本發(fā)明涉及一種抗人死亡受體5胞外區(qū)的人源化單克隆抗體、其編碼核苷酸序列、高效表達(dá)該人源化單克隆抗體的重組真核表達(dá)載體、制備所述人源化單克隆抗體的方法、所述人源化單克隆抗體及其組合物的用途。

背景技術(shù)：
發(fā)現(xiàn)于1995年的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand，簡稱TRAIL或Apo2L或TNFSF10)，定位于3號染色體的3q26，屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員，是由281個氨基酸組成的II型跨膜糖蛋白。其C末端在胞外，具有TNF家族的同源性序列。TRAIL受體2(簡稱TRAIL-R2或死亡受體5或DR5)廣泛表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面，而不表達(dá)或較少表達(dá)于正常細(xì)胞表面，其胞外區(qū)包含其天然配體TRAIL結(jié)合區(qū)，胞內(nèi)區(qū)包含死亡結(jié)構(gòu)域(deathdomain)。DR5與TRAIL或其它激動劑結(jié)合后可發(fā)生同源三聚化，其死亡結(jié)構(gòu)域募集胞內(nèi)相關(guān)蛋白形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體(death-inducingsignalcomplex，DISC)，激發(fā)下游細(xì)胞死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而特異性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。前期研究證明，鼠抗人DR5的激動性單克隆抗體AD5-10能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的多種腫瘤細(xì)胞死亡，在體內(nèi)高效抑制裸鼠體內(nèi)人移植瘤的形成和生長，對正常組織和細(xì)胞沒有毒性(GuoYetal.，Anovelanti-humanDR5monoclonalantibodywithtumoricidalactivityinducescaspase-dependentandcaspase-independentcelldeath.JBiolChem2005；280(51)：41940-52；WO2006/017961，ZL200410070093.1)，顯示了良好的臨床應(yīng)用前景。但是，鼠源單克隆抗體作為異種免疫球蛋白，應(yīng)用于人體可被人免疫系統(tǒng)識別而產(chǎn)生人抗鼠抗體(humananti-mouseantibody，HAMA)反應(yīng)，削弱其治療效果，并可能對人體器官產(chǎn)生損傷。因此，將鼠源單克隆抗體進(jìn)行人源化改造，在保持其親和力和特異性的基礎(chǔ)上降低其對人體的免疫原性，是將所述鼠源抗體成功應(yīng)用于人類疾病治療的重要途徑。第一代抗體的人源化改造是將鼠源抗體的可變區(qū)和人源抗體的恒定區(qū)相連接，組成人-鼠嵌合抗體。由于嵌合抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)在空間結(jié)構(gòu)上相對獨(dú)立，雖可較好地保持原鼠源抗體的親和力，但完整的鼠源抗體可變區(qū)仍可能引起HAMA反應(yīng)。在嵌合抗體的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity-determiningregion，CDR)移植技術(shù)，將鼠源單抗可變區(qū)中相對保守的骨架區(qū)(frameregion，F(xiàn)R)替換成人的FR區(qū)，只保留與抗原結(jié)合的CDR區(qū)，構(gòu)建功能性的人源化單克隆抗體，可以最大限度地減少鼠源抗體分子的免疫原性。同時，由于FR區(qū)不僅起到抗體分子的支持骨架作用，還涉及抗原抗體結(jié)合時正確構(gòu)象的形成。因此，對人源化抗體分子FR區(qū)中關(guān)鍵的氨基酸殘基還要進(jìn)行回復(fù)突變，以最大限度地保持鼠源抗體的親和力和特異性。此外，由于在人源化抗體分子中，只有重鏈和輕鏈可變區(qū)中互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和框架區(qū)(FR)的數(shù)個氨基酸殘基來源于所免疫動物的種屬，其余部分則全來自于人類的同型抗體，可以在保持鼠源單抗特異性和親和力的基礎(chǔ)上，最大限度地減少人抗鼠抗體反應(yīng)，延長其在體內(nèi)的半衰期，改善其藥代動力學(xué)特性。而且，人源化抗體具有抗體依賴的細(xì)胞毒反應(yīng)(antibody-dependentcellularcytotoxicity，ADCC)和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒反應(yīng)(complement-dependentcellularcytotoxicity，CDCC)等人類抗體的效應(yīng)功能，更有利于臨床應(yīng)用。