專利名稱：用微傳遞技術(shù)在聚合物活性表面圖案化固定生物大分子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用微傳遞技術(shù)在聚合物活性表面圖案化固定生物大分子的方法。具體說是把聚二甲基硅氧烷(PDMS)印章表面陣列微井中“盛裝”的蛋白類生物大分子溶液傳遞到聚合物活性表面使其與表面活潑基團(tuán)的反應(yīng)能在溶液狀態(tài)下進(jìn)行從而更方便地實(shí)現(xiàn)蛋白類生物大分子在聚合物表面的圖案化固定。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，生物大分子的圖案化固定已引起了廣泛關(guān)注。在聚合物材料表面圖案化固定生物大分子和細(xì)胞對(duì)特定的生物學(xué)檢測(cè)、基于活細(xì)胞的生物傳感器構(gòu)建以及人工神經(jīng)網(wǎng)的修復(fù)都具有重大實(shí)用價(jià)值。目前，采用微接觸印刷技術(shù)能夠在金、玻璃、硅以及聚合物等表面通過物理吸附的方式實(shí)現(xiàn)生物大分子的圖案化固定。但存在易脫附和穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)。如何實(shí)現(xiàn)生物大分子圖案的牢固固定是目前需要解決的問題。
聚合物材料因其良好的物理性能和化學(xué)性能成為生物大分子圖案化固定的理想基材。在聚合物表面可方便地引入各種反應(yīng)基團(tuán)，通過共價(jià)鍵合的方式實(shí)現(xiàn)生物大分子的牢固性固定。傳統(tǒng)的反應(yīng)性微印刷技術(shù)可方便地實(shí)現(xiàn)生物小分子的圖案化牢固性固定。但為避免溶劑橫向擴(kuò)散造成的“污染”，一般要求移印前吹干模板或保留極少量溶劑，或要求反應(yīng)時(shí)間短。這對(duì)非液態(tài)的生物大分子與表面活潑基團(tuán)的反應(yīng)是不利的，特別是對(duì)低反應(yīng)活性的生物大分子/活性表面體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用微傳遞技術(shù)在聚合物活性表面圖案化固定生物大分子的方法。
本發(fā)明的方法是先把生物大分子選擇性“裝入”聚二甲基硅氧烷(PDMS)印章的微井中，然后再在其表面形成一層冷凝水，利用印章與改性聚合物膜壓緊后微井中原有的水以及接觸區(qū)域橫向擴(kuò)散的水使生物大分子重新溶解，從而以溶液的形式與表面基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)在聚合物活性表面圖案化固定生物大分子。具體包括以下步驟1)用常規(guī)的化學(xué)改性或等離子體改性方法改性聚合物，在聚合物表面引入能與生物大分子反應(yīng)的羥基、羧基、氨基基團(tuán)；2)制備表面含微井的PDMS印章，并在其有微井的一面浸涂0.1～20mg/ml濃度的生物大分子溶液，用氮?dú)饬骶従彺蹈桑?)取上述聚合物薄膜一片壓印于印章表面0.1～10小時(shí)，壓力10～200g/cm2，以選擇性移走吸附在微井之間區(qū)域的生物大分子；4)把印章在-18～0℃溫度下保持0.1～5分鐘，再在20～37℃溫度下，相對(duì)濕度為50～99％的環(huán)境中靜置0.1～5分鐘，在其表面形成一層冷凝小液滴；5)在0～100℃下，立即將此印章壓印于步驟1)所得的改性聚合物表面0.1～10小時(shí)，壓力10～200g/cm2，優(yōu)選溫度4～50℃；6)揭起印章，用生物大分子相應(yīng)pH值的緩沖液或水溶液沖洗，浸泡24小時(shí)后吹干，即得到生物大分子的微圖案。
本發(fā)明中，所述的聚合物是可通過化學(xué)改性或等離子體改性在其表面產(chǎn)生能與生物大分子反應(yīng)的活性基團(tuán)的聚合物，如聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(D-乳酸)(PDLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚氨酯(PU)、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)等。
上述步驟3)所說的壓印于印章表面的聚合物薄膜是與步驟1)相同的聚合物，可以是未經(jīng)過改性的聚合物，也可以是經(jīng)過改性的聚合物。選擇性移走生物大分子是指把印章突起部分與壓印的聚合物薄膜相接觸區(qū)域的生物大分子轉(zhuǎn)移掉而保留微井內(nèi)的生物大分子。
