用于癌癥診斷的針對密蛋白18.2的抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及針對位于CLDN18.2的C端部分中之表位的抗體，其可用于例如診斷癌癥和/或確定癌細(xì)胞是否表達(dá)CLDN18.2。
DSM ACC3143
2011.10.06

DSM ACC3144
2011.10.06
【專利說明】用于癌癥診斷的針對密蛋白18. 2的抗體
[0001] 密蛋白（Claudin)是位于上皮與內(nèi)皮的緊密連接內(nèi)的整合膜蛋白（integral membrane protein)。預(yù)測密蛋白具有四個跨膜區(qū)段，有兩個胞外環(huán)，并且N端和C端均位 于細(xì)胞質(zhì)中?？缒さ鞍踪|(zhì)密蛋白（CLDN)家族在上皮與內(nèi)皮緊密連接的維持中發(fā)揮關(guān)鍵作 用，并且還可能在細(xì)胞骨架的維持中以及在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用。
[0002] 密蛋白18(CLDN18)分子是整合跨膜蛋白（四次跨膜蛋白，tetraspanin)，其具 有四個跨膜疏水區(qū)和兩個胞外環(huán)（環(huán)1由疏水區(qū)1和疏水區(qū)2環(huán)繞而成；環(huán)2由疏水區(qū) 3和疏水區(qū)4環(huán)繞而成）。CLDN18以兩種不同剪接變體存在，這兩種變體描述于小鼠和 人中（Niimi，Mol. Cell. Biol. 21:7380-90,2001)。所述剪接變體（Genbank 登記號：剪 接變體 1(CLDN18. I) :NP_057453, NM_016369,和剪接變體 2(CLDN18. 2) :NM_001002026， NP_001002026)的分子量為約27. 9/27. 72kD。剪接變體CLDN18. 1和CLDN18. 2在包含第一 個跨膜（TM)區(qū)和環(huán)1的N端部分中存在差異，而C端的蛋白質(zhì)一級序列相同。參見圖1。
[0003] CLDN18. 1在正常肺的細(xì)胞中選擇性表達(dá)，而CLDN18. 2僅在胃細(xì)胞上表達(dá)。但是， CLDN18. 2在正常胃中的表達(dá)局限于已分化的胃上皮短壽細(xì)胞中。已確認(rèn)，CLDN18. 2在多種 腫瘤組織中表達(dá)。例如，已發(fā)現(xiàn)，CLDN18. 2在胰腺癌、食管癌、胃癌、支氣管癌、乳腺癌以及 ENT腫瘤中表達(dá)。CLDN18. 2是有預(yù)防和/或治療原發(fā)腫瘤之價值的靶標(biāo)，所述原發(fā)腫瘤例 如胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌（例如非小細(xì)胞肺癌（NSCLC))、卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌、頭頸癌 和膽囊癌及其轉(zhuǎn)移癌，特別是胃癌轉(zhuǎn)移例如Krukenberg腫瘤、腹膜轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
[0004] CLDN18. 2在癌細(xì)胞和正常細(xì)胞之間的差異表達(dá)、其膜定位、其在大多數(shù)毒性相關(guān) 正常組織中不存在、其在胃中的表達(dá)局限在可通過胃的靶陰性干細(xì)胞來補充的非必要的細(xì) 胞群體-已分化的胃細(xì)胞，使得CLDN18. 2成為癌癥免疫治療的有吸引力的靶標(biāo)，并且在癌 癥治療中使用靶向CLDN18. 2的基于抗體的治療劑（therapeutics)使高水平的治療特異性 成為可能。
[0005] CLDN18. 2靶向抗體的臨床應(yīng)用面臨人CLDN18. 2與人CLDN18. 1高度同源這一問 題?？梢猿晒Φ貥?gòu)建靶向CLDN18. 2之示出人CLDN18. 2與人CLDN18. 1之間的序列差異的 N端胞外結(jié)構(gòu)域的CLDN18. 2特異性抗體。為產(chǎn)生靶向CLDN18. 2之N端部分并且具有使其 能夠在臨床上用于診斷目的（例如，用于檢測癌組織切片的細(xì)胞中CLDN18. 2的表達(dá)）之特 性的抗體而作出的嘗試以失敗告終。
[0006] 本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，針對位于CLDN18. 2的C端部分內(nèi)的特定表位的抗體滿 足了用于抗體診斷應(yīng)用之標(biāo)準(zhǔn)，特別是用于檢測和鑒定表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞。最出乎意料 地，這些抗體雖然針對CLDN18. 1與CLDN18. 2之間相同的序列，但并不靶向非癌肺細(xì)胞。
[0007] 本發(fā)明的抗體可用于例如診斷癌癥和/或確定癌細(xì)胞是否表達(dá)CLDN18. 2。優(yōu) 選地，癌疾病或癌細(xì)胞以CLDN18. 2在表面表達(dá)為特征。表達(dá)CLDN18. 2的癌細(xì)胞是靶向 CLDN18. 2之治療的合適的靶標(biāo)，例如，使用針對CLDN18. 2之抗體的治療。在一個實施方案 中，癌細(xì)胞表達(dá)或異常表達(dá)CLDN18. 2,而相應(yīng)的正常細(xì)胞不表達(dá)CLDN18. 2或以較低水平表 達(dá)CLDN18. 2。表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞優(yōu)選地選自致瘤性胃癌細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、 肺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、頭頸癌細(xì)胞和膽囊癌細(xì)胞。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明涉及抗體或其抗原結(jié)合片段，其
[0009] (i)與具有氨基酸序列 TEDEVQSYPSKHDYV(SEQ ID NO :5)或 EVQSYPSKHDYV(SEQ ID NO :6)的肽相結(jié)合，和/或
[0010] Qi)與密蛋白18. 2 (CLDN18. 2)相結(jié)合，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段通過至 少與 CLDN18. 2 中具有氨基酸序列 TEDEVQSYPSKHDYV(SEQ ID NO :5)或 EVQSYPSKHDYV(SEQ ID NO :6)的表位相結(jié)合從而與CLDN18. 2相結(jié)合。
[0011] 在一個實施方案中，所述CLDN18. 2是細(xì)胞表面膜結(jié)合CLDN18. 2。在一個實施方 案中，所述CLDN18. 2存在于癌細(xì)胞上，其中所述癌細(xì)胞優(yōu)選為表達(dá)CLDN18. 2的癌細(xì)胞。在 一個實施方案中，所述癌細(xì)胞選自胃癌細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì) 胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、頭頸癌細(xì)胞和膽囊癌細(xì)胞。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體或 抗原結(jié)合片段不與除胃上皮細(xì)胞以外的非癌細(xì)胞相結(jié)合。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗 體或抗原結(jié)合片段不與非癌肺細(xì)胞相結(jié)合。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是嵌合抗體、 人抗體或人源化抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。
[0012] 在這些和另一些方面，本發(fā)明涉及一種抗體，其包含：
[0013] (I)抗體重鏈，所述抗體重鏈包含：
[0014] (i)根據(jù)SEQ ID NO :7的抗體重鏈序列或其變體，
[0015] (ii)根據(jù)SEQ ID NO :7的抗體重鏈序列之⑶R序列中的至少一個、優(yōu)選兩個、更 優(yōu)選全部三個，或其變體，或者
[0016] (iii)根據(jù)SEQ ID NO : 10的⑶R3序列或其變體，并且優(yōu)選地還包含根據(jù)SEQ ID NO :8的CDRl序列或其變體，和/或根據(jù)SEQ ID NO :9的CDR2序列或其變體，
[0017] 和 / 或
[0018] (II)抗體輕鏈，所述抗體輕鏈包含：
[0019] ⑴根據(jù)SEQ ID NO : 11的抗體輕鏈序列或其變體，
[0020] (ii)根據(jù)SEQ ID NO :11的抗體輕鏈序列之⑶R序列中的至少一個、優(yōu)選兩個、更 優(yōu)選全部三個，或其變體，或者
[0021] (iii)根據(jù)SEQ ID NO : 14的⑶R3序列或其變體，并且優(yōu)選地還包含根據(jù)SEQ ID NO : 12的⑶Rl序列或其變體，和/或根據(jù)SEQ ID NO : 13的⑶R2序列或其變體。
[0022] 在上述和另一些方面，本發(fā)明還涉及一種抗體，其包含：
[0023] (I)抗體重鏈，所述抗體重鏈包含：
[0024] (i)根據(jù)SEQ ID NO : 15的抗體重鏈序列或其變體，
[0025] (ii)根據(jù)SEQ ID NO :15的抗體重鏈序列之⑶R序列中的至少一個、優(yōu)選兩個、更 優(yōu)選全部三個，或其變體，或者
[0026] (iii)根據(jù)SEQ ID NO : 18的⑶R3序列或其變體，并且優(yōu)選地還包含根據(jù)SEQ ID NO : 16的⑶Rl序列或其變體，和/或根據(jù)SEQ ID NO : 17的⑶R2序列或其變體，
[0027] 和 / 或
[0028] (II)抗體輕鏈，所述抗體輕鏈包含：
[0029] (i)根據(jù)SEQ ID NO : 19的抗體輕鏈序列或其變體，
[0030] (ii)根據(jù)SEQ ID NO :19的抗體輕鏈序列之⑶R序列中的至少一個、優(yōu)選兩個、更 優(yōu)選全部三個，或其變體，或者
[0031] (iii)根據(jù)SEQ ID NO :22的⑶R3序列或其變體，并且優(yōu)選地還包含根據(jù)SEQ ID NO :20的⑶Rl序列或其變體，和/或根據(jù)SEQ ID NO :21的⑶R2序列或其變體。
[0032] 在一些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體包含抗體重鏈和/或抗體輕鏈，所述抗體 重鏈包含Y-I重鏈恒定區(qū)，優(yōu)選人Y-I重鏈恒定區(qū)，所述抗體輕鏈包含K輕鏈恒定區(qū)。
[0033] 在上述和另一些方面，本發(fā)明涉及由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的或可從其獲得的抗體，所 述雜交瘤細(xì)胞保藏在DSMZ(Inhoffenstr. 7B，38124,布倫瑞克（Braunschweig)，德國），并 且具有以下命名和登記號之一：
[0034] LmuAB 43-14A，登記號 DSM ACC3144,保藏于 2011 年 10 月 6 日，或
[0035] 2. muAB 35-22A，登記號 DSM ACC3143,保藏于 2011 年 10 月 6 日。
[0036] 本文中通過參照抗體的命名和/或通過參照產(chǎn)生抗體的克隆來命名本發(fā)明的抗 體，例如 muAB 43-14A。
[0037] 另一些優(yōu)選的抗體是具有由上述雜交瘤產(chǎn)生或可從其獲得之抗體特異性的抗體， 并且特別是包含與由上述雜交瘤產(chǎn)生的和可從其獲得的抗體的抗原結(jié)合部分或抗原結(jié)合 位點（特別是可變區(qū)）相同或高度同源之抗原結(jié)合部分或抗原結(jié)合位點（特別是可變區(qū)） 的抗體。預(yù)期優(yōu)選其CDR區(qū)與由上述雜交瘤產(chǎn)生的和可從其獲得的抗體的CDR區(qū)相同或高 度同源的抗體。"高度同源"意指可以在每個CDR區(qū)中進行1至5 (優(yōu)選1至4,例如1至3 或者1或2)個替換。特別優(yōu)選的抗體是由上述雜交瘤產(chǎn)生的及可從其獲得的抗體的嵌合 形式和人源化形式。
[0038] 因此，本發(fā)明的抗體可選自：（i)由以如下登記號保藏之克隆產(chǎn)生的或可從其獲 得的抗體：DSM ACC3144(muAB 43-14A)或DSM ACC3143(muAB 35-22A) ;(ii)為（i)中抗體 的嵌合形式或人源化形式的抗體；（iii)具有（i)中抗體之特異性的抗體；以及（iv)包含 (i)中抗體之抗原結(jié)合部分或抗原結(jié)合位點的抗體。（i)中所述抗體的抗原結(jié)合部分或抗 原結(jié)合位點可包含（i)中抗體的可變區(qū)。此外，本發(fā)明還包括本文所述抗體的抗原結(jié)合片 段。
[0039] 本發(fā)明的抗體優(yōu)選地能夠與天然狀態(tài)的（即天然存在或非變性狀態(tài)的）CLDN18. 2 或其變性狀態(tài)的CLDN18. 2相結(jié)合。
[0040] 在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體可通過包括以下步驟的方法獲得：用包含SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6的氨基酸序列優(yōu)選地由所述氨基酸序列組成的肽、或免疫等效肽、 或表達(dá)所述肽的核酸或宿主細(xì)胞來免疫接種動物。優(yōu)選地，所述肽包含CLDN18. 2的不多于 110、100、90、80、70、60、50、40、30、或20個連續(xù)氨基酸。
[0041] 在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體可通過包括以下步驟的方法獲得：用包含SEQ ID NO :24或SEQ ID NO :25的氨基酸序列并且優(yōu)選地由所述氨基酸序列組成的肽、或免疫 等效肽、或表達(dá)所述肽的核酸或宿主細(xì)胞來免疫接種動物。優(yōu)選地，所述肽包含CLDN18. 2 的不多于110、100、90、80或75個連續(xù)氨基酸。
[0042] 本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段可與其他部分（例如可檢測標(biāo)記物）相偶聯(lián)，即共 價連接或非共價連接。