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具備完整的轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后加工與分泌機(jī)制，可以高效產(chǎn)生具有正確的折疊、裝配、空間構(gòu)象和良好生物學(xué)效應(yīng)的完整抗體分子，是人源化抗體最理想的表達(dá)體系。因此，真核表達(dá)載體的構(gòu)建對于提高人源化抗體的表達(dá)水平非常重要。理想的真核表達(dá)載體需要強(qiáng)的啟動子和適當(dāng)?shù)暮Y選標(biāo)志，既有利于基因本身的擴(kuò)增，又有利于陽性細(xì)胞的篩選。因此，本發(fā)明的技術(shù)目的在于制備抗人DR5人源化單克隆抗體及其真核表達(dá)載體和所述人源化單克隆抗體在治療多種腫瘤中的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的技術(shù)目的在于提供一種抗人DR5的人源化單克隆抗體。因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種抗人死亡受體5胞外區(qū)的人源化單克隆抗體，其包括與SEQIDNO：1所示的氨基酸序列同一性至少為90％的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列，與SEQIDNO：2所示的氨基酸序列同一性至少為90％的重鏈可變區(qū)氨基酸序列，和人抗體的恒定區(qū)。優(yōu)選地，所述人源化單克隆抗體的重鏈恒定區(qū)為人抗體IgG1的恒定區(qū)，輕鏈恒定區(qū)為人抗體的κ鏈。優(yōu)選地，所述人源化單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列分別為：CDRL1：RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQIDNO：3)；CDRL2：KVSNRFS(SEQIDNO：4)；CDRL3：FQSTHVPHT(SEQIDNO：5)；和/或所述人源化單克隆抗體的重鏈可變區(qū)CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列分別為：CDRH1：DFSMN(SEQIDNO：6)；CDRH2：WINTETGEPTYADDFKG(SEQIDNO：7)；CDRH3：IDY(SEQIDNO：8)。優(yōu)選地，所述人源化單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的骨架區(qū)FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列分別為：FRL1：DaVMTQSPLSLPVTPGEPASISC，其中氨基酸a代表I或V(SEQIDNO：9)；FRL2：WYLQKPGQSPQLLIY(SEQIDNO：10)；FRL3：GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYbC，其中氨基酸b代表Y或F(SEQIDNO：11)；FRL3：FGQGTKLEIKR(SEQIDNO：12)；和/或所述人源化抗體的重鏈可變區(qū)的骨架區(qū)FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列分別為：FRH1：cdQLVQSGeELKKPGASVKVSCKASGYTFT，其中氨基酸c代表Q或E，氨基酸d代表V或I，氨基酸e代表S或P(SEQIDNO：13)；FRH2：WVRQAPGQGLfWMG，其中氨基酸f代表E或K(SEQIDNO：14)；FRH3：RFghSiDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYjCkR，其中氨基酸g代表V或A，氨基酸h代表F或L，氨基酸i代表L或M，氨基酸j代表Y或F，氨基酸k代表A或V(SEQIDNO：15)；FRH4：WGQGTTVTVSS(SEQIDNO：16)。優(yōu)選地，所述人源化單克隆抗體包括與SEQIDNO：1所示的氨基酸序列同一性至少為91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列，和與SEQIDNO：2所示的氨基酸序列同一性至少為91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的重鏈可變區(qū)氨基酸序列。優(yōu)選地，所述人源化單克隆抗體的序列如SEQIDNO：17所示。優(yōu)選地，所述人源化單克隆抗體選自AD10、AD14或AD15，其中AD10的重鏈和輕鏈氨基酸序列分別如SEQIDNO：18和SEQIDNO：19所示，AD14的重鏈和輕鏈氨基酸序列分別如SEQIDNO：20和SEQIDNO：21所示，AD15的重鏈和輕鏈氨基酸序列分別如SEQIDNO：22和SEQIDNO：23所示。