專利名稱：氨基環(huán)戊烷衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型結(jié)構(gòu)的氨基環(huán)戊烷衍生物及合成該衍生物的中間體。更具體地說，涉及糖苷酶抑制劑。
最近的研究已經(jīng)闡明了在細(xì)胞表面層的糖鏈的生物功能。結(jié)果，構(gòu)成(Construct)或分解這些糖鏈的酶抑制劑已經(jīng)引起了公眾的注意并且化學(xué)家們已經(jīng)對其合成進(jìn)行了廣泛的研究。此外，近年來，開發(fā)對于各種糖苷酶有特效的抑制劑已經(jīng)成為關(guān)注的焦點。例如，人們試圖開發(fā)一種不抑制麥芽糖酶但抑制蔗糖酶的化合物，盡管這些酶均是α-葡糖苷水解酶，或一種不抑制源于動物的酶但抑制源于昆蟲的另一種酶的化合物。在現(xiàn)階段通常使用的達(dá)到這些目的的方法包括按照在自然條件下被目標(biāo)酶實際水解的糖鏈之后仿制抑制劑的結(jié)構(gòu)。這樣將所謂的糖化物類似物用于具有簡單結(jié)構(gòu)用作先導(dǎo)(1ead)化合物的苷水解酶抑制劑。這些糖化物類似物被分類成碳糖化物(Carbasaccharide)，氮雜糖化物，硫雜糖化物，磷雜糖化物，等等。
觀察到某些這樣設(shè)計和合成的低聚糖鏈化合物似乎顯示出對目標(biāo)酶無抑制活性但對其他酶有抑制活性。因此，考慮到開發(fā)特定的抑制劑，至今為止的已知先導(dǎo)化合物有各種問題。為了解決這些問題，已經(jīng)合成和篩選了很多新型的先導(dǎo)化合物。C-H.Wong等人現(xiàn)在正在將其研究范圍從氮雜吡喃糖[G.C.Lock，C.H.Fotsh and C-H.Wong，Acc.Chem.Res.，26，182-190(1993)]擴(kuò)展到氮雜呋喃糖[Y-F.Wang，Y.Takaoka and C-H.Wong，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，33，1242-1244(1994)]。最近已經(jīng)有了脒骨架抑制糖苷的報導(dǎo)。這樣已經(jīng)進(jìn)行了將氮雜糖化物通過該脒骨架引入低聚糖的償試[a)G.Papandreou，M.K.Tong and B.Ganem，J.Amer.Chem.Soc.，11511682-11690(1993)；b)Y.Bleriot，A.Genre-Grandpierre and C.Tellier，Tetrahedron Lett.，35，1867-1870(1994)]。
另一方面，α-葡糖苷水解酶包括α-葡糖苷酶I和II，它們對含于細(xì)胞中除了淀粉酶，麥芽糖酶，異麥芽糖酶，蔗糖酶和海藻糖酶以外的糖蛋白的生物合成過程起作用。最近，人們已經(jīng)努力地試圖將這些酶的抑制劑用于藥物和農(nóng)業(yè)化學(xué)品并且現(xiàn)在在實用上可從市場上購得某些抑制劑。例如，acarbose，它是α-淀粉酶和蔗糖酶的抑制劑，其作為抗糖尿試劑或抗肥胖試劑出售(商品名Glucobay，Bayer生產(chǎn))，而有效霉素，它抑制海藻糖酶，其作為抵抗條紋病(Stripe)的農(nóng)業(yè)化學(xué)品出售(商品名Validacin，Takeda ChemicalIndustries，Ltd.生產(chǎn))并預(yù)計作為殺蟲劑是有效的。此外，在美國，脫氧野尻霉素衍生物作為藥物(抗病毒試劑)進(jìn)行臨床試驗。再有，正在進(jìn)行的研究利用抑制劑作為工具弄清楚酶的未知功能。最近，還有報導(dǎo)說脫氧野尻霉素(DNJ)對愛滋病有效。也就是說，葡糖苷酶抑制劑已經(jīng)成為人們關(guān)注的焦點，同時人們迫切需要開發(fā)適用于藥物和農(nóng)業(yè)化學(xué)品的新型結(jié)構(gòu)的酶抑制劑。
本發(fā)明的目的是提供氨基環(huán)戊烷衍生物，它是具有新型結(jié)構(gòu)有極高α-葡糖苷酶抑制作用的糖化物類似物并可望能用或適用于藥物或農(nóng)業(yè)化學(xué)品。本發(fā)明提供(1)用式(1)表示的氨基環(huán)戊烷衍生物 其中R1表示H而R2表示CH2OH，或R1表示CH2OH而R2表示H；和R3表示取代的或未取代的芳基基團(tuán)或有1到10個碳原子的烷基、鏈烯基、炔基或羥烷基基團(tuán)。
(2)如上述(1)中所述的氨基環(huán)戊烷衍生物，其中在用式(1)表示的氨基環(huán)戊烷衍生物中，R3表示取代或未取代的芳基。
(3)如上述(2)中所述的氨基環(huán)戊烷衍生物，其中用式(1)表示的氨基環(huán)戊烷衍生物選自由下面結(jié)構(gòu)式(1-1L)表示的(1S，5R，6S，7S，8R)-6-羥甲基-3-苯氨基-2-噁-4-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛-3-烯-6，7，8-三醇，由下面結(jié)構(gòu)式(1-1D)表示的(1R，5S，6R，7R，8S)-6-羥甲基-3-苯氨基-2-噁-4-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛-3-烯6，7，8-三醇，由下面結(jié)構(gòu)式(1-2L)表示的(1S，5R，6S，7R，8S)-1-羥甲基-3-苯氨基-2-噁-4-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛-3-烯-6，7，8-三醇和由下面結(jié)構(gòu)式(1-2D)表示的(1R，5S，6R，7S，8R)-1-羥甲基-3-苯氨基-2-噁-4-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛-3-烯-6，7，8-三醇
(4)如上面(1)所述的氨基環(huán)戊烷衍生物，其中在由式(1)表示的氨基環(huán)戊烷衍生物中，R3表示1-10個碳原子的烷基。
(5)如上面(4)中所述的氨基環(huán)戊烷衍生物，其中由式(1)表示的氨基環(huán)戊烷衍生物選自由下面結(jié)構(gòu)式(2-1L)表示的(1S，5R，6S，7S，8R)-6-羥甲基-3-丁氨基-2-噁-4-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛-3-烯-6，7，8-三醇，由下面結(jié)構(gòu)式(2-1D)表的(1R，5S，6R，7R，8S)-6-羥甲基-3-丁氨基-2-噁-4-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛-3-烯-6，7，8-三醇，由下面結(jié)構(gòu)式(2-2L)表示的(1S，5R，6S，7R，8S)-1-羥甲基-3-丁氨基-2-惡-4-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛-3-烯-6，7，8-三醇和由下面結(jié)構(gòu)式(2-2D)表示的(1R，5S，6R，7S，8R)-1-羥甲基-3-丁氨基-2-惡-4-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛-3-烯-6，7，8-三醇 (6)(3S，4R，5S，6R，7S)-7-乙酰胺-4，5，6-三-O-乙酰基-1-噁螺[2.4]庚烷-4，5，6-三醇，它是由下面結(jié)構(gòu)式表示的化合物 (7)由式(2)表示的氨基環(huán)戊烷衍生物 其中R4和R5各自獨立地表示H或取代的或未取代的芳基或有1-10個碳原子的烷基，鏈烯基，炔基或羥烷基。
(8)如上面(7)中所述的氨基環(huán)戊烷衍生物，其中由式(2)表示的氨基環(huán)戊烷衍生物選自由下面結(jié)構(gòu)式(d)表示的1L-(1，2，4，5/3)-5-氨基-1C-羥甲基-1，2，3，4-環(huán)戊烷-四醇，由下面結(jié)構(gòu)式(d-1)表示的1L-(1，2，4，5/3)-5-二丁氨基-1-羥甲基-1，2，3，4-環(huán)戊烷四醇和由下面結(jié)構(gòu)式(d-2)表示的1L-(1，2，4，5/3)-5-丁氨基-1-羥甲基-1，2，3，4-環(huán)戊烷四醇 (9)1D-(1，2，4，5/3)-5-氨基-1C-羥甲基-1，2，3，4-環(huán)戊烷四醇，它是由下面結(jié)構(gòu)式表示的化合物 (10)N-[2-羥甲基-2，3，4，5-四羥基環(huán)戊基]-N′-苯基硫脲，它是由下面結(jié)構(gòu)式表示的化合物
