本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一個來源于棉花的DREB1類轉(zhuǎn)錄因子GhCBF3及其編碼基因，以及其在培育耐逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
非生物脅迫，如干旱、鹽漬、極端溫度、化學(xué)污染和氧損傷等能夠?qū)χ参锏纳L發(fā)育造成嚴(yán)重的危害，對作物產(chǎn)量造成極大損失，其中干旱對作物產(chǎn)量的影響，在諸多自然逆境中占首位，其危害相當(dāng)于其它災(zāi)害之和，是許多地區(qū)是農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸。據(jù)統(tǒng)計，世界干早、半干早地區(qū)占陸地面積的34％；我國干早、半干旱地區(qū)約占國土面積的52％，年受早面積達(dá)20～270萬公頃，全國灌溉區(qū)每年缺水約30億立方米，因缺水而少收糧食350～40億公斤；特別是我國主要產(chǎn)糧區(qū)如華北、東北和西北，是我國缺水最嚴(yán)重的地區(qū)，春旱頻繁達(dá)到十年九遇。由于植物的耐脅迫性大多屬于數(shù)量性狀，現(xiàn)有可利用的種質(zhì)資源匱乏，采用常規(guī)育種技術(shù)改良植物脅迫耐性的難度相當(dāng)大，培育出真正的耐脅迫品種就尤為困難。近年來，隨著對植物抗逆分子機(jī)理研究的不斷深入和分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，抗逆研究已經(jīng)從生理水平深入到分子水平，促進(jìn)了植物抗逆基因工程的發(fā)展。當(dāng)植物在受到脅迫時會產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng)，來降低或消除給植株帶來的危害。植物的這種應(yīng)答反應(yīng)是一個涉及多基因、多信號途徑、多基因產(chǎn)物的復(fù)雜過程。這些基因及其表達(dá)產(chǎn)物可以分為3類：(1)參與信號級聯(lián)放大系統(tǒng)和轉(zhuǎn)錄控制的基因及產(chǎn)物；(2)直接對保護(hù)生物膜和蛋白質(zhì)起作用的基因及其表達(dá)產(chǎn)物；(3)與水和離子的攝入和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白質(zhì)。近年來，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物對脅迫耐受能力的研究，以及對脅迫具有耐受能力的農(nóng)作物、旱生植物和鹽生植物的研究都取得了顯著的成果，對脅迫相關(guān)基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)也有了更進(jìn)一步的了解(LiuQ.1998.Twotranscriptionfactors，DREB1andDREB2，withanEREBP/AP2DNAbindingdomain，separatetwocellularsignaltransductionpathwaysindrought-andlowtemperature-responsivegeneexpression，respectively，inArabidopsis.PlantCell，10：1391-1406；KANGJY.2002.Arabidopsisbasicleucinezipperproteinsthatmediatestress2responsiveabscisicacidsignaling。PlantCell，14：343-357；ABEH.2003.ArabidopsisAtMYC2(bHLH)andAtMYB2(MYB)functionastranscriptionalactivatorsinabscisicacidsignaling.PlantCell，15：63-78.)。但就目前的研究狀況而言，由于其機(jī)制十分復(fù)雜，許多植物對逆境下的生物化學(xué)和生理學(xué)上的響應(yīng)機(jī)制仍有待深入研究。在抗逆應(yīng)答基因的功能及表達(dá)調(diào)控方面的研究占多數(shù)，但抗逆相關(guān)的信號傳遞途徑之間的聯(lián)系以及整個信號傳遞網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。雖然許多研究機(jī)構(gòu)通過現(xiàn)代生物技術(shù)，獲得了各類具有一定抗逆能力的轉(zhuǎn)基因植物，但還未達(dá)到產(chǎn)業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)。因此在提高植物抗逆性方面，還有許多工作需要做。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明人利用SSH與RACE相結(jié)合的方法克隆出了棉花的一個DREB(脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，dehydrationresponsiveelementbindingprotein)類轉(zhuǎn)錄因子(本文命名為GhCBF3)的編碼基因的DNA序列。