專利名稱：在側(cè)鏈具有取代或未取代的(苯基甲基)硫烷基結(jié)構(gòu)的單元的新聚羥基鏈烷酸酯及其制備方法
背景技術(shù)：
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背景技術(shù)：
已有報(bào)道，許多微生物可生產(chǎn)聚-3-羥基丁酸酯(下文也簡稱為“PHB”)或其它PHA并將其積聚在細(xì)胞中(“Biodegradable Plastics Handbook”，Biodegradable Plastics Society Ed.，NTS，178-197頁(1995))。這些聚合物可用于各種產(chǎn)品的生產(chǎn)，例如，與常規(guī)的塑料進(jìn)行熔融加工，但是不象許多常規(guī)的合成聚合物化合物，這些聚合物不在自然環(huán)境中導(dǎo)致污染，因?yàn)樗鼈兪强缮锝到獾?，即，在自然界中通過微生物將它們完全降解。另外，它們具有好的生物相容性，預(yù)期它們可在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中用作軟材料。
已知微生物的PHAs具有不同的組分和/或結(jié)構(gòu)，這取決于例如微生物的種類、培養(yǎng)基的組分和培養(yǎng)條件。因此，已經(jīng)研究對組分和結(jié)構(gòu)進(jìn)行控制以提高PHA的物理特性。
(1)首先，下述文獻(xiàn)報(bào)道了或公開了通過聚合相對簡單的單體單元——諸如3-羥基丁酸(下文簡稱3HB)——合成PHA。
例如，已知Alcaligenes eutrophus H16(ATCC No.17699)和其突變體以各種成分比例生產(chǎn)3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯(下文簡稱3HV)的共聚物(日本專利公開No.6-15604和日本專利公開No.7-14352和8-19227.)。
日本專利No.2642937公開了通過將無環(huán)的脂肪族烴化合物作為底物提供給Pseudomonas oleovorans(ATCC No.29347)生產(chǎn)3-羥基鏈烷酸C6-C12酯單體單元的PHA。
日本專利申請延遲公開No.5-7492公開了用微生物——諸如Methylobacterium sp.，Paracoccus sp.，Alcaligenes sp.和Pseudomonassp.——與C3-C7伯醇接觸生產(chǎn)3HB和3HV共聚物的方法。
日本專利申請延遲公開No.5-93049和日本專利申請延遲公開No.7-265065公開了將Aeromonas caviae與作為底物的油酸或橄欖油培養(yǎng)生產(chǎn)3HB和3-羥基己酸酯的雙成分共聚物。
日本專利申請延遲公開No.9-191893公開了Comamonans acidovorans IFO13852在作為底物的葡糖酸和1，4-丁二醇存在下培養(yǎng)時(shí)生產(chǎn)含有3HB和4-羥基丁酸酯作為單體單元的聚酯。
上述PHAs是包括具有烷基作為側(cè)鏈的單體單元的“常規(guī)的PHAs”，其通過微生物經(jīng)烴類等的β-氧化或經(jīng)糖類合成的脂肪酸合成。
(2)但是，當(dāng)考慮微生物PHAs的更廣泛的應(yīng)用時(shí)，認(rèn)為“非常規(guī)的PHAs”——即，側(cè)鏈上具有烷基之外的取代基的PHAs——非常有用，例如作為功能聚合物。某類微生物已知用于生產(chǎn)這類“非常規(guī)的PHA”，已經(jīng)進(jìn)行了努力用這種方法以提高微生物PHA的物理性能。
取代基的例子包括不飽和烴類、酯基、氰基、鹵代烴、環(huán)氧化物和那些含有芳環(huán)或環(huán)類的。其中，已經(jīng)積極研究了具有芳環(huán)的PHAs。
例如，Makromol.Chem.，191，1957-1965(1990)、Macromolecules，24，5256-5260(1001)和Chirality，3，492-494(1991)報(bào)道了Pseudomonasoleovorans生產(chǎn)含有3-羥基-5-苯基戊酸酯(下文縮寫為3HPV)作為單體單元的PHAs，觀察到的在PHA的物理性質(zhì)方面的變化大概是由于3HPV的存在。
對于在側(cè)鏈上有取代基的PHAs，最近已經(jīng)積極開發(fā)了那些在側(cè)鏈上具有苯氧基的。
已經(jīng)報(bào)道了Pseudomonas oleovorans從11-苯氧基十一酸生成由3-羥基-5-苯氧基戊酸酯和3-羥基-9-苯氧基壬酸酯單體單元形成的PHA(Macromol.Chem.Phys.，195，1665-1672(1994))。
Macromolecules，29，3432-3435(1996)報(bào)道了通過使用Pseudomonasoleovorans從6-苯氧基己酸生產(chǎn)具有3-羥基-4-苯氧基丁酸酯和3-羥基-6-苯氧基己酸酯單體單元的PHA；從8-苯氧基辛酸生產(chǎn)具有3-羥基-4-苯氧基丁酸酯、3-羥基-6-苯氧基己酸酯、3-羥基-4-苯氧基丁酸酯、3-羥基-6-苯氧基己酸酯和3-羥基-8-苯氧基辛酸酯單體單元的PHA；以及從11-羥基十-酸生產(chǎn)具有3-羥基-5-苯氧基戊酸和3-羥基-7-苯氧基庚酸單元的PHA。
Can.J.Microbiol.，41，32-43(1995)報(bào)道了通過Pseudomonas oleovoransATCC 29347或Pseudomonas putida KT 2422使用辛酸和6-(4-氰基苯氧基)己酸或6-(對硝基苯氧基)己酸作為底物生產(chǎn)含有3-羥基-6-(4-氰基苯氧基)己酸或3-羥基-6-(4-硝基苯氧基)己酸作為單體單元的PHA。
對于非常規(guī)PHAs的生成，Macromolecules，32，8315-8318(1999)報(bào)道了那些在側(cè)鏈具有硫化物(-S-)形式的硫原子的PHAs的生成，其中Pseudomonasputida 27N01使用辛酸和11-(苯基硫烷基)十一酸作為底物生產(chǎn)含有3-羥基-5-(苯基硫烷基)戊酸和3-羥基-7-(苯基硫烷基)庚酸作為單體單元的PHAs。在這種情況下，Pseudomonas putida 27N01在僅含有辛酸作為生長底物的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到僅含有11-(苯基硫烷基)十一酸作為底物的培養(yǎng)基中。
還有Polymer Preprints，Japan Vol.49，No.5，1034(2000)報(bào)道了使用Pseudomonas putida 27N01和11-[(苯基甲基)硫烷基]庚酸作為底物生產(chǎn)含有3-羥基-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸和3-羥基-7-[(苯基甲基)硫烷基]庚酸兩種單體單元的PHAs。在這種情況下，Pseudomonasputida 27N01在僅含有辛酸作為生長底物的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到僅含有11-[(苯基甲基)硫烷基]十一酸作為底物的培養(yǎng)基中。
在非常規(guī)PHAs中，關(guān)于含有3-羥基-ω-[(苯基甲基)硫烷基]鏈烷酸單元的PHAs，上述文獻(xiàn)僅報(bào)道了這類PHAs的生物合成。另外，可得到的生產(chǎn)方法是有限的。因此，得到的聚合物在類型、純度和產(chǎn)率方面不足。在上述生產(chǎn)含有3-羥基-ω-[(苯基甲基)硫烷基]鏈烷酸單元的PHAs的方法中，通過在僅含有具有長碳鏈的ω-[(苯基甲基)硫烷基]鏈烷酸作為底物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物進(jìn)行聚合物的生產(chǎn)，其中ω-[(苯基甲基)硫烷基]鏈烷酸還用作生長底物。因此，難于控制聚合物的結(jié)構(gòu)。
PHAs含有取代的3-羥基-ω-{[(取代的苯基)甲基]硫烷基}鏈烷酸單元，該單元有取代基，諸如在側(cè)鏈的末端在(苯基甲基)硫烷基的苯環(huán)上的各種官能團(tuán)，這些PHAs是有新的功能性的PHAs，并且預(yù)計(jì)這類PHAs的物理性能有所改進(jìn)。這類PHAs的應(yīng)用將擴(kuò)展到常規(guī)PHA尚未適用的新領(lǐng)域。因此，需要開發(fā)生產(chǎn)這類PHAs的有效方法。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的PHA及其制備方法，其中PHA包括新的單元，該單元在其取代的或未取代的側(cè)鏈中具有(苯基甲基)硫烷基結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種聚羥基鏈烷酸酯，其包括下述化學(xué)式(1)所示的單元 其中R1是芳環(huán)的取代基，選自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、鹵原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’選自H、Na、K、CH3和C2H5，R”選自O(shè)H、鹵原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；x表示1-8的整數(shù)，在聚羥基鏈烷酸酯中彼此相同或不同，條件是聚羥基鏈烷酸酯不由下述化學(xué)式(2)和(3)所示的兩種單元組成 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種生產(chǎn)包括化學(xué)式(1)所示單元的聚羥基鏈烷酸酯的方法，包括在含有下述化學(xué)式(10)所示的化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物的步驟 其中R2是芳環(huán)的取代基，選自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、鹵原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’選自H、Na、K、CH3和C2H5，R”選自O(shè)H、鹵原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；k表示1-8的整數(shù)。
圖2表示實(shí)施例1得到的聚羥基鏈烷酸酯的13C NMR譜。
圖3表示實(shí)施例10得到的聚羥基鏈烷酸酯的1H NMR譜。
圖4表示實(shí)施例19得到的PHA的1H NMR譜。
圖5表示實(shí)施例19得到的PHA的13C NMR譜。
圖6表示實(shí)施例29得到的PHA的1H NMR譜。