本發(fā)明的第二方面涉及一種如第一方面所述的抗人死亡受體5胞外區(qū)的人源化單克隆抗體的編碼核苷酸序列，優(yōu)選地，所述編碼核苷酸序列分別是在編碼重鏈可變區(qū)、恒定區(qū)以及輕鏈可變區(qū)、恒定區(qū)組成的人源化單克隆抗體的重鏈和輕鏈的核苷酸序列之間加入具有自我剪切功能的Furin/2A肽的編碼序列，優(yōu)選地，所述編碼核苷酸序列編碼的人源化單克隆抗體的重鏈、Furin/2A肽和輕鏈的氨基酸序列如SEQIDNO：17所示。本發(fā)明的第三方面涉及一種穩(wěn)定表達(dá)上述第一方面所述的抗人死亡受體5胞外區(qū)的人源化單克隆抗體的重組真核表達(dá)載體，其中上述第二方面所述的人源化單克隆抗體的編碼核苷酸序列被有效地連接到真核表達(dá)載體中以進(jìn)行表達(dá)，優(yōu)選地，所述重組真核表達(dá)載體帶有CAG強(qiáng)啟動子(acytomegalovirusimmediateearlyenhancerandachickenbeta-actinpromoter)和二氫葉酸還原酶(dhfr)篩選標(biāo)記，優(yōu)選地，所述真核表達(dá)載體質(zhì)粒為pcDNA3。本發(fā)明的第四方面涉及一種制備如第一方面所述的抗人死亡受體5胞外區(qū)的人源化單克隆抗體的方法，其包括以下步驟：A)用如第三方面所述的重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞；B)用特異性的親和層析法對所表達(dá)的人源化單克隆抗體進(jìn)行純化。本發(fā)明的第五方面涉及一種由活性成分為如第一方面所述的抗人死亡受體5胞外區(qū)的人源化單克隆抗體與TRAIL或其它抗腫瘤藥物組成的組合物，優(yōu)選地，所述抗腫瘤藥物是表柔比星(epirubicin)。本發(fā)明的第六方面涉及一種如第一方面所述的抗人死亡受體5胞外區(qū)的人源化單克隆抗體、如第二方面所述的第一方面所述的抗人死亡受體5胞外區(qū)的人源化單克隆抗體的編碼核苷酸序列、如第三方面所述的穩(wěn)定表達(dá)第一方面所述的抗人死亡受體5胞外區(qū)的人源化單克隆抗體的重組真核表達(dá)載體或根據(jù)第五方面所述的由活性成分為如第一方面所述的抗人死亡受體5胞外區(qū)的人源化單克隆抗體與其它化療藥物組成的組合物在制備治療腫瘤的藥物中的用途，優(yōu)選地，所述腫瘤為白血病、肝癌、結(jié)腸癌、肺癌或卵巢癌。換言之，為了完成本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種人源化單克隆抗體，其輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列包括與SEQIDNO：1所示的氨基酸序列至少90％相同的輕鏈可變區(qū)(VL)氨基酸序列，優(yōu)選地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％相同的輕鏈可變區(qū)(VL)氨基酸序列，和與SEQIDNO：2所示的氨基酸序列至少90％相同的重鏈可變區(qū)(VH)氨基酸序列，優(yōu)選地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％相同的重鏈可變區(qū)(VL)氨基酸序列。所述人源化單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列分別為：CDRL1(24位到39位氨基酸)：RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQIDNO：3)，CDRL2(55位到61位氨基酸)：KVSNRFS(SEQIDNO：4)，CDRL3(94位到102位氨基酸)：FQSTHVPHT(SEQIDNO：5)，所述人源化單克隆抗體的重鏈可變區(qū)CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列分別為：CDRH1(31位到35位氨基酸)：DFSMN(SEQIDNO：6)，CDRH2(50位到66位氨基酸)：WINTETGEPTYADDFKG(SEQIDNO：7)，CDRH3(99位到101位氨基酸)：IDY(SEQIDNO：8)。