并發(fā)現(xiàn)將其導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植株后，可明顯改善轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性和抗旱性，而且這些性狀可穩(wěn)定遺傳。本發(fā)明第一方面提供棉花的一個DREB類轉(zhuǎn)錄因子GhCBF3，其序列為SEQIDNO：1。本發(fā)明第二方面提供編碼本發(fā)明第一方面所述的轉(zhuǎn)錄因子的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述核苷酸序列具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。本發(fā)明第三方面提供一種重組表達(dá)載體，其含有本發(fā)明第二方面所述的核苷酸序列并且所述核苷酸序列與所述表達(dá)載體的表達(dá)控制序列可操作地連接；優(yōu)選地，所述載體為附圖2所示的rd29A-GhCBF3-2300載體。本發(fā)明第四方面提供一種重組細(xì)胞，其含有本發(fā)明第二方面所述的核苷酸序列或者本發(fā)明第三方面所述的重組表達(dá)載體；優(yōu)選地，所述重組細(xì)胞為重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。本發(fā)明第五方面一種改善植物耐寒性和/或抗旱性的方法，包括：將本發(fā)明第二方面所述的核苷酸序列或者本發(fā)明第三方面所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物或植物組織并使所述基因表達(dá)；優(yōu)選地，所述植物是煙草。本發(fā)明第六方面一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括：在有效產(chǎn)生植物的條件下培養(yǎng)含有本發(fā)明第二方面所述的核苷酸序列、本發(fā)明第三方面所述的重組表達(dá)載體的植物或植物組織；優(yōu)選地，所述植物是煙草。本發(fā)明第七方面提供本發(fā)明第一方面所述的轉(zhuǎn)錄因子、本發(fā)明第二方面所述的核苷酸序列、本發(fā)明第三方面所述的重組表達(dá)載體或者本發(fā)明第四方面所述的重組細(xì)胞用于改善植物耐寒性和/或抗旱性以及用于植物育種的用途；優(yōu)選地，所述植物是煙草。附圖說明圖1是GhCBF3的植物表達(dá)載體(rd29A-GhCBF3-2300)的構(gòu)建流程。圖2是GhCBF3的植物表達(dá)載體(rd29A-GhCBF3-2300)的質(zhì)粒圖。圖3是轉(zhuǎn)基因煙草抗寒性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖左為轉(zhuǎn)基因植株(T1I1-2)；圖右為非轉(zhuǎn)基因植株(對照)。圖4是轉(zhuǎn)基因煙草抗旱性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖左為轉(zhuǎn)基因植株(T1I4-13)；圖右為非轉(zhuǎn)基因植株(對照)。具體實(shí)施方式實(shí)施例下面結(jié)合非限制性實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。下面實(shí)施例中提到的限制性內(nèi)切酶均購自NewEnglandBiolabs公司實(shí)施例1冷脅迫下棉花SSH文庫構(gòu)建：具體方法為：利用Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit，按照產(chǎn)品說明書所示的方法通過抑制消減雜交方法構(gòu)建消減文庫。在實(shí)驗(yàn)過程中以低溫處理6h的棉花幼苗葉片的mRNA作為樣本(tester)，以未處理的棉花幼苗葉片的mRNA作為對照(driver)。(1)供試材料：冀棉14(國家棉花中期庫，獲取單位中國棉花研究所，統(tǒng)一編號：ZM-30270)播種到滅過菌的蛭石上，在25℃、光周期16h/8h條件下培養(yǎng)，每周澆1/2MS培養(yǎng)基(9.39mMKNO3，0.625mMKH2PO4，10.3mMNH4NO3，0.75mMMgSO4，1.5mMCaCl2，50μMKI，100μMH3BO3，100μMMnSO4，30μMZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μMCoCl2，100μMNa2EDTA，100μMFeSO4)一次。當(dāng)苗株高達(dá)25-30cm時用于實(shí)驗(yàn)。(2)材料處理：將供試幼苗分為2組，每組4盆，每盆1株。第一組為對照組，在25℃、光照培養(yǎng)，第二組為低溫處理組，在4℃低溫中處理6h，光照培養(yǎng)。