[0043] 本發(fā)明還涉及產(chǎn)生如本文所述之抗體的細(xì)胞，例如雜交瘤細(xì)胞。
[0044] 優(yōu)選的雜交瘤細(xì)胞是保藏于DSMZ(Inhoffenstr. 7B，38124布倫瑞克，德國）的雜 交瘤細(xì)胞，并且其具有以下命名和登記號之一：
[0045] LmuAB 43-14A，登記號 DSM ACC3144,保藏于 2011 年 10 月 6 日；或
[0046] 2. muAB 35-22A，登記號 DSM ACC3143,保藏于 2011 年 10 月 6 日。
[0047] 本發(fā)明還涉及包含SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6的氨基酸序列并且優(yōu)選由所述 氨基酸序列組成的肽或免疫等效肽。優(yōu)選地，所述肽包含CLDN18. 2的不多于110、100、90、 80、70、60、50、40、30、或20個連續(xù)氨基酸。
[0048] 本發(fā)明還涉及包含SEQ ID NO :24或SEQ ID NO :25的氨基酸序列并且優(yōu)選由所述 氨基酸序列組成的肽或免疫等效肽，或表達(dá)所述肽的核酸或宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，所述肽包含 CLDN18. 2的不多于110、100、90、80或75個連續(xù)氨基酸。
[0049] 本發(fā)明還涉及核酸，所述核酸包含編碼本文所述抗體或其部分（例如，抗體鏈、或 抗原結(jié)合片段、或肽）的基因或核酸序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸與允許在真核或原核細(xì)胞 中表達(dá)的表達(dá)控制元件有效連接。確保在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)的控制元件為本領(lǐng)域技術(shù) 人員所公知。
[0050] 本發(fā)明的核酸可以包含在載體中，例如質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體或者例如在遺傳 工程中常規(guī)使用的其他載體。所述載體可包含另外的基因，例如標(biāo)記物基因，其允許在合適 的宿主細(xì)胞和在合適的條件下選擇所述載體。此外，所述載體可包含表達(dá)控制元件，其允許 在合適的宿主中正確表達(dá)編碼區(qū)。這樣的控制元件是技術(shù)人員已知的，并且可包括啟動子、 剪接盒（splice cassette)和翻譯起始密碼子。
[0051] 用于構(gòu)建核酸分子、構(gòu)建包含核酸分子的載體、將載體引入適當(dāng)?shù)剡x擇的宿主細(xì) 胞、或者引起或?qū)崿F(xiàn)核酸分子之表達(dá)的方法在本領(lǐng)域中是公知的。
[0052] 本發(fā)明的另一方面涉及包含本文所公開的核酸或載體的宿主細(xì)胞。
[0053] 本發(fā)明的另一方面涉及使用本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段檢測CLDN18. 2或表達(dá) CLDN18. 2的細(xì)胞或測定CLDN18. 2或表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞的量。通過檢測CLDN18. 2與 本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段之間的復(fù)合物或測定該復(fù)合物的量來檢測CLDN18. 2或表達(dá) CLDN18. 2的細(xì)胞或測定CLDN18. 2或表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞的量。所述復(fù)合物的形成表明存 在CLDN18. 2或表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞。這樣的檢測或量的測定可以以多種方式實施，包括 但不限于，使用本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段進行免疫檢測。使用抗體來檢測肽或蛋白質(zhì) 的方法是公知的，包括ELISA、競爭結(jié)合測定等。一般而言，這樣的測定使用特異性結(jié)合靶 肽或靶蛋白的抗體或抗體片段，該抗體或抗體片段直接或間接與提供用于檢測的標(biāo)記物相 結(jié)合，所述標(biāo)記物例如指示酶、放射性標(biāo)記物、熒光團或順磁性顆粒。本發(fā)明的方法允許對 CLDN18. 2水平或表達(dá)CLDN18. 2之細(xì)胞的水平進行定量和/或定性評價，例如絕對評價和/ 或相對評價。
[0054] 在一個方面，本發(fā)明涉及用于在樣品中檢測CLDN18. 2或測定CLDN18. 2的量的方 法，該方法包括以下步驟：
[0055] (i)使樣品與本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段或本發(fā)明的綴合物相接觸，和
[0056] (ii)檢測所述抗體、抗原結(jié)合片段或綴合物與CLDN18. 2之間復(fù)合物的形成，或測 定其量。
[0057] 在一個實施方案中，所述樣品是細(xì)胞樣品，即包含細(xì)胞（例如癌細(xì)胞）的樣品。在 該實施方案中，優(yōu)選地，所述復(fù)合物是由所述抗體、抗原結(jié)合片段或綴合物與所述樣品中的 細(xì)胞所表達(dá)的CLDN18. 2之間形成的。
[0058] 在一個方面，本發(fā)明涉及用于確定細(xì)胞是否表達(dá)CLDN18. 2的方法，其包括以下步 驟：
[0059] (i)使細(xì)胞樣品與本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段或本發(fā)明的綴合物相接觸，和
[0060] (ii)檢測所述抗體、抗原結(jié)合片段或綴合物與所述樣品中的細(xì)胞所表達(dá)的 CLDN18. 2之間復(fù)合物的形成。
[0061] 在一個實施方案中，樣品中的細(xì)胞是癌細(xì)胞。優(yōu)選地，所述復(fù)合物是抗體、抗原結(jié) 合片段或綴合物與所述樣品中的細(xì)胞所表達(dá)的CLDN18. 2之間形成的。
[0062] 本發(fā)明的另一些方面涉及通過使用本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段來靶向 CLDN18. 2從而對疾病進行診斷或分類的方法。這些方法提供對表達(dá)CLDN18. 2之細(xì)胞的選 擇性檢測，從而將這些細(xì)胞與不表達(dá)CLDN18. 2的正常細(xì)胞或不表達(dá)CLDN18. 2的患病細(xì)胞 區(qū)分開?？梢酝ㄟ^靶向CLDN18. 2的療法來治療以表達(dá)CLDN18. 2的患病細(xì)胞為特征的疾病， 所述療法例如使用針對CLDN18. 2的治療性抗體的療法。優(yōu)選的用來治療或診斷的疾病是 其中表達(dá)或異常表達(dá)CLDN18. 2的那些疾病，特別是癌疾病，例如本文所述的那些癌疾病。 [0063] 在一方面，本發(fā)明涉及用于診斷、檢測或監(jiān)測癌疾?。矗_定消退、發(fā)展、進程 (course)和/或發(fā)?。┑姆椒?，其包括：使用本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段檢測從患者分 離的生物樣品中的CLDN18. 2或表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞和/或測定CLDN18. 2或表達(dá)CLDN18. 2 的細(xì)胞的量?？梢允褂迷摲椒▉頇z測對象是否患有癌疾病或者是否處于發(fā)生癌疾病的（升 商的）風(fēng)險中，或者例如，治療方案是否有效。
[0064] 因此，在一個方面，本發(fā)明涉及用于診斷、檢測或監(jiān)測癌癥的方法，其包括以下步 驟：
[0065] (i)使生物樣品與本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段或本發(fā)明的綴合物相接觸，和
[0066] (ii)檢測所述抗體、抗原結(jié)合片段或綴合物與CLDN18. 2之間復(fù)合物的形成和/或 測定該復(fù)合物的量。
[0067] 在一個實施方案中，生物樣品是細(xì)胞樣品，即包含細(xì)胞（例如癌細(xì)胞）的樣品。在 該實施方案中，優(yōu)選地，所述復(fù)合物是抗體、抗原結(jié)合片段或綴合物與所述樣品中的細(xì)胞所 表達(dá)的CLDN18. 2之間形成的。
[0068] 根據(jù)本發(fā)明的監(jiān)測方法優(yōu)選地包括在第一時間點檢測第一樣品中和在第二時間 點檢測另一樣品中的CLDN18. 2或表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞和/或測定其量，其中可以通過對 兩個樣品進行比較來確定腫瘤疾病的消退、發(fā)展、進程和/或發(fā)病。
[0069] 通常，將生物樣品中CLDN18. 2的水平或表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞的水平與參照水平 進行比較，其中與所述參照水平的偏差指示癌疾病在對象中的存在和/或階段。所述參照 水平可以是在對照樣品（例如，來自健康的組織或?qū)ο?，特別是無癌疾病的患者）中測定的 水平或者健康對象的中位水平。與所述參照水平的"偏差"表示任何顯著改變，例如升高至 少10 %、20 %或30 %，優(yōu)選至少40 %或50 %或者甚至更高。
[0070] 優(yōu)選地，存在CLDN18. 2或表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞和/或與參照水平相比（例如，與 無癌疾病的患者相比）CLDN18. 2或表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞的量增加表示患者中存在癌疾病 或者存在發(fā)生癌疾病的風(fēng)險（即，產(chǎn)生癌疾病的可能性）。
[0071] 與較早前從患者獲取的生物樣品相比，CLDN18. 2或表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞的量降 低可指示患者中癌疾病的消退、積極的進程（例如，成功的治療）或發(fā)病風(fēng)險降低。
[0072] 與較早前從患者獲取的生物樣品相比，CLDN18. 2或表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞的量提 高可指示所述患者中癌疾病的進展、消極的進程（例如，不成功的治療）、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移行為、 發(fā)病或發(fā)病風(fēng)險。
[0073] 在一個方面，本發(fā)明涉及用于確定是否可以用靶向CLDN18. 2的癌癥療法來治療 癌癥的方法，其包括以下步驟：
[0074] (i)使包含癌細(xì)胞的樣品與本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段或本發(fā)明的綴合物相接 觸，和
[0075] (ii)檢測所述抗體、抗原結(jié)合片段或綴合物與CLDN18. 2之間復(fù)合物的形成。
[0076] 優(yōu)選地，所述復(fù)合物是所述抗體、抗原結(jié)合片段或綴合物與所述樣品中的癌細(xì)胞 所表達(dá)的CLDN18. 2之間形成的。
[0077] 該方法可用于檢測患者是否適合涉及靶向表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞的治療，例如使 用發(fā)揮一種或更多種免疫效應(yīng)功能的抗體的治療，所述抗體例如細(xì)胞毒性CLDN18. 2特異 性抗體，例如用細(xì)胞毒性物質(zhì)（例如毒素）或放射性標(biāo)記物來標(biāo)記的抗體，或者誘導(dǎo)細(xì)胞殺 傷機制（例如⑶C或ADCC)的抗體?？梢杂冒邢駽LDN18. 2的療法來治療以表達(dá)CLDN18. 2 的患病細(xì)胞為特征的疾病，例如癌疾病，特別是本文所述的那些癌疾病。
[0078] 在上述任意方面的一個實施方案中，所述樣品、細(xì)胞樣品或生物樣品來自患有癌 疾病，懷疑患有癌疾病或具有患癌疾病之風(fēng)險的患者。在一個實施方案中，所述樣品、細(xì)胞 樣品或生物樣品來自在組織或器官未患癌癥時其中的細(xì)胞基本不表達(dá)CLDN18. 2的組織或 器官。優(yōu)選地，所述組織是除胃組織以外的組織。優(yōu)選地，所述組織是肺組織、食管組織、胰 腺組織或乳腺組織，并且所述組織或器官任選地已例如通過對所述組織或器官的細(xì)胞進行 目視檢查或培養(yǎng)測試而被診斷為被癌疾病影響。在該實施方案中，存在CLDN18. 2或表達(dá) CLDN18. 2的細(xì)胞和/或與參照水平相比（例如與無腫瘤疾病的患者相比）CLDN18. 2或表達(dá) CLDN18. 2的細(xì)胞的量增加可指示患者適于涉及靶向表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞的治療。
[0079] 在一個方面，本發(fā)明提供了組合物（例如，診斷組合物）或試劑盒，其包含本文所 述的抗體或抗原結(jié)合片段或者抗體和/或抗原結(jié)合片段的組合。該診斷組合物或測試試劑 盒可用于本發(fā)明的方法，例如本發(fā)明的用于診斷、檢測或監(jiān)測的方法。這些試劑盒可任選地 包含可檢測標(biāo)記物，例如指示酶、放射性標(biāo)記物、熒光團或順磁性顆粒。所述試劑盒可包含 信息手冊，例如，用于說明如何使用試劑來實施本文所公開的方法的手冊。
[0080] 通過以下的詳細(xì)描述和權(quán)利要求，本發(fā)明的另一些特征和優(yōu)勢將是明顯的。
[0081] 發(fā)明詳述
[0082] 雖然在下文中對本發(fā)明進行了詳細(xì)描述，但是應(yīng)理解，本發(fā)明不局限于本文所述 的具體方法、方案和試劑，這些方法、方案和試劑可以改變。還應(yīng)理解，本文使用的術(shù)語只出 于描述具體實施方案的目的，而無意于限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍將由所附權(quán)利要 求限定。除非另有指明，否則本文使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員通常所理解的含義相同。