所述人源化單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的骨架區(qū)FRL1、FRL2、FRL3和FR4的氨基酸序列分別為：FRL1的1位到23位氨基酸：DaVMTQSPLSLPVTPGEPASISC，其中氨基酸a代表I或V(SEQIDNO：9)；FRL2的40位到54位氨基酸：WYLQKPGQSPQLLIY(SEQIDNO：10)；FRL3的62位到93位氨基酸：GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYbC，其中氨基酸b代表Y或F(SEQIDNO：11)；FRL3的103位到113位氨基酸：FGQGTKLEIKR(SEQIDNO：12)；和/或所述人源化單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的骨架區(qū)FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列分別為：FRH1的1位到30位氨基酸：cdQLVQSGeELKKPGASVKVSCKASGYTFT，其中氨基酸c代表Q或E，氨基酸d代表V或I，氨基酸e代表S或P(SEQIDNO：13)；FRH2的36位到54位氨基酸：WVRQAPGQGLfWMG，其中氨基酸f代表E或K(SEQIDNO：14)；FRH3的67位到98位氨基酸：RFghSiDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYjCkR，其中氨基酸g代表V或A，氨基酸h代表F或L，氨基酸i代表L或M，氨基酸j代表Y或F，氨基酸k代表A或V(SEQIDNO：15)；FRH4的102位到112位氨基酸：WGQGTTVTVSS(SEQIDNO：16)。本發(fā)明還提供一種抗DR5胞外區(qū)的人源化單克隆抗體的制備方法，該人源化單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列包括SEQIDNO：1的輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列和SEQIDNO：2的重鏈可變區(qū)(VH)的氨基酸序列，其輕鏈恒定區(qū)為人抗體的κ鏈，重鏈恒定區(qū)亞型為人IgG1。該制備方法包括以下步驟：通過PCR和合成引物拼接PCR分別得到人源化單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)cDNA片段，利用同源重組將所得到的可變區(qū)cDNA片段通過同源重組到pCP載體中，分別與人IgG1重鏈恒定區(qū)和κ鏈連接后，再用重疊PCR將人源化單克隆抗體的重鏈和輕鏈相連接，并在重鏈和輕鏈之間加入具有自我剪切功能的Furin/2A肽的編碼序列。以pcDNA3為原始載體，將上述人源化單克隆抗體的基因克隆到此載體，構(gòu)建一個新的含有CAG啟動子和dhff篩選標(biāo)記的抗人DR5人源化單克隆抗體的真核表達(dá)載體。本發(fā)明獲得的新的表達(dá)載體，含有具有自我剪切功能的Furin/2A肽的編碼序列，并將人源化單克隆抗體的重鏈和輕鏈連接在一個開放閱讀框內(nèi)。具體而言，所述真核表達(dá)載體帶有CAG強(qiáng)啟動子和dhff篩選標(biāo)記、來自鼠抗人DR5的單克隆抗體(AD5-10)的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)與來自人源抗體的重鏈骨架區(qū)和輕鏈骨架區(qū)分別組成的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的編碼序列、人源IgG1重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)κ鏈的編碼序列、以及在重鏈和輕鏈之間加入的具有自我剪切功能的Furin/2A肽的編碼序列，被有效地連接以高效表達(dá)所述的人源化單克隆抗體。優(yōu)選地，所述鼠抗人DR5的單克隆抗體為AD5-10(GuoYetal.，Anovelanti-humanDR5monoclonalantibodywithtumoricidalactivityinducescaspase-dependentandcaspase-independentcelldeath.JBiolChem2005；280(51)：41940-52；WO2006/017961，ZL200410070093.1)。優(yōu)選地，來自鼠抗人DR5的單克隆抗體AD5-10的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)與來自人源抗體的重鏈骨架區(qū)和輕鏈骨架區(qū)分別組成的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的編碼序列、人IgG1重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)κ鏈、以及在重鏈(H)和輕鏈(L)之間加入的具有自我剪切功能的Furin/2A肽(F2A)連接起來的核苷酸序列編碼的氨基酸序列(HF2AL)為：GSMEFGLSWLFLVAILKGVQCcdQLVQSGeELKKPGASVKVSCKASGYTFTDFSMNWVRQAPGQGLfWMGWINTETGEPTYADDFKGRFghSiDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYjCkRIDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKRKRRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDaVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYbCFQSTHVPHTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECZLE(SEQIDNO：17),其中：斜體的氨基酸序列為F2A，F(xiàn)2A之前的序列為該人源化單克隆抗體的重鏈，F(xiàn)2A之后的序列為該人源化單克隆抗體的輕鏈；氨基酸a代表I或V，氨基酸b代表Y或F，氨基酸c代表Q或E，氨基酸d代表V或I，氨基酸e代表S或P，氨基酸f代表E或K，氨基酸g代表V或A，氨基酸代表F或L，氨基酸i代表L或M，氨基酸j代表Y或F，氨基酸k代表A或V。