發(fā)明中制備表面含微井的PDMS印章，是先通過常規(guī)的“光刻”技術(shù)構(gòu)建一個(gè)含有微米級(jí)柱狀突起的底模，再在此底模表面澆注PDMs預(yù)聚物，加熱交聯(lián)固化后揭起制得的。一般是在平整潔凈的玻璃或硅表面旋涂紫外型光刻膠，再在具有特征圖案的光掩模板下紫外光曝光，顯影，制得含有微米級(jí)柱狀突起的初始模板，然后以此做底模，再在其上澆注PDMS預(yù)聚物和交聯(lián)劑的混合物，加熱固化后揭起制得的，一般固化溫度40～100℃，時(shí)間6～24小時(shí)。
本發(fā)明中，所述的生物大分子是指蛋白類生物大分子及其衍生物，包括白蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、多聚賴氨酸、膠原以及明膠等。步驟2)所說的生物大分子溶液是指其相應(yīng)pH值的緩沖液溶液或水溶液，如白蛋白的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液、明膠的PBS溶液，膠原或殼聚糖的0.3％的乙酸溶液等。
對(duì)于用本發(fā)明方法得到的生物大分子的微圖案，可以用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)或熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)其存在，為便于觀察，這時(shí)所用生物大分子可事先用熒光染料如熒光素、羅丹明等標(biāo)記。
采用本發(fā)明方法，通過調(diào)節(jié)PDMS印章中微井的直徑和間距可以獲得相應(yīng)大小和間距的生物大分子微圖案。調(diào)節(jié)冷凝水的量可以控制生物大分子微圖案的質(zhì)量，而冷凝水量可從冷凝時(shí)間和相對(duì)濕度兩個(gè)因素來調(diào)節(jié)。
本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單靈活，重復(fù)性好，所獲得的微圖案具有很高的對(duì)比度和牢固度，是一種簡(jiǎn)單廉價(jià)的圖案化固定生物大分子的有效方法。采用“吹干-轉(zhuǎn)移-冷凝”的方法較方便地實(shí)現(xiàn)了生物大分子溶液在微井中的“盛裝”。每一個(gè)微井成為一個(gè)微反應(yīng)器，使得生物大分子與表面基團(tuán)間的反應(yīng)能夠以與在溶液中進(jìn)行的界面接枝反應(yīng)相當(dāng)?shù)乃俾蔬M(jìn)行，同時(shí)又避免了溶劑橫向擴(kuò)散造成的圖案“污染”。較之傳統(tǒng)的反應(yīng)性微印刷技術(shù)，本發(fā)明對(duì)印章表面親疏水性和微井深度要求也較低，PDMS印章無須進(jìn)行等離子親水性處理，微井深度無須太深，用常規(guī)的“光刻”技術(shù)即可制得。本發(fā)明特別適用于在具有一般反應(yīng)活性的聚合物表面圖案化固定生物大分子。在特定的生物學(xué)檢測(cè)、基于活細(xì)胞的生物傳感器構(gòu)建以及人工神經(jīng)網(wǎng)的修復(fù)等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。


圖1是用微傳遞技術(shù)在改性聚合物活性表面圖案化固定生物大分子的工藝流程圖。圖中1表示在PDMS印章有微井的一面浸涂0.1～20mg/ml生物大分子溶液；2表示用氮?dú)饬骶従彺蹈捎≌拢?表示在印章表面壓印聚合物薄膜以選擇性移走微井之間區(qū)域的生物大分子；4表示在印章表面形成冷凝水；5表示把印章壓印于改性聚合物表面。6表示揭起印章并沖洗圖案化固定了生物大分子的聚合物膜。
圖2是發(fā)明中所用的表面含有陣列微井的PDMS印章的原子力顯微鏡照片。
圖3(a)是用本發(fā)明方法在醛基化的聚己內(nèi)酯表面(PCL-CHO)圖案化固定的白蛋白(BSA)的激光共聚焦顯微(CLSM)照片，白蛋白因異硫氰酸熒光素(FITC)的標(biāo)記而顯示亮色；(b)是(a)對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度分析。
圖4是用本發(fā)明方法在醛基化的聚己內(nèi)酯(PCL-CHO)表面圖案化固定白蛋白前后PDMS印章的CLSM照片，其中(a)是圖案化固定前的，(b)是圖案化固定后的。白蛋白因FITC的標(biāo)記而顯示亮色。
圖5(a)是用已有的反應(yīng)性微印刷技術(shù)在PCL-CHO表面圖案化固定的白蛋白(BSA)的CLSM像，白蛋白因FITC的標(biāo)記而顯示亮色；(b)是(a)對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度分析。