本發(fā)明的新的聚羥基鏈烷酸酯可通過下述步驟制備在培養(yǎng)基中培養(yǎng)生產(chǎn)PHA的微生物，培養(yǎng)基含有生長底物和作為原料的取代的或未取代的ω-[(苯基甲基)硫烷基]鏈烷酸；回收聚羥基鏈烷酸酯，其含有在側(cè)鏈末端具有取代的或未取代的(苯基甲基)硫烷基的單元，在培養(yǎng)步驟期間在微生物中累積生產(chǎn)了聚羥基鏈烷酸酯。在微生物的PHAs中，在所有3-羥基鏈烷酸單元中，包括化學(xué)式(1)所示的那些，在3位的碳是不對稱碳，其絕對構(gòu)型為R，顯示出其生物可降解性。
在上述通式(1)和(10)中，在苯環(huán)上的取代基R中，鹵原子的例子包括氟、氯和溴。
下文更詳細(xì)地描述本發(fā)明。生產(chǎn)PHA的微生物在本發(fā)明的生產(chǎn)PHAs的方法中，可使用任何微生物生產(chǎn)化學(xué)式(1)所示的在側(cè)鏈末端具有取代的或未取代的(苯基甲基)硫烷基的單元的PHA(下文稱為目標(biāo)PHA)，只要在含有相應(yīng)的化學(xué)式(10)所示ω-[(苯基甲基)硫烷基]鏈烷酸作為源化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，其能夠生產(chǎn)目標(biāo)PHA并在細(xì)胞中累積。例如微生物可以是那些屬于Pseudomonas屬具有生產(chǎn)PHA能力的。
適合的Pseudomonas屬微生物的例子包括下述三種菌株P(guān)seudomonascichorii YN2(FERM BP-7375)，Pseudomonas cichorii H45(FERM BP-7374)，和Pseudomonas jessenii P161(FERM BP-7376)。這三種微生物首先作為國家保藏有被申請人保藏，并根據(jù)布達(dá)佩斯條約以上述登記號進(jìn)行了國際保藏，保藏單位是International Patent Organism Depositary，National Instituteof Advanced Industrial Science and Technology，IndependentAdministrative Institution，Ministry of Economy，Trade and Industry 1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305 JAPAN(前NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology(NIBH)of the Agency ofIndustrial Science and Technology，Ministry of Economy，Trade andIndustry)。它們還在日本專利申請No.11-371863(日本專利申請延遲公開No.2001-178484)中作為新的能生產(chǎn)PHAs的菌株描述。
菌株YN2、H45和P161的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)給出如下。<菌株YN2的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)>(1)形態(tài)學(xué)性質(zhì)細(xì)胞的形狀和大小棒狀，0.8μm×1.5-2.0μm細(xì)胞多形性陰性移動(dòng)性可動(dòng)芽胞形成陰性革蘭氏染色陰性菌落性狀環(huán)狀；完整，光滑邊界；低凸面；光滑表面；平滑；透明(2)生理學(xué)性質(zhì)過氧化氫酶陽性氧化酶陽性O(shè)/F試驗(yàn)氧化(非發(fā)酵的)硝酸鹽還原陰性吲哚生成陽性從葡萄糖生成酸陰性精氨酸二水解酶陰性脲酶陰性七葉苷水解陰性明膠水解陰性β-半乳糖苷酶陰性在King’s B瓊脂上產(chǎn)生熒光顏料陽性在4％NaCl下生長陽性(微弱生長)聚β-羥基丁酸酯累積陰性(*)吐溫80水解陽性(*)在營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)的菌落用蘇丹黑染色用于測定。(3)底物吸收葡萄糖陽性L-阿拉伯糖陽性D-甘露糖陰性D-甘露糖醇陰性N-乙?；?D-葡糖胺陰性麥芽糖陰性葡糖酸鉀陽性正癸酸鹽陽性己二酸鹽陰性dl-蘋果酸鹽陽性檸檬酸鈉陽性乙酸苯酯陽性<菌株H45的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)>(1)形態(tài)學(xué)性質(zhì)細(xì)胞的形狀和大小棒狀，0.8μm×1.0-1.2μm細(xì)胞多形性陰性移動(dòng)性可動(dòng)芽胞形成陰性革蘭氏染色陰性菌落性狀環(huán)狀；完整，光滑邊界；低凸面；光滑表面；平滑；奶油色(2)生理學(xué)性質(zhì)過氧化氫酶陽性氧化酶陽性O(shè)/F試驗(yàn)氧化硝酸鹽還原陰性吲哚生成陰性從葡萄糖生成酸陰性精氨酸二水解酶陰性脲酶陰性七葉苷水解陰性明膠水解陰性β-半乳糖苷酶陰性在King’s B瓊脂上產(chǎn)生熒光顏料陽性在4％NaCl下生長陰性聚β-羥基丁酸酯累積陰性(3)底物吸收葡萄糖陽性L-阿拉伯糖陰性D-甘露糖陽性D-甘露糖醇陽性N-乙?；?D-葡糖胺陽性麥芽糖陰性葡糖酸鉀陽性正癸酸鹽陽性己二酸鹽陰性dl-蘋果酸鹽陽性檸檬酸鈉陽性乙酸苯酯陽性<菌株P(guān)161的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)>(1)形態(tài)學(xué)性質(zhì)細(xì)胞的形狀和大小球狀，φ0.6μm，棒狀，0.6μm×1.5-2.0μm細(xì)胞多形性伸長形式移動(dòng)性可動(dòng)芽胞形成陰性革蘭氏染色陰性菌落性狀環(huán)狀；完整，光滑邊界；低凸面；光滑表面；淺黃色(2)生理學(xué)性質(zhì)過氧化氫酶陽性氧化酶陽性O(shè)/F試驗(yàn)氧化硝酸鹽還原陽性吲哚生成陰性從葡萄糖生成酸陰性精氨酸二水解酶陽性脲酶陰性七葉苷水解陰性明膠水解陰性β-半乳糖苷酶陰性在King’s B瓊脂上產(chǎn)生熒光顏料陽性(3)底物吸收葡萄糖陽性L-阿拉伯糖陽性D-甘露糖陽性D-甘露糖醇陽性N-乙酰基-D-葡糖胺陽性麥芽糖陰性葡糖酸鉀陽性正癸酸鹽陽性己二酸鹽陰性dl-蘋果酸鹽陽性檸檬酸鈉陽性乙酸苯酯陽性培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的PHA生產(chǎn)方法，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述能夠生產(chǎn)PHA的微生物，所述的培養(yǎng)基含有作為原料的上述化學(xué)式(10)表示的ω-[(苯基甲基)硫烷基]鏈烷酸，通過在細(xì)胞中累積生產(chǎn)化學(xué)式(1)所示的PHA，其在側(cè)鏈的末端含有具有取代的或未取代的(苯基甲基)硫烷基的3-羥基鏈烷酸酯單元。
對于在本發(fā)明中使用的微生物的普通培養(yǎng)，例如，為了制備原菌種，或?yàn)榱说玫郊?xì)胞或在PHA生產(chǎn)中保持要求的活性，選擇培養(yǎng)基使其含有增殖所用微生物需要的成分。例如，可使用任何一種已知的培養(yǎng)基，諸如典型的天然培養(yǎng)基(例如，營養(yǎng)肉湯、酵母提取物)和補(bǔ)充了營養(yǎng)物的合成培養(yǎng)基，只要培養(yǎng)基不對微生物的生長和生存有不利影響。根據(jù)使用的微生物適當(dāng)?shù)剡x擇培養(yǎng)條件，諸如溫度、通氣和振搖。
為了使用上述生產(chǎn)PHA的微生物生產(chǎn)目標(biāo)PHA，可使用無機(jī)培養(yǎng)基，其含有至少一種微生物需要的生長底物和上述化學(xué)式(10)所示的化合物，該化合物相應(yīng)于PHA生產(chǎn)中作為原料的單體單元。希望上述化學(xué)式(10)所示化合物的含量為每培養(yǎng)基的0.01-1(w/v)％，更優(yōu)選0.02-0.2％?；瘜W(xué)式(10)表示的化合物并不總是具有良好的水溶性。但是，由于本發(fā)明引入的微生物，懸浮液不會(huì)帶來麻煩。
化學(xué)式(10)表示的原料化合物在一些情況下可以作為在諸如1-十六碳烯或正十六碳烯的溶劑中的溶液或懸浮液加入以改進(jìn)分散性。在這種情況下，相對于培養(yǎng)基溶液，溶劑的濃度要求等于或小于3％(v/v)。
優(yōu)選獨(dú)立地將用于微生物增殖的生長基質(zhì)加入到培養(yǎng)基中。作為生長基質(zhì)，可使用營養(yǎng)素，諸如酵母提取物、聚蛋白胨和肉提取物?？苫趯λ镁曜鳛榛|(zhì)的有用性從糖類、三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的有機(jī)酸類、三羧酸循環(huán)后的一步或兩步生化反應(yīng)生成的有機(jī)酸類或其鹽、氨基酸類或其鹽類、C4-C12直鏈烷酸或其鹽中選擇生長底物。
一種或多種糖類可適當(dāng)?shù)剡x自醛糖，諸如甘油醛、赤蘚糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖；糖醇，諸如甘油、赤蘚醇和木糖醇；醛糖酸，諸如葡糖酸；糖醛酸，諸如葡糖醛酸和半乳糖醛酸；和二糖，諸如麥芽糖、蔗糖和乳糖。
作為有機(jī)酸或其鹽，一種或多種化合物可適當(dāng)?shù)剡x自丙酮酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸和其鹽。
作為氨基酸或其鹽，一種或多種化合物可適當(dāng)?shù)剡x自谷氨酸、天門冬氨酸和其鹽。
其中優(yōu)選聚蛋白胨和糖類。優(yōu)選的糖類包括至少一種選自葡萄糖、果糖和甘露糖。優(yōu)選在培養(yǎng)基中基質(zhì)的含量為0.1-5％(w/v)，更優(yōu)選0.2-2％。
有時(shí)，當(dāng)微生物充分生長并隨后轉(zhuǎn)移到氮源——諸如氯化銨——有限的并且加入了作為PHA底物的化合物的培養(yǎng)基時(shí)，提高了微生物PHA生產(chǎn)能力。例如，可使用多步驟途徑，在不同的培養(yǎng)條件下連續(xù)進(jìn)行兩步或多個(gè)步驟。
更具體的，微生物在含有化學(xué)式(10)表示的化合物和聚蛋白胨的培養(yǎng)基中生長直至從對數(shù)生長后期到穩(wěn)定期(步驟1-1)，然后使用例如離心法收集。接著，在步驟1培養(yǎng)的微生物再在含有化學(xué)式(10)表示的化合物和上述有機(jī)酸或其鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(優(yōu)選無氮源)(步驟1-2)?；蛘撸⑸镌诤谢瘜W(xué)式(10)表示的化合物和上述糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)直至從對數(shù)生長后期到穩(wěn)定期(步驟1-3)，然后用例如離心法收集。接著，在步驟1培養(yǎng)的微生物進(jìn)一步在含有化學(xué)式(10)表示的化合物和上述糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(優(yōu)選無氮源)(步驟1-4)。在這個(gè)兩步培養(yǎng)過程的第一步中，細(xì)胞進(jìn)行增殖，同時(shí)從上述通式(10)表示的原料化合物生產(chǎn)目標(biāo)PHA。在第二步，充分增殖的細(xì)胞在不含氮源的培養(yǎng)基中繼續(xù)PHA生產(chǎn)，增加細(xì)胞中累積的PHA的量。