對于上述氨基酸a到k的可選項(xiàng)，其分別代表的是相應(yīng)的人源抗體的氨基酸或者回復(fù)突變回的鼠源抗體的氨基酸。由于這些可選項(xiàng)本身就是抗體框架區(qū)的組成氨基酸，因此，雖然由這些可選氨基酸組成的抗體可能會存在活性和/或抗原性的某些差別，但均是本發(fā)明所述的抗人DR5人源化單克隆抗體，相互之間無實(shí)質(zhì)性的差別。用抗DR5人源化單克隆抗體的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，經(jīng)親和層析純化獲得完整的、具有殺傷多種腫瘤細(xì)胞活性的抗人DR5人源化單克隆抗體，命名為zaptuzumab。該人源化單克隆抗體和DR5的天然配體TRAIL均可與DR5結(jié)合，但其結(jié)合位點(diǎn)不同。體外研究表明，該抗DR5人源化單克隆抗體可殺死白血病、肝癌、結(jié)腸癌和肺癌等多種腫瘤細(xì)胞，殺傷活性呈時間和劑量依賴關(guān)系。由于該人源化單克隆抗體通過與DR5結(jié)合而發(fā)揮其功能，因此，在本發(fā)明實(shí)施例中證明了其能殺死上述種類的腫瘤細(xì)胞后，有理由相信同樣高表達(dá)DR5的其它惡性腫瘤細(xì)胞也可以被殺死，繼而實(shí)現(xiàn)治療相應(yīng)的惡性腫瘤的目的。所述抗DR5人源化單克隆抗體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬性死亡兩種不同的細(xì)胞死亡形式。體內(nèi)的研究表明，該抗DR5人源化單克隆抗體能強(qiáng)烈地抑制人結(jié)腸癌、肝癌和肺癌等腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長，并且能與TRAIL或表柔比星等抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用，達(dá)到更好的治療效果。停藥后未見明顯的反彈現(xiàn)象。組織學(xué)分析未見引起小鼠肝臟和腎臟等器官病理性變化。本發(fā)明產(chǎn)生的抗DR5人源化單克隆抗體與TRAIL或表柔比星等抗腫瘤藥物的組合具有協(xié)同殺傷多種腫瘤細(xì)胞的作用。本發(fā)明還提供本發(fā)明所述的人源化單克隆抗體在制備治療腫瘤藥物中的用途。最后，本發(fā)明還提供一種所述的人源化單克隆抗體或其至少具有80％同源性的抗體，優(yōu)選地，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的抗體與藥學(xué)上可接受的載體重組后獲得的重組表達(dá)載體在制備治療腫瘤的抗體基因治療藥物中的應(yīng)用。由此可見，在本發(fā)明中，采用基因工程等現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)和方法，制備了抗人DR5的人源化單克隆抗體及其真核表載體，進(jìn)而，將此表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，能夠大量地表達(dá)一種新型的抗DR5的人源化單克隆抗體。在體外，該人源化單克隆抗體具有強(qiáng)烈誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡的能力；在體內(nèi)，該人源化單克隆抗體具有顯著抑制人移植瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤和抑制人移植瘤生長的生物學(xué)活性；該人源化單克隆抗體可與其它抗癌藥物聯(lián)用，在體內(nèi)外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，加強(qiáng)化療藥物的療效，降低化療藥物的劑量和毒副作用。因此，該人源化單克隆抗體在新型抗腫瘤藥物研制與應(yīng)用中具有重要意義。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與效果是獲得了前人沒有報道的抗DR5人源化單克隆抗體及其真核表達(dá)載體。在所述真核表達(dá)載體中，所述人源化單克隆抗體的重鏈和輕鏈被連接在一個開放閱讀框內(nèi)，能夠同時、均衡、匹配地表達(dá)人源化單克隆抗體的重鏈和輕鏈，并自動組裝成功能完整的人源化單克隆抗體分子。