酶(A1AT)突變體是其中特定氨基酸被突變以移除α-1抗胰蛋白酶作為蛋白酶抑制劑的固有體內(nèi)活性，同時(shí)增加其半衰期的突變體。其作為蛋白酶抑制劑的固有活性被移除的α-1抗胰蛋白酶的蛋白質(zhì)序列及其制備方法在韓國專利申請公開號(hào)10-2010-01165中公開。長效人生長激素是融合蛋白，其中α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的突變體通過遺傳重組與人生長激素的N端或C端融合，是與第一代人生長激素相比具有改善的半衰期的材料。該長效人生長激素被制備，使得它在CHO細(xì)胞中表達(dá)以被糖基化，而大部分第一代人生長激素藥物是在大腸桿菌(E.coli)中生產(chǎn)的。α-1抗胰蛋白酶的純化是通過用聚乙二醇和pH(EP專利號(hào)0097274)以及陽離子交換樹脂(EP專利號(hào)96929430和95112630)將雜質(zhì)選擇性沉淀而常規(guī)進(jìn)行的。此外，第一代人生長激素通常是通過在大腸桿菌中以包涵體的形式過表達(dá)，然后重折疊并用陰離子交換樹脂純化制備的(韓國專利1998-0003752和PatraAK,MukhopadhyayR,MukhijaR,KrishnanA,GargLC,PandaAK.(2000)18,182-192,200；蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)純化(ProteinExpr.Purif.))。同時(shí)，該長效人生長激素NexP-hGH是一種具有約70至90kDa的分子量的新材料，它與第一代人生長激素或α-1抗胰蛋白酶在生理化學(xué)性質(zhì)方面例如分子量、等電點(diǎn)、多糖模式等不同，具有高純度的長效人生長激素不能由與用于第一代人生長激素或α-1抗胰蛋白酶的相同/相似的純化方法獲得。此外，該長效人生長激素的純化方法在專利或科學(xué)文獻(xiàn)中未被公開。在此情況下，在致力于發(fā)現(xiàn)其高純度尚未被認(rèn)為可能的長效人生長激素的有效純化方法時(shí)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)高純度長效人生長激素可通過陰離子交換樹脂、疏水樹脂、附著抗體片段的樹脂等獲得。此外，體內(nèi)存在的蛋白的糖基化水平對半衰期和效力的影響程度多種多樣，這取決于蛋白的類型，例如常規(guī)使用的蛋白藥物促紅細(xì)胞生成素和粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)。促紅細(xì)胞生成素——一種存在于體內(nèi)的蛋白——的體內(nèi)效力取決于其唾液酸含量而改變(JCEgrie和JKBrowne，英國癌癥雜志(BritishJ.ofCancer)，84,3-10,2001)。具體地，促紅細(xì)胞生成素在唾液酸含量和體內(nèi)效力之間具有高度相關(guān)性，含有預(yù)定比例或更高的唾液酸含量的高度糖基化的多糖顯示適當(dāng)?shù)男Я?。相反，取決于多糖的存在/不存在，GCSF的效力在體外效力方面顯示了高達(dá)25％的差異，但在體內(nèi)效力方面沒有差異(HBonig等人.骨髓移植(Bonemarrowtransplantation)，28,259-264,2001)。因此，在致力于開發(fā)在體外和體內(nèi)條件下都顯示長效藥物學(xué)活性，同時(shí)具有較低的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)的人生長激素時(shí)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)具有特定pI的NexP-hGH蛋白的一個(gè)同種型在上述在動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白中具有卓越的體內(nèi)長效效果和生長效果，因而完成了本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
技術(shù)問題因此，本發(fā)明是在考慮了現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)生的上述問題后作出的。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種在動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的長效人生長激素NexP-hGH蛋白，其中α-1抗胰蛋白酶突變體(NexP)與人生長激素(hGH)融合，具有5.2或更小的等電點(diǎn)(pI)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供制備長效人生長激素NexP-hGH蛋白的方法，該方法包括：(a)將包含長效人生長激素NexP-hGH蛋白——其中α-1抗胰蛋白酶突變體(NexP)與人生長激素(hGH)融合——的生物流體施加到填充了附著抗-α-1抗胰蛋白酶抗體片段的樹脂的親合色譜柱；以及(b)根據(jù)等電點(diǎn)(pI)差異，分離具有5.2或更低的等電點(diǎn)(pI)的長效生長激素NexP-hGH蛋白。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供一種純化高純度長效人生長激素NexP-hGH的方法。技術(shù)方案為實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種在動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的長效人生長激素NexP-hGH蛋白，其中α-1抗胰蛋白酶突變體(NexP)與人生長激素(hGH)融合，具有5.2或更小的等電點(diǎn)(pI)。另一方面，本發(fā)明提供一種純化長效人生長激素NexP-hGH的方法，所述方法包括：(a)將包含長效人生長激素NexP-hGH蛋白——其中人生長激素與α-1抗胰蛋白酶突變體融合——的生物流體施加到陰離子交換樹脂色譜；(b)將該包含NexP-hGH蛋白的生物流體或步驟(a)中產(chǎn)生的洗脫物施加到疏水樹脂色譜；和(c)將該包含長效人生長激素NexP-hGH蛋白的生物流體或步驟(a)或步驟(b)中產(chǎn)生的洗脫物施加到填充了附著抗-α-1抗胰蛋白酶抗體片段的樹脂的親合色譜柱。