本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及微寡聚核苷酸PCR檢測的方法、組成和應(yīng)用。

背景技術(shù)：
DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩個拷貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計引物做啟動子，加入熱穩(wěn)定性DNA聚合酶和dNTP就可以完成特定序列的體外復(fù)制。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)就是這樣的一種在體外由熱穩(wěn)定性DNA聚合酶促合成特異DNA片段的方法。該方法由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等三步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。PCR具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于基于任何DNA、RNA檢測的疾病診斷。在本發(fā)明人之前的工作中，通過靶向PCR和免疫PCR將DNA與抗體或小分子化合物偶聯(lián)在一起，擴(kuò)展了PCR的檢測范圍，使PCR可檢測任何可被抗體或小分子化合物識別的抗原或攜帶抗原的細(xì)胞。但是本發(fā)明人在實驗中發(fā)現(xiàn)：將DNA與抗體或小分子化合物偶聯(lián)在一起，會降低抗體或小分子化合物與抗原或受體結(jié)合的親和力。偶聯(lián)的DNA分子越大，序列越長，相應(yīng)的親和力會顯著降低，現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明DNA序列長20個堿基，小分子化合物與DNA的偶合物對抗原的親和力會降低5-10倍。這大大限制了靶向PCR或免疫PCR的應(yīng)用。因此縮短偶聯(lián)的DNA序列，降低DNA分子量成為提高靶向PCR檢測靈敏度的首選方案。但是，縮短的DNA序列導(dǎo)致PCR檢測的難度大大提高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種微寡聚核苷酸PCR檢測的方法、組成和應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種微寡聚核苷酸的PCR檢測方法，所述的微寡聚核苷酸是長度小于25bp(較佳地小于22bp；更佳地小于18bp，如16bp)的DNA，所述方法包括：(1)提供一延伸引物(RT引物)，且其3’末端的核苷酸序列與所述的微寡聚核苷酸(如3’端)互補(bǔ)；所述的延伸引物的長度在20-100bp(較佳地25-100bp；更佳地30-100bp，如40bp、50bp、60bp、70bp、80bp)；將所述的延伸引物與所述微寡聚核苷酸在適于DNA延伸的條件下混合，從而兩者互補(bǔ)結(jié)合并延伸，獲得包含有所述微寡聚核苷酸的序列以及引物互補(bǔ)序列的寡聚核苷酸；(2)以(1)獲得的寡聚核苷酸為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得該模板的PCR定性或定量結(jié)果，從而獲得所述微寡聚核苷酸的PCR定性或定量結(jié)果。在一個優(yōu)選例中，步驟(1)中，所述的延伸引物的序列結(jié)構(gòu)如式(I)：M-P(I)；其中，M為與所述的微寡聚核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列；P的序列結(jié)構(gòu)如式(II)：Seq-H-Seq’(II)；其中，Seq是4-20個(如18個、15個、12個、10個、8個、6個)核苷酸，Seq’為與Seq互補(bǔ)的序列；H為Seq和Seq’之間的間隔序列(通常7-40個堿基；如35個、30個、25個、20個、15個、12個、10個、9個、8個)，所述間隔序列與Seq和Seq’不互補(bǔ)。在另一優(yōu)選例中，式(I)結(jié)構(gòu)為：3’M-P5’。在另一優(yōu)選例中，“-”代表H和Seq、Seq’之間的共價連接關(guān)系。在另一優(yōu)選例中，式(II)可以形成如下二級結(jié)構(gòu)：其中，||表示在Seq和Seq’之間形成的氫鍵。在另一優(yōu)選例中，式(II)為：5’Seq-H-Seq’3’。在另一優(yōu)選例中，M的長度是4-20bp。在另一優(yōu)選例中，M的長度是6-16bp；更佳地，M的長度是6-14bp；最佳地，M的長度是8-10bp。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中，采用Taq酶或Klenow酶作為DNA延伸用的酶。在另一優(yōu)選例中，采用Taq酶作為DNA延伸用的酶，且步驟(1)中，延伸包括如下步驟：95℃變性，2min；60℃退火30s；72℃延伸5min。在另一優(yōu)選例中，采用Taq酶作為DNA延伸用的酶，且步驟(1)中，延伸體系包括：10×緩沖液(NH4)2SO4，Mg2+，延伸引物，dNTP，Taq酶，微寡聚核苷酸。在另一優(yōu)選例中，采用Klenow酶作為DNA延伸用的酶，且步驟1)中，延伸包括如下步驟：37℃，10min后置于4℃保存。在另一優(yōu)選例中，采用Klenow酶作為DNA延伸用的酶，且步驟(1)中，延伸體系包括：10×NEBBuffer2，dNTP，Klenow酶，延伸引物，微寡聚核苷酸。在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，PCR擴(kuò)增的正向引物和反向引物根據(jù)所述的寡聚核苷酸兩端的序列制備(即：與所述的寡聚核苷酸的兩端互補(bǔ))。在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，采用實時(Realtime)熒光PCR法進(jìn)行PCR定量。在另一優(yōu)選例中，所述的實時熒光PCR法選自：Taqman定量PCR法，SYBR-Green熒光染料定量PCR法。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)和步驟(2)在一個PCR體系中進(jìn)行；所述的PCR體系通過溫度轉(zhuǎn)換達(dá)到適于DNA延伸的條件或適于DNA擴(kuò)增的條件。在另一優(yōu)選例中，在DNA延伸步驟之后，將PCR體系在2-15℃(更佳地4℃-12℃；更佳地6-10℃；更佳地8-10℃)冷處理2-10min(較佳地3-8min；更佳地4-6min)。