培養(yǎng)溫度是上述菌株可充分增殖的溫度。例如，培養(yǎng)溫度可以是15℃-40℃，優(yōu)選20℃-35℃，更優(yōu)選20℃-30℃。
可通過任何適合的培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)，諸如液體或固體培養(yǎng)，由此可增殖上述微生物以生成聚羥基鏈烷酸酯。另外，不限制培養(yǎng)的類型，只要適當(dāng)?shù)靥峁┭鯕?。例子包括分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。在液態(tài)分批培養(yǎng)中，在振蕩搖瓶內(nèi)容物的同時(shí)可提供氧氣?；蛘撸冒l(fā)酵罐通過攪動(dòng)換氣供氧。
作為用于上述培養(yǎng)過程的無機(jī)培養(yǎng)基，可使用任何含有增殖微生物所需的成分——諸如磷源(例如，磷酸鹽)和氮源(例如銨鹽、硝酸鹽)的培養(yǎng)基。例如可使用MSB培養(yǎng)基和M9培養(yǎng)基。
用于本發(fā)明方法的無機(jī)培養(yǎng)基(M9)的組成如下(M9培養(yǎng)基)Na2HPO46.2gKH2PO43.0gNaCl 0.5gNH4Cl 1.0g(在1升培養(yǎng)基中；pH7.0)為了確保良好的增殖和聚羥基鏈烷酸酯的生產(chǎn)能力，需要向上述無機(jī)培養(yǎng)基中加入下述痕量成分溶液，其用量為約0.3％(v/v)。(痕量成分溶液)次氮基三乙酸；1.5g；MgSO4；3.0g；MnSO40.5g；NaCl1.0g；FeSO40.1g；CaCl20.1g；CoCl20.1g；ZnSO40.1g；CuSO40.1g；AlK(SO4)20.1g；
H3BO30.1g；Na2MoO40.1g；NiCl20.1g(1升溶液；pH7.0)PHA回收在本發(fā)明中使用的微生物在細(xì)胞中產(chǎn)生并積累目標(biāo)PHA。因此，在本發(fā)明生產(chǎn)PHA的方法中，在培養(yǎng)后提供一個(gè)從細(xì)胞回收目標(biāo)PHA的步驟。
為了從細(xì)胞回收PHA，使用溶劑萃取技術(shù)，其中可溶化了的聚羥基鏈烷酸酯與不溶性的細(xì)胞成分分離。標(biāo)準(zhǔn)的氯仿萃取技術(shù)是最方便和簡單的，但是可使用除了氯仿以外的溶劑，諸如二氯甲烷、二氧六環(huán)、四氫呋喃、乙腈和丙酮。
在難于使用有機(jī)溶劑的環(huán)境下，聚羥基鏈烷酸酯以外的菌株成分用例如諸如SDS的表面活性劑、諸如溶菌酶的酶或EDTA處理除去并除去細(xì)胞內(nèi)成分，僅回收聚羥基鏈烷酸酯。或者，可使用細(xì)胞破裂處理，諸如超聲波破裂、均化破裂、加壓破裂、用玻璃珠破裂、研磨、磨碎和凍熔，分離和回收細(xì)胞中積累的聚羥基鏈烷酸酯。
應(yīng)當(dāng)理解培養(yǎng)本發(fā)明的微生物、通過本發(fā)明的微生物生成聚羥基鏈烷酸酯和在細(xì)胞內(nèi)積累聚羥基鏈烷酸酯以及從細(xì)胞回收聚羥基鏈烷酸酯不限于上述技術(shù)和工藝。
根據(jù)本發(fā)明的方法通過微生物生產(chǎn)的聚羥基鏈烷酸酯除了化學(xué)式(1)表示的單元，可包括化學(xué)式(4)表示的3-羥基鏈烷酸單元或化學(xué)式(5)表示的3-羥基鏈-5-烯酸單元，它們是通過脂肪酸合成體系通過將增殖底物加入到培養(yǎng)基中生物合成的。在所含的全部3-羥基鏈烷酸單元的3位的碳是不對稱碳，它們的絕對構(gòu)型是R，顯示出它們的生物可降解性。在化學(xué)式(1)表示的單元中存在的(苯基甲基)硫烷基和在其苯環(huán)上存在的各種取代基，為聚合物提供了新的物理和化學(xué)性質(zhì)。這類聚合物有望在物理性質(zhì)上有所改進(jìn)。聚合物可擴(kuò)展到過去沒有應(yīng)用過的領(lǐng)域。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍?，得到159mg聚羥基鏈烷酸酯。
在下述條件下對聚羥基鏈烷酸酯進(jìn)行NMR分析。<波譜儀>FT-NMRBruker DPX 400，進(jìn)行1H-NMR的頻率400MHz和進(jìn)行13C的頻率100MHz。<條件>
核種類1H，13C溶劑CDCl3溫度室溫

圖1和2分別表示聚羥基鏈烷酸酯的1H-NMR譜和13C-NMR譜。其鑒定結(jié)果如下表1和2所示。
表1化學(xué)位移(ppm)積分裂分形式 鑒定1.83 2H qurt d12.36-2.54 4H m b1，c13.67 2H s f15.20 1H quint c17.20 1H m j17.25-7.28 4H m h1，11&i1，k1
表2化學(xué)位移(ppm) 鑒定26.6 d133.0 e135.9 f138.6 b169.7 c1126.9 j1128.4 h，l128.8 i，k138.0 g1168.9 a1如表1和2清楚地表示，確認(rèn)聚羥基鏈烷酸酯是下述化學(xué)式(16)表示的，其含有作為單體單元的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯和相應(yīng)于有4-12個(gè)碳原子的飽和/不飽和脂肪酸——諸如3-羥基丁酸和3-羥基戊酸--的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯。1H-NMR譜的積分表明聚羥基鏈烷酸酯含有85.9摩爾％的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯。 通過凝膠滲透色譜法(GPC；TOSOH HLC-8220，柱；TOSOH TSK-GEL SuperHM-H(商標(biāo)名)，溶劑；氯仿，聚苯乙烯等價(jià))測定聚羥基鏈烷酸酯的分子量。結(jié)果，Mn是14400，Mw是56700。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍?，得到138mg聚羥基鏈烷酸酯。
在與實(shí)施例1相同的條件下對得到的聚羥基鏈烷酸酯進(jìn)行NMR分析。結(jié)果顯示該聚羥基鏈烷酸酯是化學(xué)式(16)表示的，其含有作為單體單元的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯和相應(yīng)于有4-12個(gè)碳原子的飽和/不飽和脂肪酸——諸如3-羥基丁酸和3-羥基戊酸——的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯。1H-NMR譜的積分表明聚羥基鏈烷酸酯含有95.2摩爾％的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍铮玫?64mg聚羥基鏈烷酸酯。
在與實(shí)施例1相同的條件下對得到的聚羥基鏈烷酸酯進(jìn)行NMR分析。結(jié)果顯示該聚羥基鏈烷酸酯是化學(xué)式(16)表示的，其含有作為單體單元的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯和相應(yīng)于有4-12個(gè)碳原子的飽和/不飽和脂肪酸——諸如3-羥基丁酸和3-羥基戊酸——的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯。1H-NMR譜的積分表明聚羥基鏈烷酸酯含有96.7摩爾％的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯。實(shí)施例4Pseudomonas cichorii YN2接種到200ml含有0.5％聚蛋白胨(Wako PureChemical Industries，Ltd.)和0.1％5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸的M9培養(yǎng)基，在125次/分鐘的振搖下，在30℃培養(yǎng)48小時(shí)。然后，離心收集細(xì)胞，用冷甲醇洗滌1次，凍干。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到161mg聚羥基鏈烷酸酯。
在與實(shí)施例1相同的條件下對得到的聚羥基鏈烷酸酯進(jìn)行NMR分析。結(jié)果顯示該聚羥基鏈烷酸酯是化學(xué)式(16)表示的，其含有作為單體單元的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯和相應(yīng)于有4-12個(gè)碳原子的飽和/不飽和脂肪酸——諸如3-羥基丁酸和3-羥基戊酸——的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯。1H-NMR譜的積分表明聚羥基鏈烷酸酯含有83.8摩爾％的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍?，得到113mg聚羥基鏈烷酸酯。
在與實(shí)施例1相同的條件下對得到的聚羥基鏈烷酸酯進(jìn)行NMR分析。結(jié)果顯示該聚羥基鏈烷酸酯是化學(xué)式(16)表示的，其含有作為單體單元的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯和相應(yīng)于有4-12個(gè)碳原子的飽和/不飽和脂肪酸——諸如3-羥基丁酸和3-羥基戊酸——的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯。1H-NMR譜的積分表明聚羥基鏈烷酸酯含有96.2摩爾％的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍?，得到126mg聚羥基鏈烷酸酯。
在與實(shí)施例1相同的條件下對得到的聚羥基鏈烷酸酯進(jìn)行NMR分析。結(jié)果顯示該聚羥基鏈烷酸酯是化學(xué)式(16)表示的，其含有作為單體單元的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯和相應(yīng)于有4-12個(gè)碳原子的飽和/不飽和脂肪酸——諸如3-羥基丁酸和3-羥基戊酸——的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯。1H-NMR譜的積分表明聚羥基鏈烷酸酯含有89.8摩爾％的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍?，得到90mg聚羥基鏈烷酸酯。