該人源化單克隆抗體同DR5結(jié)合的位點(diǎn)與TRAIL與DR5結(jié)合的位點(diǎn)不同，可與TRAIL及表柔比星等抗腫瘤藥物聯(lián)合作用，協(xié)同增強(qiáng)其抗腫瘤的效果。在體外可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，但對正常細(xì)胞無毒副作用。在體內(nèi)具有強(qiáng)烈的抑制人移植瘤形成和生長的抗腫瘤活性，對正常小鼠的肝臟和腎臟等器官無毒副作用。顯示該人源化單克隆抗體可發(fā)展為安全、有效的抗腫瘤藥物。以編碼該人源化單克隆抗體或進(jìn)一步的人源化改型抗體的核苷酸序列與藥學(xué)上可接受的載體重組連接獲得的重組表達(dá)載體也可用于制備治療腫瘤的抗體基因治療藥物?？笵R5人源化單克隆抗體是利用基因工程技術(shù)將鼠源性抗DR5抗體的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)相連接，構(gòu)建成完整的人源化單克隆抗體，可以在保持原單抗特異性和親和力的基礎(chǔ)上，減少人抗鼠抗體反應(yīng)，延長其半衰期和改善藥代動力學(xué)特性，并能有效地活化補(bǔ)體和Fc受體相關(guān)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明在已制備的一株鼠源功能性抗人DR5單克隆抗體(AD5-10)基礎(chǔ)上，通過CDR移植策略建立了人源化單克隆抗體，該抗體在體內(nèi)外對多種腫瘤細(xì)胞具有特異性的凋亡誘導(dǎo)活性，對正常細(xì)胞和組織沒有毒副作用，可單獨(dú)或與TRAIL或其它抗腫瘤藥物聯(lián)用，用于多種腫瘤和與DR5高表達(dá)相關(guān)的其他疾病的治療。附圖說明圖1：是帶有CAG啟動子和dhfr篩選標(biāo)記的抗DR5人源化單克隆抗體的真核表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖。ADHFL(1692)表示抗DR5人源化單克隆抗體的重鏈、Furin/2A肽和輕鏈的編碼核苷酸序列。圖2：是該人源化單克隆抗體的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)親和層析純化獲得的抗DR5人源化單克隆抗體的SDS-PAGE分析結(jié)果。圖3：是使用Biacore系統(tǒng)和CM5芯片測定AD10、AD14和AD15三株該人源化單克隆抗體與其抗原DR5的親和力。A圖的四幅圖(從左到右，從上往下)分別對應(yīng)AD10、AD14、AD15和AD5-10與其抗原DR5親和力的Biacore測定圖譜。B圖是根據(jù)A圖計算出的相應(yīng)親和力。圖4：是采用CCK-8細(xì)胞毒檢測試劑盒測定該人源化單克隆抗體在體外殺傷腫瘤細(xì)胞的活性。顯示以不同濃度的該人源化單克隆抗體AD10、AD14和AD15處理人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat、肝癌細(xì)胞BEL-7402、肺癌細(xì)胞H460和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT11624小時的細(xì)胞存活率。具體實(shí)施方式下面通過下述非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不背離本發(fā)明精神的情況下，可以對本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。下述實(shí)驗(yàn)方法如無特別說明，均為常規(guī)方法，所使用的實(shí)驗(yàn)材料如無特別說明，均可容易地從商業(yè)公司獲取。實(shí)施例實(shí)驗(yàn)例1人源化抗體的設(shè)計與高效表達(dá)抗DR5人源化單克隆抗體的真核表達(dá)載體構(gòu)建與結(jié)果鼠源的AD5-10單克隆抗體(中國專利申請?zhí)?00410070093.1)的重鏈和輕鏈可變區(qū)的CDR片段用Kabatnumberingsystem(http：//www.bioinf.org.uk/abs/#kabatnum)找出并標(biāo)注。重鏈和輕鏈可變區(qū)CDR片段的規(guī)范(canonical)結(jié)構(gòu)預(yù)測根據(jù)文獻(xiàn)(1，KontermannR，DübelS(2001)，HumanisingAntibodiesbyCDRGrafting，p579；2，HwangWY，AlmagroJCetal.，(2005)Methods，36∶35-42)進(jìn)行，選擇具有相同規(guī)范結(jié)構(gòu)的人抗體序列作為接受框架。人源化抗體重鏈的設(shè)計：將支撐CDR結(jié)構(gòu)及VH/VL界面的氨基酸找出并回復(fù)到鼠源抗體序列。經(jīng)過回復(fù)突變的序列與具有相同規(guī)范結(jié)構(gòu)的所有人抗體進(jìn)行比對，選出最相似的人抗體進(jìn)行CDR移植。