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)和步驟(2)在一個PCR體系中進(jìn)行，包括步驟：95℃2min，40℃30S，72℃60S，2-10℃(更佳地4℃-8℃)2-10min(較佳地3-8min；更佳地4-6min)，95℃1min；然后以下步驟進(jìn)行30-45個循環(huán)：95℃10S，50℃30S，72℃10S。在另一優(yōu)選例中，所述的PCR體系包括：微寡聚核苷酸，延伸引物，DNA 延伸用的酶(如Taq酶或Klenow酶)，PCR擴(kuò)增引物(包括正向引物和反向引物，它們根據(jù)延伸引物與微寡聚核苷酸發(fā)生延伸反應(yīng)后獲得的寡聚核苷酸兩端的序列制備)；較佳地，所述的PCR體系還包括熒光探針(如Taqman-MGB探針)；或所述的PCR體系是RealtimePCRMasterMix體系，且其中還包括：微寡聚核苷酸，延伸引物，DNA延伸用的酶(如Taq酶或Klenow酶)；較佳地，所述的PCR體系還包括熒光探針(如Taqman-MGB探針)。在另一優(yōu)選例中，所述的微寡聚核苷酸的一端還與結(jié)合分子連接(共價連接、偶聯(lián)或偶合)。在另一優(yōu)選例中，所述的結(jié)合分子是特異性靶向病源細(xì)胞的結(jié)合分子；更佳地，為特異性靶向病源細(xì)胞的抗體、配體、化學(xué)小分子或多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的病源細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，所述的結(jié)合分子是葉酸或葉酸-半胱氨酸偶聯(lián)物。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于微寡聚核苷酸的PCR定量檢測的試劑盒，其中包括：延伸引物，其3’末端的核苷酸序列與所述的微寡聚核苷酸(如3’端)互補(bǔ)；所述的延伸引物的長度在15-100bp(較佳地20-100bp；更佳地30-100bp，如40bp、50bp、60bp、70bp、80bp)；DNA延伸用酶(如Taq酶或Klenow酶)；PCR擴(kuò)增試劑(包括PCR擴(kuò)增的正向引物和反向引物，它們根據(jù)延伸引物與微寡聚核苷酸發(fā)生延伸反應(yīng)后獲得的寡聚核苷酸兩端的序列制備)。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括：RealtimePCRMasterMix反應(yīng)體系，熒光探針(如Taqman-MGB探針)等。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測病源細(xì)胞的試劑盒，其中包括：(i)檢測病源細(xì)胞的靶向性分子，結(jié)構(gòu)如下：X-Y；其中，X代表特異性靶向病源細(xì)胞的結(jié)合分子；Y代表微寡聚核苷酸；“-”代表X和Y之間的共價連接、偶聯(lián)或偶合的關(guān)系。(ii)延伸引物，且其3’末端的核苷酸序列與(i)中Y的遠(yuǎn)離X的末端(如3’ 端)互補(bǔ)；所述的延伸引物的長度在15-100bp(較佳地20-100bp；更佳地30-100bp，如40bp、50bp、60bp、70bp、80bp)；(iii)DNA延伸用酶(如Taq酶或Klenow酶)；(iv)PCR擴(kuò)增試劑(包括PCR擴(kuò)增的正向引物和反向引物，它們根據(jù)延伸引物與微寡聚核苷酸發(fā)生延伸反應(yīng)后獲得的寡聚核苷酸兩端的序列制備)。在一個優(yōu)選例中，X選自：特異性靶向病源細(xì)胞的抗體、配體、化學(xué)小分子或多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的病源細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，X是葉酸或葉酸-半胱氨酸偶聯(lián)物。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤細(xì)胞是循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)。在另一優(yōu)選例中，所述的微聚寡核苷酸是經(jīng)過化學(xué)修飾的寡核苷酸，所述的化學(xué)修飾增強(qiáng)列微聚寡核苷酸的穩(wěn)定性。較佳地，所述的微聚寡核苷酸的序列中，磷酸鍵上存在硫代修飾。較佳地，所述的“磷酸鍵上存在硫代修飾”是指寡核苷酸探針的序列中，P-O發(fā)生硫代脫氧而形成P-S。較佳地，所述的“磷酸鍵上存在硫代修飾”發(fā)生在部分磷酸鍵上或發(fā)生在所有磷酸鍵上。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。附圖說明圖1、不同序列長度的MsDNA(ssPO16，ssPO19，ssPO22)的擴(kuò)增曲線。圖2、葉酸-半胱氨酸-MsDNA偶合物探針的HPLC分析(紫外260nm)。A、葉酸-半胱氨酸-ssPO22的HPLC純度分析圖譜；B、葉酸-半胱氨酸-ssPO16的HPLC純度分析圖譜。圖3、葉酸-半胱氨酸偶聯(lián)物與制備的葉酸-半胱氨酸MsDNA偶聯(lián)物進(jìn)行紫外吸收譜分析。A、葉酸-半胱氨酸偶聯(lián)物的紫外光譜；B、未偶聯(lián)的ssPO22的紫外光譜；C、葉酸-半胱氨酸-ssPO22的紫外光譜；D、葉酸-半胱氨酸-ssPO16的紫外光譜。圖4、一步法PCR測定標(biāo)準(zhǔn)品，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的Log值為橫坐標(biāo)，CT值 為縱坐標(biāo)，制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5、表14數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析的圖示。具體實施方式為了檢測微寡聚核苷酸，本發(fā)明人開發(fā)了一種改進(jìn)的PCR檢測方法，以所述的微寡聚核苷酸為模板，使用一種既定的DNA片段(延伸引物)先與所述微寡聚核苷酸互補(bǔ)結(jié)合并延伸出具有較長的既定序列的DNA片段，之后以該既定序列為模板，進(jìn)行PCR定量檢測。本發(fā)明的方法可檢測核苷酸個數(shù)在20個以內(nèi)的微寡聚核苷酸，可用于包含該微聚寡核苷酸的結(jié)合分子或短探針的定性或定量檢測，在此基礎(chǔ)上完成本發(fā)明。術(shù)語如本文所用，所述的“微寡聚核苷酸”是指長度小于25bp(較佳地小于22bp；更佳地小于18bp，如16bp)的DNA。本文中，還將之稱為MicrosinglestrandDNA(MsDNA)。