如本文所用，術(shù)語“人生長激素(hGH)”指允許人中生長、細(xì)胞增殖或再生的肽激素。人生長激素可包括任何可刺激生長板中體內(nèi)細(xì)胞分化，以促進(jìn)生長的蛋白，而不限于本發(fā)明。人生長激素包含天然產(chǎn)生的生長激素和通過遺傳改造技術(shù)生產(chǎn)的，但不限于此。此外，關(guān)于人生長激素的信息可從公眾可獲得的數(shù)據(jù)庫，例如由美國健康研究院(NationalInstituteofHealth(NIH))國立生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(NCBI)提供的GenBank獲得，例如登錄號(hào)為AAA98618的人生長激素等，但不限于此。由于人生長激素能在體內(nèi)通過刺激骺板的細(xì)胞分化促進(jìn)生長，它被視為重要的治療蛋白以用于體內(nèi)合成或分泌有困難的對象中。然而，從對患者用藥方便和治療效果方面一直有開發(fā)具有與常規(guī)生長激素相比增加的半衰期的長效人生長激素的需求。因此，本發(fā)明人開發(fā)了一種α-1抗胰蛋白酶突變體，與人生長激素融合，將獲得的結(jié)果在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，從而開發(fā)高度糖基化的人生長激素NexP-hGH。該高度糖基化的人生長激素NexP-hGH是動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白，具有5.2或更小的等電點(diǎn)(pI)。它比pI超過5.2時(shí)具有更高程度的糖基化，從而實(shí)現(xiàn)高長效性能和效力。如本文所用，術(shù)語“長效人生長激素”指一種蛋白，其中人生長激素(hGH)和α-1抗胰蛋白酶突變體(NexP)融合，可與術(shù)語“NexP-hGH”互換使用。NexP是本發(fā)明人命名的術(shù)語，指α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的一個(gè)突變體，是一種體內(nèi)蛋白，通過保留體內(nèi)長效性能具有增長的半衰期，由本發(fā)明人開發(fā)。移除了其蛋白酶抑制劑活性的α-1抗胰蛋白酶的蛋白序列及其制備方法等在韓國專利號(hào)10-1183262和韓國專利申請?zhí)?0-2013-0029713中公開，韓國專利號(hào)10-1183262或韓國專利申請?zhí)?0-2013-0029713的全部內(nèi)容作為引文使用，但不限于此。α-1抗胰蛋白酶是一種存在于哺乳動(dòng)物血液中的蛋白，具有約50000Da的分子量，也稱為α-1蛋白酶抑制劑。從血液中提取的α-1抗胰蛋白酶被FDA批準(zhǔn)，已經(jīng)以的名稱作為治療肺氣腫的治療劑上市。通常以60mg/kg的劑量通過靜脈內(nèi)注射以一周的間隔給藥，是一種其臨床安全性已被確認(rèn)的蛋白。此外，α-1抗胰蛋白酶作為蛋白酶抑制劑的功能和結(jié)構(gòu)眾所周知(Elliott,P.等人，JMB275,419-425,1998)。此外，α-1抗胰蛋白酶以超過100種不同的等位基因存在，其表型根據(jù)其等電聚焦(IEF)類型分類為‘A’至‘Z’(Stoller等人，TheLancet，365,2225-2236,2005)。其中，最普遍的M型等位基因是正常型，又基于氨基酸序列的突變分類為亞型例如M1(Val213)、M2和M3。因此，用于本發(fā)明的α-1抗胰蛋白酶是一種天然存在的特定亞型，可對其它亞型具有相同效果。關(guān)于α-1抗胰蛋白酶的信息可從公眾可獲得的數(shù)據(jù)庫例如由美國健康研究院(NIH)的國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的Genbank獲得，例如登錄號(hào)為AAH11991的野生型α-1抗胰蛋白酶蛋白等，但不限于此。野生型α-1抗胰蛋白酶蛋白的序列如SEQIDNO:1所示。α-1抗胰蛋白酶可通過經(jīng)由位點(diǎn)定向誘變修飾至少一個(gè)其氨基酸殘基移除其體內(nèi)固有活性，從而增加其半衰期。通過上述氨基酸殘基(一個(gè)或多個(gè))的修飾，產(chǎn)生α-1抗胰蛋白酶的N-糖基化區(qū)域，從而通過氨基酸替換最小化在注射入體內(nèi)時(shí)的免疫原性，同時(shí)中和α-1抗胰蛋白酶的蛋白酶抑制劑活性，并可防止游離半胱氨酸形成二聚體。具體地，至少一個(gè)氨基酸中的突變的特征可在于SEQIDNO:1所表示的α-1抗胰蛋白酶的第357個(gè)氨基酸脯氨酸(P)上的突變，該脯氨酸是該α-1抗胰蛋白酶中的P2位，更具體地，是脯氨酸至天冬酰胺(N)的轉(zhuǎn)變。此外，該α-1抗胰蛋白酶突變體可包含SEQIDNO:1所表示的α-1抗胰蛋白酶的第9個(gè)氨基酸谷氨酰胺(Q)上突變?yōu)樘於０?N)；第232個(gè)氨基酸半胱氨酸(C)上突變?yōu)榻z氨酸(S)；或第359個(gè)氨基酸絲氨酸(S)突變?yōu)樘K氨酸(T)等的突變，該突變體也可包含至少一個(gè)上述突變，以及第357個(gè)氨基酸脯氨酸(P)即P2位上突變?yōu)樘於０?N)的突變，但不限于此。該長效人生長激素NexP-hGH是一種蛋白質(zhì)，其中任何上述α-1抗胰蛋白酶(A1AT)突變體通過遺傳重組與人生長激素的N端或C端融合。具體地，該長效人生長激素NexP-hGH可以是一種融合蛋白(hGH-A1AT(Q9N，P357N))，其中該α-1抗胰蛋白酶突變體——其中第9個(gè)氨基酸谷氨酰胺和第357個(gè)氨基酸脯氨酸都突變?yōu)樘於０贰c人生長激素的N端融合，但不限于此。如本文所用，術(shù)語“高度糖基化的長效人生長激素”指一種包含α-1抗胰蛋白酶突變體和人生長激素的形式的長效人生長激素，它與天然狀態(tài)下存在的野生型蛋白相比具有較高程度的糖基化，并具有5.2或更低的等電點(diǎn)。在本發(fā)明中，確認(rèn)了長效活性隨著該長效人生長激素的糖基化程度變高而變高。具體地，確認(rèn)了當(dāng)該長效人生長激素的等電點(diǎn)為5.2或更小時(shí)，體內(nèi)的長效活性和藥物活性在體外和體內(nèi)都極高。