(11)一種含有如上面(1)或(7)所述的氨基環(huán)戊烷衍生物作為活性組份的糖苷酶抑制劑。
(12)如上面(11)所述的糖苷酶抑制劑，其中所述的糖苷酶抑制劑是α-葡糖苷酶抑制劑。
(13)如上面(12)所述的糖苷酶抑制劑，其中所述的活性組份是如上面(2)，(4)或(8)所述的氨基環(huán)戊烷衍生物。
(14)如上面(13)所述的糖苷酶抑制劑，其中所述的活性組份是如上面(3)或(5)所述的氨基環(huán)戊烷衍生物。
(15)一種制備如上面(6)所述化合物的方法，包括在溶液中氧化由下面結(jié)構(gòu)式表示的化合物 (16)一種制備如上面(1)所述氨基環(huán)戊烷衍生物的方法，包括將由式(3)表示的硫脲化合物轉(zhuǎn)變成環(huán)異脲 其中R1，R2和R3與上面(1)中所述的定義一樣。


圖1是表明對通過用HIV感染的PHA活化的PBMC產(chǎn)生HIV的抑制作用的圖。
圖2是表明對通過將HIV感染的Molt-4/C18細(xì)胞與Molt-4/IIIB細(xì)胞共培養(yǎng)引起的細(xì)胞融合(形成巨細(xì)胞)的抑制作用的圖。
下面將詳細(xì)描述本發(fā)明。
考慮到由式(1)[下文中簡稱為化合物(1)]表示的本發(fā)明氨基環(huán)戊烷衍生物有如下面式子所示的互變體。因此，在式(1)的結(jié)構(gòu)式中的虛線代表這些互變體。此外，化合物(1)包括其同樣的任意立體異構(gòu)體。 還要考慮在化合物(1)中羥基和羥甲基的指向，它有含有環(huán)異脲鍵的雙環(huán)部分，是一個極重要的因素并且極大地影響到該化合物的酶抑制活性。假定在化合物(1)結(jié)構(gòu)中有兩個氮原子的異脲部分是弱堿性的并且當(dāng)化合物(1)與酶形成絡(luò)合物時強(qiáng)鍵合到活性中心上。這樣特定地抑制酶的活性可以增強(qiáng)到前所未有的水平。脲在式(1)中，R3表示取代的或未取代的芳基或有1-10個碳原子，優(yōu)選3-8個碳原子的烷基，鏈烯基，炔基或羥烷基，優(yōu)選的R3是苯基，或丁基。芳基基團(tuán)的取代基例子包括1-6個碳原子的烷基，鏈烯基和炔基，鹵原子和羥基，硝基和羧基。
本發(fā)明化合物(1)的優(yōu)選例子包括如下所示的化合物(1-1)，(1-2)，(2-1)和(2-2)。 化合物(1-1)和(1-2)彼此是結(jié)構(gòu)異構(gòu)的，而化合物(2-1)和(2-2)也是彼此結(jié)構(gòu)異構(gòu)的。如上面(3)所述，化合物(1-1)包括由結(jié)構(gòu)式(1-1L)和(1-1D)表示的對映體。類似地，化合物(1-2)如在上面(3)所述包括由結(jié)構(gòu)式(1-2L)和(1-2D)表示的對映體。此外，化合物(1-1)和(1-2)包括在6-，7-和8-位上由羥基產(chǎn)生的任意的非對映體。如上面(5)所述，化合物(2-1)包括由結(jié)構(gòu)式(2-1L)和(2-1D)表示的對映體。類似地，如上面(5)所述，化合物(2-2)包括由結(jié)構(gòu)式(2-2L)和(2-2D)表示的對映體。此外，化合物(2-1)和(2-2)包括在6-，7-和8-位上由羥基產(chǎn)生的任意的非對映體。
化合物(1-1)和(1-2)有抑制葡糖苷酶的活性。特別地，它們顯示出極高的抑制α-葡糖苷酶的活性。它們還有抗HIV活性。類似地，化合物(2-1)和(2-2)有抑制葡糖苷酶的活性。特別地，它們顯示出極高的抑制α-葡糖苷酶的活性。它們也有抗HIV活性。
本發(fā)明的化合物(1-1L)和(1-2L)可以根據(jù)下面反應(yīng)圖解1合成。
路線1
將鏈烯化合物(即化合物(a))(用在C.Uchida，T.Yamagishiand S.Ogawa，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，1994，589-602中所述的方法合成)溶解在有機(jī)溶劑(優(yōu)選1，2-二氯乙烷)而不是酮中，同時在存在含水緩沖溶液中維持pH在中性，在0℃至約反應(yīng)混合物沸點溫度(在回流條件下)加入相當(dāng)于鏈烯化合物1-10當(dāng)量的氧化試劑例如過酸(例如間-氯代過苯甲酸，過苯甲酸，單過氧鄰苯二甲酸，三氟過乙酸，過甲酸)或過氧化物(例如二環(huán)氧乙烷)。另一方面，在0℃至約反應(yīng)混合物沸點溫度(在回流條件下)向其加入能夠生成氫過氧化物的金屬催化劑[例如，五氧化二釩(V2O5)/叔丁基氫過氧化物(tBuOOH)，鎢酸鈉(Na2WO4)/過氧化氫(H2O2)，五氧化鉬(MoO5)·六甲基磷酰胺(HMPA)/tBuOOH)。然后得到的混合物在黑暗中攪拌0.5-120小時從而氧化起始化合物(a)。反應(yīng)體系用非醇有機(jī)溶劑(氯仿，乙酸乙酯等)稀釋并用含水溶劑(硫代硫酸鈉的飽和水溶液，碳酸氫鈉的飽和水溶液，等等)洗滌從而得到化合物(b)[(3S，4R，5S，6R，7S)-7-乙酰胺-4，5，6-三-O-乙?；?1-噁螺[2.4]庚烷-4，5，6-三醇]。得到的產(chǎn)物可以進(jìn)一步用色譜等純化。Ac表示乙?；?。
將化合物(b)溶于有機(jī)溶劑的水溶液，例如N，N-二甲基甲酰胺(DMF)水溶液，二甲基亞砜(DMSO)水溶液或2-甲氧基乙醇水溶液中，接著向其加入乙酸鈉，苯甲酸鈉等。在室溫至150℃溫度下攪拌1-48小時之后，反應(yīng)混合物在減壓下濃縮。然后，得到的殘余物用堿，例如吡啶，4-二甲基氨基吡啶，二甲基吡啶或三乙基胺，和乙酸酐，乙酰氯等乙?；Ｓ蒙V等純化后，得到漿狀化合物(c)[1L-(1，2，4，5/3)-5-乙酰氨基-1-乙酸基甲基-2，3，4-三-O-乙?；?1，2，3，4-環(huán)戊烷四醇]。
化合物(c)通過溶解在0.5-6M鹽酸或硫酸脫乙酰基并在室溫至100℃溫度下攪拌0.5-5小時。在減壓條件下濃縮后，得到的殘余物用陽離子交換樹脂[例如，Dowex 50W-X2，X4，X8(商品名)，Amberlite IR-120B，CG50(商品名)]等純化，從而得到漿狀化合物(d)[表海藻糖胺＝1L-(1，2，4，5/3)-5-氨基-1C-羥甲基-1，2，3，4-環(huán)戊烷-四醇]。
另一方面，在化合物(d)的合成路線中，化合物(a)也可以用氧化鋨(VIII)(OsO4)在丙酮水溶液中，其用量為相當(dāng)于化合物(a)的1-5當(dāng)量，或0.05-1當(dāng)量的OsO4和1-5當(dāng)量的氧化劑例如N-甲基嗎啉-N-氧化物，羥基化1-72小時，然后乙?；又霉枘z色譜分離化合物(c)的非對映體從而不形成化合物(b)而得到作為中間體的化合物(c)(J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，1994，589-602)。
將化合物(d)溶解在醇等的水溶液中。然后向其加入相當(dāng)于化合物(d)1-5當(dāng)量的異硫氰酸苯酯并將得到的混合物在0-80℃攪拌1-72小時。在減壓條件下濃縮反應(yīng)混合物后，所得的殘余物通常用分配柱色譜純化從而得到苯基硫脲化合物，即白色固體的化合物(e)[N-[(1R)，(1，2，4，5/4)-2-羥甲基-2，3，4，5-四羥基環(huán)戊基]-N′-苯基硫脲]。
將化合物(e)溶解在酮或醇溶劑中。然后向其加入相當(dāng)于化合物(e)1-10當(dāng)量的催化劑[汞氧化物(黃色或紅色)，氧化鉛，烷基碘，三乙基鋨四氟硼酸鹽，三氟酸甲酯(methyl triflate)，次氯酸鈉與氫氧化鈉的混合物，三苯基膦與偶氮二羧酸二乙酯混合物，等等]，并將該混合物在0℃至該反應(yīng)混合物的沸點(在回流條件下)溫度下攪拌1-72小時，從而得到環(huán)異脲化合物。反應(yīng)體系通過硅藻土等過濾并用甲醇等洗滌。將濾液與洗滌液合并在一起并在減壓條件下濃縮。將由此得到的殘余物用薄層色譜等處理，從而將異構(gòu)體彼此粗分開來。首先得到上述粗6-羥甲基異脲，即粗化合物(1-1L)。該粗產(chǎn)物用如上所述的陽離子交換樹脂純化從而得到白色固體的化合物(1-1L)。
