專利名稱：聚合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用作治療劑和診斷劑的聚合物及其制備方法。尤其涉及在靶向診斷成像和治療劑中使用的可生物降解的氨基酸類聚合物。
本發(fā)明的聚合物適用于需要定向傳遞的各種用途，尤其適用于生物活性劑的傳遞。然而，本發(fā)明聚合物的優(yōu)選用途，是通過增強選定的哺乳動物的器官、組織和細(xì)胞的成像性質(zhì)和位置特異性，增強MR、X-射線、超聲波、光和核造影技術(shù)對這些部位的體內(nèi)成像。這些聚合物尤其適用于在此類成像技術(shù)中作為血管內(nèi)造影劑和血液匯集劑(blood pool agents)。因此它們可以用于血管成像，如核磁共振血管照相術(shù)、血流和血液體積的測定、借助于血管分布與正常組織的不同而確診和表征疾病、為診斷肺病而進行的肺部成像和用于血流灌注研究。
醫(yī)學(xué)成像技術(shù)，如MRI和X-射線技術(shù)，已成診斷和治療疾病的非常重要的工具。一些體內(nèi)部分的成像基于這些部分，如骨，在特定類型的諸如X-射線成像技術(shù)中，具有能夠與周圍組織區(qū)分開的固有的特性。其它器官和解剖部位僅在通過特別的成像技術(shù)將其特殊地增亮?xí)r，它們才成為可見的。
一種此類能夠使多種解剖部位成像的技術(shù)，包括成像促進金屬的生物靶向。此過程能夠產(chǎn)生或增強特定器官和/或腫瘤或其它類似體內(nèi)固定部位的圖像，同時降低背景和非選定部位同時增亮產(chǎn)生的潛在影響。
多年來已經(jīng)認(rèn)識到將各種金屬螯合能增加這些金屬的生理學(xué)耐受劑量，因而使其能用于體內(nèi)以增強身體各部分的成像。經(jīng)過較多研究的一種螯合物是Gd-DTPA。然而盡管它具有令人滿意的衰減周期(relaxivity)并具有安全性，仍有一些缺點。由于其低分子量，Gd-DTPA被快速從血液中清除。這嚴(yán)重限制了其成像窗(imagingwindow)，即每次注射后能得到的最佳圖像數(shù)，并增加了造影劑的所需劑量和相對毒性。另外，這些簡單的金屬螯合圖像增強劑，不經(jīng)過進一步的改性，一般不產(chǎn)生任何顯著的位置特異性。
已廣泛建議將金屬螯合物附著于組織或器官靶向分子，如蛋白質(zhì)類生物分子上，以產(chǎn)生具有位置特異性的治療劑或診斷劑。許多這樣的二官能螯合劑是已知或已被提出的，即它們借助于螯合部分能夠強烈地與一種在治療或診斷方面有用的金屬離子鍵合，并借助于位置特異性分子部分能夠選擇性地將螯合金屬離子輸送到體內(nèi)感興趣的部位。然而金屬螯合物與蛋白質(zhì)載體產(chǎn)生的共軛物在用于MR成像時的缺點包括不適當(dāng)?shù)纳锓植?、毒性和短的血液半衰期。因此限制了它們在MR成像中的應(yīng)用。另外蛋白質(zhì)提供了一種不能經(jīng)受各種合成變化的確定的結(jié)構(gòu)。
使用多種與一個位置導(dǎo)向性大分子共軛的適宜的金屬離子促進了各種成像技術(shù)的位置特異性用途，并進行了許多嘗試以產(chǎn)生在每個位置特異性大分子上具有更多數(shù)量的螯合部分的二官能多螯合劑。
然而，對于位置特異性圖像增強，更重要的是，螯合部分的靶向部分的共軛不能破壞這些二官能螯合劑的螯合物的組織或器官靶向部分的位置特異性。二官能螯合劑僅含有一個螯合部分時，這一般不是一個嚴(yán)重的問題。然而經(jīng)過一些嘗試將一些螯合部分與一個單一的位置特異性大分子共軛產(chǎn)生二官能多螯合劑時，就會發(fā)現(xiàn)不僅會相對限制螯合劑位置特異性大分子能達到的最大比例，而且當(dāng)此比例增加時，所產(chǎn)生的二官能多螯合劑的位置特異性降低。
為克服較大量的螯合部分附著到位置特異性大分子上的問題，而不破壞其位置特異性，即不破壞其鍵合位置，已有許多建議，使用骨架(backbone)分子，大量螯合部分連接到該分子上，從而產(chǎn)生一個多螯合劑，然后一個或多個這樣的多螯合劑可以與位置特異性大分子共軛，以生成二官能多螯合劑。
已制備出了這樣的二官能多螯合劑，其中的螯合部分是開鏈PAPCA的殘基，如EDTA和DTPA，其中的骨架分子是聚胺，如聚賴氨酸或聚乙烯亞胺。
國際申請WO-A-90/12050記載了制備含有大環(huán)螯合部分的多螯合劑-如聚賴氨酸-聚DOTA和制備相應(yīng)的二官能多螯合劑的技術(shù)。此文獻也建議使用星形裂開(starburst)的樹枝狀體，如一個六級衍生的PAMAM星形裂開的樹枝狀體，作為這類多螯合劑的骨架。國際申請WO-A-93/06868相似地記載了含有樹枝狀骨架分子的多螯合劑，此骨架分子上連接有多個大環(huán)螯合部分，如DOTA殘基。它們可能再與一個位置導(dǎo)向分子，如一個蛋白質(zhì)分子共軛。然而至今在成像方面仍未發(fā)現(xiàn)星形裂開的樹枝狀體的應(yīng)用。
因此仍需要其它聚合物造影劑，如MR、X-射線、超聲波、光和核造影劑，其中每個分子中含有相對大量的金屬，它們的分子量使其能在血液中循環(huán)更長的時間，并顯示更好的生物分布。
本發(fā)明基于這樣的認(rèn)識，即運載或附著有一或多個報告基團，如螯合部分、氟或吸收體的氨基酸共聚物，由于其結(jié)構(gòu)及其分子量分布的顯著的均一性，尤其適合在診斷和治療中的應(yīng)用。進一步，由于它們相對高的分子量，這些化合物可以作為有效的血液匯集劑，而不需要連接到具有位置導(dǎo)向作用的生物分子上。