該高度糖基化的長效人生長激素具有5.2或更低的等電點(diǎn)，優(yōu)選地在3.5至5.2的范圍內(nèi)，但不限于此。具體地，糖基化的區(qū)域是多肽內(nèi)的氨基酸殘基或區(qū)域，其中可發(fā)生糖基化例如碳水化合物結(jié)構(gòu)的附著，例如N-糖基化的區(qū)域或O-糖基化的區(qū)域。保守的N-糖基化區(qū)域可以是Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中X是任何氨基酸，但不限于此。該高度糖基化的長效人生長激素可通過培養(yǎng)引入包含編碼該長效人生長激素的多核苷酸的表達(dá)載體的動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生。如本文所用，術(shù)語“動(dòng)物細(xì)胞”指能表達(dá)本發(fā)明的長效人生長激素的細(xì)胞，只要它們能引起糖基化，可不具體限制，例如CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、Vero細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、293細(xì)胞和3T3細(xì)胞，但不限于此。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，制備了與其中第9個(gè)氨基酸谷氨酰胺和第357個(gè)氨基酸脯氨酸都用天冬酰胺取代的α-1抗胰蛋白酶突變體融合的人生長激素蛋白，包含編碼上述蛋白的多核苷酸的載體被引入CHO細(xì)胞，從而構(gòu)建一個(gè)穩(wěn)定細(xì)胞系(實(shí)施例1)。此外，在依次進(jìn)行陰離子交換樹脂色譜、疏水色譜和其中用附著了抗α-1抗胰蛋白酶抗體片段的樹脂填充用于親合色譜的柱的親合色譜后，根據(jù)等電點(diǎn)的差異獲得NexP-hGH蛋白。確定了在同種型1-3中具有最低的pI的同種型1具有比同種型2和同種型3高的糖基化程度，而具有比同種型3低的pI的同種型2具有比同種型3高的糖基化程度(圖1和圖2)。此外，從藥物動(dòng)力學(xué)角度確定了隨著糖基化程度的增加，本發(fā)明的長效人生長激素具有優(yōu)秀的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，并且具體地，等于或超出陽性對照組(圖3)。此外，確定了與陽性對照組中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比，同種型2和同種型3顯著增加了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體長。即，本發(fā)明的高度糖基化的長效人生長激素顯示與陽性對照組相比顯著高的有效性。在本發(fā)明的另一方面，提供了制備長效人生長激素NexP-hGH蛋白的方法，包括：(a)將包含長效人生長激素NexP-hGH蛋白——其中α-1抗胰蛋白酶突變體(NexP)與人生長激素(hGH)融合——的生物流體施加到填充了附著抗α-1抗胰蛋白酶抗體片段的樹脂的親合色譜柱；以及(b)根據(jù)等電點(diǎn)(pI)差異，分離具有5.2或更低的等電點(diǎn)(pI)的長效生長激素NexP-hGH蛋白。該α-1抗胰蛋白酶突變體、人生長激素和該長效人生長激素與上文所解釋的相同。上述制備方法的每個(gè)步驟可詳細(xì)說明如下。首先，步驟(a)涉及將包含長效人生長激素NexP-hGH蛋白的生物流體施加到填充了附著抗α-1抗胰蛋白酶抗體片段的樹脂的親合色譜柱。上述步驟是通過NexP和抗體片段之間的親和性將NexP-hGH附著到柱的步驟。如本文所用，術(shù)語“包含長效人生長激素NexP-hGH的生物流體”可指生產(chǎn)長效人生長激素NexP-hGH蛋白的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清、其細(xì)胞提取物或其部分純化形式，但不限于此。具體地，該生物流體優(yōu)選地是通過培養(yǎng)引入包含編碼該長效人生長激素的多核苷酸的表達(dá)載體的動(dòng)物細(xì)胞獲得的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清或細(xì)胞培養(yǎng)物提取物，或其細(xì)胞提取物，但不限于此。如本文所用，術(shù)語“部分純化”指在進(jìn)行至少一個(gè)純化過程例如色譜后，顯示除了具有意欲的pI值的蛋白外其他蛋白也存在的狀態(tài)。上述部分純化過程不具體限制其類型，但可以是例如疏水色譜或陰離子交換樹脂色譜，但不限于此。該部分純化可用至少一種選自疏水色譜和陰離子交換樹脂色譜的方法進(jìn)行，優(yōu)選地，通過將產(chǎn)生長效人生長激素NexP-hGH蛋白的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其細(xì)胞提取物施加到陰離子交換樹脂色譜或疏水樹脂色譜，從而從其產(chǎn)生洗脫物，并且更優(yōu)選地，依次實(shí)施陰離子交換樹脂色譜和疏水樹脂色譜并從其產(chǎn)生洗脫物，但不限于此。步驟(b)涉及根據(jù)pI差異分離具有5.2或更小的等電點(diǎn)(pI)的長效人生長激素NexP-hGH蛋白。在從附著了抗體片段的樹脂分離時(shí)，具有不同多糖模式和等電點(diǎn)的長效人生長激素NexP-hGH的結(jié)構(gòu)同種型可根據(jù)MgCl2濃度分離和洗脫。因此，在步驟(b)中，為分離和洗脫該具有5.2或更小的等電點(diǎn)的長效人生長激素，可使用包含0至1,000mMMgCl2、優(yōu)選地0至300mMMgCl2、更優(yōu)選地0至200mMMgCl2、甚至更優(yōu)選地200mMMgCl2的Tris緩沖液，但不限于此。在該用于分離和洗脫的Tris緩沖液中，MgCl2可任選地添加或不需要添加。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面，提供了制備長效人生長激素的方法。