如本文所用，“互補(bǔ)”是指兩條單鏈的核苷酸的序列可以以一種可預(yù)見的方式發(fā)生相互作用，形成雙鏈結(jié)構(gòu)。相互“互補(bǔ)”的序列通常是指將5’-3’方向的序列轉(zhuǎn)換為其3’-5’方向的序列(如5’ATCG3’→GCTA)，然后再取其互補(bǔ)序列(如GCTA→5’CGAT3’)。如本文所用，“發(fā)夾(Hairpin)”結(jié)構(gòu)也被稱作“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)、“發(fā)卡”結(jié)構(gòu)，是指一種寡核苷酸分子，其可形成一種包括雙鏈區(qū)域(莖部)的二級結(jié)構(gòu)，所述的雙鏈區(qū)域由該寡核苷酸分子的兩個區(qū)域(位于同一分子上)形成，兩個區(qū)域分列雙鏈部分的兩側(cè)；其還包括至少一個“環(huán)”結(jié)構(gòu)，包括非互補(bǔ)的核苷酸分子，即單鏈區(qū)域。發(fā)夾結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，通常在獲得了一條具有一級結(jié)構(gòu)的寡核苷酸序列后，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定該核酸是否能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”、和“由……構(gòu)成”；“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”和“由……構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。如本文所用，所述的“病源細(xì)胞”是指來自于病灶組織的細(xì)胞(固定于病灶 組織或由病灶組織釋放并游離存在于體液中)，該細(xì)胞表面上存在有特定分子(例如表面抗原或受體)，該特定分子為該種病源細(xì)胞所特有的，且能夠被特定的結(jié)合分子(如抗體、配體)結(jié)合，該特定的結(jié)合分子即為特異性靶向病源細(xì)胞的結(jié)合分子。例如，葉酸可以識別和結(jié)合癌細(xì)胞表面的葉酸受體(folatereceptor)，抗Her2的單克隆抗體可以識別和結(jié)合于乳癌細(xì)胞表面的Her2抗原；LHRH多肽可以識別和結(jié)合前列腺癌細(xì)胞表面的黃體生成素釋放激素受體(LHRHreceptor)等等。如本文所用，所述的“循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)”是指存在于血液(外周血)中的癌癥(腫瘤)細(xì)胞，CTC的濃度可以診斷癌癥、對癌癥進(jìn)行分期、預(yù)后等。如本文所用，所述的“癌癥”或“腫瘤”沒有特別的限制，較佳地該“癌癥”或“腫瘤”自發(fā)病起會向血液循環(huán)中散播癌癥細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。例如選自(但不限于)：鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、大腸癌、前列腺癌、肺癌、宮頸癌、白血病、口腔癌、唾液腺腫瘤、鼻腔與鼻旁竇惡性腫瘤、喉癌、耳部腫瘤、眼部腫瘤、甲狀腺腫瘤、縱隔腫瘤、胸壁、胸膜腫瘤、小腸腫瘤、膽道腫瘤、胰腺與壺腹周圍腫瘤、腸系膜與腹膜后腫瘤、腎臟腫瘤、腎上腺腫瘤、膀胱腫瘤、前列腺癌、睪丸腫瘤、陰莖癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢惡性腫瘤、惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤、外陰癌與陰道癌、惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、軟組織腫瘤、骨腫瘤、皮膚及附件腫瘤、惡性黑色素瘤、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、小兒腫瘤。作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述的“癌癥”或“腫瘤”選自：乳(腺)癌、肺癌。如本文所用，所述的“平衡解離常數(shù)(equilibriumdissociationconstant，Kd)”指占據(jù)半數(shù)細(xì)胞上特定的受體或表面分子所需的配體、抗體、化學(xué)小分子或多肽的濃度。Kd值與受體親和力呈反向關(guān)系，Kd值愈小，表明親和力愈高；反之Kd值愈大，表明親和力愈低。通常Kd小于10-6M表示受體或表面分子與的配體、抗體、化學(xué)小分子或多肽親和力高。如本文所用，所述的“結(jié)合分子”能夠特異性地靶向病源細(xì)胞上特定分子(例如表面抗原或受體)，其具有高的親和性，其對于的平衡解離常數(shù)通常小于10-6。所述的“結(jié)合分子”例如但不限于抗體、配體、化學(xué)小分子或多肽等。結(jié)合分子是用于識別和/或結(jié)合病源細(xì)胞的，因此，其通常根據(jù)所需檢測的病源細(xì)胞的類型而設(shè)，例如葉酸可以識別和結(jié)合肺癌細(xì)胞表面的葉酸受體(folatereceptor)；抗Her2的單克隆抗體可以識別和結(jié)合于乳癌細(xì)胞表面的Her2抗原；LHRH多肽可以識別和結(jié)合前列腺癌細(xì)胞表面的黃體生成素釋放激素受體(LHRH receptor)。目前，針對存在于各種病源細(xì)胞表面的特定分子，已經(jīng)有深入的研究，也開發(fā)出了各種針對這些表面分子的結(jié)合分子，包括抗體、配體、多肽、化學(xué)小分子等。本發(fā)明對結(jié)合分子沒有特別的限制，這些結(jié)合分子均可被應(yīng)用于本發(fā)明的方法中，從而設(shè)計出各種針對病源細(xì)胞的靶向性分子?；驹肀景l(fā)明的方法主要是針對序列長度較短的微寡聚核苷酸，在對該微寡聚核苷酸進(jìn)行PCR實時擴(kuò)增檢測之前，加入一個延伸的步驟，也即：利用一種在一端能夠與所述微寡聚核苷酸的一端互補(bǔ)的延伸引物，在適于DNA互補(bǔ)結(jié)合以及延伸的條件下，使得DNA延伸得到相對于原微寡聚核苷酸而言加長的寡聚核苷酸，其既包含微寡聚核苷酸的所有核苷酸，又包含延伸的與所述引物互補(bǔ)的核苷酸。已該加長的寡聚核苷酸為PCR模板，可以良好地實現(xiàn)PCR實時定量分析，克服了直接利用所述微寡聚核苷酸序列作為模板進(jìn)行PCR實時定量分析時，由于序列過短而難以擴(kuò)增的技術(shù)缺陷，提高檢測的準(zhǔn)確率。進(jìn)而，本發(fā)明人還簡化了檢測步驟，將所述的延伸步驟與PCR實時定量步驟在同一體系中進(jìn)行。