在與實(shí)施例1相同的條件下對得到的聚羥基鏈烷酸酯進(jìn)行NMR分析。結(jié)果顯示該聚羥基鏈烷酸酯是化學(xué)式(16)表示的，其含有作為單體單元的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯和相應(yīng)于有4-12個(gè)碳原子的飽和/不飽和脂肪酸——諸如3-羥基丁酸和3-羥基戊酸——的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯。1H-NMR譜的積分表明聚羥基鏈烷酸酯含有29.2摩爾％的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍?，得到103mg聚羥基鏈烷酸酯。
在與實(shí)施例1相同的條件下對得到的聚羥基鏈烷酸酯進(jìn)行NMR分析。結(jié)果顯示該聚羥基鏈烷酸酯是化學(xué)式(16)表示的，其含有作為單體單元的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯和相應(yīng)于有4-12個(gè)碳原子的飽和/不飽和脂肪酸——諸如3-羥基丁酸和3-羥基戊酸——的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯。1H-NMR譜的積分表明聚羥基鏈烷酸酯含有96.0摩爾％的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍铮玫?7mg聚羥基鏈烷酸酯。
在與實(shí)施例1相同的條件下對得到的聚羥基鏈烷酸酯進(jìn)行NMR分析。結(jié)果顯示該聚羥基鏈烷酸酯是化學(xué)式(16)表示的，其含有作為單體單元的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯和相應(yīng)于有4-12個(gè)碳原子的飽和/不飽和脂肪酸——諸如3-羥基丁酸和3-羥基戊酸——的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯。1H-NMR譜的積分表明聚羥基鏈烷酸酯含有86.4摩爾％的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯。
表3表示實(shí)施例1-9中細(xì)胞的干重、聚合物的干重、聚合物與細(xì)胞干重之比和在得到的聚合物中3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯(縮寫為“3HBzyTV”)單元的量(摩爾％)。
表3細(xì)胞干重 聚合物干重聚合物重量/ 3HBzyTV(mg/L) (mg/l) 細(xì)胞重量(％)單元mol％實(shí)施例1 1070795 74.3 85.9實(shí)施例2 875 690 78.9 95.2實(shí)施例3 1015820 80.8 96.7實(shí)施例4 1070805 75.2 83.8實(shí)施例5 710 565 79.6 96.2實(shí)施例6 940 630 67.0 89.8實(shí)施例7 705 450 63.8 29.2實(shí)施例8 815 515 63.2 96.0實(shí)施例9 995 435 43.7 86.4
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍?，得到39mg聚羥基鏈烷酸酯。
通過凝膠滲透色譜法(GPC；TOSOH HLC-8220(商標(biāo)名)，柱；TOSOH TSK-GELSuperHM-H(商標(biāo)名)，溶劑；氯仿，聚苯乙烯等價(jià)物)測定得到的PHA的分子量。結(jié)果，數(shù)均分子量Mn是44500，重均分子量Mw是106800。
為了確定得到的PHA的結(jié)構(gòu)，在下述條件下對PHA進(jìn)行NMR分析。<光譜儀>FT-NMRBruker DPX 400，進(jìn)行1H-NMR頻率400MHz。<條件>
核種類1H溶劑CDCl3參照在毛細(xì)管中的TMS/CDCl3溫度室溫圖3表示測得的1H-NMR譜，其鑒定結(jié)果如下表4所示。
表4化學(xué)位移(ppm) 積分裂分形式鑒定2.48-2.71 4HmB5，d53.682Hme55.271Hmc57.181Hmi57.254Hmg5，k5，h5，j5表4中所示的結(jié)果證實(shí)該聚羥基鏈烷酸酯是含有作為單體單元的3-羥基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯和相應(yīng)于有4-12個(gè)碳原子的飽和/不飽和脂肪酸——諸如3-羥基丁酸和3-羥基戊酸——的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯。更具體地，PHA具有下述化學(xué)式(17)表示的結(jié)構(gòu) 1H-NMR譜的積分表明聚羥基鏈烷酸酯含有85.4摩爾％的3-羥基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到68mg聚羥基鏈烷酸酯。
在與實(shí)施例10相同的條件下對得到的聚羥基鏈烷酸酯進(jìn)行NMR分析。結(jié)果顯示該聚羥基鏈烷酸酯是化學(xué)式(17)表示的，其含有3-羥基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯單體單元和其它相應(yīng)于有4-12個(gè)碳原子的飽和/不飽和脂肪酸——諸如3-羥基丁酸或3-羥基戊酸——的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元。1H-NMR譜的積分表明聚羥基鏈烷酸酯含有27.7摩爾％的3-羥基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍?，得到72mg聚羥基鏈烷酸酯。
在與實(shí)施例10相同的條件下對得到的聚羥基鏈烷酸酯進(jìn)行NMR分析。結(jié)果顯示該聚羥基鏈烷酸酯是化學(xué)式(17)表示的。該聚羥基鏈烷酸酯含有3-羥基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯單體單元和其它具有4-12個(gè)碳原子的諸如3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯的單體單元。1H-NMR譜的積分表明得到的聚羥基鏈烷酸酯含有50.3摩爾％的3-羥基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯單體單元。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍?，得到148mg聚羥基鏈烷酸酯。
在與實(shí)施例10相同的條件下對得到的聚羥基鏈烷酸酯進(jìn)行NMR分析。結(jié)果顯示該聚羥基鏈烷酸酯是化學(xué)式(17)表示的聚羥基鏈烷酸酯。該聚羥基鏈烷酸酯含有3-羥基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯單體單元和其它具有4-12個(gè)碳原子諸如3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯——的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元。1H-NMR譜的積分表明得到的聚羥基鏈烷酸酯含有66.7摩爾％的3-羥基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯單體單元。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍?，得到20mg聚羥基鏈烷酸酯。
在與實(shí)施例10相同的條件下對得到的聚羥基鏈烷酸酯進(jìn)行NMR分析。結(jié)果顯示該聚羥基鏈烷酸酯是化學(xué)式(17)表示的。該聚羥基鏈烷酸酯含有3-羥基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯單體單元和其它相應(yīng)于有4-12個(gè)碳原子的飽和/不飽和脂肪酸——諸如3-羥基丁酸和3-羥基戊酸——的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元。1H-NMR譜的積分表明得到的聚羥基鏈烷酸酯含有57.2摩爾％的3-羥基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯單元。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍铮玫?4mg聚羥基鏈烷酸酯。
在與實(shí)施例10相同的條件下對得到的聚羥基鏈烷酸酯進(jìn)行NMR分析。結(jié)果顯示該聚羥基鏈烷酸酯是化學(xué)式(17)表示的。該聚羥基鏈烷酸酯含有3-羥基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯單體單元和其它相應(yīng)于有4-12個(gè)碳原子的飽和/不飽和脂肪酸——諸如3-羥基丁酸和3-羥基戊酸——的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元。1H-NMR譜的積分表明得到的聚羥基鏈烷酸酯含有31.6摩爾％的3-羥基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯單體單元。
表5表示實(shí)施例10-15中細(xì)胞的干重、聚合物的干重、聚合物與細(xì)胞干重之比和在得到的聚合物中3-羥基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯(縮寫為“3HBzyTB”單元)的量(摩爾％)。
表5細(xì)胞干重聚合物干重 聚合物重量/ 3HBzyTV(mg/L) (mg/l) 細(xì)胞重量(％) 單元mol％實(shí)施例10 1040 195 18.8 85.4實(shí)施例11 655 340 51.9 27.7實(shí)施例12 955 360 37.7 50.3實(shí)施例13 1370 740 54.0 66.7實(shí)施例14 580 100 17.2 57.2實(shí)施例15 915 320 35.0 31.6生產(chǎn)含3-羥基-5-{[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的方法凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍?，得到96mg聚羥基鏈烷酸酯。