處理完畢后及時剪取兩組幼苗頂端1/3的葉片，用液氮迅速冷凍后，于-70℃冰箱中保存。(3)總RNA提?。悍謩e取對照和低溫處理的棉花葉子0.5g，用植物RNA提取試劑盒(invitrogen)提取棉花的總RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度計U-2001測定總RNA在260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值為1.8-2.0，表明總RNA純度較高，用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，28S條帶的亮度約為18S條帶的2倍，表明RNA的完整性良好。使用Qiagen公司的OligotexmRNA純化試劑盒(purificationofpolyA+RNAfromtotalRNA)分離mRNA。(4)抑制消減雜交：為了增加獲得EST(unigene)的有效性，避免基因無酶切位點(diǎn)及所獲得序列在非翻譯區(qū)，本實(shí)驗(yàn)室使用Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit，按照商品說明書用RsaI，HaeIII分別對來自上述分離mRNA的雙鏈cDNA進(jìn)行消化，做兩組抑制消減雜交，其他步驟及方法嚴(yán)格按Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit產(chǎn)品說明書所示的方法進(jìn)行抑制消減雜交，最后合并兩組正向消減雜交cDNA片段的第二次PCR產(chǎn)物。(5)cDNA消減文庫的構(gòu)建與初步篩選、克隆、鑒定合并的正向消減雜交cDNA片段的第二次PCR產(chǎn)物(QIAquickPCRPurificationKit純化，購自Qiagen)與pGEM-TEasy載體(購自Promega)連接，依照pGEM-TEasy試劑盒產(chǎn)品說明書所示的方法，具體步驟如下：用200ulPCR管依次加入下列成分：純化cDNA片段的第二次PCR產(chǎn)物3ul，T4連接酶緩沖液5ul，pGEM-TEasy載體1ul，T4DNA連接酶1ul，于4℃連接過夜。取10μL連接反應(yīng)產(chǎn)物，加入到100μL感受態(tài)大腸桿菌JM109(購自TAKARA)中，冰浴30min、熱休克60s、冰浴2min，另加250μLLB培養(yǎng)液(1％Tryptone購自O(shè)XOID，0.5％YeastExtract購自O(shè)XOID，1％NaCl購自國藥)置37℃搖床中，225r/min搖菌30min，取200μL菌液種植于含50ug/mL氨芐青霉素、40ug/mLX-gal、24ug/mLIPTG(X-gal/IPTG購自TAKARA)的LB(同上)固體培養(yǎng)平板上，37℃培育18h。計數(shù)培養(yǎng)板中直徑＞1mm的清晰白色及藍(lán)色菌落數(shù)，隨機(jī)挑取200個白色菌落(編號：Gh-C001至Gh-C200)于含有50ug/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(CORNING)中，37℃培養(yǎng)過夜后加甘油至終濃度20％，于-80℃保存?zhèn)溆?。以巢式PCR引物Primer1(PCR-selectTMcDNASubtractionKit試劑盒自帶)和Primer2R(PCR-selectTMcDNASubtractionKit試劑盒自帶)進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，得到152個陽性克隆，對所有陽性克隆在送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序。(6)差異克隆的cDNA測序分析：將DNA測序結(jié)果去除載體和不明確序列及多余的cDNA后，共得到112個EST(unigene)。經(jīng)BlastN發(fā)現(xiàn)其中52條unigene在GenBank中有同源序列(相似50％以上)，25條EST功能未知或者為假定蛋白，另有35條未獲得同源匹配，推測可能是處于3’、5’末端非翻譯區(qū)的較短序列。實(shí)施例2GhCBF3編碼基因的克隆在實(shí)施例1有同源序列的unigene中，克隆子Gh-C098序列如SEQIDNO：3所示：1ACCAGCTTCTACCGATCCGAAAGACATCCAGAAAGCGGCGGCGGAGGCAGCGGAAGCTTT61CCGACCTGTTGATTCCGCCGGAGATGGCTCAAAGACAGCTGAAAAAACGGCGGTGGAGGG121AACTAAAGAGTCGGAAGAAGTGTTTTATTTGGACGAAGAAGCAGTGTTTGGGAGAGAAAA181GTTTCTGGCAAACATGGCGGCGGGGATGATGATGTCTCCGCCTCACAGTGGATATGAAAA241AGATGAACAAGAATTTGAGTTTGCCGATGGTTATGT序列分析表明該序列的編碼的氨基酸序列屬于DREB1類蛋白，本文將該蛋白命名為GhCBF3。