所述的微寡聚核苷酸還可與結(jié)合分子相連接，所述的結(jié)合分子是特異性靶向病源細(xì)胞表面的特定分子。利用所述的微寡聚核苷酸作為模板進(jìn)行延伸，延伸產(chǎn)物作為后續(xù)PCR定量分析的擴(kuò)增模板。也即：所述的結(jié)合分子通過與病源細(xì)胞表面的特定分子結(jié)合，對病源細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記；而微寡聚核苷酸在經(jīng)由延伸后，通過定量PCR技術(shù)進(jìn)行定量檢測，最終達(dá)到對待檢細(xì)胞進(jìn)行定量的目的。由于與結(jié)合分子連接的是序列長度相當(dāng)短的微寡聚核苷酸，結(jié)合分子與其靶向的病源細(xì)胞之間的相互作用受到的影響也非常有限，因此檢測的準(zhǔn)確性非常高。微寡聚核苷酸的PCR檢測方法本發(fā)明的微寡聚核苷酸的PCR檢測方法包括：(1)提供一延伸引物，且其3’末端的核苷酸序列與所述的微寡聚核苷酸互補(bǔ)；所述的延伸引物的長度在20-100bp；將所述的延伸引物與所述微寡聚核苷酸在適于DNA延伸的條件下混合，從而兩者互補(bǔ)結(jié)合并延伸，獲得包含有所述微寡聚核苷酸的序列以及引物互補(bǔ)序列的寡聚核苷酸；(2)以(1)所述的寡聚核苷酸為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得該模板的PCR定性或定量結(jié)果，從而獲得所述微寡聚核苷酸的PCR定性或定量結(jié)果。所述的延伸引物用于延長微寡聚核苷酸的序列長度，因此其長度范圍優(yōu)選在20-100bp；較佳地25-100bp；更佳地30-100bp，如40bp、50bp、60bp、70bp、80bp。所述的延伸引物可以是一種直鏈的結(jié)構(gòu)，也可以設(shè)計為在二級結(jié)構(gòu)上可以形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列。優(yōu)選地，所述的延伸引物在二級結(jié)構(gòu)上可以形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。為了提高延伸反應(yīng)的效率，本發(fā)明人對于延伸引物上與所述的微寡聚核苷酸結(jié)合互補(bǔ)的堿基個數(shù)(結(jié)合堿基數(shù))進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)合堿基數(shù)在4-20個都是可以的，結(jié)合堿基為8個的延伸引物效果最好。結(jié)合堿基數(shù)過多，將不利于微寡聚核苷酸以及延伸引物的設(shè)計；結(jié)合堿基數(shù)過少，則將使得PCR檢測的效率下降。本發(fā)明中，可以選用任何可實現(xiàn)DNA延伸的酶進(jìn)行延伸反應(yīng)，許多DNA延伸用酶可以通過商購的途徑購買；較佳地，采用Taq酶或Klenow酶作為DNA延伸用的酶；最佳地，采用Taq酶。延伸反應(yīng)體系的構(gòu)建以及延伸反應(yīng)的其它條件可以采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)。通過所述的延伸反應(yīng)，獲得了包含有所述微寡聚核苷酸序列以及相應(yīng)延伸引物互補(bǔ)序列的寡聚核苷酸；與所述的微寡聚核苷酸相比，該寡聚核苷酸的序列長度較長，從而有利于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，采用實時熒光定量PCR技術(shù)(實時熒光PCR法)，該技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個很重要的值，即Ct值(C代表Cycle，t代表threshold)。Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。熒光域值(threshold)的設(shè)定是本領(lǐng)域已知的技術(shù)。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。由于所述微寡聚核苷酸序列以及相應(yīng)的延伸引物序列均是既定的，因此延 伸獲得的寡聚核苷酸序列也是既定的，可以根據(jù)所述的寡聚核苷酸兩端的序列來制備PCR擴(kuò)增反應(yīng)用的正向引物和反向引物。實時熒光PCR法可以采用熒光探針法和熒光染料法。所述的“TaqMan熒光探針”為一種寡核苷酸，其兩端分別標(biāo)記一個熒光發(fā)射基團(tuán)(作為可檢測信號)和一個熒光淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針完整時，熒光發(fā)射基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離，從而通過熒光檢測系統(tǒng)可接受到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，即熒光信號的累計與PCR產(chǎn)物形成的完全同步，從而實現(xiàn)定性和定量。另外，也可采用SYBR熒光染料法，該方法通過在PCR反應(yīng)體系中加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。作為本發(fā)明的特別優(yōu)選的方式，本發(fā)明人通過優(yōu)化反應(yīng)系統(tǒng)以及反應(yīng)條件，簡化了PCR檢測方法，將步驟(1)和步驟(2)在一個PCR體系中進(jìn)行(一步法)；所述的PCR體系包含進(jìn)行DNA鏈延伸以及進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的試劑，并且通過溫度轉(zhuǎn)換達(dá)到適于DNA延伸的條件或適于DNA擴(kuò)增的條件。本發(fā)明優(yōu)化PCR反應(yīng)系統(tǒng)(一步法)的一個方面是：在DNA延伸步驟之后，將PCR體系在2-15℃(更佳地4℃-12℃；更佳地6-10℃；更佳地8-10℃)冷處理2-10min。本發(fā)明人反復(fù)試驗后意外地發(fā)現(xiàn)，該冷處理的步驟可顯著地降低PCR擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值，大大地提高PCR擴(kuò)增效率。進(jìn)行一步法反應(yīng)時，較佳地，所述的PCR體系包括：微寡聚核苷酸，延伸引物，DNA延伸用的酶(如Taq酶或Klenow酶)，PCR擴(kuò)增引物(包括正向引物和反向引物，它們根據(jù)延伸引物與微寡聚核苷酸發(fā)生延伸反應(yīng)后獲得的寡聚核苷酸兩端的序列制備)；較佳地，所述的PCR體系還包括熒光探針(如Taqman-MGB探針)。