圖6是用本發(fā)明方法在醛基化的聚己內(nèi)酯(PCL-CHO)表面圖案化固定白蛋白時(shí)，因冷凝水量不適導(dǎo)致的缺陷圖案，其中(a)為冷凝水不足時(shí)得到的圓環(huán)形圖案，(b)為冷凝水過量時(shí)導(dǎo)致的圖案“污染”。
具體實(shí)施例方式
以下以具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明。
實(shí)例1本發(fā)明的用微傳遞技術(shù)在聚合物活性表面圖案化固定生物大分子的方法，包括以下步驟1.制備表面帶自由醛基的PCL膜將PCL膜置于濃度為10％(wt)的己二胺的異丙醇溶液中，37℃下胺解10分鐘，PCL表面因胺解而產(chǎn)生大量自由胺基。再把表面富含胺基的PCL膜放入2％的戊二醛溶液中，37℃下偶聯(lián)反應(yīng)30分鐘，即制得表面富含自由醛基的PCL膜。此時(shí)膜因醛基化反應(yīng)而呈現(xiàn)淺紅色或橙紅色。
2.制備表面含有陣列微井的PDMS印章先用常規(guī)“光刻”技術(shù)制備一原始底模，即在一塊干凈的3×3cm2的載玻片表面以2000轉(zhuǎn)/分鐘的速度旋涂BP218紫外正型光刻膠，隨后置于90℃的烘箱中烘30分鐘，再在1000瓦的紫外燈、光掩模下旋轉(zhuǎn)曝光150秒，然后于2％的NaOH溶液顯影45秒，注意顯影的均勻性。因所用光掩模含有微陣列的盲孔，最終制得的底模表面即含有相應(yīng)的微陣列的突起柱。在此原始底模表面澆注PDMS預(yù)聚物，該預(yù)聚物已添加質(zhì)量比10∶1的交聯(lián)劑。60℃烘箱中交聯(lián)固化12小時(shí)后揭起即制得PDMS軟印章，其表面含有的對(duì)應(yīng)尺寸的陣列微井可用原子力顯微鏡觀察到(見圖2)。
3.白蛋白(BSA)在微井中的選擇性盛裝把異硫氰酸熒光素標(biāo)記的白蛋白(FITC-BSA)配成濃度為1.0mg/ml的PBS緩沖液溶液，滴加一滴于上述PDMS有微井的一面，用玻璃棒來回趕勻，并用氮?dú)饬骶従彺蹈?。把一片PCL膜輕置于PDMS印章涂有FITC-BSA的一面，并用100g/cm2的壓力壓緊，室溫下保持1小時(shí)。揭起PCL膜，吸附于微井之間區(qū)域的BSA就被轉(zhuǎn)移掉了，只剩下盛裝于陣列微井中的BSA。
4.冷凝水的形成把此盛有BSA的PDMS印章置于-12℃的冰箱中冷卻2分鐘，再在相對(duì)濕度為80～90％的大氣環(huán)境中(25℃)靜置1分鐘，即在其表面形成一薄層冷凝水。
5.把此印章迅速倒置于醛基PCL膜上，并用100g/cm2的壓力壓緊，室溫下保持3小時(shí)。印章與醛基PCL膜壓緊后微井中原有的水以及接觸區(qū)域橫向擴(kuò)散的水使生物大分子重新溶解從而以溶液的形式與表面基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，每一微井成為一個(gè)微反應(yīng)器。
6.輕輕揭起PDMS印章，用大量PBS緩沖液沖洗圖案化固定了生物大分子的PCL膜，再在PBS中漂洗24小時(shí)，氮?dú)獯蹈伞?br> 用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察結(jié)果圖3a為用上述方法得到的BSA在醛基PCL膜表面的微陣列圖案，b為該圖案對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度分析，說明用微傳遞方法可獲得很高的圖案對(duì)比度，證實(shí)了微傳遞方法的有效性。圖4的a和b分別為微傳遞前后的PDMS印章中的BSA圖案，證實(shí)BSA已經(jīng)從PDMS微井中完全傳遞到PCL膜表面。實(shí)例2本例是與本發(fā)明的比較例。其它步驟同實(shí)例1，但改用已有的反應(yīng)性微接觸印刷技術(shù)圖案化固定白蛋白。即在PDMS印章有微井的一面浸涂濃度為1.0mg/ml的FITC-BSA的PBS緩沖液溶液，并用氮?dú)饬骶従彺蹈桑杆僖朴∮谌┗腜CL膜上。壓力、時(shí)間、溫度及隨后沖洗均同實(shí)例1。CLSM觀察發(fā)現(xiàn)，用此方法得到的BSA圖案(圖5a)比用本發(fā)明得到的BSA圖案要暗淡得多，其對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度分析顯示圖案對(duì)比度也低的多(圖5b)。實(shí)例3其它步驟同實(shí)例1，但PDMS印章在相對(duì)濕度為80～90％的大氣環(huán)境中(25℃)靜置時(shí)間為0.1分鐘或3分鐘，觀察其對(duì)圖案質(zhì)量的影響。發(fā)現(xiàn)前者因冷凝水不足形成了圓環(huán)形圖案(圖6a)，后者則因冷凝水過量而導(dǎo)致了圖案“污染”(圖6b)。這說明在用微傳遞方法圖案化固定生物大分子時(shí)，在PDMS表面形成的冷凝水量對(duì)最終圖案的質(zhì)量有很大影響，過低或過高均將導(dǎo)致圖案缺陷。