因此，本發(fā)明一方面提供一種化合物，它含有線性、分支的或樹枝狀聚合物骨架，在此骨架上至少連接一個報告因子部分，所述的聚合物骨架含有多個含胺的酸，如氨基酸殘基，或類似的非天然的含胺的酸，其條件是當(dāng)此聚合物骨架為線性時，報告因子部分含有一個碘化的造影劑、一個超聲造影劑、一個光類報告因子或一個除DOTA、DTPA或類似的聚氨基聚羧酸外的金屬螯合劑。當(dāng)聚合物骨架為線性時，報告因子部分優(yōu)選含有一個碘化的造影劑或TMT。
用于此處的術(shù)語“報告因子部分”代表任何可以連接到聚合物骨架上的原子、離子或分子，它們產(chǎn)生一種能用任何化學(xué)、物理或生物檢測方法測定的效應(yīng)。因此報告因子部分可以是治療劑或診斷劑，如一種造影劑或藥劑。當(dāng)將兩或多個報告因子部分連接到一個給定的聚合物骨架上時，它們可以是相同或不同的。因此它們可以含有任何診斷劑和/或治療劑的組合。所連接的報告因子部分的數(shù)量依賴于聚合物骨架的結(jié)構(gòu)，尤其是支化度數(shù)，但一般在3-200范圍內(nèi)，優(yōu)選至多100，如至多50。
樹枝狀(或串聯(lián))聚合物優(yōu)選作為骨架部分。它們是由作為分支點的單體形成的，并隨著每個連續(xù)分支，形成一個新的“衍生代(generation)”。樹枝狀骨架分子優(yōu)選含有多個從中心核部分向外輻射狀延伸排列的天然或非天然氨基酸殘基，優(yōu)選天然氨基酸殘基。這些氨基酸殘基可以以末端直接鍵合或可選地通過一個連接基團鍵合到一或多個報告基團上。選擇性地，可以通過進一步增加的氨基酸殘基使這些氨基酸殘基在末端產(chǎn)生分支。一個骨架分子，其中中心分支核在末端產(chǎn)生一次分支，將這樣的骨架分子命名為一級衍生骨架分子。一級衍生骨架分子的氨基酸殘基進一步在末端分支產(chǎn)生二級、三級、四級等衍生骨架。隨著每一級分支，能夠與報告基團鍵合的連接點的數(shù)目隨之增加。根據(jù)中心核部分的性質(zhì)，從此處產(chǎn)生的分支可以在一或多個方向徑向延伸，產(chǎn)生徑向不對稱或?qū)ΨQ的樹枝狀體。優(yōu)選徑向不對稱的樹枝狀體骨架分子。
本發(fā)明進一步涉及含有多個天然或非天然氨基酸殘基的樹枝狀聚合物，優(yōu)選含有天然氨基酸殘基的樹枝狀聚合物。一般地，它們含有3-200個從中心核部分徑向延伸的氨基酸殘基，如3-100個氨基酸殘基。
盡管該核部分本身可以含有一或多個氨基酸殘基，其它核部分也是如此。一般地，核部分可以是任何能夠使大量連續(xù)的氨基酸殘基連接到其上的分子，并且其自身也可以含有一個報告因子部分。適宜的核部分包括H2NCOCH2CH2CONH2，和
其中m=0-4；Y代表氫，或一個烷基或芳基，如一個C1-6烷基；X代表一個-CO2H，-SO2Cl或-CH2Br基團，及其變型和其衍生物。
在本發(fā)明的一個實施方案中，樹枝狀體核自身可以含有一個報告因子部分。因此在另一方面，本發(fā)明提供了一種化合物，它含有一個從報告因子部分徑向延伸的樹枝狀聚合物骨架，此聚合物骨架含有多個氨基酸殘基。
優(yōu)選地，可生物降解的連接基團用于將報告因子部分連接到聚合物骨架上。以此方式，化合物在靶部位的生物降解導(dǎo)致報告因子部分的釋放，如在感興趣的部位產(chǎn)生一個離子或非離子造影劑。適宜的連接基團的例子包括酰胺、醚、硫醚、胍基、縮醛、酮縮醇和磷酸酯等基團。優(yōu)選通過一個酰胺鍵將骨架和報告基團連接起來，其酰胺氮來自骨架分子，酰胺基中的羰基來自報告基團上的羧基或羧基衍生物。
可生物降解的聚合物的優(yōu)點是，在保證將其降解速度調(diào)節(jié)到所需的成像時間的情況下，它不會在諸如淋巴系造影過程中，在注射部位聚集，如在脈搏描記過程中，或在組織中如在肝中聚集。
可以通過選擇特定的連接體和肽簇化合物調(diào)節(jié)本發(fā)明化合物的生物可降解性。此外，如果需要，可以在體外用純化酶和/或生物液體/組織優(yōu)化連接體和聚合物骨架生物的可降解性。使用本身能夠快速被清除的氨基酸單體會更有利于成像后的清除。
優(yōu)選的聚合物骨架含有3-200個氨基酸殘基，優(yōu)選含有3-100個氨基酸殘基并且分子量為300-20,000道爾頓。它們優(yōu)選通過肽鍵鍵合，以保證聚合物的生物可降解性及隨后從體內(nèi)的清除。聚氨基酸可以是單一種類或至少兩種不同類型氨基酸的聚合物，或是一個嵌段共聚物。優(yōu)選的聚氨基酸是聚-1天冬氨酸。
本發(fā)明尤其優(yōu)選式I化合物
其中n是1-100的整數(shù)，R代表一個報告基團或一個可生物降解的連接體-報告因子加合物。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，報告因子部分是螯合劑。它們能夠高穩(wěn)定性地與金屬離子螯合，用適宜的金屬離子進行金屬化，例如以增強MRI、γ-閃爍照相術(shù)或X-射線成像，或傳送細(xì)胞毒性劑量的放射活性以殺死不需要的細(xì)胞如腫瘤。一般地，螯合劑是含有至少一個順磁性金屬離子的造影劑。選擇性地，可以在其未金屬化或金屬化不足的階段使用螯合劑，以吸收體內(nèi)存在的金屬離子，如在金屬解毒療法中。
報告因子部分也可以含有治療劑，如抗菌劑、止痛劑、抗炎劑或其它生物活性劑。延長攜帶這些治療劑的聚合物在血液中的循環(huán)周期會顯著延長治療劑的治療效果。連接基團的蛋白水解使治療劑釋放。選擇特定的連接基團能夠使治療劑在感興趣的所需部位定時釋放。
如果需要，可以用已知方法將本發(fā)明的化合物連接到一或多個位置導(dǎo)向分子或靶向劑上，如，一種蛋白上，以形成二官能聚合物，此物質(zhì)可以促進成像和/或?qū)⒓?xì)胞毒劑量的放射性傳遞到靶細(xì)胞、組織、器官和/或體內(nèi)導(dǎo)管中。以此方式使造影劑靶向到達感興趣的部位會增加成像方法的有效性。這些藥劑在感興趣部位的聚集基于靶向劑的特異性。選擇性地，這些聚合物可以作為血液匯集劑，而不與位置導(dǎo)向分子偶合。