更佳地，所述的PCR體系是RealtimePCRMasterMix體系，且其中還包括：微寡聚核苷酸，延伸引物，DNA延伸用的酶(如Taq酶或Klenow酶)；較佳地，所述的PCR體系還包括熒光探針(如Taqman-MGB探針)。更優(yōu)選地，基于上述PCR體系，所述一步法包括步驟：95℃2min，40℃30S，72℃60S，2-10℃(更佳地4℃-8℃)2-10min(較佳地3-8min；更佳地4-6min)， 95℃1min；然后以下步驟進(jìn)行30-45個循環(huán)：95℃10S，50℃30S，72℃10S。本發(fā)明中，所述的微寡聚核苷酸的一端還可連接(共價連接、偶聯(lián)或偶合)有結(jié)合分子，藉由PCR擴(kuò)增可進(jìn)行微寡聚核苷酸的定性或定量，進(jìn)而獲得結(jié)合分子的定性或定量結(jié)果。較佳地，所述的結(jié)合分子是特異性靶向病源細(xì)胞的結(jié)合分子；更佳地，為特異性靶向病源細(xì)胞的抗體、配體、化學(xué)小分子或多肽。更佳地，所述的病源細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，所述的結(jié)合分子是葉酸或葉酸-半胱氨酸偶聯(lián)物。在本發(fā)明地具體實施例中，將微寡聚核苷酸(MsDNA)作為檢測模板，使用一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA片段先與MsDNA結(jié)合并延伸出特定序列的DNA片段，然后使用前后引物對該特定DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，并通過Taqman探針法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用該方法能將PCR的擴(kuò)增模板序列縮短到16個堿基以內(nèi)，大大提高了DNA與抗體或小分子化合物偶合物的親和力，使得靶向PCR或免疫PCR的靈敏度顯著提高，大大增加了此類技術(shù)的應(yīng)用價值。隨后，本發(fā)明人制備了葉酸-半胱氨酸-MsDNA的偶合物探針，并將其用于病源細(xì)胞的檢測。數(shù)據(jù)表明，DNA序列越短的偶合物探針，親和力越高，使用濃度越低，檢測背景也越低，因此整個檢測的靈敏度大大提高了。試劑盒基于本發(fā)明所揭示的方法，本發(fā)明還提供了可用于實施所述方法的試劑盒，其中包括：延伸引物，且其3’末端的核苷酸序列與所述的微寡聚核苷酸互補(bǔ)；所述的延伸引物的長度在15-100bp；DNA延伸用酶，如Taq酶或Klenow酶；以及PCR擴(kuò)增試劑；包括PCR擴(kuò)增的正向引物和反向引物。更佳地，所述的試劑盒中還包括：RealtimePCRMasterMix反應(yīng)體系，熒光探針(如Taqman-MGB探針)等。通常，所述試劑盒包括多個容器，上述試劑獨立地、分別地位于不同的容器中。當(dāng)所述的微寡聚核苷酸與結(jié)合分子連接以用于定量結(jié)合分子以及結(jié)合分子的靶細(xì)胞時，針對該用途，本發(fā)明還提供了一種用于檢測病源細(xì)胞(如循環(huán)腫瘤細(xì)胞)的試劑盒，其中，除了包含前段所述可用于實施本發(fā)明方法的試劑以外，還包括微寡聚核苷酸以及結(jié)合分子的連接體(X-Y)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的試劑盒中還包括使用說明書，以指導(dǎo)技術(shù)人員進(jìn)行操作。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。材料和儀器定量PCR檢測試劑SYBRGreenRealtimePCRMasterMix、RealtimePCRMasterMix購自日本TOYOBO公司。定量PCR儀為AppliedBiosystems的7300realtimePCRsystem。寡聚核苷酸、PCR所用引物、TaqmanMGB探針、PBS、CD45Dynabeads磁珠均購自LifeTechnologies公司。SMCC(琥珀酰亞胺-4-環(huán)已烷-1-碳酸酯)購自ThermoScientific(U.S.A.)。紅細(xì)胞裂解液購自索萊寶生物(北京，中國)。葉酸-半胱氨酸購自日本OtsukaChemical。PD-10柱(SephadexG-25M)是購自美國GeneralElectricalHealthcare。其余試劑均從SigmaAldrich購買。除非另外說明，實施例所用的葉酸是γ葉酸。寡聚核苷酸、PCR所用引物與TaqmanMGB探針的序列如表1所示。表1其中，ss代表單鏈寡聚核苷酸；PO代表脫氧寡聚核苷酸。實施例1、MsDNA的PCR檢測方法(兩步法)1、Taq酶反應(yīng)體系與Klenow酶反應(yīng)體系的比較兩步法檢測MsDNA由兩個步驟構(gòu)成。第一步是延伸反應(yīng)，本發(fā)明人將不同濃度的MsDNA、RT引物加入到Taq酶反應(yīng)體系或Klenow反應(yīng)體系中，進(jìn)行延伸反應(yīng)，將MsDNA轉(zhuǎn)變成長度為60nt左右的單鏈DNA，以便進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。Taq酶反應(yīng)體系(25μl)如表2。表2Taq酶的延伸反應(yīng)按照如下步驟進(jìn)行，95℃變性，2min；60℃退火30s；72℃延伸5min。Klenow酶反應(yīng)體系(25μl)如表3。表3組分用量10×NEBBuffer22.5μlRT-A5nMdNTP0.2mMKlenow片段2.5UssPO221pM，0.1pM，0.01pMKlenow酶的延伸反應(yīng)按照如下步驟進(jìn)行：37℃，10min后置于4℃保存。第二步是PCR擴(kuò)增反應(yīng)，本發(fā)明人取出2.5μl的延伸產(chǎn)物加入定量PCR擴(kuò)增體系RealtimePCRMasterMix中，其中擴(kuò)增引物FP-A與RP各為300nM、Taqman-MGB探針100nM，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件如表4。在退火步驟時檢測熒光信號，結(jié)果如表5所示。表4表5其中，陰性對照為不添加MsDNA但其它試劑相同的Taq酶或Klenow酶體系。結(jié)果表明，Taq酶與Klenow酶均能有效延伸MsDNA，并對其進(jìn)行定量檢測?？紤]到試劑的通用性，本發(fā)明人優(yōu)選Taq酶作為延伸步驟用酶。