(1)GhCBF3的全長基因的克隆根據(jù)已經(jīng)獲得的GhCBF3的基因片段，設(shè)計兩條特異性引物，作為3’RACE的5’端特異性引物：GhCBF3GSP1：SEQIDNO：4：AAGACATCCAGAAAGCGGCGGCGhCBF3GSP2：SEQIDNO：5：CCGACCTGTTGATTCCGCCGGA實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書操作(3’RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds試劑盒，購自invitrogen公司)用SEQIDNO：4與3’端引物AUAP(試劑盒自帶)，以mRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。具體步驟如下：ExTaq購自TAKARA，50μlPCR反應(yīng)體系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlmRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO：4和AUAP各2.0μl，以及35μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，33個循環(huán)；72℃延伸10min。所得的PCR產(chǎn)物用雙餾水稀釋50倍后取1μl作為模板，用SEQIDNO：5與3’端引物AUAP進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，具體步驟如下：50μlPCR反應(yīng)體系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl第一輪稀釋的PCR產(chǎn)物，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO：5和AUAP各2.0μl，以及35μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，33個循環(huán)；72℃延伸10min。第二次PCR產(chǎn)物(QIAquickPCRPurificationKit純化，購自Qiagen)3ul連接于pGEM-TEasyVector，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109(具體方法同上)，隨機(jī)挑取10個白色菌落于含有50ug/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)過夜后加甘油至終濃度20％，-80℃保存?zhèn)溆谩EQIDNO：5與3’端引物AUAP進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增(體系及條件同上)，得到4個陽性克隆，送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序，獲得該基因的cDNA的3’端。根據(jù)已經(jīng)獲得的GhCBF3的基因片段，設(shè)計三條特異性引物，分別作為mRNA的反轉(zhuǎn)錄引物(SEQIDNO：6)和5’RACE的3’端特異性引物(SEQIDNO：7和8)。GhCBF3GSP3：SEQIDNO：6：ACTCAAATTCTTGTTCATCTGhCBF3GSP4：SEQIDNO：7：CACTGTGAGGCGGAGACATCATGhCBF3GSP5：SEQIDNO：8：GCCGCCATGTTTGCCAGAAAC實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書操作(5’RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds試劑盒，購自invitrogen公司)。SEQIDNO：6作為mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA的引物。用SEQIDNO：7與5’通用引物AAP(試劑盒自帶)，以mRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA(反轉(zhuǎn)錄引物SEQIDNO：6)為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，具體步驟如下：ExTaq購自TAKARA，50μlPCR反應(yīng)體系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO：7和AAP各2.0μl，以及35μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，33個循環(huán)；72℃延伸10min。