對于含有一個樹枝狀骨架部分的本發(fā)明的化合物，任何末端氨基酸殘基可以直接或通過一個可生物降解的連接基團鍵合到一個報告因子或一個靶向劑上。優(yōu)選地，核部分自身是報告基團時，每個末端氨基酸殘基通過一個可生物降解的連接基團鍵合到一個靶向劑上。按此方式，可以提供含有多于一個靶向劑的化合物。通常地，靶向劑的數(shù)量將在1-128，優(yōu)選1-16，如1-4。
在本發(fā)明的一個另外的實施方案中，含有一個樹枝狀聚合物骨架的化合物可以含有一個靶向劑或位置導(dǎo)向大分子作為核心部分。所產(chǎn)生的肽簇可以接著連接到一或多個報告因子部分上。進一步地，本發(fā)明因而提供一種含有一個樹枝狀聚合物骨架的化合物，此聚合物骨架從一個靶向劑徑向延伸，并含有多個氨基酸殘基，在這些氨基酸殘基上連接有至少一個報告因子部分。
國際申請WO-A-95/11694記載的從大腸桿菌得到的熱穩(wěn)定的STa腸毒素尤其適合作為一個核心靶向劑。附

圖1說明了一個本發(fā)明化合物，在其中STa肽連接到一個聚-1-天冬氨酸簇(Asp3)上，此聚-1-天冬氨酸群接著連接到多個TMT報告分子上。
本發(fā)明的聚合物在醫(yī)學(xué)診斷和治療中本質(zhì)上和自然而然地是有用的實體，這部分地是由于其在體內(nèi)獨特的定位效果。此聚合物的大小主要改變其生物分布，其大小一般在200-100,000道爾頓，特別在200-50,000道爾頓，尤其在10,000-40,000道爾頓。選擇特定的連接基團和/或改變聚氨基酸序列也會影響聚合物和所連接的報告因子部分或靶向劑的生物分布。
本發(fā)明化合物一般具有延長的血管內(nèi)保留時間，如長達數(shù)小時。不過，可以根據(jù)化合物的所需用途，通過選擇合適的連接劑和/或改變聚合物骨架的聚氨基酸序列，具體地改變此時間。一般地化合物最終清除進入細(xì)胞外液(ECF)空間，并經(jīng)腎排泄。由于這些化合物在有效的診斷保留時間內(nèi)主要存在于血管內(nèi)系統(tǒng)，它們的適用范圍是血液匯集、心臟灌注造影、CNS腫瘤探查和體積測定，以進行血栓檢查和血管造影術(shù)。作為血液匯集劑，它們特別適用于血流或血液體積的研究，尤其涉及損傷測定和心肌灌注造影研究。慣用的能夠快速分散到細(xì)胞外/血管外空間的單體MRI造影劑不能容易地用于這些目的。另外，考慮到延長了其衰減周期，本發(fā)明的聚合物可以按顯著低于現(xiàn)有單體MRI造影劑如GdDTPA和GdDOTA的劑量用藥，因此本發(fā)明為這些化合物的應(yīng)用提供了一個顯著擴大的安全范圍。
因此本發(fā)明提供了一些化合物，它們能夠增強在一個長的時間周期內(nèi)血液匯集量的MR造影，這些化合物能特異性地聚集在各身體組織中，它們在這些組織中提供相對大量的金屬，可以從合成方面滿足這些化合物的分子量以產(chǎn)生一種具有所需的組成、分子量和體積的試劑。
進而，通過適當(dāng)?shù)剡x擇螯合種類，如，選擇鎢，能夠?qū)⒈景l(fā)明制成的螯合物作為X-射線劑，或選擇適當(dāng)?shù)慕饘匐x子，如鑭系金屬離子，也能使其作為MR造影劑。
將化合物連接到一個位置導(dǎo)向分子上，在體內(nèi)產(chǎn)生更大的目標(biāo)特異性。位置導(dǎo)向分子優(yōu)選一種抗體、抗體片段、其它蛋白質(zhì)或其它大分子，它們將在體內(nèi)運行到達所需位置以傳遞被螯合的金屬。在本發(fā)明中，加入螯合金屬不會降低位置導(dǎo)向大分子到達靶器官和/或與靶器官連接的能力。對應(yīng)于每個分子的螯合數(shù)量足以增強特定靶器官的圖像。
連接到聚合物骨架上的適宜的螯合劑包括線性和大環(huán)PAPCAs。適宜的PAPCAs包括乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷四乙酸(DOTA)、1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸(DO3A)、1氧雜-4，7，10-三氮雜環(huán)十二烷三乙酸(DOXA)、1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷三乙酸(NOTA)和1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷四乙酸(TETA)。
其它適宜連接到聚合物骨架上的螯合劑包括如美國專利US-A-5367080所述的三聯(lián)吡啶，如4’-(3-氨基-4-甲氧基-苯基)-6，6”-雙(N’，N-二羧甲基-N-甲肼基)-2，2’6’，2”-三聯(lián)吡啶(THT)和4’-(3-氨基-4-甲氧基-苯基)-6，6”-雙(N，N-二羧甲基氨甲基)-2，2’6’，2”-三聯(lián)吡啶(TMT)。
可以通過螯合結(jié)合的金屬包括鑭系和其它金屬離子，包括其同位素和放射性同位素，如Mg、Ca、Sc、Ti、B、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Sr、Y、Zr、Tc、Ru、In、Hf、W、Re、Os、Pb和Bi。根據(jù)所需治療劑或診斷劑的應(yīng)用選擇螯合所用的金屬離子。
用于X-射線成像時，報告因子部分可以含有一個離子或非離子碘化的單環(huán)或雙環(huán)X-射線造影劑。單環(huán)或雙環(huán)是指造影劑含有一或兩個碘化的環(huán)。一般地，碘化環(huán)是二碘化或三碘化，如三碘化芳環(huán)，尤其是苯環(huán)。本發(fā)明所用的碘化造影劑的例子包括碘海醇、碘番醇(iopentol)、碘帕醇和iodixanol。通常，可以將一或多種碘化造影劑共軛以形成一種交替共聚物，再將它連接到聚合物骨架上。以下給出了一個從iodixanol合成這種共聚物的例子