[0083] 在下文中，將對本發(fā)明的要素進行描述。這些要素伴隨具體實施方案列舉，但是， 應(yīng)理解，它們可以以任何方式及任何數(shù)目組合從而形成另外的實施方案。多方面描述的實 施例及優(yōu)選實施方案不應(yīng)被解釋為將本發(fā)明僅局限于明確描述的實施方案。該描述應(yīng)理解 為支持和涵蓋組合明確描述的實施方案與任何數(shù)目的所公開的和/或優(yōu)選的要素的實施 方案。此外，應(yīng)認(rèn)為本申請所述全部要素的任何排列和組合均由本申請說明書所公開，上下 文中另有指明除外。
[0084] 優(yōu)選地，本文使用的術(shù)語按照 "A multilingual glossary of biotechnological terms :(IUPAC Recommendations)"，H.G.W.Leuenberger，B. Nagel 和 H. K6lbl，編著， Helvetica Chimica Acta，CH_4010Basel，Switzerland，（1995)中所述來定義。
[0085] 除非另有指明，否則本發(fā)明的實施將采用化學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)和 重組DNA技術(shù)的常規(guī)方法，其在本領(lǐng)域文獻(xiàn)中有所解釋（參見，例如，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第2版，J. Sambrook等編著，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harborl989)。
[0086] 在本說明書和所附的權(quán)利要求書通篇中，除非上下文中另外要求，否則詞語"包括 /包含（comprise) "及其變化形式將理解為意指包括所陳述的成員、整數(shù)（integer)或步驟 或者成員、整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其他成員、整數(shù)或步驟或者成員、整數(shù)或步驟的 組，盡管在一些實施方案中，這樣的其他成員、整數(shù)或步驟或者成員、整數(shù)或步驟的組可以 被排除，即，主題在于包括所陳述的成員、整數(shù)或步驟或者成員、整數(shù)或步驟的組。除非本文 中另外指明或者與上下文明顯矛盾，否則描述本發(fā)明的上下文中（尤其是在權(quán)利要求書的 上下文中）使用的沒有數(shù)量詞修飾的名詞要解釋為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)兩者。本文中數(shù)值范圍 的敘述僅意在作為單獨地指代落入該范圍內(nèi)的各獨立的值的便捷方法。除非本文中另外指 明，否則各單獨的值均并入說明書中，如同其在本文中單獨引用。除非本文中另外指明或者 與上下文明顯相矛盾，否則可以以任何合適的順序進行本文中所描述的所有方法。除非另 外要求，否則本文中提供的任意和全部實施例或示例性語言（例如，"例如"）的使用僅意在 更好地舉例說明本發(fā)明，并不對本發(fā)明的范圍進行限制。本說明書中的任何語言都不應(yīng)當(dāng) 被解釋為表示對實施本發(fā)明而言必要的任何非要求保護之要素。
[0087] 在本說明書通篇中引用了若干篇文獻(xiàn)。本文所引用的每篇文獻(xiàn)（包括全部專利、 專利申請、科學(xué)出版物、制造商的說明書、指南等），無論是在上文中的還是在下文中的，均 通過引用整體并入本文。本文中的任何內(nèi)容都不應(yīng)當(dāng)被解釋為承認(rèn)本發(fā)明無權(quán)作為在先發(fā) 明而先于這些公開內(nèi)容。
[0088] 在本發(fā)明上下文中，術(shù)語"重組"意指"通過基因工程制備"。優(yōu)選地，在本發(fā)明上 下文中，"重組物質(zhì)（recombinant object)"例如重組細(xì)胞不是天然的。
[0089] 本文所用術(shù)語"天然的"指對象可見于自然界這一事實。例如，存在于生物體（包 括病毒）中并可從自然界來源分離，并且在實驗室中未有意進行人工修飾的肽或核酸是天 然存在的。
[0090] 術(shù)語"抗原"涉及包含表位，并且針對所述表位可引起和/或產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物 質(zhì)。優(yōu)選地，在本發(fā)明上下文中，抗原是這樣的分子，其任選地在加工后誘導(dǎo)優(yōu)選地特異性 針對抗原的免疫反應(yīng)。特別地，術(shù)語"抗原"包括蛋白質(zhì)、肽、多糖、核酸（尤其是RNA和DNA) 和核苷酸。
[0091] 術(shù)語"表位"指分子中的抗原決定簇，即指分子中被免疫系統(tǒng)識別（例如被抗體識 另Ij)的部分。例如，表位是被免疫系統(tǒng)識別的抗原上不連續(xù)的三維位點。表位通常由分子 的化學(xué)活性表面基團（例如氨基酸或糖側(cè)鏈）組成，并通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及 特定的電荷特征。構(gòu)象表位與非構(gòu)象表位的區(qū)別在于在變性溶劑存在下前者喪失結(jié)合，而 后者則不然。蛋白質(zhì)（例如，CLDN)的表位優(yōu)選地包含所述蛋白質(zhì)的連續(xù)或不連續(xù)部分，并 且長度優(yōu)選地是5至100、優(yōu)選5至50、更優(yōu)選8至30、最優(yōu)選10至25個氨基酸，例如，所 述表位的長度可優(yōu)選地是 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個 氨基酸。
[0092] 本文使用的術(shù)語"不連續(xù)表位"指蛋白質(zhì)抗原上由蛋白質(zhì)一級序列中至少兩個獨 立的區(qū)域形成的構(gòu)象表位。
[0093] 在一個優(yōu)選的實施方案中，抗原是腫瘤相關(guān)抗原（例如CLDN18. 2)，即癌細(xì)胞的成 分，其可來自細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞表面和細(xì)胞核，特別是優(yōu)選地在胞內(nèi)或作為癌細(xì)胞的表面抗原大 量產(chǎn)生的那些抗原。
[0094] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"腫瘤相關(guān)抗原"或"腫瘤抗原"涉及在正常條件下在有 限數(shù)目的組織和/或器官中或者在特定發(fā)育階段中特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，例如，腫瘤相關(guān) 抗原可以在正常條件下于胃組織中特異性表達(dá)，優(yōu)選地在胃粘膜中、在生殖器官（例如，睪 丸）中、在滋養(yǎng)層組織（例如，胎盤）中或者在生殖系細(xì)胞中，以及在一種或更多種腫瘤組 織或癌組織中表達(dá)或異常表達(dá)。在本上下文中，"有限數(shù)目"優(yōu)選地指不大于3,更優(yōu)選不大 于2。在本發(fā)明的上下文中，腫瘤相關(guān)抗原包括例如分化抗原，優(yōu)選細(xì)胞類型特異性分化抗 原，即，在正常條件下在處于特定分化階段的特定細(xì)胞類型中特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)；癌/睪 丸抗原，即，在正常條件下在睪丸中并且有時在胎盤中特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，以及生殖系特 異性抗原。在本發(fā)明的上下文中，腫瘤相關(guān)抗原優(yōu)選地與癌細(xì)胞的細(xì)胞表面締合，并且優(yōu)選 地在正常組織中不表達(dá)或僅很少表達(dá)。優(yōu)選地，腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤相關(guān)抗原的異常表達(dá) 可鑒定癌細(xì)胞。在本發(fā)明的上下文中，對象（例如，患有癌疾病的患者）中的癌細(xì)胞表達(dá)的 腫瘤相關(guān)抗原優(yōu)選地為所述對象中的自體蛋白。在一些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明上下中的 腫瘤相關(guān)抗原在正常條件下在非必需的組織或器官（即，在對象受到免疫系統(tǒng)損傷時不導(dǎo) 致死亡的組織或器官）或者機體的免疫系統(tǒng)無法接近或免疫系統(tǒng)很難接近的器官或結(jié)構(gòu) 中特異性表達(dá)。優(yōu)選地，在正常組織中表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原的氨基酸序列與在癌組織中表 達(dá)的腫瘤抗原的氨基酸序列相同。
[0095] 理想地滿足作為腫瘤免疫治療（特別是腫瘤疫苗接種）中的靶結(jié)構(gòu)之腫瘤相關(guān)抗 原標(biāo)準(zhǔn)的分化抗原的實例是密蛋白家族的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，例如CLDN18. 2。密蛋白是緊密 連接中最重要組分的一個蛋白質(zhì)家族，在緊密連接中，密蛋白構(gòu)成了細(xì)胞旁屏障，所述細(xì)胞 旁屏障控制上皮細(xì)胞之間的細(xì)胞間隙中的分子流動。密蛋白是四次跨膜的跨膜蛋白，其N 端和C端均位于細(xì)胞質(zhì)中。
[0096] 術(shù)語"密蛋白18"或"CLDN18"優(yōu)選地涉及人CLDN18并且包括任何剪接變體，例如 CLDN18 的 CLDN18. 1 和 CLDN18. 2。CLDN18. 1 和 CLDN18. 2 在包含第一個跨膜（TM)區(qū)和環(huán) 1 的N端部分存在差異，而C端的蛋白質(zhì)一級序列相同。
[0097] 術(shù)語"CLDN18. 1"優(yōu)選地涉及人CLDN18. 1，并且特別地涉及包含根據(jù)序列表的SEQ ID NO :1的氨基酸序列或所述氨基酸序列之變體的蛋白質(zhì)。
[0098] 術(shù)語"CLDN18. 2"優(yōu)選地涉及人CLDN18. 2,并且特別地涉及包含根據(jù)序列表的SEQ ID NO :2的氨基酸序列或所述氨基酸序列之變體的蛋白質(zhì)。
[0099] 根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語"變體"特別地指突變體、剪接變體、構(gòu)象、同種型、等位基因變 體、種變體（species variant)和種同源物（species homolog)，特別是天然存在的變體。 等位基因變體涉及基因正常序列中的改變，其顯著性通常不明顯。全基因測序通常鑒定出 給定基因的大量等位基因變體。種間同源物是與給定核酸或氨基酸序列具有不同物種起源 的核酸或氨基酸序列。
[0100] 術(shù)語"(：0^"、"(：0^18"、"(：0^18.1"和"(：0^18.2"應(yīng)涵蓋任何翻譯后修飾的變體 和構(gòu)象變體。
[0101] CLDN18. 2在正常組織中分化的胃粘膜上皮細(xì)胞中選擇性表達(dá)。CLDN18. 2在不同 來源的癌中表達(dá)并且由于其選擇性表達(dá)（在毒性相關(guān)的正常組織中不表達(dá)）和定位于質(zhì)膜 而特別適合作為用于開發(fā)抗體介導(dǎo)的癌癥免疫療法的靶結(jié)構(gòu)。例如，已發(fā)現(xiàn)，CLDN18. 2在 胰腺癌、食管癌、胃癌、支氣管癌、乳腺癌及ENT腫瘤中表達(dá)。CLDN18. 2是在預(yù)防和/或治療 原發(fā)腫瘤及其轉(zhuǎn)移中有價值的靶標(biāo)，所述原發(fā)腫瘤例如胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌例如非 小細(xì)胞肺癌（NSCLC)、卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌、頭頸癌和膽囊癌，所述轉(zhuǎn)移特別是胃癌轉(zhuǎn)移例 如Krukenberg腫瘤、腹膜轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞優(yōu)選為癌細(xì)胞，并且特 別地選自致瘤性胃癌細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、 肝癌細(xì)胞、頭頸癌細(xì)胞和膽囊癌細(xì)胞。
[0102] 根據(jù)本發(fā)明，表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞優(yōu)選特征在于細(xì)胞表面膜結(jié)合的CLDN18. 2， 艮P，CLDN18. 2與細(xì)胞表面締合。此外，根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞CLDN18. 2優(yōu)選地為細(xì)胞表面膜結(jié) 合的CLDN18. 2。表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞或特征在于CLDN18. 2與其細(xì)胞表面締合的細(xì)胞優(yōu)選 為癌細(xì)胞，優(yōu)選為來自本文所述之癌癥的癌細(xì)胞。
[0103] 術(shù)語"與細(xì)胞表面締合"指腫瘤相關(guān)抗原（例如CLDN18. 2)與細(xì)胞的質(zhì)膜締合并且 定位于細(xì)胞的質(zhì)膜，其中腫瘤相關(guān)抗原的至少一部分面向所述細(xì)胞的細(xì)胞外間隙并且從所 述細(xì)胞的外部可接近（accessible)，例如被位于細(xì)胞外部的抗體。在本上下文中，所述一部 分優(yōu)選地為至少4個、優(yōu)選至少8個、優(yōu)選至少12個、更優(yōu)選至少20個氨基酸。該締合可 以是直接的，也可以是間接的。例如，該締合可以是通過一個或更多個跨膜結(jié)構(gòu)域，一個或 更多個脂質(zhì)錨，或者通過與任何其他蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類或可見于細(xì)胞質(zhì)膜外葉（leaflet) 上的其他結(jié)構(gòu)的相互作用。例如，與細(xì)胞表面締合的腫瘤相關(guān)抗原可以是具有胞外部分的 跨膜蛋白質(zhì)或者可以是通過與作為跨膜蛋白質(zhì)的另一蛋白質(zhì)相互作用而與細(xì)胞表面締合 的蛋白質(zhì)。