所得的PCR產(chǎn)物用雙蒸水稀釋50倍后取1μl作為模板，用SEQIDNO：8與3’端引物AUAP進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，具體步驟如下：50μlPCR反應(yīng)體系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl第一輪稀釋的PCR產(chǎn)物，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO：8和AUAP各2.0μl，以及35μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，33個循環(huán)；72℃延伸10min。第二次PCR產(chǎn)物(QIAquickPCRPurificationKit純化，購自Qiagen)3ul連接于pGEM-TEasyVector，轉(zhuǎn)化到JM109(具體方法同上)，隨機(jī)挑取10個白色菌落于含有50ug/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)過夜后加甘油至終濃度20％，-80℃保存?zhèn)溆?。SEQIDNO：8與3’端引物AUAP進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增(反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同上)，得到6個陽性克隆，送廣州英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序，獲得該基因的cDNA的5’端。所得的5’RACE產(chǎn)物克隆測序后，與3’RACE產(chǎn)物測序結(jié)果拼接。獲得GhCBF3的全長cDNA序列。根據(jù)GhCBF3的全長cDNA序列設(shè)計一對引物如下：GhCBF3F：SEQIDNO：9：ATGGTTTCGTCACCGATGTCGGATAGhCBF3R：SEQIDNO：10：TTAAATAGAATAGCTCCACAGCCGTA通過SEQIDNO：9和SEQIDNO：10來克隆GhCBF3編碼基因的全長。采用TaKaRa的PrimeSTARHSDNA聚合酶，以棉花的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。50μlPCR反應(yīng)體系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlcDNA，1.0μlPrimeSTAR，10μM的引物SEQIDNO：9和SEQIDNO：10各2.0μl，30μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，33個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加A：PCR產(chǎn)物加2.5倍的無水乙醇，-20℃放置10分鐘，離心，去上清，晾干，用21μl雙蒸水溶解。加入2.5ul10×ExBuffer，0.5ul5mM的dATP，2.5ul10×ExTaq。反應(yīng)條件：70℃反應(yīng)30分鐘。將得到約600bp的DNA片段回收(Omega回收試劑盒)，克隆至pGEMT-easy載體上，轉(zhuǎn)化JM109(方法同上)。隨機(jī)挑取10個白色菌落于含有50ug/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)過夜后加甘油至終濃度20％，-80℃保存?zhèn)溆?。SEQIDNO：9與SEQIDNO：10進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增(反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同上)，得到4個陽性克隆，送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序，序列為SEQIDNO：2。其蛋白表達(dá)序列為SEQIDNO：1。GhCBF3的氨基酸序列：SEQIDNO：11MVSSPMSDSGSGNGASRPPN21FSDEDVMLASCYPKKRAGRK41KFRETRHPVFRGVRRRNSGK61WVCEVREPYKKSRIWLGTFP81TEEMAARAHDVAALALRGRL101ACLNFADSAWRLPVPASTDP121KDIQKAAAEAAEAFRPVDSA141GDGSKTAEKTAVEGTKESEE161VFYLDEEAVFGREKFLANMA181AGMMMSPPHSGYEKDEQEFE201FADGYVRLWSYSI＊GhCBF3編碼基因的核苷酸序列：SEQIDNO：21ATGGTTTCGTCACCGATGTCGGATAGTGGGAGTGGAAATGGAGCTTCTCGTCCGCCGAAT61TTTTCCGATGAAGACGTGATGTTAGCTTCGTGTTACCCCAAGAAGCGAGCGGGAAGGAAG121AAATTCCGGGAGACTCGACACCCGGTGTTCCGAGGAGTTCGCCGGAGGAACTCCGGAAAA181TGGGTTTGTGAAGTAAGGGAACCTTACAAAAAGTCAAGGATTTGGCTCGGGACTTTTCCG241ACAGAAGAGATGGCGGCGCGTGCCCACGACGTGGCGGCGTTAGCTCTGAGAGGAAGGTTG301GCTTGTTTGAACTTCGCTGACTCTGCTTGGAGACTCCCTGTACCAGCTTCTACCGATCCG361AAAGACATCCAGAAAGCGGCGGCGGAGGCAGCGGAAGCTTTCCGACCTGTTGATTCCGCC421GGAGATGGCTCAAAGACAGCTGAAAAAACGGCGGTGGAGGGAACTAAAGAGTCGGAAGAA481GTGTTTTATTTGGACGAAGAAGCAGTGTTTGGGAGAGAAAAGTTTCTGGCAAACATGGCG541GCGGGGATGATGATGTCTCCGCCTCACAGTGGATATGAAAAAGATGAACAAGAATTTGAG601TTTGCCGATGGTTATGTACGGCTGTGGAGCTATTCTATTTAA實(shí)施例3GhCBF3植物表達(dá)載體構(gòu)建植物表達(dá)載體rd29A-GhCBF3-2300構(gòu)建流程如附圖1所示。選擇植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA2300(購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)作為植物表達(dá)載體，用Pnos啟動子替換NPTII基因含雙增強(qiáng)子的35S啟動子，以降低NPTII蛋白在植物中的表達(dá)。選擇誘導(dǎo)型啟動子rd29A及Tnos作為GhCBF3基因的啟動子和終止子。具體步驟如下：使用SEQIDNO：11和SEQIDNO：12以植物表達(dá)載體PBI121(購自北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司)為模板擴(kuò)增Pnos，采用TaKaRa的PrimeSTARHSDNA聚合酶。50μlPCR反應(yīng)體系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，1.0μlPBI121，1.0μlPrimeSTAR、10μM的引物SEQIDNO：11和SEQIDNO：12各2.0μl，以及31μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，33個循環(huán)；72℃延伸10min，產(chǎn)物通過EcoRI、BglII酶切連接到pCAMBIA2300(promegaT4連接酶盒)獲得pCAMBIA2300-1。SEQIDNO：11：GCACGAATTCATACAAATGGACGAACGGATSEQIDNO：12：ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG使用SEQIDNO：13和SEQIDNO：14以PBI121為模板擴(kuò)增Tnos，采用TaKaRa的PrimeSTARHSDNA聚合酶。50μlPCR反應(yīng)體系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，1.0μlPBI121，1.0μlPrimeSTAR、10μM的引物SEQIDNO：13和SEQIDNO：14各2.0μl，以及31μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，33個循環(huán)；72℃延伸10min。產(chǎn)物通過SacI、EcoRI酶切連接到pCAMBIA2300-1，獲得pCAMBIA2300-2。SEQIDNO：13：AAGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAASEQIDNO：14：TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA使用SEQIDNO：15和SEQIDNO：16以擬南芥(哥倫比亞型，購自www.arabidopsis.org)基因組DNA為模板擴(kuò)增擬南芥rd29A啟動子(參考ZengJ.，etL.2002，PreparationoftotalDNAfrom“recalcitrantplanttaxa”，ActaBot.Sin.，44(6)：694-697中的方法提取擬南芥DNA)。采用TaKaRa的PrimeSTARHSDNA聚合酶。50μlPCR反應(yīng)體系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，1.0μl擬南芥DNA，1.0μlPrimeSTAR、10μM的引物SEQIDNO：15和SEQIDNO：16各2.0μl，以及31μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，33個循環(huán)；72℃延伸10min，PCR產(chǎn)物通過HindIII、SalI酶切連接到pCAMBIA2300-2，獲得pCAMBIA2300-3。