在本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方式中，培養(yǎng)用人生長激素/α-1抗胰蛋白酶突變體轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞，并通過超濾用20mM磷酸鈉緩沖液透析過濾該細(xì)胞培養(yǎng)物的上清。將韓國專利申請?zhí)?0-2010-0037496作為引文以其整體包括。該制備方法詳細(xì)說明如下。步驟(a)涉及將包含其中人生長激素與α-1抗胰蛋白酶突變體融合的長效人生長激素NexP-hGH蛋白的生物流體施加到用樹脂填充的親合色譜柱到陰離子交換樹脂色譜，優(yōu)選地，將包含長效人生長激素的培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基或通過將培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基用具有pH6至9、包含0至100mMNaCl的緩沖液透析過濾獲得的培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基施加到平衡的陰離子交換樹脂以吸附于其上；用具有pH6至9、包含0至1,00mMNaCl的緩沖液沖洗生成物；并用具有pH6至9、包含100至1,000mMNaCl的緩沖液洗脫包含該長效人生長激素NexP-hGH的部分。使用陰離子交換樹脂，可移除細(xì)胞培養(yǎng)物中的染料和核酸例如DNA/RNA，并可濃縮該生物流體中含有的長效人生長激素。如本文所用，術(shù)語“陰離子交換樹脂色譜”指將帶負(fù)電(或酸性)的分子綴合到帶正電的載體，從而根據(jù)電荷分離該分子，該分子的同系物(酸性、堿性和中性)可用該技術(shù)方便地分離。用于本發(fā)明的陰離子交換色譜的樹脂可包括但不限于強(qiáng)陰離子交換樹脂和弱陰離子交換樹脂，例如(GEhealthcare)等，也可使用其官能團(tuán)是季胺(Q)、二乙基氨乙基(DEAE)和季氨基乙基(QAE)的樹脂，但不限于此。優(yōu)選地，樹脂的官能團(tuán)可以是Q或DEAE，更優(yōu)選地是QSepharose，它是強(qiáng)陰離子交換樹脂。陰離子交換樹脂色譜可通過柱色譜或間歇方式進(jìn)行。對于商業(yè)制造，可優(yōu)選間歇方式。在沖洗陰離子交換樹脂后，通過分步鹽梯度或連續(xù)鹽梯度進(jìn)行洗脫?？墒褂萌魏芜m當(dāng)?shù)姆植禁}梯度或連續(xù)鹽梯度，只要它們能從該長效人生長激素分離雜質(zhì)。此外，用于本發(fā)明的陰離子交換樹脂色譜的陰離子交換樹脂在向其吸附培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基前可用水性緩沖液平衡。當(dāng)培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基在吸附到陰離子交換樹脂前用具有pH6至9、包含0至100mMNaCl的緩沖液稀釋或濃縮或透析時(shí)，純化效力可大大提高。以上可通過使用超濾進(jìn)行透析過濾實(shí)現(xiàn)。透析過濾能移除培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基中具有30000或更小的截留分子量(MWCO)的低分子量材料(例如表面活性劑、染料、小肽、糖組分等)，并通過用一種用于陰離子交換樹脂色譜的平衡緩沖液進(jìn)行緩沖液交換增強(qiáng)柱吸附效力。同時(shí)，超濾能夠根據(jù)顆粒尺寸分級(jí)溶解或分散在液體中的材料，并且通常，它能夠分離、濃縮和純化具有數(shù)千至數(shù)十萬的分子量的分子或膠體顆粒。超濾膜的功能由MWCO指示，并且具有大于該膜的MWCO的分子量的材料被從過濾排除。通常，MWCO由其中90％可被排除的球形蛋白的分子量代表。超濾膜的主要功能是透析過濾、純化和濃縮。待用于相應(yīng)的沖洗和洗脫步驟的緩沖液包括磷酸鈉緩沖液、磷酸鉀緩沖液或Tris緩沖液。在本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方式中，由表達(dá)長效人生長激素NexP-hGH從CHO細(xì)胞獲得的培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基用20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)通過超濾透析過濾。該樣品然后通過以20mL/min的流速施加，結(jié)合到用20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)平衡的Q-Sepharose樹脂填充的XK-50柱，用3倍柱體積的作為洗脫溶劑的含100mMNaCl的20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)以20mL/min的流速?zèng)_洗以移除雜質(zhì)，最后以約85％的純度洗脫該長效人生長激素(圖5)。步驟(b)可涉及將包含該長效人生長激素NexP-hGH的培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基或步驟(a)中產(chǎn)生的洗脫物施加到疏水樹脂色譜中，優(yōu)選地，從陰離子交換樹脂色譜回收的溶液加到平衡的疏水樹脂并吸附于其上，用具有6至8的pH、包含1至3MNaCl的緩沖液沖洗，以用具有6至8的pH、包含0至1MNaCl的緩沖液洗脫包含該長效人生長激素NexP-hGH的部分。疏水樹脂能夠更好地移除未從該陰離子交換樹脂純化的源自細(xì)胞的雜質(zhì)。上述結(jié)果可通過比較約80％純度的陰離子交換樹脂和圖6中約90％或更高純度的疏水樹脂確認(rèn)。因此，本發(fā)明與常規(guī)純化方法不同的在純化中在步驟(a)后進(jìn)行步驟(b)的構(gòu)成特征基于以下關(guān)于色譜組合的發(fā)現(xiàn)：(1)由于陰離子交換樹脂(約10-20mgNexP-hGH/樹脂1mL)具有比疏水樹脂(約6mgNexP-hGH/樹脂1mL)高的結(jié)合容量，陰離子交換樹脂適于第一柱，其主要目標(biāo)是捕獲培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基中的NexP-hGH。