2、不同結(jié)構(gòu)RT引物對MsDNA檢測的影響采用Taq酶的延伸體系，按照上述“1”中反應(yīng)體系和步驟(包括延伸反應(yīng)和擴(kuò)增反應(yīng))用不同結(jié)構(gòu)的RT引物對不同濃度的ssPO22進(jìn)行了檢測。其中，RT-A是含有莖環(huán)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物，而RT-B是直鏈引物，去除了RT-A的莖環(huán)發(fā)卡結(jié)構(gòu)。結(jié)果如表6所示。表6其中，陰性對照為不添加MsDNA-但其它試劑相同的Taq酶體系。結(jié)果表明，雖然RT-A和RT-B均能對ssPO22進(jìn)行擴(kuò)增，但是RT-A的擴(kuò)增效率要遠(yuǎn)高于RT-B，同時RT-A的特異性也好于RT-B。因此本發(fā)明人選擇莖環(huán)類RT引物作為優(yōu)選方案。3、延伸反應(yīng)中不同的退火溫度對MsDNA檢測的影響采用Taq酶與莖環(huán)類的RT引物(RT-A)的延伸體系，本發(fā)明人對延伸反應(yīng)的退火溫度進(jìn)行的考察，延伸反應(yīng)和擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系和步驟如上“1”所示，MsDNA模板采用ssPO22。延伸反應(yīng)的溫度分別選為30℃、40℃、50℃和60℃，實驗結(jié)果如表7。表7其中，陰性對照為不添加MsDNA-但其它試劑相同的Taq酶體系。實驗結(jié)果表明，延伸反應(yīng)中退火溫度的不同對MsDNA擴(kuò)增無顯著影響。4、不同結(jié)合長度的RT引物對MsDNA檢測的影響采用Taq酶與莖環(huán)類的RT引物的延伸體系，本發(fā)明人對不同結(jié)合長度的RT引物進(jìn)行的考察，延伸反應(yīng)和擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系和步驟如上“1”所示，MsDNA采用ssPO22，不同RT引物與MsDNA的結(jié)合堿基個數(shù)如表8序列中方框內(nèi)標(biāo)示。表8實驗結(jié)果如表9所示。表9實驗結(jié)果表明，不同結(jié)合長度的RT引物對MsDNA擴(kuò)增有極大的影響，在結(jié)合堿基數(shù)4-14的范圍內(nèi)，8個結(jié)合堿基的RT引物(RT-A)效果最好，為優(yōu)選RT引物。實施例2、MsDNAPCR檢測方法(一步法)由于延伸反應(yīng)和擴(kuò)增反應(yīng)均使用Taq酶，本發(fā)明人優(yōu)化了反應(yīng)條件，用一個反應(yīng)體系完成延伸反應(yīng)和擴(kuò)增反應(yīng)兩個步驟。改良后的一步反應(yīng)法，一次性在PCR反應(yīng)體系中加入了MsDNA模板、RT引物、Taqman探針與PCR擴(kuò)增引物，在PCR儀上直接進(jìn)行定量檢測。與兩步法相比，一步法減少了操作工序和開蓋過程中帶來污染的可能性，能更有效方便對MsDNA進(jìn)行檢測。1、延伸步驟結(jié)束后的降溫步驟提高擴(kuò)增效率一步法檢測的反應(yīng)體系中包括2×PCR反應(yīng)體系RealtimePCRMasterMix(Toyobo)、RT引物(RT-A)(25nM)、PCR擴(kuò)增引物FP-A與RP(300nM)、Taqman-MGB探針(100nM)以及檢測的MsDNA模板ssPO22。反應(yīng)步驟如表10所示。表10在步驟7時，檢測熒光信號，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行實時定量分析。在方法優(yōu)化過程中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在延伸步驟(步驟3)結(jié)束后添加一步降溫反應(yīng)，能大大地提高M(jìn)sDNA的擴(kuò)增效率。結(jié)果如表11。表11實驗結(jié)果表明，延伸步驟結(jié)束后的降溫步驟能有效提高M(jìn)sDNA的擴(kuò)增效率，4℃降溫與8℃降溫的效果相差不大，考慮到PCR擴(kuò)增儀的性能和反應(yīng)時間，優(yōu)選8-10℃為降溫的反應(yīng)溫度。除非另外說明，后續(xù)的一步法PCR檢測均采用8℃為降溫的反應(yīng)溫度。2、MsDNA序列長度對MsDNA檢測的影響采用前面“1”所述MsDNA一步法檢測法和反應(yīng)體系(但PCR擴(kuò)增引物FP-B與RP)，本發(fā)明人考察了不同序列長度的MsDNA的擴(kuò)增特性。MsDNA的序列如下：ssPO16：5’GAACTTGATTAGAACC3’(長度：16個堿基)；ssPO19：5’AGGCATGAACTTGATTAGA3’(長度：19個堿基)；ssPO22：5’AGGCATGAACTTGATTAGAACC3’(長度：22個堿基)。結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，16-22個堿基MsDNA均可以被有效擴(kuò)增，其中擴(kuò)增曲線線形良好，擴(kuò)增效率E接近100％，可以用于定量檢測。實施例3、葉酸-半胱氨酸-MsDNA偶合物探針的制備及鑒定1、葉酸-半胱氨酸-MsDNA偶合物探針的制備首先制備葉酸-半胱氨酸偶聯(lián)物。將270mg的H-Cys(Trt)-2-ClTrt樹脂(以 樹脂的表面分子數(shù)為1當(dāng)量)浸于5mL二甲基甲酰胺中30分鐘。加入4當(dāng)量的Fmoc-Glu-OtBu(購自Novabiochem，美國)和4當(dāng)量的N,N二異丙基乙胺，及加入2.5當(dāng)量的HOBT和2.5當(dāng)量HBTU反應(yīng)1小時。之后，加入20％的吡啶15分鐘去除保護(hù)基團(tuán)Fmoc，后用5mL二甲基甲酰胺洗滌樹脂3次。此后，加入4當(dāng)量的蝶酸和4當(dāng)量的N,N二異丙基乙胺及2.5當(dāng)量的HOBT和HBTU反應(yīng)過夜。次日，分別用二甲基甲酰胺、二氯甲烷和甲醇洗樹脂3次。用氮氣干燥樹脂60分鐘。此后，在樹脂中加入10mL三氟乙酸、水和三異丙基硅烷(體積比，95:2.5:2.5)的混合物反應(yīng)2小時。收集液體反應(yīng)物于圓底燒瓶，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上揮發(fā)液體至大約1mL。加入50mL的預(yù)冷的乙醚，然后4,000g離心收集固體粗產(chǎn)物。收集的粗產(chǎn)物用HPLC純化得到，純度為91％的葉酸(為γ葉酸)-半胱氨酸的偶聯(lián)物52mg。