SEQIDNO：15：ACTAAGCTTCCTTCTTGACATCATTCAATTTTASEQIDNO：16：TGAGTCGACTCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAATAG使用SEQIDNO：17和SEQIDNO：18擴(kuò)增GhCBF3基因(模板是實(shí)施例2所獲得含有GhCBF3基因的pGEMT-easy重組載體)，采用TaKaRa的PrimeSTARHSDNA聚合酶。50μlPCR反應(yīng)體系：10μl5×PSBuffer，3μl2.5mM的dNTP，1.0μlGhCBF3-pGEM，1.0μlPrimeSTAR、10μM的引物SEQIDNO：17和SEQIDNO：18各2.0μl，以及31μl的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，33個循環(huán)；72℃延伸10min。通過SalI、SacI酶切連接到pCAMBIA2300-3，獲得植物表達(dá)載體，rd29A-GhCBF3-2300。SEQIDNO：17：TGAGTCGACATGGTTTCGTCACCGATGTCGGATASEQIDNO：18：AAGGAGCTCTTAAATAGAATAGCTCCACAGCCGTA實(shí)施例4rd29A-GhCBF3-2300表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌LBA4404(購自BiovectorScienceLab，Inc)感受態(tài)制備：提前1-2d將農(nóng)桿菌LBA4404在含50μg/ml利福平和50μg/ml鏈霉素的LB固體培養(yǎng)基上劃單斑接種，28℃培養(yǎng)1至2d。挑取單菌落接種于5ml含50μg/ml利福平和50μg/ml鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃下?lián)u動培養(yǎng)過夜(約12-16h)至OD600值為0.4，形成種子菌液。取5ml活化后的菌液(1∶20的比例)接種于100ml同樣濃度抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃搖動培養(yǎng)2-2.5h至OD600＝0.8。冰浴菌液10min，每隔3min搖勻一次，令細(xì)菌均勻進(jìn)入休眠狀態(tài)。于4℃下4000g離心10min，棄上清液；加入一定量預(yù)冷10％甘油重懸浮菌體，4℃下4000g離心10min，收集沉淀；用10％甘油重復(fù)洗3-4次；加入適量冰浴預(yù)冷的10％甘油重新懸浮細(xì)菌沉淀，以40μl/管將其分裝，于-70℃保存?zhèn)溆?。轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌：在冰上融化感受態(tài)細(xì)胞，往40μl的感受態(tài)細(xì)胞中加入1μl的rd29A-GhCBF3-2300質(zhì)粒，混勻后冰浴約10min。將感受態(tài)和DNA的混合物用槍轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電擊杯中，輕敲使懸浮液到達(dá)底部，注意不要有氣泡。將電擊杯(購自bio-rad)放到電擊室的滑道上，推動滑道將電擊杯放至電擊室基座電極處。使用0.1cm的電擊杯的時候，MicroPulser(購自bio-rad)的程序設(shè)置為“Agr”，電擊一次。立即取出電擊杯，加入28℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基?？焖俣p柔的用槍將細(xì)胞打勻。將懸浮液轉(zhuǎn)入1.5ml的離心管，28℃，225rpm培養(yǎng)1h。取100～200μl的菌液涂布與相應(yīng)的抗性篩選培養(yǎng)基(LB固體培養(yǎng)基，含50μg/ml利福平、50μg/ml鏈霉素、50μg/ml卡那霉素)平板上，28℃培養(yǎng)。實(shí)施例5利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因煙草用75％酒精浸泡煙草種子(國家煙草中期庫，獲取單位中國農(nóng)科院煙草所，庫編號I5A00660)30s，再用0.1％升汞浸泡8min，進(jìn)行表面消毒。將消過毒的煙草種子置于MS固體培養(yǎng)基(18.78mMKNO3，1.25mMKH2PO4，20.6mMNH4NO3，1.5mMMgSO4，3.0mMCaCl2，50μMKI，100μMH3BO3，100μMMnSO4，30μMZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μMCoCl2，100μMNa2EDTA，100μMFeSO4，7.4g/L瓊脂，蔗糖30g/L)上無菌發(fā)芽，制備無菌苗。取無菌苗葉片剪成5mm×5mm大小的葉盤，用處于對數(shù)生長期的含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌浸染葉盤10min，吸干菌液，在黑暗條件下共培養(yǎng)2天(MS培養(yǎng)基)。