在與前述實(shí)施例10相同的條件下對得到的聚羥基鏈烷酸酯進(jìn)行NMR分析。結(jié)果顯示該聚羥基鏈烷酸酯是化學(xué)式(18)表示的。該聚羥基鏈烷酸酯包括3-羥基-5-[[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基]戊酸酯單體單元和其它相應(yīng)于有4-12個(gè)碳原子的飽和/不飽和脂肪酸——諸如3-羥基丁酸和3-羥基戊酸——的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元。1H-NMR譜的積分表明得到的聚羥基鏈烷酸酯含有41.0摩爾％的3-羥基-5-[[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基]戊酸酯單體單元。 通過凝膠滲透色譜法(GPC；TOSOH HLC-8220，柱；TOSOH TSK-GEL SuperHM-H，溶劑；氯仿，聚苯乙烯等價(jià)物)測定得到的聚羥基鏈烷酸酯的分子量。結(jié)果，Mn是21500，Mw是83200。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到82mg聚羥基鏈烷酸酯。
在與前述實(shí)施例10相同的條件下對得到的聚羥基鏈烷酸酯進(jìn)行NMR分析。結(jié)果顯示該聚羥基鏈烷酸酯是化學(xué)式(18)表示的。該聚羥基鏈烷酸酯包括3-羥基-5-[[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基]戊酸酯單體單元和其它相應(yīng)于有4-12個(gè)碳原子的飽和/不飽和脂肪酸——諸如3-羥基丁酸和3-羥基戊酸——的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元。1H-NMR譜的積分表明得到的聚羥基鏈烷酸酯含有56.2摩爾％的3-羥基-5-[[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基]戊酸酯單體單元。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到75mg聚羥基鏈烷酸酯。
在與前述實(shí)施例10相同的條件下對得到的聚羥基鏈烷酸酯進(jìn)行NMR分析。結(jié)果顯示該聚羥基鏈烷酸酯是化學(xué)式(18)表示的。該聚羥基鏈烷酸酯包括3-羥基-5-[[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基]戊酸酯單體單元和其它相應(yīng)于有4-12個(gè)碳原子的飽和/不飽和脂肪酸——諸如3-羥基丁酸和3-羥基戊酸——的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元。1H-NMR譜的積分表明得到的聚羥基鏈烷酸酯含有38.8摩爾％的3-羥基-5-[[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基]戊酸酯單體單元。
表6表示實(shí)施例16-18中細(xì)胞的干重、聚合物的干重、聚合物與細(xì)胞干重之比和在得到的聚合物中3-羥基-5-{[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯(縮寫為“3HMBzyTV”)的量(摩爾％)。
表6
細(xì)胞干重聚合物干重聚合物重量/ 3HBzyTV(mg/L) (mg/l)細(xì)胞重量(％) 單元mol％實(shí)施例16 805 481 59.8 41.0實(shí)施例17 625 408 65.3 56.2實(shí)施例18 710 377 53.1 38.8
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍铮玫?06mg聚羥基鏈烷酸酯。
通過凝膠滲透色譜法(GPC；TOSOH HLC-8220，柱；TOSOH TSK-GEL SuperHM-H，溶劑；氯仿，聚苯乙烯等價(jià)物)測定得到的PHA的平均分子量。結(jié)果，數(shù)均分子量Mn是32000，重均分子量Mw是96000。
為了確定得到的PHA的結(jié)構(gòu)，在下述條件下對PHA進(jìn)行NMR分析。<光譜儀>FT-NMRBruker DPX 400，1H-NMR頻率400MHz13C頻率100MHz。<條件>
核種類1H，13C溶劑CDCl3溫度室溫圖4表示測定的1H-NMR譜。其鑒定結(jié)果如下表7所示。圖5表示測定的13C-NMR譜。其鑒定結(jié)果如下表8所示。
表7化學(xué)位移(ppm)積分 裂分形式 鑒定1.83 2H qurt d12.35-2.584H m b1.e13.64 2H s f15.20 1H m c16.92-6.982H m j1，k17.23-7.262H m h1，l1表8化學(xué)位移(ppm) 鑒定26.7 d133.2 e135.3 f138.6 b169.7 c1115.1&115.4 i1，k1130.3&130.3 h1，l1133.7g1160.6&163.0 i1168.9a1如表7和8中的結(jié)果所示，PHA包括3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元和其它有4-12個(gè)碳原子的諸如3-羥基丁酸和3-羥基戊酸的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元。更具體地，該P(yáng)HA具有下述化學(xué)式(19)表示的結(jié)構(gòu) 1H-NMR譜的積分表明得到的PHA含有76.7摩爾％的3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到89mg聚羥基鏈烷酸酯。
在如實(shí)施例19的條件下對得到的PHA進(jìn)行NMR分析和平均分子量的測定。NMR分析結(jié)果顯示該實(shí)施例中的PHA包括3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元和其它有4-12個(gè)碳原子的諸如3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元，證實(shí)其具有化學(xué)式(19)表示的結(jié)構(gòu)。1H-NMR譜的積分表明該實(shí)施例的PHA含有27.0摩爾％的3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到69mg聚羥基鏈烷酸酯。
在如實(shí)施例19的條件下對得到的PHA進(jìn)行NMR分析和平均分子量的測定。NMR分析結(jié)果顯示該實(shí)施例中的PHA包括3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元和其它有4-12個(gè)碳原子的諸如3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元，證實(shí)其具有化學(xué)式(19)表示的結(jié)構(gòu)。1H-NMR譜的積分表明該實(shí)施例的PHA含有76.7摩爾％的3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍?，得到68mg聚羥基鏈烷酸酯。
在如實(shí)施例19的條件下對得到的PHA進(jìn)行NMR分析和平均分子量的測定。NMR分析結(jié)果顯示該實(shí)施例中的PHA包括3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元和其它有4-12個(gè)碳原子的諸如3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元，證實(shí)其具有化學(xué)式(19)表示的結(jié)構(gòu)。1H-NMR譜的積分表明該實(shí)施例的PHA含有90.3摩爾％的3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到164mg聚羥基鏈烷酸酯。
在如實(shí)施例19的條件下對得到的PHA進(jìn)行NMR分析和平均分子量的測定。NMR分析結(jié)果顯示該實(shí)施例中的PHA包括3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元和其它有4-12個(gè)碳原子的諸如3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元，證實(shí)其具有化學(xué)式(19)表示的結(jié)構(gòu)。1H-NMR譜的積分表明該實(shí)施例的PHA含有85.9摩爾％的3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍?，得到138mg聚羥基鏈烷酸酯。
在如實(shí)施例19的條件下對得到的PHA進(jìn)行NMR分析和平均分子量的測定。NMR分析結(jié)果顯示該實(shí)施例中的PHA包括3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元和其它有4-12個(gè)碳原子的諸如3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元，證實(shí)其具有化學(xué)式(19)表示的結(jié)構(gòu)。1H-NMR譜的積分表明該實(shí)施例的PHA含有90.7摩爾％的3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到138mg聚羥基鏈烷酸酯。
在如實(shí)施例19的條件下對得到的PHA進(jìn)行NMR分析和平均分子量的測定。NMR分析結(jié)果顯示該實(shí)施例中的PHA包括3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元和其它有4-12個(gè)碳原子的諸如3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元，證實(shí)其具有化學(xué)式(19)表示的結(jié)構(gòu)。1H-NMR譜的積分表明該實(shí)施例的PHA含有88.5摩爾％的3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍铮玫?25mg聚羥基鏈烷酸酯。