接下來，從上述薄層色譜得到粗1-羥甲基異脲，即粗化合物(1-2L)并用上述陽離子交換樹脂純化從而得到白色固體的化合物(1-2L)。
為了合成化合物(1-1D)和(1-2D)，重復(fù)上述過程但用下面立體異構(gòu)體(ad)(用J.Chem，Soc.Perkin Trans.1，1992，1939-1942所述的方法合成)替代化合物(a)。這樣用路線1和2的方法能夠分別得到化合物(1-1D)和(1-2D)。
路線2
在路線1和2中，具有苯基作為式(1)中R3的化合物(e)或(ed)是通過用異硫氰酸苯酯處理化合物(d)或(dd)合成的。用同樣的方法，具有不同R3的硫脲化合物可以通過使用異硫氰酸苯酯的苯基基團(tuán)已經(jīng)被所希望的取代基(R3)取代了的異氰酸酯衍生物得到。然后用與上述同樣的方法將該硫脲化合物轉(zhuǎn)變成環(huán)異脲并純化。這樣可以得到本發(fā)明所需要的氨基環(huán)戊烷衍生物。換言之，通過重復(fù)上述方法但用異硫氰酸丁酯替代異硫氰酸苯酯可以得到化合物(2-1L)，(2-2L)，(2-1D)和(2-2D)。
在用式(2)[下文中簡稱為化合物(2)]表示的本發(fā)明的氨基環(huán)戊烷衍生物中，R4和R5各自獨立地表示H或取代的或未取代的芳基或有1-10個碳原子的烷基，鏈烯基，炔基，羥烷基。芳基的取代基的例子包括具有1-6個碳原子的烷基，鏈烯基和炔基，鹵原子和羥基，硝基和羧基。
本發(fā)明化合物(2)的優(yōu)選例子包括化合物(d)，(d-1)和(d-2)。
本發(fā)明的化合物(d-1)和(d-2)可以合成如下。將化合物(d)溶解在醇的水溶液中，如果需要，也可以加入分子篩等，接著在4-40℃攪拌混合物0.5-5小時，然后加入相當(dāng)于化合物(d)的1-10當(dāng)量，優(yōu)選1當(dāng)量的丁醛。在0℃至約反應(yīng)混合物沸點(在回流條件下)溫度攪拌0.5-5小時之后，加入相當(dāng)于化合物(d)的1-10當(dāng)量的還原試劑，例如氰基硼氫化鈉，該混合物在0℃至約該反應(yīng)混合物的沸點(回流條件下)溫度攪拌1-72小時。該反應(yīng)體系通過硅藻土等過濾并用甲醇等洗滌。將濾液與洗滌液體合并在減壓條件下濃縮。將如此得到的殘余物用薄層色譜等處理。這樣首先得到粗化合物(d-1)。這一粗產(chǎn)物用如上所述的陽離子交換樹脂純化從而得到化合物(d-1)。
接下來，從上述薄層色譜得到粗化合物(d-2)并用如上所述的陽離子交換樹脂純化從而得到化合物(d-2)。
通過將化合物(d)與丁醛反應(yīng)，制備式(2)中R4和/或R5是丁基的化合物。類似地，通過使用丁醛的丁基基團(tuán)被所需要的取代基取代的醛衍生物可以得到本發(fā)明所需要的氨基環(huán)戊烷衍生物。
預(yù)計本發(fā)明的氨基環(huán)戊烷衍生物，尤其是化合物(1-1)，(1-2)，(2-1)和(2-2)，它們是具有類似于DJN的內(nèi)氮和類似于mannostatin的外氮的新型化合物，可用于新型藥物和農(nóng)業(yè)化學(xué)品。還預(yù)計從本發(fā)明的新型化合物能夠合成各種類似物從而得到改進(jìn)了特性的衍生物。
因此，本發(fā)明的化合物能夠有助于對看上去影響涉及葡糖苷酶抑制活性的各種生化相互反應(yīng)體系的研究。因此這些化合物適用于開發(fā)新型藥物，例如，抗病毒試劑，如抗HIV試劑，對涉及糖化物和脂新陳代謝的疾病(例如，肥胖和糖尿病)的治療，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的藥物例如免疫輔藥，癌轉(zhuǎn)移抑制劑，抗條紋病(由稻紋枯病，棉立枯病等引起)的農(nóng)業(yè)化學(xué)品，抗菌劑和殺蟲劑。此外，由于具有抗HIV活性，本發(fā)明的化合物作為抗HIV試劑是有效的。
為了更詳細(xì)地而不是以限制的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，將給出下面實施例。
用于下面實施例中的步驟，測定方法和樣品如下。
合成1)薄層色譜(TLC)將用于色譜的硅膠(Kieselgel60GF 254，Merck& Co.Inc.生產(chǎn))涂敷在玻璃板上并在70℃活化30分鐘。通過將濃硫酸噴在該板上接著加熱誘發(fā)著色。在噴濃硫酸之前用紫外燈(254nm，由Hirai Rika Kenkyusho制造)進(jìn)行紫外吸收測定。
2)旋光率([α]D)使用數(shù)字旋光儀(DIP-370，由Nippon Bunko-sha制造)。使用石英池(10×10mm)用鈉的D射線進(jìn)行測量。
3)核磁共振譜(1H-NMR，13C-NMR)在1H-NMR測定中，使用NMR波譜儀(JNM-270FT，270MHz，由JEOLLtd制造)。重氯仿或重水用作溶劑，而四甲基硅烷(δ0.00)(在重氯仿情況下)或丙酮(δ2.08)(在重水情況下)用作內(nèi)標(biāo)。
在13C-NMR測定中，使用NMR波譜儀(JNM-400FT，由JEOL Ltd制造)。重甲醇用作溶劑而四甲基硅烷(δ0.00)用作內(nèi)標(biāo)。
4)紅外吸收光譜(IR)在粘合方法(純的)的情況下，將樣品粘接到KBr晶片上并使用紅外光譜儀(IR-810型，由Nippon Bunko-sha制造)測定。在壓片方法(KBr片)的情況下，使用Hitachi 225衍射光柵BIO-RAD DIGITALFTS-65富里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行測定。
5)質(zhì)譜分析在HR-FAB-MS中，使用JEOL JMS HX-110(由JEOL，Ltd.制造)。離子檢測模式是FAB正并用甘油(離子群[93＋(92)n]+)作為基質(zhì)。使用碘化銫(CsI)作為質(zhì)量校正樣品。
6)制備性薄怪色譜(PTLC)使用一平板作為制備性薄層色譜(Merck Art5744，由Merck&Co.，Inc.制造)。使用甲醇進(jìn)行洗脫。
7)硅膠柱色譜使用Wakogel C-300(200-300目，由Wako Pure ChemicalIndestries，Ltd.生產(chǎn))。
8)減壓濃縮減壓條件下的濃縮是在約40℃溫度下使用旋轉(zhuǎn)式汽化器用一吸氣器在減壓條件下進(jìn)行的。
9)反應(yīng)溶劑在反應(yīng)中使用的每一溶劑都是未蒸餾的。
10)反應(yīng)試劑純度70％的mCPBA(間-氯代過苯甲酸)是從Tokyo Kasei購買的。
乙酸鈉是從Wako Pure Chemical Industries，Ltd.購買的。
異硫氰酸苯酯是從Tokyo Kasei購買的。
汞氧化物是從氫氧化鈉和氯化汞(II)制備的。
就這樣使用這些市售的試劑。
酶抑制測定1)吸光度使用96孔(Well)微板，用微板讀數(shù)器(MPR-4Ai，由TosohCorporation制造)測定釋放的對-或鄰-硝基苯酚的吸光度(在405nm)。
2)培育在37℃用自然培育箱(Compact NIB-10，由Iwaki Glass Co.Ltd.制造)進(jìn)行培育。
3)酶本文中所用的酶[α-葡糖苷酶(發(fā)面酵母)，β-葡糖苷酶(杏仁)，α-半乳糖苷酶(E.coli)，β-半乳糖苷酶(E.Coli)和β-半乳糖苷酶(牛肝)]均從Sigma購買。
4)酶作用物這些酶的酶作用物(對-或間-硝基苯基苷)均購自Sigma。
實施例1(3S，4R，5S，6R，7S)-7-乙酰胺-4，5，6-三-O-乙?；?1-噁螺[2.4]庚烷-4，5，6-三醇(化合物(b))的合成將化合物(a)(21.7mg，0.0725mol)溶解于1，2-二氯乙烷(2ml)中。在存在磷酸鹽緩沖溶液的條件下，在室溫下加入70％mCPBA(53.4mg，0.218mmol，3當(dāng)量)。在黑暗中攪拌26小進(jìn)后，反應(yīng)體系用氯仿(30ml)稀釋并接著用硫代硫酸鈉飽和水溶液(5ml)和碳酸氫鈉飽和水溶液(5ml)洗滌。有機(jī)層在芒硝上干燥并過濾。在減壓條件下濃縮濾液并將如此得到的殘余物用硅膠柱色譜(Wakogel C-300，1g，丙酮/甲苯＝1/2)純化。這樣得到漿狀的化合物(b)(19.8mg，收率86.5％)。
