一個(gè)棉花半胱氨酸蛋白酶cysp1-1及其編碼基因與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及半胱氨酸蛋白酶及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一個(gè)來(lái)源于棉花的半胱氨酸蛋白酶cysp1-1及其編碼基因，以及其在培育耐旱性提高的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。技術(shù)背景非生物脅迫，如干旱、鹽漬、極端溫度、化學(xué)污染和氧損傷等能夠?qū)χ参锏纳L(zhǎng)發(fā)育造成嚴(yán)重的危害，對(duì)作物產(chǎn)量造成極大損失，其中干旱對(duì)作物產(chǎn)量的影響，在諸多自然逆境中占首位，其危害相當(dāng)于其它災(zāi)害之和，是許多地區(qū)是農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界干早、半干旱地區(qū)占陸地面積的34％；我國(guó)干早、半干旱地區(qū)約占國(guó)土面積的52％，年受旱面積達(dá)200～270萬(wàn)公頃，全國(guó)灌溉區(qū)每年缺水約300億立方米，因缺水而少收糧食350～400億公斤；特別是我國(guó)主要產(chǎn)糧區(qū)如華北、東北和西北，是我國(guó)缺水最嚴(yán)重的地區(qū)，春旱頻繁達(dá)到十年九遇。由于植物的耐脅迫性大多屬于數(shù)量性狀，現(xiàn)有可利用的種質(zhì)資源匱乏，采用常規(guī)育種技術(shù)改良植物脅迫耐性的難度相當(dāng)大，培育出真正的耐脅迫品種就尤為困難。近年來(lái)，隨著對(duì)植物抗逆分子機(jī)理研究的不斷深入和分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，抗逆研究已經(jīng)從生理水平深入到分子水平，促進(jìn)了植物抗逆基因工程的發(fā)展。當(dāng)植物在受到脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng)，來(lái)降低或消除給植株帶來(lái)的危害。植物的這種應(yīng)答反應(yīng)是一個(gè)涉及多基因、多信號(hào)途徑、多基因產(chǎn)物的復(fù)雜過程。這些基因及其表達(dá)產(chǎn)物可以分為3類：(1)參與信號(hào)級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)和轉(zhuǎn)錄控制的基因及產(chǎn)物；(2)直接對(duì)保護(hù)生物膜和蛋白質(zhì)起作用的基因及其表達(dá)產(chǎn)物；(3)與水和離子的攝入和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白質(zhì)。近年來(lái)，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物對(duì)脅迫耐受能力的研究，以及對(duì)脅迫具有耐受能力的農(nóng)作物、旱生植物和鹽生植物的研究都取得了顯著的成果，對(duì)脅迫相關(guān)基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)也有了更進(jìn)一步的了解(LiuQ.1998.Twotranscriptionfactors，DREB1andDREB2，withanEREBP/AP2DNAbindingdomain，separatetwocellularsignaltransductionpathwaysindroughtandlowtemperatureresponsivegeneexpression，respectively，inArabidopsis.PlantCell，10：1391-1406；KANGJY.2002.Arabidopsisbasicleucinezipperproteinsthatmediatestressresponsiveabscisicacidsignaling。PlantCell，14：343-357；ABEH.2003.ArabidopsisAtMYC2(bHLH)andAtMYB2(MYB)functionastranscriptionalactivatorsinabscisicacidsignaling.PlantCell，15：63-78.)。半胱氨酸蛋白酶作為一類重要的蛋白酶家族，廣泛參與植物的各種生理過程。許多研究表明在環(huán)境脅迫如低溫、干旱和鹽脅迫條件下半胱氨酸蛋白酶mRNA會(huì)累積，其負(fù)責(zé)逆境條件下受損或變性蛋白的降解，為新蛋白的合成提供肽段或游離的氨基酸。但就目前的研究狀況而言，由于其機(jī)制十分復(fù)雜，許多植物對(duì)逆境下的生物化學(xué)和生理學(xué)上的響應(yīng)機(jī)制仍有待深入研究。