[0104] "細(xì)胞表面"或"細(xì)胞的表面"根據(jù)其在本領(lǐng)域中的常規(guī)含義使用，因此包括易于被 蛋白質(zhì)和其他分子結(jié)合的細(xì)胞外部。
[0105] 根據(jù)本發(fā)明，如果表達(dá)和締合的水平與除胃以外的非癌組織中的表達(dá)和締合水平 相比超出不大于2倍，優(yōu)選1. 5倍，并且優(yōu)選地不超過在所述非癌組織中的表達(dá)和締合水 平，則CLDN18. 2在細(xì)胞中基本不表達(dá)并且基本不與細(xì)胞表面締合。優(yōu)選地，如果表達(dá)或締 合的水平低于檢出限和/或如果表達(dá)或締合的水平太低而不能被加至細(xì)胞的CLDN18. 2特 異性抗體結(jié)合，則CLDN18. 2在細(xì)胞中基本不表達(dá)并且基本不與細(xì)胞表面締合。
[0106] 根據(jù)本發(fā)明，如果表達(dá)和締合的水平超出在除胃以外的非癌組織中表達(dá)和締合的 水平，優(yōu)選大于2倍，優(yōu)選10倍、100倍、1000倍或10000倍，則CLDN18. 2在細(xì)胞中表達(dá)并 與細(xì)胞表面締合。優(yōu)選地，如果表達(dá)和締合的水平高于檢出限和/或如果表達(dá)和締合的水 平足夠高從而可以與被加至細(xì)胞的CLDN18. 2特異性抗體結(jié)合，則CLDN18. 2在細(xì)胞中表達(dá) 并與細(xì)胞表面締合。
[0107] 術(shù)語"抗體"指包含通過二硫鍵互聯(lián)的至少兩條重（H)鏈和兩條輕（L)鏈的糖蛋 白，并且包括任何包含其抗原結(jié)合部分的分子。術(shù)語"抗體"包括單克隆抗體及抗體片段或 衍生物，包括但不限于人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體（例如，scFv' s)和抗原結(jié) 合的抗體片段（例如，F(xiàn)ab和Fab'片段），術(shù)語"抗體"還包括抗體的所有重組體形式，例 如在原核細(xì)胞中表達(dá)的抗體、未糖基化的抗體以及本文所述的任何與抗原結(jié)合的抗體片段 及衍生物。每條重鏈由重鏈可變區(qū)（本文縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)構(gòu)成。每條輕鏈由輕鏈 可變區(qū)（本文縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)構(gòu)成。VH和VL區(qū)可進一步細(xì)分為稱為互補決定區(qū) (CDR)的高變區(qū)，它們散布在稱為構(gòu)架區(qū)（FR)的更保守區(qū)域中。每個VH和VL由三個CDR 和四個FR構(gòu)成，從氨基端至羧基端按以下順序排列：FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。 重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。抗體的恒定區(qū)可介導(dǎo)該免疫球蛋 白與宿主組織或因子的結(jié)合，所述宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞（例如，效應(yīng) 細(xì)胞）和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一成分（Clq)。
[0108] 本文所述的抗體可以是人抗體。本文使用的術(shù)語"人抗體"旨在包括具有來自人 生殖系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可包含不是由人生殖系 免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基（例如，通過體外隨機誘變或定點誘變或者通過體內(nèi)體 細(xì)胞突變引入的突變）。
[0109] 術(shù)語"人源化抗體"指具有基本來自非人物種免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點的分子， 其中所述分子其余的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)是基于人免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和/或序列。所述抗原結(jié) 合位點可包含融合到恒定結(jié)構(gòu)域上的完整可變結(jié)構(gòu)域，或者僅包含移接（graft)到可變結(jié) 構(gòu)域中適當(dāng)構(gòu)架區(qū)上的互補決定區(qū)（CDR)。抗原結(jié)合位點可以是野生型的，或者通過一個或 更多個氨基酸替換進行修飾，例如進行修飾以與人免疫球蛋白更為類似。某些形式的人源 化抗體保留了全部CDR序列（例如含有來自小鼠抗體的全部六個CDR的人源化小鼠抗體）。 其他形式具有一個或更多個相對于原始抗體而言發(fā)生了改變的CDR。
[0110] 術(shù)語"嵌合抗體"指這樣的抗體，其中每個重鏈和輕鏈氨基酸序列的一部分與來自 特定物種或者屬于特定類別的抗體中相應(yīng)序列同源，而該鏈的其余區(qū)段則與另一物種或?qū)?于另一類別的相應(yīng)序列同源。一般地，輕鏈和重鏈的可變區(qū)均模擬來自一個哺乳動物物種 之抗體的可變區(qū)，而恒定部分則與來自另一物種的抗體序列同源。這種嵌合形式的一個明 顯優(yōu)點是可使用易于獲得的B細(xì)胞或來自非人宿主生物體的雜交瘤從目前已知的來源方 便地產(chǎn)生可變區(qū)，而與其組合的恒定區(qū)來自例如人細(xì)胞制備物。所述可變區(qū)具有易于制備 的優(yōu)點，并且特異性不受來源的影響，而由于恒定區(qū)為人類的，因此該抗體在注射時引發(fā)人 類對象免疫應(yīng)答的可能性將比恒定區(qū)來自非人來源時更低。然而，定義不限于此具體實例。
[0111] 術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"（或簡稱為"結(jié)合部分"）或抗體的"抗原結(jié)合片 段"（或簡稱為"結(jié)合片段"）指抗體中保留特異性結(jié)合抗原之能力的一個或更多個片段。 已經(jīng)顯示，抗體的抗原結(jié)合功能可通過全長抗體的片段來實現(xiàn)。術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部 分"所涵蓋的結(jié)合片段的實例包括（i) Fab片段，由VL、VH、CL和CH結(jié)構(gòu)域組成的一價片段； (ii)F(ab' )2片段，包含通過鉸鏈區(qū)處的二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；（iii) 由VH和CH結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；（iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；（V) 由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段（Ward等，（1989) Nature 341 :544-546) ;(vi)分離的互補決定 區(qū)（CDR)，和（vii)可任選地通過合成接頭連接的兩個或更多個分離的⑶R的組合。此外，盡 管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH由單獨的基因編碼，但可使用重組方法通過合成接頭將它 們連接在一起，所述接頭使它們成為單個蛋白質(zhì)鏈，其中VL和VH區(qū)配對形成一價分子（稱 為單鏈 Fv (scFv)，參閱例如 Bird 等（1988) Science 242 :423-426 ;以及 Huston 等（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883)。這樣的單鏈抗體還旨在涵蓋于術(shù)語抗體的"抗 原結(jié)合片段"中。另一實例為包含以下部分的結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白：（i)與免疫 球蛋白鉸鏈區(qū)多肽融合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽，（ii)與該鉸鏈區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH2恒 定區(qū)，和（iii)與CH2恒定區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)。所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽可 以是重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)。所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白在US 2003/0118592 和US 2003/0133939中進一步公開。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得這些抗體片 段，并以與完整抗體相同的方式篩選所述片段的效用。
[0112] 本文所述的抗體可以是單克隆抗體。本文使用的術(shù)語"單克隆抗體"指具有單分 子組成的抗體分子制備物。單克隆抗體顯示單一結(jié)合特異性和親和性。在一個實施方案 中，單克隆抗體通過雜交瘤產(chǎn)生，所述雜交瘤包括與無限增殖化（immortalized)細(xì)胞融合 的得自非人動物（例如小鼠）的B細(xì)胞。
[0113] 本文所述的抗體可以是重組抗體。本文使用的術(shù)語"重組抗體"包括通過重組手 段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有抗體，例如（a)從免疫球蛋白基因為轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的 動物（例如小鼠）或由其制備的雜交瘤分離的抗體，（b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)所述抗體的宿主細(xì) 胞（例如轉(zhuǎn)染瘤）分離的抗體，（c)從重組的組合抗體文庫分離的抗體，和（d)通過涉及將 免疫球蛋白基因序列剪接成其他DNA序列的任何其他手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。
[0114] 本文使用的術(shù)語"轉(zhuǎn)染瘤"包括表達(dá)抗體的重組真核宿主細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞、 NS/0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞、植物細(xì)胞或真菌（包括酵母）細(xì)胞。
[0115] 本文使用的術(shù)語"異源抗體"以產(chǎn)生這種抗體的轉(zhuǎn)基因生物體進行定義。該術(shù)語 指這樣的抗體，其具有對應(yīng)于不由該轉(zhuǎn)基因生物體組成的生物體中可見的氨基酸序列或編 碼核酸序列的氨基酸序列或編碼核酸序列，并且通常來自與該轉(zhuǎn)基因生物體不同的物種。
[0116] 本文使用的術(shù)語"異源雜合抗體（heterohybrid antibody) "指具有不同生物來源 的輕鏈和重鏈的抗體。例如，具有與鼠類輕鏈連接的人重鏈的抗體是異源雜合抗體。
[0117] 本發(fā)明包括本文所述的為了本發(fā)明的目的由術(shù)語"抗體"涵蓋的所有抗體和抗體 衍生物。術(shù)語"抗體衍生物"指抗體的任何修飾形式，例如抗體與另一物質(zhì)（agent)或抗體 的綴合物或抗體片段。
[0118] 本文所述抗體優(yōu)選是分離的。本文使用的"分離的抗體"旨在指基本不含具有不 同抗原特異性之其他抗體的抗體。此外，分離的抗體可基本不含其他細(xì)胞材料和/或化學(xué) 物質(zhì)。
[0119] 根據(jù)本發(fā)明，在標(biāo)準(zhǔn)測定中，如果抗體對預(yù)定靶標(biāo)具有顯著的親和力并且與所述 預(yù)定靶標(biāo)結(jié)合，則所述抗體能夠與所述預(yù)定靶標(biāo)結(jié)合。通常通過平衡解離常數(shù)（KD)來測量 "親和力"或"結(jié)合親和力"。優(yōu)選地，術(shù)語"顯著的親和力"指以KT 5M或更低、KT6M或更低、 KT7M或更低、KT8M或更低、KT9M或更低、KTwM或更低、KT 11M或更低或者KT12M或更低的解 離常數(shù)（Kd)與預(yù)定靶標(biāo)結(jié)合。
[0120] 在標(biāo)準(zhǔn)的測定中，如果抗體對靶標(biāo)不具有顯著的親和力并且不與所述靶標(biāo)顯著地 結(jié)合，特別是不與之可檢測地結(jié)合，則所述抗體（基本）不能與所述靶標(biāo)結(jié)合。優(yōu)選地，如 果以高達(dá)2 ii g/ml、優(yōu)選10 ii g/ml、更優(yōu)選20 ii g/ml、特別是50 ii g/ml或100 ii g/ml或者更 高的濃度存在，則所述抗體不與所述靶標(biāo)可檢測地結(jié)合。優(yōu)選地，如果抗體與所述靶標(biāo)以與 預(yù)定之靶標(biāo)（所述抗體能夠與其結(jié)合）結(jié)合之K d相比高至少10倍、100倍、IO3倍、IO4倍、 IO5倍或IO6倍的Kd結(jié)合，則抗體對靶標(biāo)不具有顯著的親和力。例如，如果抗體與所述抗體 能夠與之結(jié)合的靶標(biāo)相結(jié)合的K d是KT7M,則抗體與對其不具有顯著親和力的靶標(biāo)相結(jié)合 的 Kd 可以是至少 10_6M、10_5M、10_4M、10_3M、KT 2M 或 101。