Rf 0.41(乙醇/甲苯＝1/5，雙展開)[α]27D-63.7°(C 0.96，氯仿)。
IR(純的)3360(OH和NH)，1740(OAc)和1670(NAc)cm-1。
1H-NMR(270MHz，CDCl3)δ5.59(1H，d，J7，NH9.2Hz，NH)，5.26(1H，dd，J4，5～1，J5，62.9Hz，5-H)，5.21-5.17(2H，m，4和6-H)，5.00(1H，dd，J6，75.1，J7，NH9.2Hz，7-H)，2.98和2.68(每個1H，ABq，Jgem4.8Hz，2×2-H)，2.14，2.12，2.09和2.00(每個3H，4s，4Ac)。
作為C14H19NO8的元素分析計算值(％)C51.06，H5.82，N4.25實驗值(％)C51.61，H5.82，N4.20實施例21L-(1，2，4，5/3)-5-氨基-1-羥甲基-1，2，3，4-環(huán)戊烷四醇(化合物(d)的合成將化合物(b)(19.8mg，0.0628mmol)溶于80％的DMF水溶液(1ml)中并加入乙酸鈉(30.9mg，0.377mmol，6當(dāng)量)。在120℃攪拌20小時后，將反應(yīng)混合物在減壓條件下濃縮。這樣得到的殘余物用吡啶(1ml)和乙酸酐(0.5ml)乙?；５玫降漠a(chǎn)物用硅膠柱色譜(Wakogel C-300 1g，丙酮/甲苯＝1/2)純化從而得到漿狀五乙酸酯(化合物(c))(16.0mg收率65.3％)。
化合物(c)的數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(C.Uchida，T.Yamagishi和S.Ogawa，J.Chem.Soc.，Perkin Trans，1，1994，589-602)中所述的一致。
將化合物(c)(42.5mg，0.109mmol)溶于2M鹽酸中。然后該溶液在80℃攪拌2小時并在減壓條件下濃縮。這樣得到的殘余物用Dowex50W-X2(H+，1ml，1M氨水)純化從而得到漿狀表海藻糖胺(化合物(d))(19.7mg，收率最高達(dá)100％)。
Rf0.38(水/乙腈＝1/4)。23D-3.8°(C0.98，水)。
IR(純的)3350(OH和NH2)cm-1。
1H-NMR(270MHz，D2O，基準(zhǔn)，丙酮)。
δ3.96(1H，dd，J2，38.1，J3，44.8Hz，3-H)，3.87(1H，dd，J3，44.8，J4，57.7Hz，4-H)，3.69(1H，d，J2，38.1Hz，2-H)，3.51(2H，s，2×6-H)，3.27(1H，d，J4，57.7Hz，5-H)實施例3N-[(1R)-(1，2，3，5/4)-2-羥甲基-2，3，4，5-四羥基環(huán)戊基]-N′-苯基硫脲(化合物(e))的合成將化合物(d)(15.3mg，0.0854mmol)溶于60％乙醇水溶液(1ml)中并加入異硫氰酸苯酯(23μl，0.171mmol，2.0當(dāng)量)。攪拌3小時后，反應(yīng)混合物在減壓下濃縮并且得到的殘余物用硅膠柱色譜(Wakogel C-300，2g，甲苯-乙醇/甲苯＝1/5)純化從而得到白色固體苯基硫脲化合物，即化合物(e)(23.6mg，收率88.1％)Rf0.41(乙醇/甲苯＝1/2)。22D＋43.9°(C 1.18，丙酮)。
IR(KBr片)3280(OH和NH)和1540(NH)cm-1。
1H-NMR(270MHz，D2O，基準(zhǔn)，丙酮)。
δ7.38-7.17(5H，m，Ph)，4.66(1H，m，1-H)，3.97(1H，dd，J1，58.1，J4，54.6Hz，5-H)，3.87(1H，dd，J3，48.4，J4，54.6Hz，4-H)，3.67(1H，d，J3，48.4Hz，3-H)，3.38和3.33(每個1H，ABq，Jgem12.1Hz，2×6-H)。
作為C13H18N2O5S的元素分析計算值(％)C 49.67，H5.77，N8.91實驗值(％)C 49.93，H6.17，N8.59
實施例4(1S，5R，6S，7S，8R)-6-羥甲基-3-苯基氨基-2-噁-4-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛-3-烯-6，7，8-三醇[化合物(1-1L)]和(1S，5R，6S，7R，8S)-1-羥甲基-3-苯氨基-2-噁-4-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛-3-烯-6，7，8-三醇[化合物(1-2L)]的合成將化合物(e)(23.6mg，0.075mmol)溶于丙酮/乙醇(1.5ml，V/V)中并加入汞氧化物(黃色)(55.2mg，0.256mmol，3當(dāng)量)。在室溫攪拌2小時后，反應(yīng)體系通過硅藻土過濾并用甲醇充分洗滌。將濾液與洗滌液體合并在減壓條件下濃縮。這樣得到的殘余物用PTLC(乙酸/乙醇/甲苯＝1/2/4，4次展開)分離。這樣首先得到粗6-羥甲基異脲[化合物(1-1L)]。然后用Dowex50W-X2(H+，1ml，14M氨水∶甲醇＝1/28)將其純化從而得到白色固體的化合物(1-1L)(9.2mg，收率43.8％)。
Rf0.22(乙醇/甲苯＝1/2)。28D＋50.1°(C0.15，甲醇)。
IR(KBr片)3430(OH和NH)，1660(C＝N)和1580(NH)cm-1。
1H-NMR(270MHz，D2O，基準(zhǔn)，丙酮)。
δ7.26-6.97(5H，m，Ph)，4.56(1H，dd，J1，59.5，J1，84.2Hz，1-H)，4.25(1H，d，J1，59.5Hz，5-H)，4.13(1H，dd，J1，84.2，J7，89.5Hz，8-H)，3.67(1H，d，J7，89.5Hz，7-H)，3.46(2H，s，2×9-H)。
作為C13H16N2O5的元素分析計算值(％)C 55.71，H5.75，N9.99實驗值(％)C 55.30，H5.81，N9.84其次，得到粗1-羥甲基異脲[化合物(1-2L)]并用Dowex50W-X2(H+，1ml，14M氨水50％甲醇水溶液＝1/28)純化從而得到白色固體的化合物(1-2L)(10.6mg，收率50.5％)。
Rf0.17(乙醇/甲苯＝1/2)。28D-27.5°(C0.26，甲醇)。
IR(KBr片)3420(OH和NH)，1670(C＝N)和1560(NH)cm-1。
1H-NMR(270MHz，D2O，基準(zhǔn)，丙酮)。
δ7.29-6.97(5H，m，Ph)，4.06(1H，d，J5，65.9Hz，5-H)，3.76和3.56(每個1H，ABq，Jgem12.5Hz，2X9-H)，3.72-3.61(3H，m，6.7和8-H)。
作為C13H16N2O5的元素分析計算值(％)C 55.71，H5.75，N9.99實驗值(％)C 55.25，H5.75，N10.01實施例5重復(fù)上面實施例1-4的方法步驟，根據(jù)路線2得到化合物(1-1D)和(1-2D)。
實施例6N-[(1R)-(1，2，3，5/4)-2-羥甲基-2，3，4，5-四羥基環(huán)戊基]-N′-丁基硫脲的合成根據(jù)Furukawa等人[Nippon Kagaku Kaishi(1989)，P.822-825]的方法采用下列方式制備異硫氰酸丁酯。將三苯基膦(31.47g，0.12mol)溶解于苯(20ml)和三乙胺(41.8ml，0.30mol)中并加入二硫化碳(7.3ml，0.12mol)。加入乙腈(150ml)后，將反應(yīng)體系冷至-15℃并加入丁胺(9.9ml，0.10mol)和四氯化碳(9.7ml，0.10mol)，接著攪拌。30分鐘后，將反應(yīng)體系加熱至0℃并攪拌1小時。然后將反應(yīng)混合物進(jìn)一步加熱至室溫并攪拌5小時。將反應(yīng)混合物過濾棄去不溶物質(zhì)。然后將濾液在減壓條件下濃縮至約50ml并用己烷(100ml×5)萃取。合并有機(jī)層并在芒硝上干燥。重復(fù)地過濾和減壓濃縮后，得到的液體殘余物通過減壓蒸餾純化。這樣得到液體的異硫氰酸丁酯(6.34g，收率55.0％)。