在如實(shí)施例19的條件下對得到的PHA進(jìn)行NMR分析和平均分子量的測定。NMR分析結(jié)果顯示該實(shí)施例中的PHA包括3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元和其它有4-12個(gè)碳原子的諸如3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元，證實(shí)其具有化學(xué)式(19)表示的結(jié)構(gòu)。1H-NMR譜的積分表明該實(shí)施例的PHA含有89.5摩爾％的3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍?，得到154mg聚羥基鏈烷酸酯。
在如實(shí)施例19的條件下對得到的PHA進(jìn)行NMR分析和平均分子量的測定。NMR分析結(jié)果顯示該實(shí)施例中的PHA包括3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元和其它有4-12個(gè)碳原子的諸如3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元，證實(shí)其具有化學(xué)式(19)表示的結(jié)構(gòu)。1H-NMR譜的積分表明該實(shí)施例的PHA含有97.9摩爾％的3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到158mg聚羥基鏈烷酸酯。
在如實(shí)施例19的條件下對得到的PHA進(jìn)行NMR分析和平均分子量的測定。NMR分析結(jié)果顯示該實(shí)施例中的PHA包括3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元和其它有4-12個(gè)碳原子的諸如3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元，證實(shí)其具有化學(xué)式(19)表示的結(jié)構(gòu)。1H-NMR譜的積分表明該實(shí)施例的PHA含有91.6摩爾％的3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單體單元。
表9表示實(shí)施例19-28中細(xì)胞的干重、聚合物的干重、聚合物與細(xì)胞干重之比和在得到的PHA聚合物中3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單元(縮寫為“3HFBzyTV”)的量(摩爾％)。
表9細(xì)胞干重 聚合物干重 聚合物重量/ 3HBzyTV(mg/L)(mg/l) 細(xì)胞重量(％) 單元mol％實(shí)施例19945 530 56.1 76.7實(shí)施例20680 445 65.4 27.0實(shí)施例21915 345 37.7 76.7實(shí)施例22740 340 45.9 90.3實(shí)施例231120 820 73.2 85.9實(shí)施例24940 690 73.4 90.7實(shí)施例25955 690 72.3 88.5實(shí)施例261015 625 61.6 89.5實(shí)施例271125 770 68.4 97.9實(shí)施例281215 790 65.0 91.6生產(chǎn)含3-羥基-4-{[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基}丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的方法凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍铮玫?1mg聚羥基鏈烷酸酯。
通過凝膠滲透色譜法(GPC；TOSOH HLC-8220，柱；TOSOH TSK-GEL SuperHM-H，溶劑；氯仿，聚苯乙烯等價(jià)物)測定得到的PHA的平均分子量。結(jié)果，數(shù)均分子量Mn是15300，重均分子量Mw是37100。
為了確定得到的PHA的結(jié)構(gòu)，在下述條件下對PHA進(jìn)行NMR分析。<光譜儀>FT-NMRBruker DPX 400，1H-NMR頻率400MHz。<條件>
核種類1H溶劑CDCl3參照在毛細(xì)管中的TMS/CDCl3溫度室溫圖6表示測得的1H-NMR譜，其鑒定結(jié)果如下表10所示。
表10化學(xué)位移(ppm) 積分 裂分形式 鑒定2.40-2.72 4H m b1，d13.65 2H m e15.27 1H m c16.95 2H m h1，j17.23 2H m g1，k1如表10中的結(jié)果所示，目標(biāo)PHA包括3-羥基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯單體單元和其它有4-12個(gè)碳原子的諸如3-羥基丁酸酯或3-羥基戊酸酯的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元。更具體地，該P(yáng)HA具有下述化學(xué)式(20)表示的結(jié)構(gòu) 1H-NMR譜的積分表明得到的PHA含有89.8摩爾％的3-羥基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯單體單元。實(shí)施例30Pseudomonas cichorii YN2接種到200ml含有0.1％壬酸和0.1％4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸的M9培養(yǎng)基，在125次/分鐘的振搖下，在30℃培養(yǎng)48小時(shí)。然后，離心收集細(xì)胞，用冷甲醇洗滌1次，凍干。稱量凍干細(xì)胞的重量(細(xì)胞干重)。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍铮玫?5mg聚羥基鏈烷酸酯。
在如實(shí)施例29的條件下對得到的PHA進(jìn)行NMR分析和平均分子量的測定。NMR分析結(jié)果顯示該實(shí)施例中的PHA包括3-羥基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯單體單元和其它有4-12個(gè)碳原子的諸如3-羥基丁酸酯或3-羥基戊酸酯的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元，證實(shí)其具有化學(xué)式(20)表示的結(jié)構(gòu)。1H-NMR譜的積分表明該實(shí)施例的PHA含有10.6摩爾％的3-羥基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯單體單元。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到11mg聚羥基鏈烷酸酯。
在如實(shí)施例29的條件下對得到的PHA進(jìn)行NMR分析和平均分子量的測定。NMR分析結(jié)果顯示該實(shí)施例中的PHA包括3-羥基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯單體單元和其它有4-12個(gè)碳原子的諸如3-羥基丁酸酯或3-羥基戊酸酯的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元，證實(shí)其具有化學(xué)式(20)表示的結(jié)構(gòu)。1H-NMR譜的積分表明該實(shí)施例的PHA含有84.1摩爾％的3-羥基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯單體單元。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍?，得到153mg聚羥基鏈烷酸酯。
在如實(shí)施例29的條件下對得到的PHA進(jìn)行NMR分析和平均分子量的測定。NMR分析結(jié)果顯示該實(shí)施例中的PHA包括3-羥基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯單體單元和其它有4-12個(gè)碳原子的諸如3-羥基丁酸酯或3-羥基戊酸酯的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元，證實(shí)其具有化學(xué)式(20)表示的結(jié)構(gòu)。1H-NMR譜的積分表明該實(shí)施例的PHA含有68.5摩爾％的3-羥基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯單體單元。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍铮玫?8mg聚羥基鏈烷酸酯。
在如實(shí)施例29的條件下對得到的PHA進(jìn)行NMR分析和平均分子量的測定。NMR分析結(jié)果顯示該實(shí)施例中的PHA包括3-羥基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯單體單元和其它有4-12個(gè)碳原子的諸如3-羥基丁酸酯或3-羥基戊酸酯的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元，證實(shí)其具有化學(xué)式(20)表示的結(jié)構(gòu)。1H-NMR譜的積分表明該實(shí)施例的PHA含有43.1摩爾％的3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯單體單元。
凍干顆粒懸浮在20ml氯仿中，在60℃攪拌20小時(shí)，萃取聚羥基鏈烷酸酯。用孔尺寸為0.45μm的膜過濾器過濾萃取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。濃縮的溶液用冷甲醇沉淀?；厥粘恋聿⒄婵崭稍?，得到47mg聚羥基鏈烷酸酯。
在如實(shí)施例29的條件下對得到的PHA進(jìn)行NMR分析和平均分子量的測定。NMR分析結(jié)果顯示該實(shí)施例中的PHA包括3-羥基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯單體單元和其它有4-12個(gè)碳原子的諸如3-羥基丁酸酯或3-羥基戊酸酯的3-羥基鏈烷酸酯和/或3-羥基鏈烯酸酯單體單元，證實(shí)其具有化學(xué)式(20)表示的結(jié)構(gòu)。1H-NMR譜的積分表明該實(shí)施例的PHA含有48.7摩爾％的3-羥基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯單體單元。
表11表示實(shí)施例29-34中細(xì)胞的干重、聚合物的干重、聚合物與細(xì)胞干重之比和在得到的PHA聚合物中3-羥基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯單元(縮寫為“3HFBzyTB”)的量(摩爾％)。