[0121] 如果抗體能夠與預(yù)定靶標(biāo)結(jié)合而不能與其他靶標(biāo)結(jié)合（即，在標(biāo)準(zhǔn)測定中對其他 靶標(biāo)沒有顯著的親和力并且不與其他靶標(biāo)顯著地結(jié)合），則所述抗體對所述預(yù)定靶標(biāo)具有 特異性。根據(jù)本發(fā)明，如果抗體能夠與CLDN18. 2結(jié)合但（基本）不能與其他靶標(biāo)（特別是除 密蛋白之外的蛋白質(zhì)，優(yōu)選除CLDN18之外的蛋白質(zhì)，特別是除CLDN 18.2之外的蛋白質(zhì)）結(jié) 合，則所述抗體對CLDN18. 2具有特異性。優(yōu)選地，如果與這些其他靶標(biāo)的親和力和結(jié)合沒 有顯著超過與密蛋白不相關(guān)的蛋白質(zhì)（例如，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA)、 酪蛋白、人血清白蛋白（human serum albumin，HSA)或非密蛋白跨膜蛋白質(zhì)（例如，MHC分 子或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體）或任何其他指定的多肽）的親和力或結(jié)合，則所述抗體對CLDN18. 2具 有特異性。優(yōu)選地，如果抗體與所述靶標(biāo)以與抗體對其不具有特異性的靶標(biāo)結(jié)合之Kd相比 低至少10倍、100倍、IO 3倍、IO4倍、IO5倍或IO6倍的Kd結(jié)合，則所述抗體對預(yù)定靶標(biāo)具有 特異性。例如，如果抗體與對其具有特異性之靶標(biāo)結(jié)合的K d是KT7M,則與對其非特異性的 靶標(biāo)結(jié)合的 Kd 可以是至少 1(T6M、1(T5M、1(T4M、1(T3M、KT 2M 或 1〇1。
[0122] 可使用任何合適的方法實驗性測定抗體與祀標(biāo)的結(jié)合；參見例如Berzofsky 等，"Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, ff. E.編， Raven Press New York, N Y(1984), Kuby, Janis Immunology, ff. H. Freeman and Company New York，N Y(1992)和本文中描述的方法。可使用常規(guī)技術(shù)容易地測定親和力，例如，通 過平衡透析；通過使用BIAcore 2000儀器，使用制造商所描述的通用方法；通過使用放射 標(biāo)記的祀抗原的放射免疫測定；或通過技術(shù)人員已知的其他方法。例如，可通過Scatchard 等，Ann N.Y. Acad. ScL，51 :660(1949)的方法分析親和力數(shù)據(jù)。如果在不同條件（例如，鹽 濃度、pH)下測量，則所測量的具體抗體-抗原相互作用的親和力可以不同。因此，親和力 和其他抗原-結(jié)合參數(shù)（例如，K D、IC5tl)的測量優(yōu)選地用抗體與抗原的標(biāo)準(zhǔn)化溶液以及標(biāo) 準(zhǔn)化緩沖液進行。
[0123] 本文使用的術(shù)語"同種型"指重鏈恒定區(qū)基因所編碼的抗體類別（例如，IgM或 IgGl)。根據(jù)本發(fā)明的抗體包括多克隆抗體和單克隆抗體，并包括IgG2a(例如，IgG2a、K、 入）、IgG2b (例如，IgG2b、K、A)、IgG3(例如，IgG3、K、X)和IgM抗體。然而，本發(fā)明還 涵蓋其他抗體同種型，包括IgGl、IgAl、IgA2、分泌性IgA、IgD和IgE抗體。
[0124] 本文使用的術(shù)語"同種型轉(zhuǎn)換（isotype switching) "指抗體的類別或同種型由一 個Ig類別變成另一 Ig類別的現(xiàn)象。
[0125] 本文使用的術(shù)語"重排"指重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的構(gòu)型，其中V區(qū)段在編 碼基本完整VH或VL結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象中分別位于緊鄰D-J或J區(qū)段的位置。重排的免疫球蛋 白（抗體）基因座可通過與生殖系DNA的比較來鑒定，重排的基因座將具有至少一個重組 的七聚體/九聚體同源性元件。
[0126] 涉及V區(qū)段時，本文使用的術(shù)語"未重排的"或"生殖系構(gòu)型"指其中V區(qū)段未重 組從而未與D或J區(qū)段緊鄰的構(gòu)象。
[0127] 根據(jù)本發(fā)明，抗體可來自不同物種，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。抗體 還包括嵌合分子，其中來自一個物種（優(yōu)選人）的抗體恒定區(qū)與來自另一物種的抗原結(jié)合 位點組合。此外，抗體包括人源化分子，其中來自非人物種的抗體的抗原結(jié)合位點與人來源 的恒定區(qū)和構(gòu)架區(qū)組合。
[0128] 抗體可通過多種技術(shù)產(chǎn)生，包括常規(guī)單克隆抗體法，例如Kohler和Milstein, Nature 256:495(1975)的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)。盡管原則上優(yōu)選體細(xì)胞雜交方案，但也可 以采用產(chǎn)生單克隆抗體的其他技術(shù)，例如B淋巴細(xì)胞的病毒或致癌性轉(zhuǎn)化，或者使用抗體 基因文庫的噬菌體展不技術(shù)。
[0129] 用于制備分泌單克隆抗體的雜交瘤的優(yōu)選動物系統(tǒng)是小鼠系統(tǒng)。小鼠中雜交瘤的 產(chǎn)生是已經(jīng)非常成熟的方案。分離用于融合的免疫化的（immunized)脾細(xì)胞的免疫操作和 技術(shù)為本領(lǐng)域所已知。融合伴侶（fusion partner)(例如小鼠骨髓瘤細(xì)胞）和融合方案也 是已知的。
[0130] 用于制備分泌單克隆抗體的雜交瘤的其他優(yōu)選動物系統(tǒng)為大鼠和兔系統(tǒng)（例如 Spieker-Polet 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92 :9348 (1995)所述，還可參閱 Rossi 等， Am. J. Clin. Pathol. 124 ：295 (2005)) 〇
[0131] 在另一優(yōu)選的實施方案中，針對CLDN18. 2的人單克隆抗體可使用攜帶部分人 免疫系統(tǒng)而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠來產(chǎn)生。這些轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小 鼠包括分別稱為HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，在本文中統(tǒng)稱為"轉(zhuǎn)基因小鼠"?？砂凑?W02004035607中對⑶20的詳細(xì)描述在這些轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生人抗體。
[0132] 產(chǎn)生單克隆抗體的另一策略是從產(chǎn)生確定特異性抗體的淋巴細(xì)胞中直接分 離編碼抗體的基因，參閱例如 Babcock 等，1996 ;A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificites。重組抗體工程的細(xì)節(jié)還可參閱 Welschof 和 Kraus，Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 和 Benny K.C.Lo Antibody Engineering ISBN1-58829-092-1。
[0133] 為了產(chǎn)生針對CLDN18. 2的抗體，可以如所述的，用來自CLDN18. 2序列的載體綴合 肽、重組表達(dá)的CLDN18. 2抗原或其片段的富集制備物和/或表達(dá)CLDN18. 2或其片段的細(xì) 胞來免疫接種小鼠?；蛘撸梢杂镁幋a全長人CLDN18. 2或其片段的DNA免疫接種小鼠。在 使用純化或富集的CLDN18. 2抗原制備物進行的免疫接種未產(chǎn)生抗體的情況中，還可以用 表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞（例如細(xì)胞系）免疫接種小鼠，以促進免疫應(yīng)答。
[0134] 可以用由尾靜脈或眶后取血獲得的血漿和血清樣品在免疫方案的全程中監(jiān)測免 疫應(yīng)答?？蓪⑿r足夠的抗CLDN18. 2免疫球蛋白小鼠用于融合?？梢栽谔幩啦⒄⒅?前3至5天用表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞腹腔內(nèi)或靜脈內(nèi)對小鼠進行加強免疫，以提高分泌特異 性抗體的雜交瘤的比率。
[0135] 為了產(chǎn)生生產(chǎn)CLDN18. 2單克隆抗體的雜交瘤，可從免疫接種的小鼠的淋巴結(jié)、脾 或骨髓分離細(xì)胞，并與適當(dāng)?shù)臒o限增殖細(xì)胞系（如小鼠骨髓瘤細(xì)胞系）融合。接著可針對抗 原特異性抗體的產(chǎn)生篩選得到的雜交瘤。接著可以通過ELISA對單個孔篩選分泌抗體的雜 交瘤。通過使用表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞進行的免疫熒光和FACS分析，可以鑒定對CLDN18. 2 具有特異性的抗體?？蓪⒎置谠摽贵w的雜交瘤重新鋪板，再次篩選，并且如果抗CLDN18. 2 單克隆抗體仍為陽性則可以通過有限稀釋進行亞克隆。接著可以體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆， 以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生抗體用于表征。
[0136] 本發(fā)明的抗體還可以在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中產(chǎn)生，例如使用本領(lǐng)域公知的重組DNA 技術(shù)與基因轉(zhuǎn)染方法的組合來進行（Morrison，S. (1985) Science 229:1202)。
[0137] 例如，在一個實施方案中，可將目的基因（如抗體基因）連接進表達(dá)載體（例如真 核表達(dá)質(zhì)粒）中，例如所用的通過WO 87/04462、W0 89/01036和EP 338 841中所公開的GS 基因表達(dá)系統(tǒng)或本領(lǐng)域公知的其他表達(dá)系統(tǒng)?？蓪в兴寺】贵w基因的純化質(zhì)粒引入真 核宿主細(xì)胞中，例如CHO細(xì)胞、NS/0細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞或HEK293細(xì)胞，或者其他真核細(xì)胞， 例如來自植物的細(xì)胞、真菌或酵母細(xì)胞。用于引入這些基因的方法可以是本領(lǐng)域已描述過 的方法，例如電穿孔、IipofectineUipofectamine或其他。將這些抗體基因引入宿主細(xì)胞 后，可以鑒定并選擇表達(dá)該抗體的細(xì)胞。這些細(xì)胞代表其后可擴增其表達(dá)水平并擴大規(guī)模 以生產(chǎn)抗體的轉(zhuǎn)染瘤。重組抗體可從這些培養(yǎng)物上清液和/或細(xì)胞中分離和純化。
[0138] 或者，克隆的抗體基因可以在其他表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，包括原核細(xì)胞例如微生物，例 如大腸桿菌（E. coli)。此外，抗體也可以在非人轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生，例如在綿羊和兔的乳汁 中或在雞蛋中產(chǎn)生，或者在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生，參閱例如Verma，R.，等（1998) J. Immunol. Meth. 216 :165-181 ;Pollock，等（1999) J. Immunol. Meth. 231 :147-157 以及 Fischer，R.， 等（1999)Biol. Chem. 380 :825-839。
[0139] 嵌合抗體是不同部分來自不同動物物種的抗體，例如具有來自小鼠抗體的可變區(qū) 和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體?？贵w的嵌合通過將小鼠抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)與人重鏈和 輕鏈恒定區(qū)連接在一起來實現(xiàn)（例如Kraus等，Methods in Molecular Biology series， Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 所述）。在一個優(yōu)選 的實施方案中，嵌合抗體通過將人K輕鏈恒定區(qū)與小鼠輕鏈可變區(qū)連接來產(chǎn)生。在另一優(yōu) 選的實施方案中，嵌合抗體可通過將人A輕鏈恒定區(qū)與小鼠輕鏈可變區(qū)連接來產(chǎn)生。用于 產(chǎn)生嵌合抗體的優(yōu)選重鏈恒定區(qū)為IgGl、IgG3和IgG4。用于產(chǎn)生嵌合抗體的另一些優(yōu)選 的重鏈恒定區(qū)為IgG2、IgA、IgD和IgM。
[0140] 抗體主要通過位于六個重鏈及輕鏈互補決定區(qū)（⑶R)中的氨基酸殘基與靶抗原 相互作用。因此，在單個抗體之間⑶R中的氨基酸序列比⑶R外的序列更為多樣。由于⑶R 序列負(fù)責(zé)大多數(shù)抗體-抗原相互作用，因此有可能通過構(gòu)建表達(dá)載體來表達(dá)模擬特定天然 抗體之特性的重組抗體，所述表達(dá)載體包含來自所述特定天然抗體的CDR序列，其移接到 來自具有不同特性的不同抗體的框架序列上（參閱例如Riechmann，L.等（1998)Nature 332 :323-327 Jones，P?等（1986)Nature 321 :522-525 以及 Queen，C?等（1989)卩1'〇。. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 :10029-10033)。這樣的框架序列可得自包含生殖系抗體基因序 列的公共DNA數(shù)據(jù)庫。這些生殖系序列將不同于成熟的抗體基因序列，因為它們將不包含 完整裝配的可變基因，其是在B細(xì)胞成熟過程中通過V(D)J連接形成的。生殖系基因序列 還將在均勻跨可變區(qū)的個別位置不同于高親和力次級全套抗體（secondary repertoire antibody)的序列。例如，體細(xì)胞突變在框架區(qū)1的氨基端部分和框架區(qū)4的羧基端部分 中相對少見。此外，許多體細(xì)胞突變不顯著改變抗體的結(jié)合特性。因此，為了重建具有與原 始抗體相似的結(jié)合特性的完整重組抗體，沒有必要獲得特定抗體的全部DNA序列（參閱WO 99/45962)?？缭紺DR區(qū)的部分重鏈和輕鏈序列對于該目的而言通常是足夠的。所述部分 序列用于確定哪些生殖系可變，并連接對重組抗體可變基因有貢獻(xiàn)的基因區(qū)段。接著使用 生殖系序列填補該可變區(qū)中缺少的部分。重鏈和輕鏈前導(dǎo)序列在蛋白質(zhì)成熟過程中被切割 掉，并對最終抗體的特性沒有貢獻(xiàn)。為了加入缺少的序列，可通過連接或PCR擴增將克隆的 cDNA序列與合成寡核苷酸組合?；蛘?，可以將全部可變區(qū)合成為一組短的重疊寡核苷酸，并 通過PCR擴增組合以產(chǎn)生全部的合成可變區(qū)克隆。這種方法具有一些優(yōu)點，例如消除或包 含特定的限制性位點，或者優(yōu)化特定的密碼子。