沸點75-76℃(31mmHg)[上面引用文獻(xiàn)報導(dǎo)的沸點為76-77℃(22mmHg)]。
將化合物(d)(表海藻糖胺)(21.4mg，0.119mmol)溶解于60％乙醇水溶液(1.5ml)中。然后加入從丁胺制備的上述異硫氰酸丁酯(44μl，0.358mmol，3當(dāng)量)并將所得混合物在室溫攪拌。3，5和19小時之后，加入同樣量(即總共4次，176ml，1.43mmol，12當(dāng)量)的異硫氰酸丁酯并攪拌混合物22小時。減壓濃縮反應(yīng)混合物并用硅膠柱色譜(Katayama60(商品名，由Katayama Chemical出售)8g，乙醇/甲苯＝1/3)純化所得的殘余物從而得到白色固體的丁基硫脲衍生物(35.2mg，收率最高達(dá)100％)。
Rf0.36(乙醇/甲苯＝1/2)。21D＋38.1°(C2.06，甲醇)。
IR(KBr片)3370(OH和NH)和1560(NH)cm-1。
1H-NMR(270MHz，D2O，基準(zhǔn)，丙酮)。
δ4.70-4.60(1H，m，1-H)，3.95-3.87(2H，m，4和5-H)，3.67(1H，d，J3，48.4Hz，3-H)3.40-3.25(2H，m，NCH2CH2CH2CH3)，3.37和3.30(每個1H，ABq，Jgem11.9Hz，2×6-H)，1.49-1.37(2H，m，NCH2CH2CH2CH3)，1.29-1.14(2H，m，NCH2CH2CH2CH3)，0.76(3H，t，J3′，4′7.3Hz，NCH2CH2CH2CH3)。
作為C11H22N2O5S的元素分析計算值(％)C 44.88，H7.53，N9.52實驗值(％)C 44.26，H7.94，N9.38實施例7(1S，5R，6S，7S，8R)-6-羥甲基-3-丁氨基-2-噁-4-氮雜雙環(huán)(3.3.0]辛-3-烯-6，7，8-三醇[化合物(2-1L)]和(1S，5R，6S，7R，8S)-1-羥甲基-3-丁氨基-2-噁-4-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛-3-烯-6，7，8-三醇[化合物(2-2L)]的合成。
將在實施例6中得到的丁基硫脲衍生物(35.2mg，0.119mmol)溶解于丙酮/乙醇(2ml，1/1，V/V)中并加入汞氧化物(77.0mg，0.357mmol，3當(dāng)量)。在室溫下攪拌所得混合物。6小時后，再加入同樣量(77mg)的汞氧化物繼續(xù)攪拌3小時。然后反應(yīng)體系通過硅藻土過濾并用甲醇徹底洗滌。將濾液與洗滌液體合并減壓濃縮。用硅膠柱色譜(Katayama60(商品名，由Katayama Chemical出售)，8g，乙酸/乙醇/甲苯＝1/2/4)分離所得的殘余物。這樣首先得到粗6-羥甲基異脲[化合物(2-1L)]并用Dowex50W-X2(H+，1ml，14M氨水∶甲醇＝1/28)純化從而得到白色固體的化合物(2-1L)(8.4mg，收率23.1％)。
RF0.14(乙酸/乙醇/甲苯＝1/2/4)。23D＋35.2°(c0.41，甲醇)。
IR(KBr片)3400(OH和NH)，1655(C＝N)和1555(NH)cm-1。
1H-NMR(270MHz，D2O，基準(zhǔn)，丙酮)δ4.45(1H，dd，J1，59.2，J1，84.4Hz，1-H)，4.18(1H，d，J1，59.2Hz，5-H)，4.02(1H，dd，J1，84.4J7，89.7Hz，8-H)，3.63(1H，d，J7，89.7Hz，7-H)，3.44和3.39(每個1H，ABq，Jgem11.7Hz，2×9-H)，3.01(2H，t，J1′，2′7.0Hz，NCH2CH2CH2CH3)，1.41-1.31(2H，m，NCH2CH2CH2CH3)，1.25-1.11(2H，m，NCH2CH2CH2CH3)，0.74(3H，t，J3′，4′7.3Hz，NCH2CH2CH2CH3)。
13C-NMR(100MHz，CD3OD，基準(zhǔn)TMS)δ164.89，87.34，82.24，78.57，77.19，67.78，64.23，43.47.，32.83，21.01，14.16。
作為C11H20N2O5的元素分析計算值(％)C50.76，H7.74，N10.76實驗值(％)C50.35，H8.09，N10.46其次，得到1-羥甲基異脲[化合物(2-2L)]并用Dowex50W-X2(H+，1ml，14M氨水∶50％甲醇水溶液＝1/28)純化從而得到白色固體的化合物(2-2L)(11.7mg，收率32.1％)。
Rf0.12(乙酸/乙醇/甲苯＝1/2/4)。23D＋16.7°(c0.58，甲醇)。
IR(KBr片)3400(OH和NH)，1660(C＝N)和1560(NH)cm-1。
1H-NMR(270MHz，D2O，基準(zhǔn)，丙酮)δ3.97(1H，d，J1，56.2Hz，5-H)，3.68和3.49(每個1H，ABq，Jgem12.5Hz，2×9-H)，3.64-3.54(3H，m，6，7和8-H)，3.02(2H，t，J1′，2′6.8Hz，NCH2CH2CH2CH3)，1.42-1.32(2H，m，NCH2CH2CH2CH3)，1.26-1.02(2H，m，NCH2CH2CH2CH3)，0.74(3H，t，J3′，4′7.1Hz，NCH2CH2CH2CH3)。
13C-NMR(100MHz，CD3OD，基準(zhǔn)，TMS)δ163.59，91.02，80.12，75.90，75.16，68.78，63.31，43.49，32.86，21.05，14.19。
作為C11H20N2O5的元素分析計算值(％)C50.76，H7.74，N10.76實驗值(％)C50.41，H8.16，N10.61實施例81L-(1，2，4，5/3)-5-二丁氨基-1-羥甲基-1，2，3，4-環(huán)戊烷四醇[化合物(d-1)]和1L-(1，2，4，5/3)-5-丁氨基-1-羥甲基-1，2，3，4-環(huán)戊烷四醇[化合物(d-2)]的合成將化合物(c)(表海藻糖胺五乙酸酯；51.8mg，0.1331mmol)溶解于2M鹽酸(2ml)中并在80℃攪拌2小時。冷至室溫后，反應(yīng)體系在減壓條件下濃縮從而得到殘余物表海藻糖胺氫氯化物。然后將該殘余物溶于甲醇(1.5ml)中并加入分子篩4A(50.0mg)。在室溫攪拌2小時后，加入丁醛(13.2μl，0.1464mmol，1.1當(dāng)量)并在室溫下再攪拌所得混合物1小時。接下來，加入氰基硼氫化鈉(26.4mg，0.3992mmol，3當(dāng)量)并在同樣溫度下攪拌混合物3小時。通過硅藻土過濾反應(yīng)體系并用甲醇充分洗滌。然后減壓濃縮濾液，并用硅膠柱色譜(WakogelC-300，2g，乙酸/甲醇/氯仿＝1/4/12)分離這樣得到的殘余物。這樣首先得到粗二丁基表海藻糖胺[化合物(d-1)]。該粗產(chǎn)物進(jìn)一步用Dowex 50W-X2(H+，1ml)吸附，用水充分洗滌并用14M氨水/甲醇(1∶13)洗脫從而得到漿狀化合物(d-1)(4.2mg，收率10.9％)。
Rf0.47(12M鹽酸/乙腈＝1/8)。23D-18.5°(c0.21，甲醇)。
IR(KBr片)3400(OH和NH)，1620(NH)cm-1。
1H-NMR(270MHz，D2O，基準(zhǔn)，丙酮)δ3.95(1H，dd，J3，44.4，J4，56.4Hz，4-H)，3.89(1H，dd，J2，36.0，J3，44.4Hz，3-H)，3.53(1H，d，J2，36.0Hz，2-H)，3.49和3.43(每個1H，ABq，Jgem11.7Hz，2X6-H)，3.06(1H，d，J4，56.4Hz，5-H)，2.83-2.65(4H，m，NCH2CH2CH2CH3)，1.42-1.28(4H，m，NCH2CH2CH2CH3)，1.22-1.08(4H，m，NCH2CH2CH2CH3)，0.76(6H，t，J3′，4′，7.1Hz，NCH2CH2CH2CH3)。
13C-NMR(100MHz，CD3OD，基準(zhǔn)，TMS)δ84.77，80.28，78.84，78.20，67.12，64.05，53.33，(2C)，31.70(2C)，21.58(2C)，14.50(2C)。