表11細(xì)胞干重聚合物干重聚合物重量/ 3HBzyTV(mg/L) (mg/l)細(xì)胞重量(％)單元mol％實(shí)施例29 975 20521.0 89.8實(shí)施例30 515 22543.7 10.6實(shí)施例31 955 55 5.8 84.1實(shí)施例32 136576556.0 68.5實(shí)施例33 515 19030.1 43.1實(shí)施例34 780 23536.9 48.權(quán)利要求
1.一種聚羥基鏈烷酸酯，其包括下述化學(xué)式(1)所示的單元 其中R1是芳環(huán)的取代基，選自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、鹵原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’選自H、Na、K、CH3和C2H5，R”選自O(shè)H、鹵原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；x表示1-8的整數(shù)，在聚羥基鏈烷酸酯中彼此相同或不同，條件是聚羥基鏈烷酸酯不由下述化學(xué)式(2)和(3)所示的兩種單元組成
2.根據(jù)權(quán)利要求1的聚羥基鏈烷酸酯，其中聚羥基鏈烷酸酯進(jìn)一步包括一種或多種選自下述化學(xué)式(4)和(5)的單元 其中y是0-8的整數(shù)，z是3或5的整數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的聚羥基鏈烷酸酯，其中聚羥基鏈烷酸酯包括下述化學(xué)式(2)表示的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯單元。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的聚羥基鏈烷酸酯，其中聚羥基鏈烷酸酯包括下述化學(xué)式(6)表示的3-羥基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯單元。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的聚羥基鏈烷酸酯，其中聚羥基鏈烷酸酯包括下述化學(xué)式(7)表示的3-羥基-5-{[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單元。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的聚羥基鏈烷酸酯，其中聚羥基鏈烷酸酯包括下述化學(xué)式(8)表示的3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單元。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的聚羥基鏈烷酸酯，其中聚羥基鏈烷酸酯包括下述化學(xué)式(9)表示的3-羥基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯單元。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的聚羥基鏈烷酸酯，其中聚羥基鏈烷酸酯具有5000-300000范圍內(nèi)的數(shù)均分子量。
9.一種生產(chǎn)包括下述化學(xué)式(1)所示單元的聚羥基鏈烷酸酯的方法， 其中R1是芳環(huán)的取代基，選自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、鹵原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’選自H、Na、K、CH3和C2H5，R”選自O(shè)H、鹵原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；x表示1-8的整數(shù)，在聚羥基鏈烷酸酯中彼此相同或不同；該方法包括在含有下述化學(xué)式(10)所示的化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物的步驟， 其中R2是芳環(huán)的取代基，選自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、鹵原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’選自H、Na、K、CH3和C2H5，R”選自O(shè)H、鹵原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；k表示1-8的整數(shù)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中聚羥基鏈烷酸酯進(jìn)一步包括一種或多種選自下述化學(xué)式(4)和(5)的單元 其中y是0-8的整數(shù)，z是3或5的整數(shù)。
11.一種生產(chǎn)包括下述化學(xué)式(1)所示單元的聚羥基鏈烷酸酯的方法， 其中R1是芳環(huán)的取代基，選自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、鹵原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’選自H、Na、K、CH3和C2H5，R”選自O(shè)H、鹵原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；x表示1-8的整數(shù)，在聚羥基鏈烷酸酯中彼此相同或不同；該方法包括在含有下述化學(xué)式(10)所示的化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物的步驟， 其中R2是芳環(huán)的取代基，選自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、鹵原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’選自H、Na、K、CH3和C2H5，R”選自O(shè)H、鹵原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；k表示1-8的整數(shù)，其中培養(yǎng)基進(jìn)一步含有聚蛋白胨。
12.一種生產(chǎn)包括下述化學(xué)式(1)所示單元的聚羥基鏈烷酸酯的方法， 其中R1是芳環(huán)的取代基，選自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、鹵原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’選自H、Na、K、CH3和C2H5，R”選自O(shè)H、鹵原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；x表示1-8的整數(shù)，在聚羥基鏈烷酸酯中彼此相同或不同；該方法包括在含有下述化學(xué)式(10)所示的化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物的步驟， 其中R2是芳環(huán)的取代基，選自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、鹵原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’選自H、Na、K、CH3和C2H5，R”選自O(shè)H、鹵原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；k表示1-8的整數(shù)，其中培養(yǎng)基進(jìn)一步含有酵母提取物。
13.一種生產(chǎn)包括下述化學(xué)式(1)所示單元的聚羥基鏈烷酸酯的方法， 其中R1是芳環(huán)的取代基，選自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、鹵原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’選自H、Na、K、CH3和C2H5，R”選自O(shè)H、鹵原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；x表示1-8的整數(shù)，在聚羥基鏈烷酸酯中彼此相同或不同；該方法包括在含有下述化學(xué)式(10)所示的化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物的步驟， 其中R2是芳環(huán)的取代基，選自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、鹵原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’選自H、Na、K、CH3和C2H5，4”選自O(shè)H、鹵原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；k表示1-8的整數(shù)，其中培養(yǎng)基進(jìn)一步含有糖類。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中糖類是一種或多種選自甘油醛、赤蘚糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、甘油、赤蘚醇、木糖醇、葡糖酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、麥芽糖、蔗糖和乳糖的化合物。
15.一種生產(chǎn)包括下述化學(xué)式(1)所示單元的聚羥基鏈烷酸酯的方法， 其中R1是芳環(huán)的取代基，選自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、鹵原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’選自H、Na、K、CH3和C2H5，R”選自O(shè)H、鹵原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；x表示1-8的整數(shù)，在聚羥基鏈烷酸酯中彼此相同或不同；該方法包括在含有下述化學(xué)式(10)所示的化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物的步驟， 其中R2是芳環(huán)的取代基，選自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、鹵原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’選自H、Na、K、CH3和C2H5，R”選自O(shè)H、鹵原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；k表示1-8的整數(shù)，其中培養(yǎng)基進(jìn)一步含有有機(jī)酸或其鹽。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中有機(jī)酸或其鹽是一種或多種選自丙酮酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸和其鹽的化合物。