然后，與IMGT數(shù)據(jù)庫中所有該類抗體比對，盡量將特殊氨基酸突變成常見氨基酸，以降低免疫原性。N端的第一個氨基酸如果是Q，則改變成E。同時，對通過構(gòu)建模型選定的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行回復(fù)突變。確認(rèn)人源化抗體序列沒有引進(jìn)糖基化位點(diǎn)。人源化抗體的J區(qū)(J-region)選擇完全依據(jù)序列的相似程度。人源化抗體的輕鏈設(shè)計采用與上述相同的方法?？贵w同源模建：分別用AD10-5的輕鏈和重鏈以及BLASTSEARCH來搜索PDB蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，尋找與其序列相似度最高的已知結(jié)構(gòu)的人抗體。根據(jù)BLASTSEARCH的輸出結(jié)果和序列相似度，將1DLF、1I9J、1NQB和1PLG選作VL模建的模板。將1IAL、1NLB、1A4K和1FJ1選為VH的模板，利用Schrodinger軟件包分別對VH和VL做同源模建，分別獲得輕鏈和重鏈的結(jié)構(gòu)模型。再利用CCP4軟件包中的contact程序來對結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行分析，列出與CDRloop有相互作用的輕鏈和重鏈框架區(qū)的氨基酸殘基。根據(jù)軟件分析的結(jié)果和人工檢視，發(fā)現(xiàn)框架區(qū)中的以下氨基酸殘基對于維持CDRloop的空間構(gòu)象較為重要，它們是：輕鏈的D60、D70、Y49、F71、M4和V2；重鏈的K46、W47、M48、F67、L69、M71、W102和I2。所設(shè)計的人源化抗體的重鏈、Furin/2A肽和輕鏈的氨基酸序列(如SEQIDNO：17所示)。經(jīng)優(yōu)選設(shè)計的3個人源化抗體AD10、AD14和AD15重鏈和輕鏈的氨基酸序列分別如SEQIDNO：18和19、SEQIDNO：20和21、SEQIDNO：22和23所示。以pcDNA3(Invitrogen，A-150228)為原始載體，以pAM/CAG載體(香港大學(xué)提供)為模板，以上游引物5’GGCGCAGATCTATTGACGTCAAT3’(SEQIDNO：24)和下游引物5’GGCAAGCTTAATTCTTTGCCAAAATG3’(SEQIDNO：25)擴(kuò)增CAG啟動子序列(amodifiedcytomegalovirusimmediateearlyenhancerandachickenbeta-actinpromoter)。以pSV2-dhfr載體DNA(購自ATCC，67110)為模版，以上游引物5’AATCCCGGGACAGCTCAGGGCTGCG3’(SEQIDNO：26)和下游引物5’GGCGGCGCTTCGAAAAAGCCAGCAAAAGCTC3’(SEQIDNO：27)擴(kuò)增二氫葉酸還原酶(dhfr)基因片段。通過拼接PCR擴(kuò)增或化學(xué)合成人源化單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)cDNA片段，利用同源重組技術(shù)將得到的可變區(qū)cDNA片段整合到線性化的帶有人IgG1重鏈恒定區(qū)的通用序列的pCP載體(上海睿智化學(xué)有限公司提供)中。利用PCR擴(kuò)增自我剪切位點(diǎn)Furin/2A肽編碼序列(F2A)(引物1：5’CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAGGAAGAGGCGAGCACCTGT3’(SEQIDNO：28)，引物2：5’GCCCAGCAGCTGGGCGGGCACGCGCATGTCGGGCCCAGGATTGGACTCA3’(SEQIDNO：29)并插入上述獲得的重組質(zhì)粒中人源化單克隆抗體的重鏈和輕鏈編碼核苷酸序列之間，從而依次將CAG、該人源化抗體重鏈(H)、Furin/2A肽(F2A)、該人源化抗體輕鏈(L)的編碼核苷酸序列(表示為HF2AL)和編碼dhfr的核苷酸序列組成一個開放閱讀框(openreadingframe，OPF)。將上述獲得的編碼OPF核苷酸序列插入原始載體pcDNA3，經(jīng)測序鑒定正確，獲得新的抗DR5的人源化單克隆抗體的真核表達(dá)載體(命名為pcDNA3-CAG-HF2AL-dhfr)。所獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒的圖譜如附圖1所示。實(shí)驗(yàn)例2抗DR5人源化單克隆抗體的表達(dá)與純化用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3-CAG-HF2AL-dhfr轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞(購自ATCC，CRL-9096)，于37℃、5％CO2、120rpm/min振蕩培養(yǎng)，使抗DR5人源化單克隆抗體在HEK293真核細(xì)胞中表達(dá)并分泌到細(xì)胞培養(yǎng)液中。