本發(fā)明的二官能劑包括將化合物偶合到一個位置導(dǎo)向分子上。位置導(dǎo)向分子可以是任何一種在體內(nèi)自然地濃集在哺乳動物體內(nèi)一個選定的靶器官、組織、細(xì)胞或細(xì)胞群，或其它位置的分子。這些包括氨基酸、寡肽(如六肽)、分子識別單位(MRU’s)、單鏈抗體(SCA’s)、蛋白質(zhì)、非肽有機分子、抗原結(jié)合片段(Fab片段)和抗體。位置導(dǎo)向分子的例子包括多糖(如縮膽囊素(CCK)和六肽)、蛋白質(zhì)(如外源凝集素、脫唾液酸胎球蛋白(asialofetuin)、多克隆免疫球蛋白、血液凝集蛋白(如水蛭素)、脂蛋白和糖蛋白)、激素、生長因子和凝集因子(如PF4)。位置導(dǎo)向蛋白的例子包括大腸桿菌(E.coli)熱穩(wěn)定腸毒素STa及其類似物、聚合的血纖維片段(如E1)、血清淀粉樣前體(SAP)蛋白、低密度脂蛋白(LDL)前體、血清白蛋白、完整紅細(xì)胞的表面蛋白、受體連接分子如雌激素、肝特異蛋白/聚合物如半乳糖-新糖元白蛋白(neoglycoalbumin)(NGA)(見Vera等，放射學(xué)，151191(1984))/有不同數(shù)量的結(jié)合型半乳糖胺的N-(2-羥基-丙基)甲基丙烯酰胺(HMPA)共聚物(見Duncan等，《生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報》88062(1986))，及烯丙基和6-氨基已基甙(見Wong等，《碳水化合物研究》，17027(1987))，和血纖維蛋白原。
位置導(dǎo)向性蛋白質(zhì)也可以是一種抗體。根據(jù)共軛體的用途選擇抗體，尤其是抗體的抗原特異性。與多克隆抗體相比更優(yōu)選單克隆抗體。
在研究血管系統(tǒng)時人血清白蛋白(HSA)是一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)?？梢詮陌⊿igma化學(xué)公司在內(nèi)的多個途徑得到市售的HSA。與所期望的抗原反應(yīng)的抗體的制劑是已知。能夠從許多途徑得到市售的抗體制劑?？梢园碠lexa等在《生物化學(xué)雜志》254頁4925(1979)記載的方法制備纖維蛋白片段E1。de Beer等在《免疫法雜志》50頁17(1982)記載了LDL前體和SAP蛋白質(zhì)的制備。在此將上述文章全部作為參考。
通常通過在反應(yīng)惰性的溶劑中，將一個含有多個氨基酸殘基的線性、分支或樹枝狀骨架與一或多個報告基團共軛制備本發(fā)明的化合物?？梢越柚绢I(lǐng)域已知的任何反應(yīng)活性基團和標(biāo)準(zhǔn)的偶合技術(shù)使報告基團連接到骨架分子上。優(yōu)選的反應(yīng)條件，如溫度、溶劑等主要依賴于特定的反應(yīng)物，并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定這些條件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道將現(xiàn)有的任何螯合劑金屬化的方法?？梢杂萌N常規(guī)方法之一將金屬結(jié)合到一個螯合部分直接結(jié)合法、模板合成法和/或金屬轉(zhuǎn)移作用法。優(yōu)選直接結(jié)合法。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道將聚合物骨架連接到抗體和其它蛋白質(zhì)上的方法。Pierce1989手冊和綜合目錄及其引用的參考資料，Blatter等，《生物化學(xué)》，241517(1985)，和Jue等，《生物化學(xué)》，175399(1978)記載了這些方法。
可以用通用的肽合成技術(shù)合成聚合物骨架本身。例如，“光學(xué)活性α-氨基酸的合成”，Robert M.Williams(Pergamon出版社，1989)記載了形成氨基酸單位的適宜方法。一般地，在將單個氨基酸偶合的過程中，要把存在的反應(yīng)活性的側(cè)鏈基團如氨基、硫羥基和/或羧基保護起來。雖然在整個合成過程中會失去一些未被保護的側(cè)鏈基團，如羥基、伯酰胺基團。
合成本發(fā)明化合物的最終步驟將是將此化合物的全部保護或部分保護衍生物解除保護，此過程是本發(fā)明的一部分。因此本發(fā)明提供了一種制備前述化合物的方法，此方法包括對此化合物的受到部分或全部保護的衍生物解除其基團保護。
在構(gòu)建肽鏈時，理論上既可以從C-末端開始，也能從N-末端開始。然而公用的僅是從C-末端開始的方法。因為當(dāng)按N末端至C末端的方向合成時會遇到困難，包括不能接受的大量的外消旋化(見Kong & Geiger，Chemische Berichte 1032024-2033，1970)。
出乎意料地，已發(fā)現(xiàn)按氨基至羧基方向合成時，可以制備出高產(chǎn)量和高純度(每步＜0.1％消旋體)的本發(fā)明所用的肽化合物。已發(fā)現(xiàn)此方法在制備樹枝狀聚合物骨架時尤其有效。特別地，已發(fā)現(xiàn)這些化合物比按更通用的Michael化學(xué)加成法制備的樹枝狀衍生物更穩(wěn)定。另外，已發(fā)現(xiàn)按氨基至羧基方向合成聚合物骨架會產(chǎn)生基本不交聯(lián)的單個聚合物，其中的外消旋雜質(zhì)含量特別低。