(2)在工藝效率方面，在陰離子交換樹脂工藝完成時(shí)，從該陰離子交換樹脂獲得的洗脫物可直接施加到疏水樹脂工藝而不需要對從陰離子交換樹脂獲得的該洗脫物進(jìn)行濃縮/透析。當(dāng)步驟(b)疏水樹脂工藝首先進(jìn)行時(shí)，來自疏水樹脂的洗脫物應(yīng)當(dāng)用一種用于陰離子交換樹脂的平衡緩沖液濃縮/透析，然后用陰離子交換樹脂工藝處理，因此具有需要額外的濃縮/透析工藝的缺點(diǎn)。(3)此外，由于陰離子交換樹脂在移除培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基中所含的染料和移除DNA方面有效，本發(fā)明的在第一柱中使用陰離子交換樹脂的方法可顯示優(yōu)于常規(guī)純化方法的純化結(jié)果。如本文所用，術(shù)語“疏水樹脂色譜”指在具有綴合于多種市售基質(zhì)、不帶電的疏水性——更適當(dāng)?shù)胤枷阕寤蛑咀宓摹潴w的凝膠中進(jìn)行的色譜。待用作上述凝膠的樹脂優(yōu)選地具有相對小的微珠尺寸用于高分辨率，例如Source(GEhealthcare)、Resource(GEhealthcare)等，但不限于此。優(yōu)選地，待用作配體的樹脂的官能團(tuán)可以是苯基、辛基、異丙基、丁基、乙基等，以及更優(yōu)選地是苯基樹脂。待用于本發(fā)明的疏水色譜的洗脫液可不具體限制，但優(yōu)選地是具有6至8的pH、包含0至1MNaCl的緩沖液。在本發(fā)明中，可通過在將陰離子交換樹脂洗脫物吸附到疏水樹脂前用具有6至8的pH、包含3至4MNaCl的緩沖液稀釋，或用具有6至8的pH、包含1至3MNaCl的緩沖液濃縮/透析該陰離子交換樹脂洗脫物，從而將該陰離子交換樹脂洗脫物中的NaCl濃度增加到2M或更高，以提高純化效力。用于上述相應(yīng)的沖洗和洗脫的緩沖液的實(shí)例優(yōu)選地是磷酸鈉緩沖液、磷酸鉀緩沖液或Tris緩沖液。此外，優(yōu)選地使用該緩沖液，以線性濃度梯度洗脫從將陰離子交換樹脂色譜洗脫物施加到疏水色譜樹脂獲得的結(jié)合于疏水色譜樹脂的長效人生長激素。在本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方式中，長效人生長激素是如下洗脫的：通過將含4MNaCl的20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)加到Q-Spharose柱洗脫物，以獲得包含2.5MNaCl的20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)，制備苯基Sepharose的裝填溶液；將該溶液以20mL/min的流速施加到用苯基Sepharose填充、用含2.5MNaCl的20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)平衡的XK-50柱；用3倍柱體積的含2.5MNaCl的20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)沖洗；然后用4倍柱體積的含0.5MNaCl的20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)洗脫該長效人生長激素。結(jié)果，獲得的長效人生長激素的純度是約96％(圖6)。步驟(c)涉及將包含該長效人生長激素NexP-hGH的生物流體或步驟(a)或步驟(b)中產(chǎn)生的洗脫物施加到填充了附著抗α-1抗胰蛋白酶抗體片段的樹脂的親合色譜柱。優(yōu)選地，步驟(c)可涉及將包含長效人生長激素NexP-hGH的培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基、步驟(a)或步驟(b)中產(chǎn)生的洗脫物加樣到附著抗α-1抗胰蛋白酶抗體片段的平衡的親合色譜樹脂以吸附于其上；用具有6.5至8.5的pH、包含0至200mMNaCl的Tris緩沖液沖洗；和用具有6.5至8.5的pH、包含0至1MMgCl2的Tris緩沖液洗脫包含該長效人生長激素NexP-hGH的部分。本發(fā)明的具有高純度和高產(chǎn)量的高級(jí)純化方法的重點(diǎn)在于涉及進(jìn)行抗體片段附著于其上的樹脂的工藝的步驟(c)作為最終步驟進(jìn)行。本發(fā)明人首先確認(rèn)了如果將含有大量留在透析過濾后仍留在培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基中的去垢劑、染料、其他雜質(zhì)等的培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基直接加載到步驟(c)的色譜工藝作為第一工藝，能獲得具有90％或更高純度的長效人生長激素NexP-hGH，但它降低結(jié)合容量，從而減少產(chǎn)量。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了首先進(jìn)行在去垢劑、染料和其他雜質(zhì)存在下對該長效人生長激素NexP-hGH具有高結(jié)合容量(10mg/mL或更高)的步驟(a)以部分移除雜質(zhì)，然后依次進(jìn)行步驟(b)和步驟(c)，其是確保98％或更高的純度和25％或更高的產(chǎn)量的純化工藝，從而完成本發(fā)明的構(gòu)成特征。從上述陰離子交換樹脂和疏水樹脂工藝能獲得具有90％至95％純度的長效人生長激素NexP-hGH，并且為獲得具有99％或更高純度的長效人生長激素NexP-hGH，可進(jìn)一步使用附著了抗體片段的樹脂。此外，確認(rèn)了當(dāng)只使用該附著了抗體片段的樹脂進(jìn)行純化時(shí)，獲得的產(chǎn)量與上述工藝相比減少約20％，但能獲得具有約90％至95％的純度的長效人生長激素。優(yōu)選地，將從該疏水樹脂獲得的包含長效人生長激素NexP-hGH的洗脫物濃縮并用具有7至9的pH、包含0至100mMNaCl的Tris緩沖液透析，或稀釋使得該溶液中NaCl濃度變?yōu)?00mM或更低。經(jīng)濃縮并透析的溶液或經(jīng)稀釋的溶液吸附于附著了抗體片段的樹脂中，具體地，吸附了抗α-1抗胰蛋白酶的樹脂，用具有6.5至8.5的pH、包含0至200mMNaCl的Tris緩沖液沖洗，并用具有6.5至8.5的pH、包含0至1MMgCl2的Tris緩沖液洗脫。