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)到細(xì)胞活力小于60％時(約需6天)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。制備1mlProteinA親和層析柱，先用PBS磷酸緩沖液(20mM磷酸鹽、300mM氯化鈉，pH7.0)平衡，然后加入收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清，用PBS磷酸緩沖液洗滌，用100mM的檸檬酸(pH3.0)洗脫。收集的洗脫液立即用1M的Tris-HCl(pH9.0)調(diào)節(jié)到pH8.0，并對PBS緩沖液透析過夜。以SDS-PAGE分析其中的抗DR5人源化單克隆抗體的純度與分子量，結(jié)果見附圖2。實(shí)驗(yàn)例3抗DR5人源化單克隆抗體與其抗原DR5結(jié)合親和力的測定在BiacoreX100系統(tǒng)(GEHealthcare，Uppsala，瑞典)使用的CM5芯片(GEHealthcare，BR-1000-14)上選定空白對照通道和樣品通道。首先用按1∶1混合的50mMN-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)：200mM碳化二亞胺[1-ethyl-3-3-dimethylaminopropylcarbodiimide，EDC]以10μl/min的速度注入空白對照通道和樣品通道7分鐘，進(jìn)行芯片活化。以5μl/min的速度注入溶在pH5.5醋酸鈉溶液中的抗原DR5(45μg/ml)，包被芯片，直至獲得目標(biāo)值680Ru的信號。將1M乙醇胺以10μl/min的速度注入7分鐘，封閉芯片上多余的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合動力學(xué)測試選用HBS-EP(0.01MHEPESpH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.005％SurfactantP20)緩沖液，將純化的該人源化單克隆抗體AD10、AD14和AD15稀釋為不同濃度，分別以30μl/min的速度注入空白通道和樣品通道3分鐘。將HBS-EP緩沖液以30μl/min的速度注入5min，進(jìn)行解離。采用BiacoreX100evaluation2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，結(jié)果見附圖3的A圖和B圖。結(jié)果表明該人源化單克隆抗體保留了親本鼠源抗人DR5單克隆抗體(AD5-10)的抗原親和力。實(shí)驗(yàn)例4抗人DR5人源化單克隆抗體殺傷腫瘤細(xì)胞的活性測定在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行。在生長至對數(shù)生長期的人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat(ATCC，TIB-152)、結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116(ATCC，CCL-247)、肝癌細(xì)胞BEL-7402(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，TCHu10)和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460(ATCC，HTB-177)中，分別加入不同濃度(0、0.5、1、2、4、8μg/ml)的該抗人DR5人源化單克隆抗體AD10、AD14和AD15，處理24小時，以親本鼠源抗人DR5單克隆抗體(AD5-10)及其人-鼠嵌合抗體zaptuximab為對照。按照CCK-8細(xì)胞毒檢測試劑盒(Dojindo，Gaithersburg，MD)操作規(guī)程，加入CCK-8試劑，反應(yīng)2-4小時，在微型酶標(biāo)板測定儀波長450nm處測定OD值。以無細(xì)胞孔的OD值為空白對照“0”。細(xì)胞存活率＝處理孔的OD值/未處理孔OD值，結(jié)果見附圖4。結(jié)果表明上述人源化單克隆抗體具有顯著的腫瘤細(xì)胞殺傷活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，在不改變本發(fā)明所述人源化單克隆抗體的親和性和生物活性的前提下，本發(fā)明所公開的所述人源化單克隆抗體的具體序列可以被進(jìn)行適當(dāng)?shù)母淖?。例如，所述序列中的部分氨基酸殘基可以被刪除、添加和替換而不改變所述序列的親和性和生物活性。例如，本發(fā)明所述CDR和FR區(qū)的部分氨基酸殘基可以被性質(zhì)類似的氨基酸所替換而不影響其親和性和生物活性。所述人源化單克隆抗體的編碼序列可根據(jù)其宿主的密碼子偏愛性的不同而進(jìn)行相應(yīng)的替換。