因此，本發(fā)明另一方面進一步提供了一種制備此種化合物的方法，此化合物含有一個線性、分支或樹枝狀的聚合物骨架，此骨架至少與一個報告因子部分連接，并含有多個氨基酸殘基，所述方法包括(a)將一系列受到保護的氨基酸殘基按氨基至羧基的方向分步連接以形成一個聚合物骨架；(b)將聚合物骨架，可選地通過一個連接基團，連接到一或多個報告因子部分上，并
(c)解除所有受保護基團的保護。
因此我們可以從N-末端開始，使一個適當(dāng)?shù)氖艿奖Ｗo的例如天冬氨酸衍生物與第二天冬氨酸分子的適當(dāng)受到保護的衍生物反應(yīng)。第一天冬氨酸衍生物有一受到保護的氨基和一游離的羧基，另一反應(yīng)物有一游離的或活化的α-氨基和一受到保護的羧基。偶合后，可以用例如色譜法純化中間體，然后選擇性地解除保護以加入下一氨基酸殘基。繼續(xù)此過程直至完成所需的氨基酸序列。
已知多種氨基酸保護基團。適宜的胺保護基團包括芐酯基(Z-或Cbz)、叔丁氧基羰基(Boc-)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc-)。可以使用的羧基保護基團包括芐基(-Bzl)和叔丁基(-tBu)。
有許多去除胺和羧基保護基團的方法?？梢杂盟崽幚矸ㄍ瑫r除去胺保護基團如Boc和羧基保護基團如叔丁基(-tBu)，如用三氟乙酸處理。
例如，可以用N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)完成游離氨基與羧基的偶合?？梢允褂玫钠渌己蟿┌?-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和2-(11-H-苯并三唑-1-基)-1，1，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽。
偶合反應(yīng)可以在環(huán)境溫度下，通常在一適宜的溶劑系統(tǒng)中進行，如四氫呋喃、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜或這些溶劑的混合物。
在一個固相樹脂載體上進行肽的合成是方便的。氨基酸分步加到一個增長的肽鏈上，此肽鏈與不溶性基體如聚苯乙烯珠相連。此種固相法的一個優(yōu)點是將每個階段預(yù)期的產(chǎn)品連接到珠上，能將它們快速過濾和洗滌，所以可以免去純化中間體的步驟。本領(lǐng)域已知一些適宜的固相支撐體，如經(jīng)改性與琥珀酐形成酯的4-羥基芐醇樹脂。
本發(fā)明的化合物，尤其是二官能聚合物，可以按用特定的成像技術(shù)足以產(chǎn)生所需對比度的量給病人服用，以用于成像。一般劑量為病人每公斤體重給以0.001至5.0mmol螯合成像金屬離子，會有效地產(chǎn)生足夠的對比度增強效果。對于多數(shù)在MRI方面的應(yīng)用，成像金屬離子的優(yōu)選劑量在0.02-1.2mmol/每公斤體重。而用于X-射線的劑量為0.5-1.5mmol/每公斤體重，一般能有效地產(chǎn)生X-射線衰減。多數(shù)X-射線應(yīng)用的優(yōu)選劑量為0.8-1.2mmol鑭系或重金屬/每公斤體重。
本發(fā)明化合物用于治療的劑量根據(jù)病情而定，但一般在1pmol/kg至1mmol/kg體重的數(shù)量級。
本發(fā)明的化合物可以與慣用的制藥或獸醫(yī)用的輔劑，如乳化劑、脂肪酸酯、膠凝劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等制成制劑，并能適于胃腸外或經(jīng)腸給藥的方式用藥，如注射或輸液，或直接向某個具有外部排泄導(dǎo)管的體腔內(nèi)用藥，如胃腸道、膀胱或子宮。因此可以將本發(fā)明的化合物制成慣用的藥學(xué)給藥形式，如片劑、膠囊劑、粉劑、溶液、懸浮劑、分散劑、糖漿劑、栓劑等。然而，一般優(yōu)選在生理學(xué)上可接受的載體中，如注射用水中制成的溶液劑、懸浮劑和分散劑。
因此可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式，將本發(fā)明的化合物，用生理學(xué)上可接受的載體或賦形劑，制成藥物制劑。如，可以將化合物，可選地加入藥學(xué)可接受的賦形劑，懸浮或溶解在一種水性介質(zhì)中，然后將制得的溶液或懸浮液滅菌。
對于身體某些部位的MRI或X-射線成像，作為造影劑的金屬螯合物的最優(yōu)選的給藥方式是胃腸外給藥，如靜脈內(nèi)給藥。能夠胃腸外給藥的劑型，如靜脈溶液，應(yīng)是無菌的，并除去了生理學(xué)上不能接受的物質(zhì)，并且應(yīng)具有低的重量克分子滲透壓濃度，以減少給藥產(chǎn)生的刺激或其它副作用，因此造影劑優(yōu)選等滲或稍高滲。適宜的溶媒包括慣用于藥用胃腸外溶液的水溶性溶媒，如氯化鈉注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射液、乳酸鹽林格注射液和其它如《Remington’s藥物學(xué)》(Remington’sPharmaceutical Sciences)15版(EastonMack出版公司，1405-1412頁和1461-1487頁(1975))和美國《國家處方集XIV》14版(華盛頓美國藥物學(xué)會(1975))記載的溶液。這些溶液可以含有胃腸外溶液慣用的防腐劑、抗菌劑、緩沖劑和抗氧劑，及能夠與螯合物配伍而不影響藥物制備、儲存或使用的賦形劑和其它添加劑。
本發(fā)明進一步提供了一種藥物組合物，如一種含有本發(fā)明的化合物及至少一種藥物載體或賦形劑的促進成像或具有治療作用的組合物。
本發(fā)明還進一步提供了本發(fā)明化合物或其螯合物在制備一種促進成像的造影劑或一種治療性組合物中的用途。