將SMCC溶于500μL水和二甲基亞砜的混合物中(體積比1:1)，然后加入濃度為1mg/mL的5’端氨基修飾的MsDNA(序列如表1所示)中并在室溫孵育4小時。此反應(yīng)是將MsDNA上的氨基和SMCC以C-N共價鍵鍵合。反應(yīng)后的產(chǎn)物用PD-10柱(SephadexG-25M)去除過量的SMCC。然后在反應(yīng)體系中加入終濃度為1mg/mL的葉酸-半胱氨酸偶聯(lián)物。此反應(yīng)是以葉酸-半胱氨酸的硫基和SMCC上的馬來酰亞胺以C-S共價鍵鍵合。終產(chǎn)物用HPLC純化可以得到葉酸-半胱氨酸-MsDNA探針。5’端氨基修飾的MsDNA可為如下幾種的其中之一：ssPO16：5’AminoC6-GAACTTGATTAGAACC3’；ssPO22：5’AminoC6-AGGCATGAACTTGATTAGAACC3’。2、葉酸-半胱氨酸-MsDNA偶合物探針的HPLC分析對上述制備獲得的產(chǎn)物分別進(jìn)行HPLC分析(紫外260nm)，葉酸-半胱氨酸-ssPO22的HPLC純度分析圖譜見圖2A。HPLC純度分析表明其純度為93.46％。葉酸-半胱氨酸-ssPO16的HPLC純度分析圖譜見圖2B。HPLC純度分析表明其純度為90.89％。3、紫外分光光度分析將未偶聯(lián)的MsDNA，葉酸-半胱氨酸偶聯(lián)物與制備的葉酸-半胱氨酸MsDNA偶聯(lián)物進(jìn)行紫外吸收譜分析。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，260nm附近為核酸的特征吸收峰 而350nm附近為葉酸的特征吸收峰。如果樣品紫外光譜的掃描結(jié)果同時具有約260nm和350nm附近的吸收峰，那么其同時含有核苷酸和葉酸。結(jié)果，葉酸-半胱氨酸偶聯(lián)物的紫外光譜如圖3A；未偶聯(lián)的ssPO22的紫外光譜如圖3B；葉酸-半胱氨酸-ssPO22的紫外光譜如圖3C；葉酸-半胱氨酸-ssPO16的紫外光譜如圖3D。由圖可見，未偶聯(lián)的MsDNA只有212和259納米左右的吸收峰，葉酸-半胱氨酸偶聯(lián)物的吸收峰在217、281和346納米左右。而寡聚核苷酸與葉酸-半胱氨酸的偶聯(lián)物都有在212、259和348納米的吸收峰。4、偶合物探針解離常數(shù)的檢測“葉酸-半胱氨酸-OG”制備方法如下：首先，合成葉酸-半胱氨酸偶合物。將441mg的γ葉酸慢慢溶入20mL二硫甲砜，然后加入1.2mmol的二環(huán)己基碳二亞胺和2mmol的N-羥基硫代琥珀酰亞胺于50℃反應(yīng)6小時。此反應(yīng)得到的γ葉酸-N-羥基硫代琥珀酰亞胺和10倍等摩爾量的半胱氨酸加入50微升吡啶在25℃反應(yīng)5小時。粗產(chǎn)物(其中包含γ葉酸-半胱氨酸和α-異構(gòu)體-半胱氨酸)用20mL乙腈沉淀并離心收集。隨后產(chǎn)物用乙醚洗三遍。收集的產(chǎn)物最后用真空干燥，并稱量，重量為390mg。此粗產(chǎn)物用美國AgilentTechnologies的Microsorb碳-18制備型反相高效液相色譜柱(250mm×21mm)分離純化。γ葉酸-半胱氨酸的洗脫時間分別為7.6分鐘。分離的γ葉酸-半胱氨酸(此為脂鍵CO-NH連接的偶合物，含2個半胱氨酸)為58mg，得率為12％。然后，將純化后的1.5mg偶合物在100μL的二硫甲砜中溶解，并加入1.0mg的OregonGreen488琥珀酰亞胺酯并在室溫孵育4小時。反應(yīng)后的產(chǎn)物用高效液相色譜純化，獲得OregonGreen488(簡稱OG)熒光標(biāo)記的葉酸探針(稱為：葉酸-半胱氨酸-OG)。取105個KB細(xì)胞，重懸于100μLPBS中，加入不同濃度的待測物共100μL后15分鐘，再加入熒光探針葉酸-半胱氨酸-OG(6nM)。室溫避光孵育60min；反應(yīng)結(jié)束后加入200μLPBS，600g離心15min；棄上清，加入300μLPBS重懸細(xì)胞，流式檢測熒光強(qiáng)度。在反應(yīng)中未熒光標(biāo)記的葉酸用作陽性對照。通過測得的熒光強(qiáng)度計算出特異性結(jié)合的百分率(specificbound％)與對應(yīng)的探針濃度用Prism5(GraphpadsoftwareInc.)作圖，用bindingcompetitive-OnesiteFitKi計算偶合物探針的親和力常數(shù)Ki(即：競爭性阻斷劑的平衡解離常數(shù),該常數(shù)數(shù) 值越低，則親和力越大；反之常數(shù)數(shù)值越高，則親和力越小)。探針親和力檢測結(jié)果見表12。表12結(jié)果顯示，分子量越小的葉酸-半胱氨酸-MsDNA偶合物親和力越高。實施例4、葉酸-半胱氨酸-MsDNA偶合物探針的PCR檢測1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線首先用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將葉酸-半胱氨酸-ssPO16偶合物探針按照濃度梯度依次稀釋成1.0E-9mol/L、1.0E-10mol/L、1.0E-11mol/L、1.0E-12mol/L、1.0E-13mol/L、1.0E-14mol/L六個稀釋度作為標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照為去離子水。PCR測定時按一步法配制擴(kuò)增反應(yīng)液，后加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測品2.5μL。并按照一步法設(shè)置檢測步驟，RT引物采用RT-A，PCR擴(kuò)增引物采用FP-B和RP。分析數(shù)據(jù)時基線采用缺省值。熒光閾值設(shè)定為0.3。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的Log值為橫坐標(biāo)，CT值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。2、陽性腫瘤細(xì)胞葉酸受體數(shù)量的測定為了驗證本發(fā)明的方法的準(zhǔn)確性，利用本發(fā)明的方法測定了HeLa、KB和A549等細(xì)胞的葉酸受體數(shù)量。測定方法如下，首先取2×105細(xì)胞，PBS洗滌后，加入400μLPBS+0.1％BSA含1mMblockingDNA，封閉細(xì)胞20分鐘；然后加入葉酸-半胱氨酸-ssPO16或葉酸-半胱氨酸-ssPO22探針標(biāo)記細(xì)胞，葉酸-半胱氨酸-ssPO16探針的濃度為10nM，葉酸-半胱氨酸-ssPO22探針的濃度為20nM，室溫孵育20分鐘。孵育結(jié)束后加入1mLPBS終止反應(yīng)；離心收集細(xì)胞。