優(yōu)選地，用于相應(yīng)的沖洗和洗脫的緩沖液可是磷酸鈉緩沖液、磷酸鉀緩沖液或Tris緩沖液。在本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方式中，該從步驟(b)獲得的包含該長效人生長激素NexP-hGH的溶液通過超濾系統(tǒng)用含150mMNaCl的Tris緩沖液(pH7.4)透析過濾。通過允許足量的含150mMNaCl的Tris緩沖液(pH7.4)流入柱中，平衡了用附著了抗α-1抗胰蛋白酶(A1AT，下文)抗體片段的樹脂填充的XK-50柱(GEHealthcare)，并以20mL/min的流速允許經(jīng)透析過濾的液體流入柱中，再次允許用約3倍柱體積的含150mMNaCl的Tris緩沖液(pH7.4)流入柱中以沖洗該柱。然后用含50mMMgCl2的Tris緩沖液(pH7.4)沖洗柱，隨后依次允許含100mMMgCl2的Tris緩沖液(pH7.4)、含200mMMgCl2的Tris緩沖液(pH7.4)、含300mMMgCl2的Tris緩沖液(pH7.4)流入柱中以洗脫包含該長效人生長激素NexP-hGH的部分。將包含該長效人生長激素NexP-hGH的洗脫物通過超濾系統(tǒng)(MWCO為30000)用含150mMNaCl的PBS緩沖液(pH7.45)透析過濾?；厥盏南疵撐锏募兌蕊@示約為99％(圖7)。優(yōu)選地，上述方法可進(jìn)一步包括步驟(d)，在通過用附著了抗-α-1抗胰蛋白酶抗體片段的樹脂填充的親合色譜柱的純化步驟中，用0至1000mMMgCl2分離和洗脫具有不同多糖模式和等電點(diǎn)的該長效人生長激素NexP-hGH的結(jié)構(gòu)同種型。步驟(d)可使用NaCl代替MgCl2，優(yōu)選地，代替MgCl2使用的NaCl的量是0至2000mM，并且可以是用于分離和洗脫具有不同多糖模式和等電點(diǎn)的該長效人生長激素NexP-hGH的結(jié)構(gòu)同種型的步驟。在分離附著了抗體片段的樹脂時(shí)，具有不同多糖模式和等電點(diǎn)的該長效人生長激素NexP-hGH的結(jié)構(gòu)同種型可根據(jù)MgCl2的濃度分離和洗脫。例如，100mMMgCl2緩沖液可比200mMMgCl2緩沖液選擇性洗脫具有更多多糖模式和更低等電點(diǎn)的結(jié)構(gòu)同種型(圖8)。從附著了抗體片段的樹脂獲得的包含該長效人生長激素NexP-hGH的洗脫物可經(jīng)受進(jìn)一步的緩沖液交換工藝。緩沖液交換工藝可通過凝膠層析或濃縮和透析過濾等進(jìn)行。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用上述方法制備的長效人生長激素NexP-hGH蛋白。該方法和該長效人生長激素NexP-hGH蛋白與以上說明的相同。有益效果根據(jù)本發(fā)明的高度糖基化的長效人生長激素及其制備方法與常規(guī)人生長激素相比顯示了糖基化的顯著增加，因而具有與市售人生長激素例如Diclase相比大幅改善的長效性能和藥學(xué)效力，因此可用于需要人生長激素的領(lǐng)域。此外，本發(fā)明的方法能夠用陰離子交換樹脂、疏水樹脂和附著抗體片段的樹脂從細(xì)胞培養(yǎng)物獲得具有99％或更高純度的重組長效人生長激素NexP-hGH。當(dāng)應(yīng)用于制造工藝時(shí)，本發(fā)明的高純度純化方法可大規(guī)模純化長效人生長激素以具有高純度，因此可用于制造蛋白治療劑。附圖說明圖1和圖2顯示了長效人生長激素的根據(jù)等電點(diǎn)(pI)差異的部分。圖3顯示了確認(rèn)本發(fā)明的高度糖基化的長效人生長激素的同種型1至3對體重的影響的曲線。圖4顯示了本發(fā)明的高度糖基化的長效人生長激素的同種型1至3體長的測量結(jié)果。圖5顯示了通過陰離子交換樹脂色譜分離并通過SDS-PAGE和C4HPLC分析色譜測量的長效人生長激素的純度的測量結(jié)果。圖6顯示了通過疏水樹脂色譜分離并通過SDS-PAGE和C4HPLC分析色譜測量的長效人生長激素的純度的測量結(jié)果。圖7顯示了通過用附著了抗α-1抗胰蛋白酶抗體片段的樹脂填充的親合色譜柱分離并通過SDS-PAGE和C4HPLC分析色譜測量的長效人生長激素的純度的測量結(jié)果。圖8顯示了說明根據(jù)MgCl2濃度分離和洗脫的長效人生長激素的多肽模式和等電點(diǎn)的差異的圖片。左圖中，第1道：疏水樹脂洗脫物；第2道：用100mMMgCl2/Tris緩沖液(pH7.4)洗脫的長效人生長激素NexP-hGH；第3道：用200mMMgCl2/Tris緩沖液(pH7.4)洗脫的長效人生長激素；和第4道：用300mMMgCl2/Tris緩沖液(pH7.4)洗脫的長效人生長激素。右圖中，第1道：用50mMMgCl2/Tris緩沖液(pH7.4)洗脫的長效人生長激素NexP-hGH；第2道：用100mMMgCl2/Tris緩沖液(pH7.4)洗脫的長效人生長激素NexP-hGH；第3道：用200mMMgCl2/Tris緩沖液(pH7.4)洗脫的長效人生長激素NexP-hGH；和第4道：用300mMMgCl2/Tris緩沖液(pH7.4)洗脫的長效人生長激素NexP-hGH。最佳實(shí)施方式下文中，將參考以下的實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明。然而，以下實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)實(shí)施例僅供說明目的，本發(fā)明的范圍不以任何方式受其限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)給定環(huán)境適當(dāng)?shù)剡x擇常規(guī)使用的載體和培養(yǎng)條件。實(shí)施例1：制備人生長激素/α-1抗胰蛋白酶融合蛋白和用于表達(dá)該融合蛋白的細(xì)胞系用源自pSGHV0(GenBank登記號(hào)AF285183)、通過從其移除shGH、His標(biāo)簽和TEV位點(diǎn)改進(jìn)的載體pAV1克隆人生長激素/α-1抗胰蛋白酶融合蛋白，并且將其設(shè)計(jì)以能夠使用蛋白的固有信號(hào)序列進(jìn)行細(xì)胞外分泌。