HR-FAB-MS[M+H]+實驗值292.2124計算值292.2124其次得到粗單丁基表海藻糖胺[化合物(d-2)]并用Dowex50W-X2(H+，1ml)以與二丁基化合物情況下使用的同樣方法純化從而得到漿狀的化合物(d-2)(4.6mg，收率14.7％)。
Rf0.43(12M鹽酸/乙腈＝1/8)。23D＋10.9(c0.23，甲醇)。
IR(KBr片)3350(OH和N)cm-1
1H-NMR(270MHz，D2O，基準(zhǔn)，丙酮)δ3.84(1H，dd，J3，44.8，J4，57.3Hz，4-H)，3.78(1H，dd，J2，37.7，J3，4，4.8Hz，3-H)，3.54(1H，d，J2，37，7Hz，2-H)，3.42和3.38(每個1H，ABq，Jgem12.3Hz，2×6-H)，2.94(1H，d，J4，57.3Hz，5-H)，2.59-2.41(2H，m，NCH2CH2CH2CH3)，1.39-1.26(2H，m，NCH2CH2CH2CH3)，1.23-1.12(2H，m，NCH2CH2CH2CH3)，0.75(3H，t，J3′，4′7.1Hz，NCH2CH2CH2CH3)。
13C-NMR(100MHz，CD3OD，基準(zhǔn)，TMS)δ83.25，77.93，76.85，74.27，55.76，60.75，53.29，33.32，21.40，14.32。
HR-FAB-MS[M＋H]+實驗值236.1492計算值236.1498實驗實施例1用上面實施例得到的化合物(d)，(d-1)，(d-2)，(1-1L)，(1-1D)，(1-2L)，(1-2D)和(2-2L)，脫氧野尻霉素(DNJ)，N-丁基脫氧野尻霉素(稱之為N-B-DNJ)和海藻糖胺作為試樣測定對下列酶的抑制活性。1)α-葡糖苷酶(發(fā)面酵母，EC3.2.1.20)[在H.Halvorson andL.Ellias，Biochim.Biophys.Acta.30，28-40，(1958)中有敘述]在每個孔(Well)中引入試樣的水溶液(1μl)，0.66mM對-硝基苯基α-D-吡喃葡糖苷在緩沖劑(98μl)中的溶液和(0.4mg/ml)在緩沖劑中的酶溶液(1μl)從而得到總體積100μl。在37℃培育30分鐘后，通過加入1M碳酸鈉水溶液(100μl)使反應(yīng)停止。然后測定由該酶反應(yīng)釋放的對-硝基苯酚的吸光度(A405)。為了得到空白吸光度(A空白)，試樣(1μl)和酶作用物(99μl)以同樣的方式培育并加入碳酸鈉水溶液(100μl)，接著測定吸光度。另一方面，為了得到對比吸光度(A對比)，水(1μl)，酶作用物(98μl)和酶溶液(1μl)以同樣的方式培育并加入碳酸鈉水溶液接著測定吸光度。同時在兩個各自的孔中處理每個濃度的試樣、空白和對比(試驗)。使用0.1M磷酸鹽緩沖溶液(pH6.8，從KH2PO4和K2HPO4制備)作為緩沖劑。
根據(jù)在連續(xù)稀釋的試樣濃度[即100，50，25，12.5，6.25，…(μg/μl)]下的吸光度確定酶活性的50％抑制濃度[IC50(M)]。2)β-葡糖苷酶(杏仁，EC3.2.1.21)[在A.Kobayashi，Agr.Biol.Chem.，26，203-207(1962)中有描述]將試樣水溶液(1μl)，0.33mM對-硝基苯基β-D-吡喃葡糖苷在緩沖劑中的溶液(98μl)和(0.4mg/ml)酶在緩沖劑中的溶液(1μl)引入每個孔中得到總體積100μl。在37℃培育45分鐘后，加入1M碳酸鈉水溶液(100μl)中止反應(yīng)。然后測定由該酶反應(yīng)釋放的對-硝基苯酚的吸光度(A405)。為了得到空白吸光度(A空白)，該試樣(1μl)和該酶作用物(99μl)以同樣方式培育并加入碳酸鈉水溶液(100μl)接著測定吸光度。另一方面，為了得到對比吸光度(A對比)，水(1μl)，該酶作用物(98μl)和該酶溶液(1μl)以同樣方式培育并加入碳酸鈉水溶液(100μl)接著測定吸光度。使用0.1M乙酸緩沖溶液(pH5.0，由NaOAc和AcOH制備)作為緩沖劑。以與α-葡糖苷酶的情況下用的同樣方法確定IC50。3)α-半乳糖苷酶(E.Coli.，EC.3.2.1.22)[在H.Suzuki，S-C.Liand Y-T.Li，J.Biol.Chem.，245，781-786(1970)中有描述]在每一個孔中引入試樣水溶液(1μl)，緩沖劑(74μl)，9.9mM對-硝基苯基α-D-吡喃半乳糖苷酶在緩沖劑中的溶液(20μl)和(50μg/ml)酶在緩沖劑中的溶液(5μl)得到總體積100μl。在室溫(20-30℃)培育所得混合物15分鐘后，加入0.2M硼酸鹽緩沖劑(pH9.8，由NaOH和H3BO3制備，100μl)中止反應(yīng)。然后測定由該酶反應(yīng)釋放的對-硝基苯酚的吸光度(A405)。該試樣(1μl)，該酶作用物(20μl)和該緩沖溶液(79μl)以同樣的方式被培育并加0.2M硼酸鹽緩沖溶液(100μl)接著測定吸光度得到空白吸光度(A空白)。另一方面，以同樣的方式培育水(1μl)，該酶作用物(20μl)，該緩沖溶液(74μl)和該酶溶液(5μl)并加入該硼酸鹽緩沖溶液(100μl)接著測定吸光度得到對比吸光度(A對比)。使用0.1M磷酸鹽緩沖溶液(pH6.5，由KH2PO4和K2HPO4制備)作為酶反應(yīng)緩沖劑。以與在α-葡糖苷酶情況下所用的同樣方式確定IC50。4)β-半乳糖苷酶(E.Coli，EC.3.2.1.23][在G.R.Graven，E.Steers，Jr.and C.B.Anfinsen，J.Biol.Chem.，240，2468-2477(1965)中有描述]在每個孔中引入試樣水溶液(2μl)，緩沖劑(153μl)，20mM鄰-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷在緩沖劑中的溶液(25μl)，100mM 2-巰基乙醇(10μl)和(10μg/ml)酶在緩沖劑中的溶液(10μl)得到總體積200μl。在室溫(20-30℃)下培育30分鐘后，測定該酶反應(yīng)釋放的鄰-硝基苯酚的吸光度(A405)。以同樣的方式培育該試樣(2μl)，該酶作用物(25μl)，該緩沖溶液(163μl)和2-巰基乙醇(10μl)，接著測定吸光度得到空白吸光度(A空白)。另一方面，以同樣的方式培育水(2μl)，該酶作用物(25μl)，該緩沖溶液(153μl)，2-巰基乙醇(10μl)和該酶溶液(10μl)接著測定吸光度得到對比吸光度(A對比)。使用50mM磷酸鹽緩沖溶液(pH7.3，由KH2PO4和K2HPO4制備，含1.3mM MgCl2)作為酶反應(yīng)緩沖劑。以與在α-葡糖苷酶情況下所用的同樣方式確定IC50。5)β-半乳糖苷酶(牛肝，EC3.2.1.23)[在T.Aoyagi，T.Hazato，M.Kumagai，M.Hamada，T.Takeuchi and H.Umezawa，J.Antibiot.，28，1006-1008(1975)中有描述]在每個孔中引入試樣水溶液(2μl)，緩沖劑(158μl)，20mM鄰-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷在緩沖劑中的溶液(25μl)，100mM 2-巰基乙醇(10μl)和(5mg/ml)酶在緩沖劑中的溶液(5μl)得到總體積200μl。在室溫(20-30℃)培育30分鐘后，測定該酶反應(yīng)釋放的鄰-硝基苯酚的吸光度(A405)。以同樣的方式培育該試樣(2μl)，該酶作用物(25μl)，該緩沖溶液(163μl)和2-巰基乙醇(10μl)，接著測定吸光度得到空白吸光度(A空白)。另一方面，以同樣方式培育水(2μl)，該酶作用物(25μl)，該緩沖溶液(158μl)，2-巰基乙醇(10μl)和該酶溶液(5μl)接著測定吸光度得到對比吸光度(A對比)。50mM磷酸鹽緩沖溶液(pH7.3，由KH2PO4和K2HPO4制備，含有1.3mM MgCl2)用作該酶反應(yīng)的緩沖劑。以與α-萄糖苷酶所用的同樣方式確定IC50。
在表1中給出了結(jié)果。