[0141] 使用來自雜交瘤的重鏈及輕鏈轉(zhuǎn)錄本的核苷酸序列來設(shè)計合成寡核苷酸的重 疊組，以產(chǎn)生與天然序列的氨基酸編碼能力相同的合成V序列。合成的重鏈和K鏈序 列可以以三種方式不同于天然序列：中斷了重復(fù)的核苷酸堿基串，以便于寡核苷酸合成 和PCR擴增；根據(jù)Kozak規(guī)則摻入了最佳翻譯起始位點（Kozak，1991，J. Biol. Chem. 266 : 19867-19870);以及翻譯起始位點上游的經(jīng)改造 HindIII位點。
[0142] 對于重鏈和輕鏈可變區(qū)而言，經(jīng)優(yōu)化的編碼鏈及相應(yīng)非編碼鏈的序列在相應(yīng)非編 碼寡核苷酸的大致中點處打斷成30-50個核苷酸。因此，對于每條鏈，可將所述寡核苷酸 裝配成為跨越150-400個核苷酸的區(qū)段的重疊雙鏈組。接著將該庫用作模板產(chǎn)生150-400 個核苷酸的PCR擴增產(chǎn)物。通常將單個可變區(qū)寡核苷酸組分為兩個庫，將它們各自擴增以 產(chǎn)生兩個重疊的PCR產(chǎn)物。接著通過PCR擴增來組合這些重疊產(chǎn)物，以形成完整的可變區(qū)。 在PCR擴增中還可能期望包括重鏈或輕鏈恒定區(qū)的重疊片段，以產(chǎn)生可容易地克隆進表達(dá) 載體構(gòu)建體的片段。
[0143] 接著將重建的嵌合或人源化重鏈及輕鏈可變區(qū)與克隆的啟動子序列、前導(dǎo)序列、 翻譯起始序列、恒定區(qū)序列、3'非翻譯序列、多聚腺苷酸化序列和轉(zhuǎn)錄終止序列組合，以形 成表達(dá)載體構(gòu)建體?？蓪⒅劓溂拜p鏈表達(dá)構(gòu)建體組合進單個載體，共轉(zhuǎn)染、連續(xù)轉(zhuǎn)染或分別 轉(zhuǎn)染進宿主細(xì)胞中，接著將其融合形成表達(dá)這兩種鏈的宿主細(xì)胞。描述了用于構(gòu)建人IgG K 表達(dá)載體的質(zhì)粒。構(gòu)建所述質(zhì)粒使得PCR擴增的V重鏈及V K輕鏈cDNA序列可用于重建 完整的重鏈及輕鏈小基因（minigene)。這些質(zhì)粒可用于表達(dá)全人抗體或者嵌合IgGl K或 IgG4 K抗體。可以構(gòu)建類似的質(zhì)粒用于表達(dá)其他重鏈同種型，或者表達(dá)包含A輕鏈的抗 體。
[0144] 因此，在本發(fā)明的另一方面，使用本文所述的抗CLDN18. 2抗體的結(jié)構(gòu)特征來產(chǎn)生 結(jié)構(gòu)上相關(guān)的人源化抗CLDN18. 2抗體，所述人源化抗CLDN18. 2抗體保留本發(fā)明抗體的 至少一種功能特性，例如結(jié)合CLDN18. 2。更具體地，可通過重組方式將小鼠單克隆抗體的 一個或更多個CDR區(qū)與已知的人框架區(qū)和CDR組合，以產(chǎn)生另外的經(jīng)重組改造的人源化抗 CLDN18. 2 抗體。
[0145] 抗體結(jié)合CLDN18. 2的能力可使用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測定進行測定，例如ELISA、Western印 跡、免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)分析。
[0146] 可以使用ELISA來證明經(jīng)免疫接種的小鼠的血清中存在抗體或者證明單克隆抗 體與CLDN18. 2蛋白或肽的結(jié)合?？梢允褂糜糜诿庖呓臃N的肽或蛋白質(zhì)來測定雜交瘤上清 液的特異性或分析血清滴度。
[0147] 為了證明經(jīng)免疫接種小鼠的血清中存在抗體或者證明單克隆抗體結(jié)合活細(xì)胞，可 以使用流式細(xì)胞術(shù)?？蓪⑻烊槐磉_(dá)或在轉(zhuǎn)染后表達(dá)抗原的細(xì)胞系以及缺乏抗原表達(dá)的陰性 對照（在標(biāo)準(zhǔn)生長條件下生長）與雜交瘤上清液中或含1% FBS的PBS中多種濃度的單克 隆抗體混合，并可在4°C下孵育30分鐘。洗滌后，可在與第一抗體染色相同的條件下使APC 或Alexa647標(biāo)記的抗IgG抗體與結(jié)合了抗原的單克隆抗體結(jié)合?？赏ㄟ^使用FACS儀器的 流式細(xì)胞術(shù)分析樣品，其中使用光散射和側(cè)散射特性對單個活細(xì)胞設(shè)置門控（gate)。為了 在單個測量中區(qū)分抗原特異性單克隆抗體與非特異性結(jié)合物，可以使用共轉(zhuǎn)染法。可以按 照上述對用編碼抗原和熒光標(biāo)記物的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進行染色。經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可在與 抗體染色細(xì)胞不同的熒光通道中檢測到。由于大部分轉(zhuǎn)染細(xì)胞同時表達(dá)兩種轉(zhuǎn)基因，因此 抗原特異性單克隆抗體優(yōu)先與表達(dá)熒光標(biāo)記的細(xì)胞結(jié)合，而非特異性抗體以相當(dāng)?shù)谋嚷逝c 未轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)合。作為流式細(xì)胞術(shù)測定的補充或替代，可以使用利用熒光顯微術(shù)的替代性 測定。可以完全如上所述對細(xì)胞進行染色，并通過熒光顯微術(shù)來檢查細(xì)胞。
[0148] 為了證明免疫接種的小鼠的血清中存在抗CLDN18. 2抗體或者證明單克隆抗體結(jié) 合表達(dá)CLDN18. 2的活細(xì)胞，可以使用免疫熒光顯微術(shù)分析。例如，在標(biāo)準(zhǔn)生長條件下，在補 充了 10%胎牛血清（FCS)、2mM L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和IOOii g/ml鏈霉素的DMEM/ F12培養(yǎng)基中，在載玻片（chamber slide)中培養(yǎng)自發(fā)或在轉(zhuǎn)染后表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞系 以及缺乏CLDN18. 2表達(dá)的陰性對照。接著將細(xì)胞用甲醇或多聚甲醛固定，或者不作處理。 接著可在25°C下使細(xì)胞與針對CLDN18. 2的單克隆抗體反應(yīng)30分鐘。洗滌后，可在相同條 件下使細(xì)胞與Alexa555標(biāo)記的抗小鼠 IgG第二抗體（Molecular Probes)反應(yīng)。接著通過 熒光顯微術(shù)檢查細(xì)胞。
[0149] 當(dāng)細(xì)胞用甲醇固定或多聚甲醛固定并用Triton X-100進行透化后，可觀察細(xì)胞中 的總CLDN18. 2水平。在活細(xì)胞和非透化的多聚甲醛固定細(xì)胞中，可以檢查CLDN18. 2的表 面定位。此外，可以通過用緊密連接標(biāo)記如Z0-1共染色來分析CLDN18. 2對緊密連接的靶 向。此外，可以檢查抗體結(jié)合以及細(xì)胞膜中CLDN18. 2定位的效果。
[0150] 還可以通過Western印跡來檢測抗CLDN18. 2IgG與CLDN18. 2抗原的反應(yīng)性。簡 言之，可以制備來自表達(dá)CLDN18. 2之細(xì)胞的細(xì)胞提取物和合適的陰性對照，并進行十二烷 基硫酸鈉（SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將分開的抗原轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉并 用待測試的單克隆抗體進行檢測。可以使用抗小鼠 IgG過氧化物酶檢測IgG結(jié)合，并用ECL 底物顯影。
[0151] 還可以按技術(shù)人員熟知的方式通過免疫組化來檢測抗CLDN18. 2小鼠 IgG與 CLDN18. 2抗原的反應(yīng)性，例如使用來自非癌組織或癌組織樣品的多聚甲醛或丙酮固定冷凍 切片或多聚甲醛固定的石蠟包埋組織切片，所述樣品在常規(guī)手術(shù)過程中得自患者，或者得 自接種了自主表達(dá)或在轉(zhuǎn)染后表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞系的攜帶異種移植腫瘤的小鼠。為進 行免疫染色，可以孵育與CLDN18. 2反應(yīng)的抗體，其后按照生產(chǎn)商的說明孵育綴合了辣根過 氧化物酶的山羊抗小鼠或山羊抗兔抗體。
[0152] 在本發(fā)明的方法中，用于測定CLDN18. 2的一個特別優(yōu)選的方法是免疫組化 (IHC)。免疫組化（IHC)指檢測組織切片的細(xì)胞中的抗原（例如，蛋白質(zhì)）的方法，例如，本 文所述組織的細(xì)胞。免疫組化染色廣泛用于診斷異常細(xì)胞，例如見于癌性腫瘤中的那些?？?以以多種方式實現(xiàn)抗體-抗原相互作用的可視化。在最常見的情況下，抗體綴合至酶，例如 可催化產(chǎn)生顏色之反應(yīng)的過氧化物酶?；蛘?，可以為抗體加以標(biāo)記熒光團，例如熒光素或羅 丹明。
[0153] 樣品的制備對于維持細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)和靶表位的抗原性是至關(guān)重要的。這要 求適當(dāng)?shù)慕M織收集、固定和切片。通常使用多聚甲醛來固定。根據(jù)目的和實驗樣品的厚度， 從目的組織切取?。s4至40 ym)的切片，或者如果組織不是非常厚并且可穿透，則其可 整體使用。通常通過使用顯微切片機來實現(xiàn)切片，并且將切片封片于載片上。
[0154] 樣品可能需要額外的步驟來使得表位可用于抗體結(jié)合，包括脫石蠟化和抗原修復(fù) (antigen retrieval)。通常，在免疫組化中使用去污劑（例如Triton X-100)來降低表面 張力，使得可以使用較少的試劑來實現(xiàn)樣品的更好且更均勻的覆蓋。
[0155] 免疫組化染色的直接方法是使用一種標(biāo)記抗體，其直接與所染抗原相結(jié)合。更常 用的免疫組化染色間接方法是使用一種針對待檢測抗原的抗體和針對第一抗體的第二標(biāo) 記抗體。
[0156] 為了減少IHC中的背景染色，用緩沖液孵育樣品，所述緩沖液封閉反應(yīng)位點，否則 第一抗體或第二抗體可與之結(jié)合。第一抗體針對目的抗原并且通常是非綴合（未標(biāo)記）的， 而第二抗體針對第一抗體物質(zhì)的免疫球蛋白。第二抗體通常與接頭分子（例如，生物素） 相綴合，其然后募集報告分子，或者第二抗體直接與報告分子本身相結(jié)合。常見的封閉緩沖 齊抱括正常血清、非脂奶粉、BSA或明膠以及市售封閉緩沖劑。
[0157] 報告分子基于檢測方法的性質(zhì)而不同，并且最常用的檢測方法分別是用酶介導(dǎo)的 生色檢測和熒光團介導(dǎo)的熒光檢測。對于生色報告分子，酶標(biāo)記物與底物反應(yīng)產(chǎn)生可以用 普通光學(xué)顯微鏡進行分析的強烈著色的產(chǎn)物。雖然酶底物的列表是廣泛的，但是堿性磷酸 酶（AP)和辣根過氧化物酶（HRP)是最廣泛地用作蛋白質(zhì)檢測標(biāo)記物的兩種酶。一系列生 色底物、熒光底物和化學(xué)致發(fā)光底物可與酶一起使用，包括DAB或BCIP/NBT。熒光報告分子 是用于IHC檢測的小的有機分子。對于生色和熒光檢測方法，信號的光密度分析可分別提 供半定量和全定量數(shù)據(jù)，以將報告分子信號的水平與蛋白表達(dá)水平或定位水平相關(guān)聯(lián)。
[0158] 在對靶抗原進行免疫組化染色后，通常進行第二染色以提供幫助凸顯第一染色的 反差。許多這些染色對離散的細(xì)胞室或抗原示出特異性，但其他染色將對整個細(xì)胞染色。生 色染料和熒光染料二者均可用于IHC以提供大量的試劑從而符合每個實驗設(shè)計。通常使用 蘇木精、Hoechst染色劑和DAPI。
[0159] 可以按照 Glenn E. Morris 在"Epitope Mapping Protocols(Methods in Molecular Biology)，' ISBN-089603-375-9 中和 Olwyn M. R. Westwood，F(xiàn)rank C. Hay 在 "Epitope Mapping :A Practical Approach'Tract i cal Approach Series, 248 中的詳細(xì)描 述進行抗體所識別表位的作圖（map)。
[0160] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"免疫效應(yīng)功能"包括免疫系統(tǒng)的組成所介導(dǎo)的任何功 能，其導(dǎo)致抑制腫瘤生長和/或抑制腫瘤發(fā)生，包括抑制腫瘤的擴散和轉(zhuǎn)移。優(yōu)選地，免疫 效應(yīng)功能導(dǎo)致殺傷癌細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明上下文中的免疫效應(yīng)功能是抗體介導(dǎo)的效應(yīng)功 能。這樣的功能包括補體依賴的細(xì)胞毒性作用（CDC)、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用 (ADCC)、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用（ADCP)、在攜帶腫瘤相關(guān)抗原的細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡 (例如，通過抗體與表面抗原的結(jié)合）、抑制CD40L介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（例如通過抗體與CD40 受體或CD40配體（CD40L)相結(jié)合），和/或抑制攜帶腫瘤相關(guān)抗原之細(xì)胞的增殖，優(yōu)選ADCC 和/或⑶C。因此，能夠介導(dǎo)一種或更多種免疫效應(yīng)功能的抗體優(yōu)選地能夠通過誘導(dǎo)⑶C介 導(dǎo)的裂解、ADCC介導(dǎo)的裂解、凋亡、同型黏著和/或吞噬作用（優(yōu)選通過誘導(dǎo)⑶C介導(dǎo)的裂 解和/或ADCC介導(dǎo)的裂解）來介導(dǎo)對細(xì)胞的殺傷?？贵w還可簡單地通過與癌細(xì)胞表面上 的腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合而發(fā)揮作用。例如，抗體可僅通過與癌細(xì)胞表面上的腫瘤相關(guān)抗原結(jié) 合來阻斷腫瘤相關(guān)抗原的功能或誘導(dǎo)凋亡。