本發(fā)明另一方面提供了一種生成人類或非人類動物，尤其是哺乳動物身體圖像的方法，此方法包括以下步驟用能夠促進成像劑量的一種本發(fā)明的化合物給所述的身體部位用藥，此后對身體的至少一部分生成一個圖像，如MR、X-射線、超聲或閃爍掃描圖像。
通過以下非限定性的實施例進一步說明本發(fā)明。除非有另外的說明，所有給出的百分比為重量百分比。
實施例1不對稱的肽簇z-[Asp(α，γ-Asp2(α，γ-Asp4(α，γ-Asp8(α，γ-Lys16(α-報告因子16)))))](a)雙-α，γ-(α，γ-叔丁基-天冬氨?；?-N-Cbz-天冬酰胺“Asp3簇”(化合物I)在500mL圓底燒瓶中加入8.5mmol N-Cbz-L-天冬氨酸、10.2mmol N-羥基苯并三唑、25mL THF∶DMF(2∶1，V/V)和10.2mmolEDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺)。在室溫攪拌45分鐘后，在攪拌條件下加入20.4mmol α，γ-叔丁基-L-天冬氨酸和25mmol N，N-二異丙基乙胺。4小時后，加入10.2mmolEDC，按如上條件繼續(xù)反應(yīng)3天。用水提取反應(yīng)生成液。
純度在薄層色譜(TLC)上為單一色點，用MS和NMR鑒定。產(chǎn)率44.5％。
(b)N-Cbz-天冬酰胺-((α，γ-天冬氨?；?(α，γ-叔丁基-天冬氨?；?)“Asp7簇”(化合物II)在500mL圓底燒瓶中加入10mmol化合物I，95mL氯仿∶THF∶乙腈(2.5∶7∶7)，36.4mmol N-羥基苯并三唑，和36.5mmol DCC(N，N’-二環(huán)己基碳化二亞胺)。在室溫攪拌20分鐘后，加入40mmol α，γ-叔丁基-L-天冬氨酸，并加入N，N’-二異丙基乙胺直至pH約為7。在室溫攪拌16小時后，用水提取反應(yīng)液。
純度在薄層色譜(TLC)上為單一色點，用MS和NMR鑒定。產(chǎn)率12.1％。
(c)N-Cbz-天冬酰胺-((α，γ-天冬氨?；?(α，γ-叔丁基-天冬氨?；?)“Asp15簇”(化合物III)步驟1在室溫條件下將0.85mmol化合物II在200mL95％三氟乙酸(水溶液)中攪拌8小時。將反應(yīng)液在40℃真空蒸發(fā)至干，然后溶于200mL甲苯，再次蒸發(fā)至干，再溶于THF，蒸發(fā)至干。
步驟2在250mL圓底燒瓶中加入0.85mmol從上述步驟1得到的物質(zhì)，90mL DMF∶THF(1∶1，V/V)，8.12mmol N-羥基苯并三唑，8.12mmolEDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺)。在室溫攪拌20分鐘，加入16.24mmol α，γ-叔丁基-L-天冬氨酸和19.92mmol N，N’-二異丙基乙胺。在室溫攪拌16小時，用水提取及離子交換色譜法處理反應(yīng)生成液。
純度在薄層色譜(TLC)上為單一色點，用MS和NMR鑒定。產(chǎn)率82.2％。
(d)N-Cbz-天冬酰胺-((α，γ-天冬氨?；?(α，γ-天冬氨?；?(天冬氨酰基-(α，γ-賴氨酰基((α-甲氧基乙酰胺，ε-胺)))))))“Asp15Lys16簇”(化合物IV)步驟1
在室溫條件下將0.7mmol化合物III在200mL 95％三氟乙酸(水溶液)中攪拌8小時。將反應(yīng)液在40℃真空蒸發(fā)至干，然后溶于200mL甲苯，再次蒸發(fā)至干，再溶于THF，蒸發(fā)至干。
步驟2在250mL圓底燒瓶中加入0.7mmol從以上步驟1得到的化合物，90mL DMF∶THF(1∶1，V/V)，8.12mmol N-羥基苯并三唑，和8.12mmolEDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺)。在室溫攪拌20分鐘，加入16.24mmol α，γ-叔丁基-L-天冬氨酸和19.92mmol N，N’-二異丙基乙胺。在室溫攪拌16小時，用水提取及離子交換色譜法處理反應(yīng)生成液。
純度在薄層色譜(TLC)上為單一色點，用MS和NMR鑒定。產(chǎn)率99％。
步驟3在250mL圓底燒瓶中加入0.7mmol從以上步驟2得到的化合物，100mLDMSO∶DMF∶THF(1.5∶3.5∶5，V/V)，27.5mmol N-羥基苯并三唑，和27.5mmol EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺)。在室溫攪拌20分鐘，加入55mmol α-BOC-L-賴氨酸和68.7mmolN，N’-二異丙基乙胺。在室溫攪拌16小時，用水提取及凝膠滲透色譜法處理反應(yīng)生成液。
純度在薄層色譜(TLC)上為單一色點。
步驟4在250mL圓底燒瓶中加入從以上步驟3得到的化合物，40mLDMF∶DCM(2∶2，V/V)，23.5mmol N-羥基苯并三唑，和23.5mmolEDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺)。在室溫攪拌30分鐘后，加入75mmol 2-甲氧基乙醇胺。在室溫攪拌過夜，用水提取及離子交換色譜法處理反應(yīng)生成液。
純度在薄層色譜(TLC)上為單一色點。產(chǎn)率90％。
(e)N-Cbz-天冬酰胺-((α，γ-天冬氨?；?(α，γ-天冬氨?；?(天冬氨酰基-(α，γ-賴氨?；?(α-甲氧基乙酰胺，ε-TMT)))))))“Asp15Lys16TMT16簇”(化合物V)在250mL圓底燒瓶中加入化合物IV，1.1摩爾當(dāng)量的TMT-NCS，和100mL pH為9.0的5mM硼酸鈉。在室溫攪拌48小時后，用膜滲濾(截留分子量為2000MW)法處理反應(yīng)生成液。