在抗逆應(yīng)答基因的功能及表達(dá)調(diào)控方面的研究將對(duì)植物抗逆相關(guān)的信號(hào)傳遞途徑之間的聯(lián)系以及整個(gè)信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的研究提供重要的基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明人利用SSH(抑制差減雜交)與RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增)相結(jié)合的方法克隆了棉花的一個(gè)半胱氨酸蛋白酶(本文命名為cysp1-1)的編碼基因。并發(fā)現(xiàn)將其導(dǎo)入受體植物后，可明顯改善轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性，而且這些性狀可穩(wěn)定遺傳。本發(fā)明第一方面提供棉花的一個(gè)半胱氨酸蛋白酶cysp1-1的編碼基因(本文命名為Ghcysp1-1)，其序列為SEQIDNO：2。本發(fā)明第二方面提供一種重組表達(dá)載體，其含有本發(fā)明第一方面所述的基因，其是通過所述基因插入到一種表達(dá)載體而獲得的，優(yōu)選地，所述表達(dá)載體是pCAMBIA2300；并且所述基因的核苷酸序列與所述重組表達(dá)載體的表達(dá)控制序列可操作地連接；優(yōu)選地，所述重組表達(dá)載體為附圖2所示的rd29A-Ghcysp1-1-2300載體。本發(fā)明第三方面提供一種重組細(xì)胞，其含有本發(fā)明第一方面所述的基因或者本發(fā)明第二方面所述的重組表達(dá)載體；優(yōu)選地，所述重組細(xì)胞為重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。本發(fā)明第四方面提供一種改善植物耐旱性的方法，包括：將本發(fā)明第一方面所述的基因或者本發(fā)明第二方面所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物或植物組織并使所述基因表達(dá)；優(yōu)選地，所述植物是煙草。本發(fā)明第五方面提供一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括：在有效產(chǎn)生植物的條件下培養(yǎng)含有本發(fā)明第一方面所述的基因或本發(fā)明第二方面所述的重組表達(dá)載體的植物或植物組織；優(yōu)選地，所述植物是煙草。本發(fā)明第六方面提供本發(fā)明第一方面所述的基因、本發(fā)明第二方面所述的重組表達(dá)載體或者本發(fā)明第三方面所述的重組細(xì)胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育種的用途；優(yōu)選地，所述植物是煙草。本發(fā)明第七方面提供由本發(fā)明第一方面所述基因編碼的氨基酸序列，如SEQIDNO：1所示。附圖說明圖1是Ghcysp1-1的植物表達(dá)載體(rd29A-Ghcysp1-1-2300)的構(gòu)建流程(圖1a-1b)。圖2是Ghcysp1-1的植物表達(dá)載體(rd29A-Ghcysp1-1-2300)的質(zhì)粒圖。圖3是Ghcysp1-1轉(zhuǎn)基因煙草T0代植株(圖中，T0A5；右，T0A11)和作為對(duì)照的非轉(zhuǎn)基因煙草植株(圖左，CK)的耐旱模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖4是利用反轉(zhuǎn)錄PCR對(duì)T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓曛蠫hcysp1-1基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分子水平檢測(cè)的結(jié)果。M為標(biāo)示物DNALadderMarker(DL2000)，1-5為非轉(zhuǎn)基因的對(duì)照煙草植株，6-18為耐旱效果顯著的轉(zhuǎn)基因煙草T0代植株，19-24耐旱效果不顯著的轉(zhuǎn)基因煙草T0代植株。具體實(shí)施方式實(shí)施例下面結(jié)合非限制性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。下面實(shí)施例中提到的限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自NewEnglandBiolabs公司。實(shí)施例1、干旱脅迫下棉花SSH文庫(kù)構(gòu)建：具體方法為：按照Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit試劑盒說明書所示的方法通過抑制差減雜交方法構(gòu)建差減文庫(kù)。在實(shí)驗(yàn)過程中以生長(zhǎng)過程中干旱處理的棉花幼苗葉子的mRNA作為樣本(tester)，以未處理的棉花幼苗葉子的mRNA作為對(duì)照(driver)。