表1IC50(M)化合物 α-葡糖苷酶 α-葡糖苷酶 α-半乳糖苷酶 β-半乳糖 β-半乳糖苷酶(發(fā)面酵母) (杏仁) (E.coli) 苷酶 (牛肝)(E.coli)d 4.02×10-72.93×10-5- - 3.63×10-41-1D2.32×10-6-- - 3.00×10-61-1L2.93×10-8-- - 1.53×10-41-2D9.99×10-7-- - 1.89 ×10-61-2L5.0×10-12-- - 5.17×10-52-2L7.0×10-14-… … …d-1 5.0×10-71.3×10-4… … …d-2 1.7×10-83.0×10-6… … …DNJ 9.19×10-51.47×10-4… … …N-B-DNJ 8.0×10-55.0×10-4… … …海藻糖胺5.0×10-49.9×10-6… … …注)-超過3.0×10-4M…未測定如上表所示，包括化合物(d)(表海藻糖胺)，(d-1)和(d-2)和5個異脲化合物[即化合物(1-1L)，(1-1D)，(1-2L)，(1-2D)和(2-2L)]的本發(fā)明化合物的α-葡糖苷酶抑制活性高達(dá)脫氧野尻霉素的102-2×109倍。還表明這些化合物對于α-葡糖苷酶是高度有特效的。此外，上述5個異脲化合物均比表海藻糖胺有更高的抑制活性和更高的α，β-選擇性，這表明它們是非常有用的化合物。仲羥基參與(participates in)異脲鍵的化合物(1-1L)與叔羥基參與異脲鍵的化合物(1-2L)之間抑制活性方面的比較表明后一化合物活性略微高一些。這一事實假定相應(yīng)于葡萄糖2-位的羥基也許提供作為質(zhì)子給體的氫鍵鍵合到本研究中所用的酶上。再有，通過在其中引入苯基可以顯著地提高化合物(d)的α，β-選擇性。根據(jù)這一事實，假定疏水部分會極大地影響選擇性。
實驗實施例2用實施例中得到的化合物(d)，(1-2L)和(2-2L)及比較化合物海藻糖胺和N-丁基脫氧野尻霉素測定對α-葡糖苷酶I的抑制活性。
根據(jù)I.Neverova等人在Anal.Biochem.，222，190-196(1994)中的方法制備本文中使用的α-葡糖苷酶I(發(fā)面酵母)和其酶作用物(α-D-Glc1→2α-D-Glc1→3α-D-Glc-O(CH2)6COOCH3)。
用該文獻(xiàn)所述的方法進(jìn)行下面的測定。
也就是說，將25μl含有α-葡糖苷酶I的緩沖溶液加入到含有上述試樣和酶作用物(α-D-Glcl→2α-D-Glc1→3α-D-Glc-O(CH2)6COOCH3)的微管中。在37℃培育1小時后，向其加入1.25M三鹽酸化物緩沖溶液(pH7.6，25μl)中止反應(yīng)。然后將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到微板上，接著加入250μl反應(yīng)緩沖溶液[展開溶液；1M含有葡萄糖氧化酶(5單位/毫升，Sigma生產(chǎn))，辣根過氧化物酶(1紅棓酚單位，Sigma生產(chǎn))和鄰-聯(lián)(二)茴香胺二鹽酸化物(40μg/ml)的三鹽酸化物緩沖溶液(40μg/ml)(pH7.2)]。然后，在37℃培育該混合物30分鐘或直至吸光度升高達(dá)到一平穩(wěn)段。然后測定由該酶反應(yīng)形成和氧化的鄰-聯(lián)(二)茴香胺的吸光度(A450-650)。重復(fù)上面的反應(yīng)但既不加上述試樣也不加上述酶作用物并測定光度作為空白。并且將上述反應(yīng)緩沖溶液加入到已知濃度的D-葡萄糖中并培育所得混合物接著測定吸光度從而測定D-葡萄糖濃度和吸光度之間的關(guān)系。同時在兩個孔中完成每一測定。
上面的測定是在酶作用物濃度范圍(0.25-4.0mM)內(nèi)和試樣濃度范圍在每個試樣給出的IC50附近進(jìn)行的。根據(jù)上述D-葡萄糖濃度與吸光度之間的關(guān)系，確定存在試樣時由于α-葡糖苷酶的酶反應(yīng)從酶作用物釋放出的葡萄糖量。從這樣得到的結(jié)果確定Km，然后從試樣的量的Km值確定Ki。
表2給出了這些結(jié)果。如表2所示，本發(fā)明的化合物抑制α-葡糖苷酶I的酶活性。它們之中，化合物(2-2L)在活性方面可與已經(jīng)研究并開發(fā)成為抗HIV試劑的N-丁基脫氧野尻霉素相比。因此預(yù)計該化合物(2-2L)也能用作抗HIV試劑。
表2化合物 Ki(μM)d 3001-2L 512-2L 4.2N-丁基脫氧野尻霉素3.6海藻糖胺 1500
實驗實施例3氨基環(huán)戊烷衍生物對HIV產(chǎn)生的抑制作用(HIV中和試驗)通過用人正常外部血液單核細(xì)胞(PBMC)病毒中和試驗測定本發(fā)明化合物的HIV中和活性。
將在實施例中得到的化合物(d)，(1-1L)，(1-2L)和(2-2L)及比較化合物N-甲基脫氧野尻霉素(稱之為N-mDNJ)，N-丁基脫氧野尻霉素(稱之為N-B-DNJ)，海藻糖胺和疊氮胸苷(AZT)作為試樣，每個的量為0.1μm和1μM，與TCID50100倍量(中等組織培養(yǎng)感染劑量)的HIVMN混合，然后在37℃培育60分鐘。將混合物移至含有1×106已經(jīng)用5μg植物血球凝集素(PHA)活化了24小時的PBMC的Eppendorf管中，在37℃水浴中搖動60分鐘。用PHA的活化是通過在刺激介質(zhì)中培育PBMC24小時進(jìn)行的。該刺激介質(zhì)是通過將谷氨酰胺(2mM)，熱失活的10％胎腓腸血清，0.01％PHA(Difco生產(chǎn))，抗INFα抗體(50單位/毫升，從Cosmobio購得)，青霉素(50單位/毫升)和鏈霉素(50μg/ml)加入到RPMI1640介質(zhì)中制備的。用PBS洗滌三次之后，將該細(xì)胞懸浮在1ml的生長介質(zhì)中，然后將懸浮液移到培育管(A-S Nunc，Roskilde，Denmark)并培育7天。該生長介質(zhì)是通過將谷氨酰胺(2μM)，熱失活的10％胎腓腸血清，T細(xì)胞生長因子(IL-2)(40單位/毫升，由Shionogi&Co.，Ltd，生產(chǎn))，抗INFα-抗體(50單位/毫升，從Cosmobio購得)，青霉素(50單位/毫升)和鏈霉素(50μg/ml)加入到RPMI1640中制備的。然后用HIV-1p24抗原ELISA(Dinabot生產(chǎn))測定在上層清液中產(chǎn)生的HIV[J.Immunol.，142，4248-4255(1989)；J.Immunol.，148，2175-2180(1992)]并以抑制率(％)表示試樣對HIV產(chǎn)生的抑制作用。
用于中和試驗的HIVMN是通過將已經(jīng)用5μg/ml PHA活化了7天的PBMC與其量為TCID50100倍的HIVMN(H9/HTLV-IIIMN，AIDSResearch and Reference Reagent Program，NIH，Rockvill，MD)培育7天并從培養(yǎng)物上層清液棄去細(xì)胞制備的，接著在使用前在-130℃保存。用PHA活化的PBMC滴定該HIVMN從而確定每毫升TCID50。
圖1給出了這些結(jié)果?？v坐標(biāo)表示每個試樣的抑制程度，它是以通過將1μM AZT的抑制作用作為70％計算出的抑制率(％)表示的。如圖1所示，本發(fā)明的化合物有抗HIV活性。
實驗實施例4氨基環(huán)戊烷衍生物對由HIV誘發(fā)的細(xì)胞融合(形成巨大細(xì)胞)的抑制作用向含有106Molt4細(xì)胞或106Molt4/HIV-IIIB細(xì)胞的介質(zhì)中分別加入在實施例中得到的化合物(1-2L)，(2-2L)，(d)，(d-2)和(d-1)及比較化合物N-mDNJ，N-B-DNJ和AZT用作試樣，其量為0.1μm和1μm，接著培育3天。本文中使用的每一介質(zhì)是通過將谷氨酰胺(2mM)，熱失活的10％胎腓腸血清，青霉素(50單位/毫升)和鏈霉素(50mg/ml)加入到RPMI1640介質(zhì)中制備的。完成培育后，Molt4細(xì)胞與同樣數(shù)量的Molt4/HIV-III B細(xì)胞混合并在37℃培育24小時。然后用多重篩分機(jī)(Coulter制造)測定細(xì)胞尺寸大小和細(xì)胞數(shù)。直徑超過20μm的細(xì)胞稱為由細(xì)胞融合形成的巨細(xì)胞。這樣測定每個試樣對細(xì)胞融合(形成巨細(xì)胞)的抑制率(％)。
圖2給出了這些結(jié)果。縱坐標(biāo)表示抑制率(％)。如圖2所示，本發(fā)明化合物有抗HIV活性。