純度RP-HPLC法處理，為80％。
實施例2對稱的天冬氨酸簇(a)雙-(α，γ-叔丁基-天冬氨?；?-琥珀酰胺(化合物I)合成路線A在一2升圓底燒瓶中加入20mmol琥珀酸、26mmol EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺)、24mmol三乙胺、12mmolTBTU(2-(1-H-苯并三唑基-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽)和150mL THF∶DMF(2∶1，V/V)，然后加入20mmol α，γ-叔丁基-L-天冬氨酸。反應(yīng)液在室溫反應(yīng)4天，然后水提取。
純度在薄層色譜(TLC)上為單一色點，用MS和NMR鑒定。
產(chǎn)率23.2％。
合成路線B在一2升圓底燒瓶中加入10mmol琥珀酸、100mLTHF∶DMF(2∶1，V/V)、60mmol三乙胺和20mmol TBTU(2-(1-H-苯并三唑基-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽)。攪拌15分鐘后，加入22mmol α，γ-叔丁基-L-天冬氨酸。反應(yīng)液在室溫反應(yīng)21小時，然后水提取。
純度在薄層色譜(TLC)上為單一色點，用MS和NMR鑒定。
產(chǎn)率64.7％。
(b)(雙-α，γ-天冬氨?；?(α，γ-叔丁基-天冬氨?；?-琥珀酰胺(化合物II)步驟1
在室溫將4.6mmol化合物I加入100mL三氟乙酸/二氯甲烷(1∶1，v/v)中，攪拌45分鐘。將反應(yīng)物在30℃真空蒸發(fā)至干。然后將其溶于100mL氯仿，再次真空蒸發(fā)至干，連續(xù)5次。
步驟2將步驟1的產(chǎn)品溶解在250mL THF∶DMF(1∶1，V/V)中，加入60mmol三乙胺和40mmol L-天冬氨酸-(α，γ-叔丁基)酯。向此溶液中加入60mmol TBTU。16小時后，另加入20mmol L-天冬氨酸-(α，γ-叔丁基)酯，使反應(yīng)持續(xù)過夜。
將反應(yīng)液溶于水中，經(jīng)過離子交換色譜法處理，在薄層色譜上產(chǎn)生一個單一的主要色點，用MS和NMR鑒定為預(yù)期化合物。產(chǎn)率90％。實施例3X-射線造影劑(a)碘化單體的合成(化合物I)
(b)可以將化合物I偶合到實施例1和2所述的任何一個ASPx簇上，以形成一個碘化的X-射線造影劑。
權(quán)利要求
1.一種化合物，它含有一個線性、分支的或樹枝狀聚合物骨架，在此骨架上至少連接一個報告因子部分，所述的聚合物骨架含有多個含胺的酸；條件是當(dāng)此聚合物骨架為線性時，至少一個報告因子部分含有一個碘化的造影劑、一個超聲造影劑、一個光類報告因子或一個除DOTA、DTPA基聚氨基羧酸外的金屬螯合物。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于其中所述的聚合物骨架含有多個天然或非天然氨基酸殘基。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于其中所述的聚合物骨架含有3-200個氨基酸殘基。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于其中所述的聚合物骨架含有一個樹枝狀體。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其特征在于其中所述的樹枝狀體含有3-200個從中心核部分徑向延伸的氨基酸殘基。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物，其特征在于其中所述的核部分選自H2NCOCH2CH2CONH2，和
其中m=0-4；每個Y獨立地代表氫或一個烷基或芳基；并且每個X獨立地代表一個-CO2H，-SO2Cl或-CH2Br基團，及其衍生物。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物，其特征在于其中所述的核部分含有一個報告因子部分。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物，其特征在于其中所述的核部分含有一個能夠到達或特異地與哺乳動物體內(nèi)的靶細(xì)胞、組織、器官或其它部位結(jié)合的靶向劑。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于其中所述的樹枝狀體為徑向不對稱形。
10.一種根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于其中所述的聚合物骨架的分子量為300-20,000道爾頓。
11.一種根據(jù)權(quán)利要求2-10中任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于其中所述的聚合物骨架含有一個由單一種類的或至少兩種不同種類的氨基酸構(gòu)成的聚合物，或一個嵌段共聚物。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求11所述的化合物，其特征在于其中所述的聚合物骨架是聚-1-天冬氨酸。
13.一種根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于其中含有3-200個報告因子部分。
14.一種根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于其中每個報告因子部分通過一個可生物降解的連接基團連接到所述的聚合物骨架上。