[0161] ADCC描述了所述效應(yīng)細(xì)胞（特別是淋巴細(xì)胞）的細(xì)胞殺傷能力，這優(yōu)選地需要靶 細(xì)胞被抗體標(biāo)記。ADCC優(yōu)選在抗體結(jié)合癌細(xì)胞上的抗原并且抗體Fc結(jié)構(gòu)域結(jié)合免疫效應(yīng) 細(xì)胞表面的Fc受體（FcR)時發(fā)生。已經(jīng)鑒定出若干Fc受體家族，特定的細(xì)胞群特征性地 表達(dá)確定的Fc受體。ADCC可以看作是直接誘導(dǎo)不同程度的直接腫瘤破壞的機制，其還引起 抗原呈遞并誘導(dǎo)針對腫瘤的T細(xì)胞應(yīng)答。優(yōu)選地，ADCC的體內(nèi)誘導(dǎo)將引起針對腫瘤的T細(xì) 胞應(yīng)答和來自宿主的進一步抗體應(yīng)答。
[0162] CDC是可由抗體引導(dǎo)的另一細(xì)胞殺傷方法。對于補體活化，IgM是最有效的同種 型。IgGl和IgG3在通過經(jīng)典補體活化途徑引導(dǎo)⑶C方面也都非常有效。優(yōu)選地，在這一級 聯(lián)中，抗原-抗體復(fù)合物的形成導(dǎo)致緊鄰參與抗體分子（例如IgG分子）CH2結(jié)構(gòu)域的多個 Clq結(jié)合位點暴露出來（Clq是補體Cl的三種亞組分之一）。優(yōu)選地，這些暴露的Clq結(jié)合 位點將先前低親和力的Clq-IgG相互作用轉(zhuǎn)變成一種高親合力相互作用，這觸發(fā)了涉及一 系列其他補體蛋白的級聯(lián)事件，并引起效應(yīng)細(xì)胞趨化/活化劑C3a和C5a的蛋白水解釋放。 優(yōu)選地，該補體級聯(lián)最終形成膜攻擊復(fù)合物，它在細(xì)胞膜中產(chǎn)生孔，有利于水和溶質(zhì)自由穿 行于細(xì)胞內(nèi)外，并且可導(dǎo)致凋亡。
[0163] 本發(fā)明上下中的術(shù)語"免疫效應(yīng)細(xì)胞"涉及在免疫反應(yīng)期間發(fā)揮效應(yīng)功能的細(xì)胞。 例如，這樣的細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和/或趨化因子、殺傷微生物、分泌抗體、識別癌細(xì)胞以及 任選地清除這樣的細(xì)胞。例如，免疫效應(yīng)細(xì)胞包括T細(xì)胞（細(xì)胞毒性T細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、 腫瘤浸潤性T細(xì)胞）、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞。
[0164] 根據(jù)本發(fā)明的核酸優(yōu)選為脫氧核糖核酸（DNA)或核糖核酸（RNA)，更優(yōu)選為RNA， 最優(yōu)選為體外轉(zhuǎn)錄的RNA (IVT RNA)。根據(jù)本發(fā)明的核酸包括基因組DNA、cDNA、mRNA、重組 制備的和化學(xué)合成的分子。根據(jù)本發(fā)明的核酸可以是單鏈或雙鏈分子形式并且可以是線性 的或者共價閉合成環(huán)。核酸可以例如以RNA形式引入（即，轉(zhuǎn)染）細(xì)胞中，所述RNA可通過 體外轉(zhuǎn)錄從DNA模板來制備。此外，在使用之前，RNA可通過穩(wěn)定化序列、加帽和多聚腺苷 酸化來修飾。
[0165] 本文所述的核酸可包含在載體中。本文使用的術(shù)語"載體"包括本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的任何載體，包括質(zhì)粒載體、粘粒載體、噬菌體載體（例如A噬菌體）、病毒載體（例 如，腺病毒或桿狀病毒）或人造染色體載體（例如細(xì)菌人造染色體（BAC)、酵母人造染色體 (YAC)或Pl人造染色體（PAC))。所述載體包括表達(dá)以及克隆載體。表達(dá)載體包括質(zhì)粒載體 及病毒載體，并且一般包含期望的編碼序列和在特定宿主生物體（例如細(xì)菌、酵母、植物、 昆蟲或哺乳動物）中或在體外表達(dá)系統(tǒng)中有效連接的編碼序列之表達(dá)所必需的合適的DNA 序列。克隆載體一般用于改造和擴增某些期望的DNA片段，并且可缺少表達(dá)期望DNA片段 所需要的功能序列。
[0166] 可以使用其中抗體鏈存在于不同載體中的載體類型或者其中抗體鏈存在于相同 載體中的載體類型作為用于抗體表達(dá)的載體。
[0167] 本文中使用的術(shù)語"RNA"意為包含至少一個核糖核苷酸殘基的分子。"核糖核苷 酸"意為P -D-核呋喃糖部分的2'位為羥基的核苷酸。該術(shù)語包括雙鏈RNA、單鏈RNA、分 離的RNA(例如，部分純化的RNA)、基本上純的RNA、合成的RNA、重組產(chǎn)生的RNA以及通過添 力口、缺失、替換和/或改變一個或更多個核苷酸而不同于天然RNA的經(jīng)改變RNA。這樣的改 變可包括添加非核苷酸物質(zhì)，例如，添加到RNA的一個或更多個末端或內(nèi)部，例如，在RNA的 一個或更多個核苷酸處。RNA分子中的核苷酸也可包括非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸，例如非天然核苷酸或 化學(xué)合成的核苷酸或脫氧核苷酸。這些經(jīng)改變的RNA可稱為類似物或天然RNA之類似物。
[0168] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"RNA"包括并且優(yōu)選地涉及"mRNA"（即，信使RNA)，并且涉及可 以使用DNA作為模板產(chǎn)生且編碼肽或蛋白質(zhì)的"轉(zhuǎn)錄本（transcript)"。mRNA通常包含5' 非翻譯區(qū)、蛋白質(zhì)或肽編碼區(qū)和3'非翻譯區(qū)。mRNA在細(xì)胞中及在體外具有有限的半衰期。
[0169] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"轉(zhuǎn)錄"涉及其中將DNA序列中的遺傳密碼轉(zhuǎn)錄成RNA 的過程。
[0170] 根據(jù)本發(fā)明所述的核酸優(yōu)選是已經(jīng)分離的。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"分離的核酸"指該 核酸是（i)在體外擴增的，例如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴增，（ii)通過克隆重組產(chǎn)生 的，（iii)純化的，例如通過切割和凝膠電泳分級純化的，或者（iv)合成的，例如通過化學(xué) 合成。分離的核酸是可通過重組DNA技術(shù)操作的核酸。
[0171] 根據(jù)本發(fā)明，核酸可以單獨存在或與其他核酸組合存在，所述其他核酸可以是同 源或異源的。在一些優(yōu)選的實施方案中，核酸與表達(dá)控制序列功能性連接，所述表達(dá)控制序 列對于所述核酸可以是同源或異源的。術(shù)語"同源"指核酸還功能性地天然連接，而術(shù)語"異 源"指所述核酸不是功能性地天然連接。
[0172] 如果核酸與表達(dá)控制序列以所述核酸的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄處在所述表達(dá)控制序列的控 制或影響之下的方式彼此共價連接，則它們彼此"功能性"連接。如果該核酸待翻譯成功能 性蛋白質(zhì)，而其帶有與編碼序列功能性連接的表達(dá)控制序列，則所述表達(dá)控制序列的誘導(dǎo) 引起所述核酸的轉(zhuǎn)錄，而不導(dǎo)致編碼序列中的移碼或?qū)е滤鼍幋a序列不能翻譯成所需蛋 白質(zhì)或肽。
[0173] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"表達(dá)控制序列"或"表達(dá)控制元件"包括啟動子、核糖體結(jié)合位 點、增強子和調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄或mRNA翻譯的其他控制元件。在本發(fā)明的一些具體實施方案 中，所述表達(dá)控制序列可受到調(diào)節(jié)。表達(dá)控制序列的確切結(jié)構(gòu)可根據(jù)物種或細(xì)胞類型的功 能而變化，但通常包含分別參與轉(zhuǎn)錄和翻譯起始的5'非轉(zhuǎn)錄序列以及5'和3'非翻譯序 列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。更具體地，5'非轉(zhuǎn)錄表達(dá)控制序列包括啟動子 區(qū)，啟動子區(qū)包含用于轉(zhuǎn)錄控制功能性連接核酸的啟動子序列。表達(dá)控制序列還可包括增 強子序列或上游活化子序列。
[0174] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"啟動子"或"啟動子區(qū)"涉及這樣的核酸序列：其位于所表達(dá)核 酸序列的上游（5')，并通過提供RNA聚合酶的識別和結(jié)合位點來控制該序列的表達(dá)。"啟 動子區(qū)"可包括用于參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的其他因子的其他識別和結(jié)合位點。啟動子可控制 原核或真核基因的轉(zhuǎn)錄。此外，啟動子可以為"誘導(dǎo)型"，并可響應(yīng)于誘導(dǎo)物而起始轉(zhuǎn)錄，或 者如果轉(zhuǎn)錄不受誘導(dǎo)物的控制則可以為"組成型"。如果誘導(dǎo)劑不存在，則誘導(dǎo)型啟動子控 制下的基因不表達(dá)，或僅低程度地表達(dá)。存在誘導(dǎo)物時，該基因開始轉(zhuǎn)錄，或者轉(zhuǎn)錄水平提 高。一般而言，這通過特異性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合來介導(dǎo)。
[0175] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的啟動子包括用于SP6、T3和17聚合酶的啟動子、人U6RNA啟動 子、CMV啟動子及其人工雜合啟動子（如CMV)，其中啟動子的某一個或多個部分與其他細(xì)胞 蛋白質(zhì)（例如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脫氫酶）基因啟動子的某一個或多個部分融合，并 包含或不包含額外的內(nèi)含子。
[0176] 本文使用的術(shù)語"表達(dá)"以其最廣泛的意義使用，包括產(chǎn)生RNA或者RNA和蛋白質(zhì) /肽。就RNA而言，術(shù)語"表達(dá)"或"翻譯"特別地涉及產(chǎn)生肽或蛋白質(zhì)。表達(dá)可以是瞬時的 或穩(wěn)定的。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語表達(dá)還包括"異常表達(dá)"或"不正常表達(dá)"。
[0177] 根據(jù)本發(fā)明，"異常表達(dá)"或"不正常表達(dá)"意為與參照相比（例如未患有與某些蛋 白質(zhì)（例如，腫瘤相關(guān)抗原）的異常表達(dá)或不正常表達(dá)相關(guān)的疾病之對象的狀態(tài)），表達(dá)改 變（優(yōu)選升高）。表達(dá)的升高指升高至少10%，特別是至少20%，至少50%或至少100%或 者更多。在一個實施方案中，表達(dá)僅見于患病的組織，而健康組織中的表達(dá)被抑制。
[0178] 術(shù)語"特異性表達(dá)"意指蛋白質(zhì)基本上只在特定組織或器官中表達(dá)。例如，特異性 地在胃粘膜中表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原意指所述蛋白質(zhì)主要在胃粘膜中表達(dá)而在其他組織中 不表達(dá)或者在其他組織或器官類型中不顯著表達(dá)。因此，只在胃粘膜的細(xì)胞中表達(dá)并且在 任何其他組織中只以顯著較低的程度表達(dá)的蛋白質(zhì)是在胃粘膜細(xì)胞中特異性表達(dá)的。在一 些實施方案中，腫瘤相關(guān)抗原也可以在正常條件下在多于一種組織類型或器官中（例如， 在2種或3種組織類型或器官中，但優(yōu)選不多于3種不同的組織或器官類型中）特異性表 達(dá)。在這種情況下，則腫瘤相關(guān)抗原在這些器官中特異性表達(dá)。
[0179] 根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語"翻譯"涉及信使RNA鏈在細(xì)胞核糖體中引導(dǎo)氨基酸序列裝配 成蛋白質(zhì)或肽的過程。
[0180] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"核酸編碼"意為如果存在于合適的環(huán)境下（優(yōu)選在細(xì)胞中），核 酸可以被表達(dá)以產(chǎn)生其所編碼的蛋白質(zhì)或肽。
[0181] 術(shù)語"肽"包括寡肽和多肽，指包含通過肽鍵共價連接的兩個或更多個、優(yōu)選3個 或更多個、優(yōu)選4個或更多個、優(yōu)選6個或更多個、優(yōu)選8個或更多個、優(yōu)選9個或更多個、 優(yōu)選10個或更多個、優(yōu)選13個或更多個、優(yōu)選16個或更多個、優(yōu)選21個或更多個以及高 達(dá)優(yōu)選8、10、20、30、40或50個（尤其是100個）氨基酸的物質(zhì)。術(shù)語"蛋白質(zhì)"指大的肽， 優(yōu)選指具有超過100個氨基酸殘基的肽，但一般來說，術(shù)語"肽"和"蛋白質(zhì)"是同義詞，并 可在本文中可互換使用。
[0182] 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)和肽是已經(jīng)分離的。術(shù)語"分離的蛋白質(zhì)"或"分 離的肽"意指所述蛋白質(zhì)或肽已從其天然環(huán)境中被分離出來。分離的蛋白質(zhì)或肽可處于基 本上純化的狀態(tài)。術(shù)語"基本上純化的"意指所述蛋白質(zhì)或肽基本上不含與其在自然界中 或在體內(nèi)相締合的其它物質(zhì)。