權(quán)利要求
1.用微傳遞技術(shù)在聚合物活性表面圖案化固定生物大分子的方法，其特征是包括以下步驟1)用常規(guī)的化學(xué)改性或等離子體改性方法改性聚合物，在聚合物表面引入能與生物大分子反應(yīng)的羥基、羧基、氨基基團(tuán)；2)制備表面含微井的聚二甲基硅氧烷印章，并在其有微井的一面浸涂0.1～20mg/ml濃度的生物大分子溶液，用氮?dú)饬骶従彺蹈桑?)取上述聚合物薄膜一片壓印于印章表面0.1～10小時(shí)，壓力10～200g/cm2，以選擇性移走吸附在微井之間區(qū)域的生物大分子；4)把印章在-18～0℃溫度下保持0.1～5分鐘，再在20～37℃溫度下，相對(duì)濕度為50～99％的環(huán)境中靜置0.1～5分鐘，在其表面形成一層冷凝小液滴；5)在0～100℃下，立即將此印章壓印于步驟1)所得的改性聚合物表面0.1～10小時(shí)，壓力10～200g/cm2；6)揭起印章，用生物大分子相應(yīng)pH值的緩沖液或水溶液沖洗，浸泡24小時(shí)后吹干，即得到生物大分子的微圖案。
2.按權(quán)利要求1所述的用微傳遞技術(shù)在聚合物活性表面圖案化固定生物大分子的方法，其特征是所說的聚合物是聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚己內(nèi)酯、聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)、聚氨酯、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、聚苯乙烯。
3.按權(quán)利要求1所述的用微傳遞技術(shù)在聚合物活性表面圖案化固定生物大分子的方法，其特征是表面含有微并的聚二甲基硅氧烷印章，是先通過常規(guī)的“光刻”技術(shù)構(gòu)建一個(gè)含有微米級(jí)柱狀突起的底模，再在此底模表面澆注聚二甲基硅氧烷預(yù)聚物，加熱交聯(lián)固化后揭起制得的。
4.按權(quán)利要求1所述的用微傳遞技術(shù)在聚合物活性表面圖案化固定生物大分子的方法，其特征是所說的生物大分子是指蛋白類生物大分子及其衍生物，包括白蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、多聚賴氨酸、膠原以及明膠等。
5.按權(quán)利要求1所述的用微傳遞技術(shù)在聚合物活性表面圖案化固定生物大分子的方法，其特征是步驟2)所說的生物大分子溶液是指其相應(yīng)pH值的緩沖液溶液或水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開的用微傳遞技術(shù)在聚合物活性表面圖案化固定生物大分子的方法是先把生物大分子選擇性“裝入”聚二甲基硅氧烷印章的微井中，再在其表面形成一層冷凝水，利用印章與改性聚合物膜壓緊后微井中原有的水以及接觸區(qū)域橫向擴(kuò)散的水使生物大分子重新溶解，從而以溶液的形式與表面基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)在聚合物活性表面圖案化固定生物大分子。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單靈活，重復(fù)性好，所獲得的微圖案具有很高的對(duì)比度和牢固度。同時(shí)對(duì)印章表面性質(zhì)和微井深度要求較低，是一種簡(jiǎn)單廉價(jià)的圖案化固定生物大分子的有效方法，尤其適用于具有較低反應(yīng)活性的生物分子/活性表面體系。本發(fā)明在基于細(xì)胞的生物器件構(gòu)建、組織工程以及細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C08J3/24GK1425958SQ0216033
公開日2003年6月25日 申請(qǐng)日期2002年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月26日
發(fā)明者高長(zhǎng)有, 馮杰, 沈家驄 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)