15.一種根據(jù)權(quán)利要求14所述的化合物，其特征在于其中所述的連接基團選自酰胺、醚、硫醚、胍基、醛縮醇、酮縮醇和磷酸酯基團。
16.一種根據(jù)權(quán)利要求14所述的化合物，其特征在于其中所述的連接基團含有一個酰胺鍵，其中的酰胺氮源于骨架分子，并且酰胺羰基源于報告基團上的一個羧基或羧基衍生物。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于具有下式
其中n是一個1-100的整數(shù)；R代表一個報告因子部分，可選地通過一個可生物降解的連接基團連接到聚合物骨架上。
18.一種根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于其中至少一個報告因子部分含有一種診斷或治療劑。
19.一種根據(jù)權(quán)利要求18所述的化合物，其特征在于其中所述的診斷或治療劑含有螯合劑殘基或其金屬螯合物。
20.一種根據(jù)權(quán)利要求19所述的化合物，其特征在于其中所述的螯合劑是一種含有至少一個順磁性的金屬離子的造影劑。
21.一種根據(jù)權(quán)利要求20所述的化合物，其特征在于其中所述的金屬離子選自鑭系金屬離子、Mg、Ca、Sc、Ti、B、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Sr、Y、Zr、Tc、Ru、In、Hf、W、Re、Os、Pb和Bi。
22.一種根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的化合物，其特征在于其中所述的螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷四乙酸(DOTA)、1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸(DO3A)、1-氧雜-4，7，10-三氮雜環(huán)十二烷三乙酸(DOXA)、1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷三乙酸(NOTA)和1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷四乙酸(TETA)。
23.一種根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的化合物，其特征在于其中所述的螯合劑選自4’-(3-氨基-4-甲氧基-苯基)-6，6”-雙(N’，N’-二羧甲基-N-甲肼基)-2，2’6’，2”-三聯(lián)吡啶(THT)和4’-(3-氨基-4-甲氧基-苯基)-6，6”-雙(N’，N’-二羧甲基氨甲基)-2，2’6’，2”-三聯(lián)吡啶(TMT)。
24.一種根據(jù)權(quán)利要求18所述的化合物，其特征在于其中所述的診斷或治療劑含有一個離子或非離子碘化的單環(huán)或雙環(huán)X-射線造影劑。
25.一種根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于它與一個能夠到達或特異地與哺乳動物體內(nèi)的靶細(xì)胞、組織、器官或其它部位結(jié)合的靶向劑連接。
26.一種根據(jù)權(quán)利要求8或權(quán)利要求25所述的化合物，其特征在于其中所述的靶向劑含有大腸桿菌熱穩(wěn)定的腸毒素STa或其類似物。
27.一種樹枝狀聚合物，其特征在于含有多個從中心核部分徑向延伸的天然或非天然氨基酸殘基。
28.一種根據(jù)權(quán)利要求27所述的化合物，其特征在于其中所述的中心核部分如權(quán)利要求6-8中的任一權(quán)利要求所定義。
29.一種制備權(quán)利要求1-26中任一權(quán)利要求所述化合物的方法，其特征在于此方法包括將至少一個報告因子部分與一個含有多個氨基酸殘基的線性、分支或樹枝狀聚合物骨架共軛。
30.一種制備權(quán)利要求1-26中任一權(quán)利要求所述化合物的方法，其特征在于此方法包括使此化合物的部分或全部被保護的衍生物解除保護的步驟。
31.一種制備化合物的方法，此化合物含有一個連接有至少一個報告因子部分的線性、分支或樹枝狀聚合物的骨架，所述聚合物骨架含有多個氨基酸殘基，此方法包括(a)將一系列被保護的氨基酸殘基按氨基至羧基的方向分步連接以形成一個聚合物骨架；(b)將聚合物骨架可選地通過一個連接基團連接到一或多個報告因子部分上，并(c)解除所有受保護基團的保護。
32.一種藥物組合物，其特征在于含有權(quán)利要求1-26中任一權(quán)利要求所述的化合物，及至少一種藥物載體或賦形劑。
33.根據(jù)權(quán)利要求1-26中任一權(quán)利要求所述的化合物在制備一種圖像增強造影劑或一種治療性組合物中的用途。
34.一種生成人類或非人類動物身體圖像的方法，所述方法包括以下步驟用一種權(quán)利要求1-26中任一權(quán)利要求所述的化合物給所述的身體用藥，此后對身體的至少一部分生成一個圖像。
全文摘要
本發(fā)明提供一種化合物,它含有線性的、分支的或樹枝狀聚合物骨架,在此骨架上至少連接一個報告因子部分,所述的聚合物骨架含有多個含胺的酸。可以將此化合物連接到一或多個靶向劑上,并作為有效的治療劑和診斷劑,尤其在醫(yī)學(xué)成像技術(shù)中作為治療劑和診斷劑。
文檔編號C07K14/00GK1246059SQ98802158
公開日2000年3月1日 申請日期1998年1月29日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月29日
發(fā)明者H·沃爾夫, K·克拉 申請人:奈科姆成像有限公司