具體步驟如下：(1)供試材料：冀棉14(國(guó)家棉花中期庫(kù)，獲取單位中國(guó)棉花研究所，統(tǒng)一編號(hào)：ZM-30270)播種到滅菌的蛭石上，在25℃、光周期16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗條件下培養(yǎng)，每周澆1/2MS培養(yǎng)基(9.39mMKNO3，0.625mMKH2PO4，10.3mMNH4NO3，0.75mMMgSO4，1.5mMCaCl2，50μMKI，100μMH3BO3，100μMMnSO4，30μMZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μMCoCl2，100μMNa2EDTA，100μMFeSO4)一次。當(dāng)苗株高達(dá)25-30cm時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。(2)材料處理：將供試幼苗分為2組，每組4盆，每盆1株。第一組為對(duì)照組，在25℃、光照培養(yǎng)，正常用1/2MS澆灌；第二組為干旱處理組，在25℃、光周期16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗條件下培養(yǎng)，停止?jié)补啵?0天后及時(shí)剪取兩組幼苗頂端1/3的葉片，用液氮迅速冷凍后，于-70℃冰箱中保存。(3)總RNA提取：分別取對(duì)照組和干旱處理組的棉花葉子0.5g，用植物RNA提取試劑盒(Invitrogen)提取棉花的總RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度計(jì)U-2001測(cè)定總RNA在260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值為1.8-2.0，表明總RNA純度較高，用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，28S條帶的亮度約為18S條帶的2倍，表明RNA的完整性良好。使用Qiagen公司的OligotexmRNA純化試劑盒(從總RNA中純化polyA+RNA)分離mRNA。(4)抑制差減雜交：為了增加獲得表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressedsequencetag，EST)(unigene)的有效性，避免基因無(wú)酶切位點(diǎn)及所獲得序列在非翻譯區(qū)。本實(shí)驗(yàn)室按照差減試劑盒中記載的方案，由兩組mRNA分別以引物Oligo(dT)18(TTTTTTTTTTTTTTTTTT)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并將所得cDNA用RsaI，HaeIII進(jìn)行消化，做兩組抑制差減，其他步驟及方法按Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit試劑盒所示的方法進(jìn)行抑制差減雜交，最后合并兩組正向差減雜交cDNA片段的第二次PCR產(chǎn)物。(5)cDNA差減文庫(kù)的構(gòu)建與初步篩選、克隆及鑒定將合并的正向差減雜交cDNA片段的第二次PCR產(chǎn)物(QIAquickPCRPurificationKit純化，購(gòu)自Qiagen)與pGEM-TEasy(購(gòu)自Promega試劑盒)載體連接，依照pGEM-TEasy試劑盒產(chǎn)品說明書所示方法，具體步驟如下：用200μlPCR管依次加入下列成分：純化的正向差減雜交cDNA片段的第二次PCR產(chǎn)物3μl、T4連接酶緩沖液5μl、pGEM-TEasy載體1μl、T4DNA連接酶1μl，于4℃連接過夜。然后取10μL連接反應(yīng)產(chǎn)物，加入到100μL感受態(tài)大腸桿菌JM109(購(gòu)自TAKARA)中，冰浴30min，熱休克60s，冰浴2min，另加250μLLB液體培養(yǎng)基(含有1％胰蛋白胨(Tryptone，購(gòu)自O(shè)XOID)、0.5％酵母提取物(YeastExtract，購(gòu)自O(shè)XOID)和1％NaCl(購(gòu)自國(guó)藥))后置于37℃搖床中，以225r/min振蕩培養(yǎng)30min，然后從中取200μL菌液種植于含50μg/mL氨芐青霉素、40μg/mLX-gal、24μg/mLIPTG(X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)購(gòu)自TAKARA)的LB(同上)固體培養(yǎng)平板上，37℃培育18h。計(jì)數(shù)培養(yǎng)板中直徑＞1mm的清晰白色及藍(lán)色菌落數(shù)，隨機(jī)挑取300個(gè)白色菌落(編號(hào)：Gh-C001至Gh-C300)。