17.一種生產(chǎn)包括下述化學(xué)式(1)所示單元的聚羥基鏈烷酸酯的方法， 其中R1是芳環(huán)的取代基，選自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、鹵原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’選自H、Na、K、CH3和C2H5，R”選自O(shè)H、鹵原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；x表示1-8的整數(shù)，在聚羥基鏈烷酸酯中彼此相同或不同；該方法包括在含有下述化學(xué)式(10)所示的化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物的步驟， 其中R2是芳環(huán)的取代基，選自H、CH3、C3H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、鹵原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’選自H、Na、K、CH3和C2H5，R”選自O(shè)H、鹵原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；k表示1-8的整數(shù)，其中培養(yǎng)基進(jìn)一步含有氨基酸或其鹽。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中氨基酸或其鹽是一種或多種選自谷氨酸、天門冬氨酸和其鹽的化合物。
19.一種生產(chǎn)包括下述化學(xué)式(1)所示單元的聚羥基鏈烷酸酯的方法， 其中R1是芳環(huán)的取代基，選自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、鹵原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’選自H、Na、K、CH3和C2H5，R”選自O(shè)H、鹵原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；x表示1-8的整數(shù)，在聚羥基鏈烷酸酯中彼此相同或不同；該方法包括在含有下述化學(xué)式(10)所示的化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物的步驟， 其中R2是芳環(huán)的取代基，選自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、鹵原子、CN、NON、COOR’和SO2R”，其中R’選自H、Na、K、CH3和C2H5，R”選自O(shè)H、鹵原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；k表示1-8的整數(shù)，其中培養(yǎng)基進(jìn)一步含有具有4-12個(gè)碳原子的直鏈鏈烷酸或其鹽。
20.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中微生物的培養(yǎng)包括兩個(gè)或多個(gè)培養(yǎng)步驟。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中在第一個(gè)步驟之后的步驟中培養(yǎng)基不含氮源。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中培養(yǎng)步驟包括步驟(1-1)在含有至少一種化學(xué)式(10)表示的化合物和聚蛋白胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物；(1-2)在含有化學(xué)式(10)表示的化合物和有機(jī)酸或其鹽的培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)來自步驟1-1的微生物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中有機(jī)酸或其鹽是一種或多種選自丙酮酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸和其鹽的化合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中培養(yǎng)步驟包括步驟(1-3)在含有至少一種化學(xué)式(10)表示的化合物和糖類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，和(1-4)在含有化學(xué)式(10)表示的化合物和糖類的培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)來自步驟1-3的微生物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中糖類是一種或多種選自甘油醛、赤蘚糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、甘油、赤蘚醇、木糖醇、葡糖酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、麥芽糖、蔗糖和乳糖的化合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中在含有下述化學(xué)式(11)表示的5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，生產(chǎn)含有下述化學(xué)式(2)表示的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯單元的聚羥基鏈烷酸酯。
27.根據(jù)權(quán)利要求9-17任一項(xiàng)的方法，其中在含有下述化學(xué)式(12)表示的4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，生產(chǎn)含有下述化學(xué)式(6)表示的3-羥基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯單元的聚羥基鏈烷酸酯。
28.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中在含有下述化學(xué)式(13)表示的5-{[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基}戊酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，生產(chǎn)含有下述化學(xué)式(7)表示的3-羥基-5-{[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單元的聚羥基鏈烷酸酯。
29.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中在含有下述化學(xué)式(14)表示的5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，生產(chǎn)含有下述化學(xué)式(8)表示的3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯單元的聚羥基鏈烷酸酯。
30.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中在含有下述化學(xué)式(15)表示的4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，生產(chǎn)含有下述化學(xué)式(9)表示的3-羥基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯單元的聚羥基鏈烷酸酯。
31.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，進(jìn)一步包括將聚羥基鏈烷酸酯與培養(yǎng)步驟中培養(yǎng)的微生物的細(xì)胞分離的步驟。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中分離聚羥基鏈烷酸酯的步驟包括用溶劑處理以溶解并萃取在培養(yǎng)步驟培養(yǎng)的微生物的細(xì)胞中積累的聚羥基鏈烷酸酯。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中溶劑是一種或多種選自氯仿、二氯甲烷、二氧六環(huán)、四氫呋喃、乙腈和丙酮的溶劑。
34.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中分離聚羥基鏈烷酸酯的步驟包括破裂微生物的細(xì)胞的步驟。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中細(xì)胞通過超聲波破裂、均化破裂、加壓破裂、用玻璃珠破裂、研磨、磨碎或凍熔破裂。
36.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中微生物屬于假單胞菌Pseudomonas屬。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中屬于假單胞菌Pseudomonas屬的微生物選自Pseudomonas cichorii YN2(FERMBP-7375)、Pseudomonas cichorii H45(FERM BP-7374)和Pseudomonas jessenii P161(FERM BP-7376)。
全文摘要
一種聚羥基鏈烷酸酯，其包括下述化學(xué)式(1)所示的單元其中R1是芳環(huán)的取代基，選自H、CH
文檔編號C08G63/78GK1424337SQ0216061
公開日2003年6月18日 申請日期2002年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月31日
發(fā)明者見目敬, 須川悅子, 矢野哲哉, 野本毅, 今村剛士, 鈴木智博, 本間務(wù) 申請人:佳能株式會(huì)社