此外，引入DHFR系統(tǒng)作為構(gòu)建組成型表達(dá)該融合蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系的選擇標(biāo)記，并且為此目的，將IRES-DHFR基因插入pAV1載體。為增加表達(dá)量，在該信號(hào)序列中額外插入了Kozac序列。靶蛋白hGH-A1AT(Q9N，P357N)被引入以便它能與hGH在A1AT的N端融合。然后將如此制備的克隆引入CHODG44細(xì)胞系，并選擇高達(dá)4μM，同時(shí)允許其進(jìn)行從50nM甲氨蝶呤(MTX)開始的兩倍增加，從而建立穩(wěn)定細(xì)胞系。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)給定情況適當(dāng)?shù)剡x擇常規(guī)使用的載體和細(xì)胞系并相應(yīng)地應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1：培養(yǎng)表達(dá)長效人生長激素/α-1抗胰蛋白酶融合蛋白的細(xì)胞系并產(chǎn)生該融合蛋白為從如上建立的細(xì)胞系以高產(chǎn)量獲得高度糖基化的生長激素/α-1抗胰蛋白酶融合蛋白，在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)該生長激素/α-1抗胰蛋白酶融合蛋白，即本發(fā)明的長效生長激素。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)給定情況適當(dāng)?shù)剡x擇常規(guī)使用的培養(yǎng)條件并相應(yīng)地應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)實(shí)施方式2：根據(jù)pI分離人生長激素/α-1抗胰蛋白酶融合蛋白將從以上實(shí)施例獲得的表達(dá)細(xì)胞系進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，并且純化從細(xì)胞培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基獲得的本發(fā)明的新型長效生長激素。具體地，過濾細(xì)胞培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基以移除細(xì)胞，因此獲得細(xì)胞上清。通過超濾系統(tǒng)(MWCO為30,000)，使用平衡緩沖液(20mM磷酸鈉，pH8.0)，透析過濾該上清。然后，將生成物注射到Q-Sepharose(GEHealthcare，美國)柱，用含50mMNaCl的20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)移除蛋白雜質(zhì)，并允許含190mMNaCl的20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)流入其中，并且回收包含長效生長激素的溶液。通過將4MNaCl/20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)添加到Q-Sepharose柱洗脫物從而將溶液調(diào)整至約2.5MNaCl/20mM磷酸鈉(pH7.5)，制備苯基-Sepharose(GEHealthcare，美國)的裝填溶液。然后將裝填溶液施加到苯基-Sepharose柱中，用含2.5MNaCl的20mM磷酸鈉緩沖液沖洗該柱。然后，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)回收包含該長效人生長激素的溶液。將該苯基-Sepharose柱洗脫物通過超濾系統(tǒng)(MWCO為30000)，用含150mMNaCl的Tris緩沖液(pH7.4)透析過濾。然后，將生成物施加到附著了抗α-1抗胰蛋白酶(A1AT)抗體片段的樹脂中，并結(jié)合于其上，并用含50mMMgCl2的Tris緩沖液(pH7.4)沖洗。然后，依次允許含100mMMgCl2的Tris緩沖液(pH7.4)、含200mMMgCl2的Tris緩沖液(pH7.4)和含300mMMgCl2的Tris緩沖液(pH7.4)流入其中，從而根據(jù)pI差異分離和洗脫本發(fā)明的長效生長激素。具體地，用100mMMgCl2/Tris緩沖液(pH7.4)、200mMMgCl2緩沖液(pH7.4)和300mMMgCl2/Tris緩沖液(pH7.4)洗脫的本發(fā)明的長效生長激素分別指定為同種型1、同種型2和同種型3(圖1和圖2)。除了以上方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)?shù)剡x擇根據(jù)等電點(diǎn)分離蛋白質(zhì)的常規(guī)方法。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3：人生長激素/α-1抗胰蛋白酶融合蛋白的藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)為確認(rèn)根據(jù)本發(fā)明的長效生長激素的分級(jí)的藥物動(dòng)力學(xué)，進(jìn)行了如下的實(shí)驗(yàn)。通過皮下注射以0.6mg/kg的濃度向切除垂體的大鼠給藥上述同種型1至3，并測量其體重和體長改變，直至第14天，結(jié)果分別如圖3和圖4所示。結(jié)果，如圖3所示，用PBS處理的陰性對照組未顯示體重改變，但用同種型1至3處理的組和用和處理的陽性對照組顯示了顯著的體重增加。具體地，與陽性對照組相比，用同種型1和2處理的組在第10天顯示了體重增加的顯著差異，而用同種型3處理的組顯示了低于陽性對照組的體重增加。此外，體長測量的結(jié)果顯示用同種型1和2處理的組顯示比用處理的組高的體重增加速度，而用同種型3處理的組顯示略低的增加(圖4)。上述結(jié)果說明，取決于多糖程度，即使相同類型的長效激素也可顯示不同的效力，并且特別地，可暗示根據(jù)本發(fā)明的方法制造的具有5.2或更低的pI的NexP-hGH蛋白是高度糖基化的蛋白，并且在體內(nèi)具有長效性能和高生長效果。