然后加入1mLPBS離心洗滌細(xì)胞三次，最后加入120μLPH2.5的0.1M甘氨酸鹽酸緩沖液重懸細(xì)胞，洗脫探針。離心將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入 12μL0.5MNaOH中和。然后，本發(fā)明人將這些樣品按照前述一步法進(jìn)行PCR定量分析(RT引物采用RT-A，葉酸-半胱氨酸-ssPO22的PCR擴(kuò)增引物采用FP-A和RP，葉酸-半胱氨酸-ssPO16的PCR擴(kuò)增引物采用FP-B和RP)從而測定結(jié)合的探針數(shù)量，即細(xì)胞的葉酸受體數(shù)量。將測得的總受體數(shù)除以加入的細(xì)胞數(shù)可得到每個細(xì)胞的受體數(shù)，結(jié)果見表13。表13從檢測結(jié)果可以看出，在三種細(xì)胞株中，KB表達(dá)量最高，HeLa其次，而A549最低。這與文獻(xiàn)(G.B.Henderson,etal,J.Membr.Biol.101(1988)247–258.C.A.Luhrs,etal.Arch.Biochem.Biophys.250(1986)94–105.M.A.Kane,etal,J.Clin.Invest.81(1988)1398-1406)的報道中這些受體的mRNA的表達(dá)水平是相符的。葉酸-半胱氨酸-ssPO16探針的檢測結(jié)果與葉酸-半胱氨酸-ssPO22類似，無明顯區(qū)別。實施例5、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)檢測的回收率、線性和檢測限本發(fā)明人從健康人抽取血樣，然后將所有血樣放到一起混勻并均勻分成3mL的待測樣品。然后分別將8、40、200、1,000個KB細(xì)胞，加入3mL的如上樣品中配制成細(xì)胞濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)樣品。另外的3mL未加KB細(xì)胞的作為陰性對照品。分離富集步驟：樣品處理時，首先往血樣中加入9mL紅細(xì)胞裂解液，待紅細(xì)胞充分裂解后，離心收集剩余細(xì)胞。離心后用10mLPBS+0.1％BSA洗滌細(xì)胞一次，然后在細(xì)胞懸液中加入200μlantiCD-45Dynabeads，4℃冰箱中孵育30min。孵育結(jié)束后加入1mLPBS+0.1％BSA，顛倒混勻，置于磁場中10min。然后將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，離心收集細(xì)胞。探針標(biāo)記前加入400μLPBS+0.1％BSA含1mMblockingDNA封閉細(xì)胞 20min；然后加入葉酸-半胱氨酸-ssPO16探針標(biāo)記細(xì)胞，探針的濃度為10nM，室溫孵育20min。孵育結(jié)束后加入1mLPBS終止反應(yīng)。離心收集細(xì)胞，然后加入1mLPBS離心洗滌細(xì)胞三次，去除未結(jié)合的探針。最后加入120μLpH2.5的0.1M甘氨酸鹽酸緩沖液重懸細(xì)胞，洗脫探針。離心將上清洗脫液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入12μL0.5MNaOH中和。然后本發(fā)明人將這些樣品進(jìn)行PCR定量分析(RT引物采用RT-A，PCR擴(kuò)增引物采用FP-B和RP)測定結(jié)合的探針數(shù)量，即細(xì)胞的葉酸受體數(shù)量。用檢測出的葉酸受體數(shù)除去每個陽性細(xì)胞的受體數(shù)量即得細(xì)胞數(shù)。結(jié)果如表14。表14標(biāo)準(zhǔn)品中的細(xì)胞數(shù)量平均檢出細(xì)胞數(shù)量回收率100098598％20019895％404284％81696％08.5--注：回收率＝(平均檢出細(xì)胞數(shù)量-陰性對照品細(xì)胞數(shù)量)/標(biāo)準(zhǔn)品中的細(xì)胞數(shù)量*100％。結(jié)果表明，本方法的細(xì)胞回收率很高，達(dá)到84-98％。這超過了CTC陽性磁珠篩選法的回收率(30-70％)。本發(fā)明人對上述數(shù)據(jù)做了線性回歸分析。將標(biāo)準(zhǔn)品中的細(xì)胞數(shù)量作為獨立變量，平均檢出的細(xì)胞數(shù)量作為依賴變量，可以得到縱軸截距5.643，斜率為0.9786。及R2＝0.99，如圖5。因此，去除了癌細(xì)胞在分離富集中的人為損失，該分析說明本方法的檢測范圍為0到1000個細(xì)胞每3mL血樣。實施例6、對腫瘤患者胸水樣本中腫瘤細(xì)胞的定性和定量分析本發(fā)明人從若干肺癌患者或其它腫瘤患者中各取3mL胸水樣本(樣本號1-6)，然后按照實施例5的分離富集方法進(jìn)行分離富集處理，并用葉酸-半胱氨酸-ssPO16探針對胸水樣本中腫瘤細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。如前述一步法進(jìn)行PCR定量分析(RT引物采用RT-A，PCR擴(kuò)增引物采用FP-B和RP)、計算CTC個數(shù)(針 對每一樣本都需如前檢測該樣本的腫瘤細(xì)胞上葉酸受體數(shù)，從而計算CTC數(shù))，結(jié)果如表15。表15由表15的對照結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)胸水中CTC的數(shù)量與腫瘤患者的癌癥類型與治療狀況有明顯的聯(lián)系。對化療不敏感的肺癌患者與化療的肺癌患者相比，CTC的數(shù)量明顯增多。良性疾病與非肺原性腫瘤幾乎檢測不到信號。綜上通過本發(fā)明的方法檢測患者胸水中的CTC細(xì)胞，可以準(zhǔn)確地反映患者在檢測時的疾病狀況。實施例7、對腫瘤患者和良性疾病患者血樣中CTC的定量分析本發(fā)明人從若干初診肺癌患者中取3mL血樣，然后按照實施例5的分離富集方法進(jìn)行分離富集處理。并用葉酸-半胱氨酸-ssPO16探針對血樣中腫瘤細(xì)胞 進(jìn)行標(biāo)記。按照前述PCR方法(一步法)定量分析(RT引物采用RT-A，PCR擴(kuò)增引物采用FP-B和RP)后、計算CTC個數(shù)，結(jié)果如表16。表16由表16的對照結(jié)果可見，肺癌患者與良性疾病患者的血液中CTC數(shù)量存在著明顯的差異，肺癌患者的CTC均值為43.4CTC/ml。而良性疾病的患者的檢測均值僅為2.4CTC/ml。因此通過本發(fā)明的方法檢測肺癌患者的CTC細(xì)胞，可以準(zhǔn)確地反映患者在檢測時的疾病狀況。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。