實驗實施例5如表1和2所示，它證明了本發(fā)明的化合物(d)，(1-1L)，(1-2L)，(2-2L)，(d-1)和(d-2)與已知具有抑制活性的脫氧野尻霉素相比，具有非常強(qiáng)的對α-葡糖苷酶的抑制活性。特別地，化合物(1-1L)，(1-2L)，和(2-2L)對β-葡糖苷酶有弱抑制活性，這表明這些化合物是對α-葡糖苷酶非常有特效的抑制劑。此外，在細(xì)胞毒性方面也檢測了這些化合物。
制備了20mM化合物(d)水溶液，10mM化合物(1-1L)在50％DMSO中的溶液和10mM化合物(1-2L)在50％DMSO中的溶液，并將其用作實驗試樣。
使用12-孔微板(3.8平方厘米/孔，由Corning生產(chǎn))，在37℃、5％CO2、密度為2×105細(xì)胞/毫升/孔條件下，在含有10％胎腓腸血清(FCS)的Dulbecco改性的Eagle介質(zhì)(由Gibco實驗室生產(chǎn))中培育B16黑素瘤細(xì)胞。24小時后，該介質(zhì)用含有每個試樣的Dulbecco改性的Eagle介質(zhì)替換。在同樣條件下繼續(xù)培育24小時。然后通過加入EDTA收獲該細(xì)胞，用PBS洗滌并用0.3％錐蟲藍(lán)溶液染色從而確定該細(xì)胞的存活率。
如表3所示，在測定的任何濃度范圍內(nèi)沒有觀察到細(xì)胞毒性。化合物(1-2L)甚至在高達(dá)50％α-葡糖苷酶抑制濃度(IC50)的10000倍濃度下也沒有顯示出細(xì)胞毒性，這意謂著它可以用作高度安全的藥物。
表3化合物化合物濃度(μM)100 5010 5d -- --1-1L -- --1-2L -- --通過用0.3％錐蟲藍(lán)溶液染色確定的存活率(對比100％)。+25％，±50％，-＞95％。
盡管已經(jīng)詳細(xì)地并參考其具體的實施方案描述了本發(fā)明，但是顯然本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以在不脫離其精神和范圍的條件下作各種改變和修改。
權(quán)利要求
1.一種由式(1)表示的氨基環(huán)戊烷衍生物 其中R1表示H而R2表示CH2OH，或R1表示CH2OH而R2表示H；和R3表示取代的或未取代的芳基或具有1-10個碳原子的烷基，鏈烯基，炔基或羥烷基。
2.如權(quán)利要求1所述的氨基環(huán)戊烷衍生物，其中在用上面式(1)表示的氨基環(huán)戊烷衍生物中，R3表示取代的或未取代的芳基。
3.如權(quán)利要求2所述的氨基環(huán)戊烷衍生物，其中用上面式(1)表示的氨基環(huán)戊烷衍生物選自用下面結(jié)構(gòu)式(1-1L)表示的(1S，5R，6S，7S，8R)-6-羥甲基-3-苯氨基-2-噁-4-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛-3-烯-6，7，8-三醇，用下面結(jié)構(gòu)式(1-1D)表示的(1R，5S，6R，7R，8S)-6-羥甲基-3-苯氨基-2-噁-4-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛-3-烯-6，7，8-三醇，用下面結(jié)構(gòu)式(1-2L)表示的(1S，5R，6S，7R，8S)-1-羥甲基-3-苯氨基-2-噁-4-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛-3-烯-6，7，8-三醇和用下面結(jié)構(gòu)式(1-2D)表示的(1R，5S，6R，7S，8R)-1-羥甲基-3-苯氨基-2-噁-4-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛-3-烯-6，7，8-三醇
4.如權(quán)利要求1所述的氨基環(huán)戊烷衍生物，其中，在用上面式(1)表示的氨基環(huán)戊烷衍生物中，R3表示有1-10個碳原子的烷基。
5.如權(quán)利要求4所述的氨基環(huán)戊烷衍生物，其中用上面式(1)表示的氨基環(huán)戊烷衍生物選自用下面結(jié)構(gòu)式(2-1L)表示的(1S，5R，6S，7S，8R)-6-羥甲基-3-丁氨基-2-噁-4-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛-3-烯-6，7，8-三醇，用下面結(jié)構(gòu)式(2-1D)表示的(1R，5S，6R，7R，8S)-6-羥甲基-3-丁氨基-2-噁-4-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛-3-烯-6，7，8-三醇，用下面結(jié)構(gòu)式(2-2L)表示的(1S，5R，6S，7R，8S)-1-羥甲基-3-丁氨基-2-噁-4-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛-3-烯-6，7，8-三醇和用下面結(jié)構(gòu)式(2-2D)表示的(1R，5S，6R，7S，8R)-1-羥甲基-3-丁氨基-2-噁-4-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛-3-烯-6，7，8-三醇
6.(3S，4R，5S，6R，7S)-7-乙酰胺-4，5，6-三-O-乙酰基-噁螺[2.4]庚烷-4，5，6-三醇，它是用下面結(jié)構(gòu)式表示的化合物
7.一種由式(2)表示的氨基環(huán)戊烷衍生物 其中R4和R5各自獨立地表示H或取代的或未取代的芳基或具有1-10個碳原子的烷基，鏈烯基，炔基或羥烷基。
8.如權(quán)利要求7所述的氨基環(huán)戊烷衍生物，其中由上面式(2)表示的氨基環(huán)戊烷衍生物選自用下面結(jié)構(gòu)式(d)表示的1L-(1，2，4，5/3)-5-氨基-1C-羥甲基-1，2，3，4-環(huán)戊烷四醇，用下面結(jié)構(gòu)式(d-1)表示的1L-(1，2，4，5/3)-5-二丁氨基-1-羥甲基-1，2，3，4-環(huán)戊烷四醇和用下面結(jié)構(gòu)式(d-2)表示的1L-(1，2，4，5/3)-5-丁氨基-1-羥甲基-1，2，3，4-環(huán)戊烷四醇
9. 1D-(1，2，4，5/3)-5-氨基-1C-羥甲基-1，2，3，4-環(huán)戊烷四醇，它是由下面結(jié)構(gòu)式表示的化合物
10.N-[2-羥甲基-2，3，4，5-四羥基環(huán)戊基]-N′-苯基硫脲，它是由下面結(jié)構(gòu)式表示的化合物
11.一種含有如權(quán)利要求1或7所述的氨基環(huán)戊烷衍生物作為活性組份的糖苷酶抑制劑。
12.如權(quán)利要求11所述的糖苷酶抑制劑。其中所述的糖苷酶抑制劑是α-葡糖苷酶抑制劑。
13.如權(quán)利要求12所述的糖苷酶抑制劑，其中所述的活性組份是如權(quán)利要求2，4或8中所述的氨基環(huán)戊烷衍生物。
14.如權(quán)利要求13所述的糖苷酶抑制劑，其中所述的活性組份是如權(quán)利要求3或5中所述的氨基環(huán)戊烷衍生物。
15.一種制備如權(quán)利要求6所述化合物的方法，包括在溶液狀態(tài)下氧化由下面結(jié)構(gòu)式表示的化合物
16.一種制備如權(quán)利要求1所述的氨基環(huán)戊烷衍生物的方法，包括將式(3)表示的硫脲化合物轉(zhuǎn)變成環(huán)異脲 其中R1，R2和R3的定義與上面(1)所述的相同。
全文摘要
本發(fā)明提供氨基環(huán)戊烷衍生物，該衍生物是具有極高的α-葡糖苷酶抑制作用并具有新型結(jié)構(gòu)的糖化物類似物且可望能用于或適用于藥物或農(nóng)車業(yè)化學(xué)品。一種用式(1)表示的氨基環(huán)戊烷衍生物，其中R
文檔編號C07D263/52GK1131672SQ9512189
公開日1996年9月25日 申請日期1995年11月21日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月22日
發(fā)明者小川誠一郎, 內(nèi)田力, 木村洋, 井口仁一 申請人:生化學(xué)工業(yè)株式會社