將葉片轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基(MS+1mg/LBA+0.1mg/LNAA+50mg/L卡那霉素+500mg/L頭孢霉素)上，光照條件下培養(yǎng)45天左右，待芽長大后切下轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(MS+50mg/L卡那霉素+500mg/L頭孢霉素)中培養(yǎng)30天左右，待根系發(fā)達(dá)后將小苗轉(zhuǎn)入僅加有500mg/L頭孢霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行編號保存。取獲得的轉(zhuǎn)基因煙草葉片，提取基因組DNA(同實(shí)施例3中擬南芥DNA提取方法)，用引物SEQIDNO：17和SEQIDNO：18進(jìn)行PCR鑒定(50μlPCR反應(yīng)體系：5μl10×ExBuffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μlDNA，1.0μlExTaq、10μM的引物SEQIDNO：17和SEQIDNO：18各2.0μl，以及35μ1的雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，33個循環(huán)；72℃延伸10min)，保存陽性植株，分別編號為T0I1至T0I20。選取T0I1-T0I5的種子進(jìn)行。實(shí)施例6過表達(dá)GhCBF3的轉(zhuǎn)基因煙草T1代的抗寒模擬實(shí)驗(yàn)及功能鑒定將滅過菌的蛭石用1/2MS培養(yǎng)基浸透。將T0代轉(zhuǎn)基因煙草T0I1、T0I2、T0I3、T0I4和T0I5的種子以及野生型非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢煵莘N子分別播種在蛭石上，25℃、10小時光培養(yǎng)/14小時暗培養(yǎng)循環(huán)，每5天澆一次1/2MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)25天之后，摘取最下端一片葉子，提取基因組DNA(同實(shí)施例3中擬南芥DNA提取方法)，利用引物SEQIDNO：17和SEQIDNO：18做PCR鑒定(反應(yīng)及條件同上)，剔除陰性植株(對照煙草也同樣摘取一片葉子)。挑取大小一致的轉(zhuǎn)基因煙草(T1I1、T1I2、T1I3、T1I4和T1I5各10株，編號分別是T1I1-1至T1I1-10、T1I2-1至T1I2-10、T1I3-1至T1I3-10、T1I4-1至T1I4-10和T1I5-1至T1I5-10)、對照煙草(10株)做耐寒實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)基因煙草、對照煙草，4℃脅迫72小時。再經(jīng)過14天恢復(fù)培養(yǎng)。然后取出植株對植株進(jìn)行稱重。上述T1代轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性鑒定表明，對照植株不能恢復(fù)正常生長，生長明顯受到抑制，而轉(zhuǎn)基因植株生長明顯高于對照植株，顯現(xiàn)出明顯的抗寒性(附圖3及表1)。在圖3中，選取轉(zhuǎn)基因植株T1I1-2和一株對照煙草示例性顯示，其他煙草的結(jié)果與它們類似。實(shí)施例7過表達(dá)GhCBF3的轉(zhuǎn)基因煙草T1代的抗旱模擬實(shí)驗(yàn)及功能鑒定滅過菌的蛭石用1/2MS培養(yǎng)基浸透。將T0代轉(zhuǎn)基因煙草T0I1、T0I2、T0I3、T0I4和T0I5的種子以及對照煙草種子分別播種在蛭石上，25℃、10小時光培養(yǎng)/14小時暗培養(yǎng)循環(huán)，每5天澆一次1/2MS，培養(yǎng)25天之后，摘取最下端一片葉子，提取基因組DNA(同實(shí)施例3中擬南芥DNA提取方法)，利用引物SEQIDNO：17和SEQIDNO：18做PCR鑒定，剔除陰性植株(對照煙草也同樣摘取一片葉子)。挑取大小一致的轉(zhuǎn)基因煙草(T1I1、T1I2、T1I3、T1I4和T1I5各10株，編號分別是T1I1-11至T1I1-20、T1I2-11至T1I2-20、T1I3-11至T1I3-20、T1I4-11至T1I4-20和T1I5-11至T1I5-20)、對照煙草(10株)做耐旱實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)基因煙草、對照煙草干旱14天(不澆水)，25℃、10小時光培養(yǎng)/14小時暗培養(yǎng)循環(huán)。然后取出植株對植株進(jìn)行稱重。上述T1代轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性鑒定表明，對照植株萎蔫嚴(yán)重，而轉(zhuǎn)基因植株能夠正常生長，顯示出明顯的抗旱性(附圖4及表1)。圖4中，選取轉(zhuǎn)基因植株T1I4-13和一株對照煙草示例性顯示，其他煙草的結(jié)果與它們類似。表1