實(shí)施例2：通過陰離子交換樹脂和疏水樹脂色譜純化長效人生長激素NexP-hGH的方法通過超濾系統(tǒng)(MWCO為30000)用20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)透析過濾在實(shí)施例1中制備的表達(dá)該長效人生長激素NexP-hGH的轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞獲得的約2L培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基。XK-50柱(GEHealthcare)用約250mLQ-Sepharose(GEHealthcare)樹脂填充并通過允許足量的20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)流入其中而平衡。允許約1L經(jīng)透析過濾的液體以20mL/min的流速流入如此制備的Q-sepharose，并且再次通過允許約3倍柱體積(CV)的20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)流入其中以沖洗該柱。在通過允許約3CV的含100mMNaCl的20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)以20mL/min的流速流動(dòng)而移除蛋白雜質(zhì)后，允許約3CV的含200mMNaCl的200mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)以20mL/min的流速流動(dòng)以回收包含該長效人生長激素NexP-hGH的溶液。回收的洗脫物的純度通過C4HPLC分析色譜測量，并且結(jié)果在圖5中顯示。結(jié)果，確認(rèn)了該長效人生長激素NexP-hGH的純度是約85％。通過將4MNaCl/20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)添加到Q-Sepharose柱洗脫物從而將溶液調(diào)整至約2.5MNaCl/20mM磷酸鈉(pH8.0)，制備苯基-Sepharose裝填溶液。XK-50柱(GEHealthcare)用約250mLQ-Sepharose(GEHealthcare)樹脂填充并通過允許足量的含2.5MNaCl的20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)流入其中而平衡。允許約1.2L該苯基-Sepharose裝填溶液以20mL/min的流速流入如此制備的苯基-Sepharose柱，并且再次通過允許約3倍柱體積(CV)的含2.5MNaCl的20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)流入其中以沖洗該柱。通過允許約4CV的含0.5MNaCl的20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)以20mL/min的流速流動(dòng)以回收包含該長效人生長激素NexP-hGH的溶液?；厥盏南疵撐锏募兌韧ㄟ^C4HPLC分析色譜測量，并且結(jié)果在圖6中顯示。結(jié)果，確認(rèn)了該長效人生長激素NexP-hGH的純度是約96％。實(shí)施例3：使用吸附了抗α-1抗胰蛋白酶抗體片段的樹脂的純化方法通過超濾系統(tǒng)(MWCO為30000)使用含150mMNaCl的Tris緩沖液(pH7.4)透析過濾約1L實(shí)施例2中制備的包含該長效人生長激素NexP-hGH的溶液。XK-50柱(GEHealthcare)用約250mL吸附了抗α-1抗胰蛋白酶抗體片段的樹脂(GEHealthcare)(“AIAT”，下文)填充并通過允許足量的含150mMNaCl的Tris緩沖液(pH7.4)以平衡。允許約1L該透析過濾的液體以20mL/min的流速流入如此制備的A1AT柱，并且再次通過允許約3倍柱體積的含150MNaCl的Tris緩沖液(pH7.4)流入其中以沖洗該柱。然后用含50mMMgCl2的Tris緩沖液(pH7.4)沖洗該柱，隨后允許含100mMMgCl2的Tris緩沖液(pH7.4)、含200mMMgCl2的Tris緩沖液(pH7.4)和含300mMMgCl2的Tris緩沖液(pH7.4)依次流入其中，從而洗脫包含該長效人生長激素NexP-hGH的部分。將包含該長效人生長激素NexP-hGH的洗脫物通過超濾系統(tǒng)(MWCO為30000)用含150mMNaCl的PBS(pH7.45)透析過濾?；厥盏南疵撐锏募兌韧ㄟ^C4HPLC分析色譜測量，并且結(jié)果在圖7中顯示。因此，確認(rèn)了該長效人生長激素NexP-hGH的純度是約99％。實(shí)施例4：根據(jù)多糖模式和等電點(diǎn)分離長效人生長激素NexP-hGH在實(shí)施例3中，可根據(jù)MgCl2的濃度分離和洗脫該具有不同的多糖模式和等電點(diǎn)的長效人生長激素NexP-hGH的結(jié)構(gòu)同種型。用含100mMMgCl2的Tris緩沖液(pH7.4)、含200mMMgCl2的Tris緩沖液(pH7.4)和含300mMMgCl2的Tris緩沖液(pH7.4)分離和洗脫的該長效人生長激素NexP-hGH的多糖模式和等電點(diǎn)的差異如圖8所示。以上結(jié)果支持，當(dāng)依次使用陰離子交換樹脂、疏水樹脂和附著抗體片段的樹脂填充的柱時(shí)，本發(fā)明的長效人生長激素可分離和純化成99％或更高的純度，并且具有所需的糖基化的該長效人生長激素可根據(jù)糖基化的差異分離和純化。根據(jù)上文，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將能理解，本發(fā)明可在不改變本發(fā)明的技術(shù)理念或基本特征的前提下以其他具體形式實(shí)施。在此方面，本文公開的示例性實(shí)施方式僅用于說明目的，并且不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明范圍。相反，本發(fā)明意欲不僅覆蓋示例性實(shí)施方式，也覆蓋包含在如權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種替代方案、改進(jìn)、等效和其他實(shí)施方式。