將所挑取的白色菌落接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(CORNING)中的含有50μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜后加甘油至甘油終濃度20％(體積比)，于-80℃保存?zhèn)溆谩?duì)所培養(yǎng)的菌落克隆以巢式PCR引物Primer1和Primer2R(來(lái)自Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit試劑盒)進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，得到243個(gè)陽(yáng)性克隆，將所有陽(yáng)性克隆送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序。(6)差異克隆的cDNA測(cè)序分析：將DNA測(cè)序結(jié)果去除載體和不明確序列及冗余的cDNA后，共得到167條表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressedsequencetag，EST)(unigene)。經(jīng)BlastN發(fā)現(xiàn)其中82條unigene在GenBank中有同源序列(蛋白同源性50％以上)，23條EST功能未知或者為假定蛋白，另有35條未獲得同源匹配，推測(cè)可能是處于3’、5’末端非翻譯區(qū)的較短序列。實(shí)施例2棉花半胱氨酸蛋白酶編碼基因Ghcysp1-1的克隆將實(shí)施例1獲得的有效克隆子之一Gh-C192的測(cè)序結(jié)果去掉冗余DNA后，序列為SEQIDNO：3，序列分析表明該序列的編碼的氨基酸序列與已知半胱氨酸蛋白酶序列有較高同源性，本文將克隆子Gh-C192編碼的全長(zhǎng)基因命名為Ghcysp1-1，對(duì)應(yīng)的蛋白命名為cysp1-1。SEQIDNO：3Ghcysp1-1全長(zhǎng)基因的克隆已經(jīng)獲得的Ghcysp1-1基因片段(SEQIDNO：3)，已經(jīng)有終止密碼子TGA，只需要做5’RACE。根據(jù)已經(jīng)獲得的Ghcysp1-1基因片段(SEQIDNO：3)，設(shè)計(jì)三條特異性引物，作為反轉(zhuǎn)錄引物及5’RACE的3’端特異性引物。Ghcysp1-1GSP1：SEQIDNO：4：GTGGCGATTTTATTTATGGhcysp1-1GSP2：SEQIDNO：5：GAGTAACGGCTCCATGATCGhcysp1-1GSP3：SEQIDNO：6：GACGTTTAGGGTCACTCTTTG實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書操作(5’RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司)。用SEQIDNO：5與5’通用引物AAP(試劑盒自帶)，以干旱處理組棉花葉子提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA(反轉(zhuǎn)錄引物SEQIDNO：4)為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，具體步驟如下：ExTaq購(gòu)自TAKARA，50μlPCR反應(yīng)體系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlmRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA，1.0μlExTaq，10μM的引物SEQIDNO：5和AAP各2.0μl，以及35μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，33個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。所得的PCR產(chǎn)物用雙蒸水稀釋50倍后取2.0μl作為模板，用SEQIDNO：6與3’端引物AUAP進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，具體步驟如下：50μlPCR反應(yīng)體系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl稀釋的第一輪PCR產(chǎn)物，1.0μlExTaq，10μM的引物SEQIDNO：6和AUAP各2.0μl，以及35μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。第二次PCR產(chǎn)物回收片段約為600bp條帶(GelExtractionKit購(gòu)自O(shè)MEGA)連接于pGEM-TEasy載體，轉(zhuǎn)化到JM109(具體方法同上)，隨機(jī)挑取10個(gè)白色菌落于...