[0183] 本文就特定氨基酸序列（例如序列表中所示的那些）而言給出的教導(dǎo)應(yīng)理解為還 涉及對所述特定序列的修飾（即，變體），所述修飾產(chǎn)生與所述特定序列功能等價的序列， 例如顯示與該特定氨基酸序列相同或相似的特性的氨基酸序列。一個重要的特性是保留抗 體與其靶標(biāo)的結(jié)合。優(yōu)選地，就特定序列而言進行了修飾的序列，當(dāng)其在抗體中替換該特定 序列時保留所述抗體與靶標(biāo)的結(jié)合。
[0184] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，特別地是可以修飾CDR序列、高變區(qū)和可變區(qū)的序列 而不喪失結(jié)合靶標(biāo)的能力。例如，CDR序列將與本文所述CDR序列相同或高度同源。
[0185] "高度同源"被認(rèn)為是可以產(chǎn)生1至5、優(yōu)選1至4例如1至3或1或2個替換。
[0186] 根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語"變體"還包括突變體、剪接變體、構(gòu)象、同種型、等位基因變體、 種變體和種同源物，特別是天然存在的那些。等位基因變體涉及基因正常序列中的改變，其 顯著性通常不明顯。全基因測序通常鑒定給定基因的大量等位基因變體。種間同源物是給 定核酸或氨基酸序列的具有不同物種來源的核酸或氨基酸序列。
[0187] 對于本發(fā)明的目的而言，氨基酸序列的"變體"包括氨基酸插入變體、氨基酸添加 變體、氨基酸缺失變體和/或氨基酸替換變體。在蛋白質(zhì)的N端和/或C端包含缺失的氨 基酸缺失變體還稱為N端和/或C端截短變體（truncation variant)。
[0188] 氨基酸插入變體包括在特定氨基酸序列中插入單個或兩個或更多個氨基酸。在具 有插入的氨基酸序列變體的情況中，向氨基酸序列的特定位點中插入一個或更多個氨基酸 殘基，但是隨機插入并對所產(chǎn)生的產(chǎn)物進行合適的篩選也是可能的。
[0189] 氨基酸添加變體包含氨基和/或羧基端融合一個或更多個氨基酸，例如1、2、3、5、 10、20、30、50或更多個氨基酸。
[0190] 氨基酸缺失變體以從序列中除去一個或更多個氨基酸（例如，除去1、2、3、5、10、 20、30、50或更多個氨基酸）為特征。所述缺失可以在蛋白質(zhì)的任何位置。
[0191] 氨基酸替換變體以序列中至少一個殘基被除去并在其位置中插入另一個殘基為 特征。優(yōu)選在氨基酸序列中同源的蛋白質(zhì)或肽之間非保守的位置處修飾和/或優(yōu)選將氨基 酸置換為其他具有相似特性的氨基酸。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)變體中的氨基酸改變是保守性氨基 酸改變，即替換帶有類似電荷的或不帶電荷的氨基酸。保守性氨基酸改變涉及替換與其側(cè) 鏈相關(guān)的氨基酸家族的一個。天然氨基酸通常分為四個家族：酸性的（天冬氨酸、谷氨酸）、 堿性的（賴氨酸、精氨酸、組氨酸）、非極性的（丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、 苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）和不帶電的極性的（甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、 絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸）氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時共同分類為芳香族氨基 酸。
[0192] 優(yōu)選地，給定氨基酸序列與所述給定氨基酸序列之變體的氨基酸序列之間的相似 度優(yōu)選同一性將為至少約 60%、65%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。優(yōu)選地相似度或同 一性針對氨基酸區(qū)域給出，所述氨基酸區(qū)域為參照氨基酸序列之全長的至少約10%、至少 約20 %、至少約30 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至 少約90%或約100%。例如，如果參照氨基酸序列由200個氨基酸組成，優(yōu)選地針對至少約 20、至少約40、至少約60、至少約80、至少約100、至少約120、至少約140、至少約160、至少 約180或約200個氨基酸給出相似度或同一性，優(yōu)選連續(xù)的氨基酸。在一些優(yōu)選的實施方 案中，針對全長的參照氨基酸序列給出相似度或同一性?？捎帽绢I(lǐng)域已知的工具進行用于 確定序列相似性（優(yōu)選序列同一性）的比對，優(yōu)選使用最佳序列比對，例如使用Align，采用 標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置，優(yōu)選 EMBOSS : :needle;Matrix:Blosum62;Gap Open 10.0 ;Gap Extend 0.5。
[0193] "序列相似性"指相同或表示保守性氨基酸替換的氨基酸的百分比。兩條氨基酸序 列之間的"序列同一性"指所述序列間相同的氨基酸的百分比。
[0194] 術(shù)語"百分比同一性"意指在最佳比對之后獲得的所比較的兩條序列之間相同 的氨基酸殘基所占的百分比，這一百分比完全是統(tǒng)計學(xué)意義上的，且兩序列之間的差異隨 機分布在其全長上。兩條氨基酸序列之間的序列比較通過在對其進行最佳比對后比較其 序列來常規(guī)地進行，所述比較通過區(qū)段或"比較窗"來進行，以鑒定和比較序列相似的局 部區(qū)域。除了手工產(chǎn)生以外，用于比較的序列最佳比對還可通過以下手段產(chǎn)生：Smith和 Waterman，1981，Ads App. Math. 2,482 的局部同源性算法，Neddleman 和 Wunsch，1970， J. Mol. Biol. 48,443 的局部同源性算法，Pearson 和 Lipman，1988，Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444的相似性檢索法或者使用這些算法的計算機程序（在Wisconsin Genetics軟 件包中的 GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，BLAST P，BLAST N 和 TFASTA，Genetics Computer Group， 575Science Drive, Madison, Wis. )〇
[0195] 通過以下方法計算百分比同一性：測定進行比較的兩個序列之間相同的位置數(shù)， 用該數(shù)除以進行比較的位置數(shù)，并用所得結(jié)果乘以100,從而得到這兩個序列之間的百分比 同一I"生。
[0196] 根據(jù)本發(fā)明的同源氨基酸序列表現(xiàn)出至少40%、特別是至少50%、至少60%、至 少70%、至少80%、至少90%以及優(yōu)選至少95%、至少98或至少99%的氨基酸殘基同一 性。
[0197] 本文所述的氨基酸序列變體可由本領(lǐng)域技術(shù)人員例如通過重組RNA操作容易地 制備。例如，Sambrook等（1989)中詳細(xì)描述了用于制備具有替換、添加、插入或缺失的蛋 白質(zhì)和肽的DNA序列操作。此外，本文所述的肽和氨基酸變體可以借助于已知的肽合成技 術(shù)（例如，固相合成和類似方法）容易地制備。
[0198] 本發(fā)明包括本文所述的肽或蛋白質(zhì)的衍生物，其涵蓋于術(shù)語"肽"和"蛋白質(zhì)"的范 圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明，蛋白質(zhì)和肽的"衍生物"為蛋白質(zhì)和肽的經(jīng)修飾形式。這樣的修飾包括 任何化學(xué)修飾并且包括與蛋白質(zhì)或肽相關(guān)之任何分子（例如碳水化合物、脂質(zhì)和/或蛋白 質(zhì)或肽）的單個或多個替換、缺失和/或添加。在一個實施方案中，蛋白質(zhì)或肽的"衍生物" 包括得自糖基化、乙?；⒘姿峄?、酰胺化、棕櫚?；?、豆蘧?；?、異戊二烯化、脂化、烷化、衍 生化、引入保護/封閉基團、蛋白質(zhì)水解切割或與抗體或者其他細(xì)胞配體相結(jié)合的那些經(jīng) 修飾的類似物。術(shù)語"衍生物"還延伸至所述蛋白質(zhì)和肽的全部功能性化學(xué)等同物。優(yōu)選 地，經(jīng)修飾的肽具有提高的穩(wěn)定性和/或提高的免疫原性。
[0199] 根據(jù)本發(fā)明，氨基酸序列、肽或蛋白質(zhì)的變體、衍生物、經(jīng)修飾形式、片段、部件 (part)或部分（portion)優(yōu)選地分別具有其所源于的氨基酸序列、肽或蛋白質(zhì)的功能特 性，即其為功能上等同的。在一個實施方案中，氨基酸序列、肽或蛋白質(zhì)的變體、衍生物、經(jīng) 修飾形式、片段、部件或部分分別與其所源于的氨基酸序列、肽或蛋白質(zhì)在免疫學(xué)上等同。 在一個實施方案中，功能特性是免疫學(xué)特性。
[0200] 根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語"衍生的"意指特定實體（特別是，特定序列）存在于得出該實 體的物質(zhì)（特別是生物體或分子）中。在氨基酸序列的情況下（尤其是特定的序列區(qū)）， "衍生的"特別意指相關(guān)氨基酸序列來自該序列存在于其中的氨基酸序列。
[0201] 術(shù)語"細(xì)胞"或"宿主細(xì)胞"優(yōu)選地為完整細(xì)胞，即具有完整膜的尚未釋放其正常 的細(xì)胞內(nèi)組分（例如，酶、細(xì)胞器或遺傳物質(zhì)）的細(xì)胞。完整細(xì)胞優(yōu)選地是有活力的細(xì)胞 (viable cell)，即能夠進行其正常代謝功能的活細(xì)胞（living cell)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語 "細(xì)胞"包括原核細(xì)胞（例如，大腸桿菌（E. coli))或真核細(xì)胞（例如，樹突細(xì)胞、B細(xì)胞、 CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、K562細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、HELA細(xì)胞、酵母細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞）。特別優(yōu)選 為哺乳動物的細(xì)胞，例如來自人、小鼠、倉鼠、豬、山羊和靈長類的細(xì)胞。所述細(xì)胞可以源自 大量組織類型，并且包括原代細(xì)胞和細(xì)胞系。術(shù)語"細(xì)胞"包括非癌細(xì)胞和癌細(xì)胞，例如本 文所公開的癌類型的細(xì)胞。
[0202] 包含核酸分子的細(xì)胞優(yōu)選地表達(dá)所述核酸所編碼的肽或蛋白質(zhì)。
[0203] "靶細(xì)胞"應(yīng)指作為免疫應(yīng)答之靶標(biāo)（例如抗體）的細(xì)胞。靶細(xì)胞包括任何非期望 的細(xì)胞，例如本文所述的癌細(xì)胞。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述靶細(xì)胞為表達(dá)CLDN18. 2 的細(xì)胞。表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞通常包括癌細(xì)胞。
[0204] 術(shù)語"轉(zhuǎn)基因動物"指具有包含一個或更多個轉(zhuǎn)基因（優(yōu)選抗體重鏈和/或輕鏈轉(zhuǎn) 基因）或轉(zhuǎn)染色體（transchromosome)(整合或不整合到動物的天然基因組DNA中）的基 因組的動物，并且其優(yōu)選能夠表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因。例如，轉(zhuǎn)基因小鼠可具有人輕鏈轉(zhuǎn)基因以及 人重鏈轉(zhuǎn)基因或人重鏈轉(zhuǎn)染色體，以使當(dāng)用CLDN18. 2抗原和/或表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞免 疫接種時，所述小鼠產(chǎn)生人抗CLDN18. 2抗體。可將人重鏈轉(zhuǎn)基因整合到小鼠的染色體DNA 中（如轉(zhuǎn)基因小鼠（例如，HuMb小鼠（例如，HC〇7或HC〇12小鼠））的情況那樣），或者可 以染色體外維持人重鏈轉(zhuǎn)基因（如WO 02/43478中描述的轉(zhuǎn)染色體（例如，KM)小鼠的情 況那樣）。通過進行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換，這樣的轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠可能能夠產(chǎn)生 針對CLDN18. 2的人單克隆抗體（例如，IgG、IgA和/或IgE)的多個同種型。
[0205] 術(shù)語"免疫等效"意為例如對于免疫作用的類型（例如誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)）、所誘 導(dǎo)的免疫反應(yīng)的強度和/或持續(xù)時間或者免疫反應(yīng)的特異性而言，免疫等效分子（例如免 疫等效氨基酸序列）表現(xiàn)出相同或基本相同的免疫特性和/或發(fā)揮相同或基本相同的免疫 作用。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"免疫等效"優(yōu)選地相對于用于免疫接種的肽或肽變體或 者抗體的免疫作用或特性而使用。特定的免疫特性是與抗體結(jié)合和（在適當(dāng)情況下）產(chǎn)生 免疫應(yīng)答（優(yōu)選地通過刺激抗體的產(chǎn)生）的能力。例如，如果所述氨基酸序列在暴露于對象 的免疫系統(tǒng)時誘導(dǎo)免疫反應(yīng)（優(yōu)選抗體），其具有與參照氨基酸序列（例如，形成CLDN18. 2 的一部分的參照氨基酸序列）反應(yīng)的特異性，則所述氨基酸序列與參照氨基酸序列免疫等 效。
[0206] 本發(fā)明提供了用于檢測樣品中CLDN18. 2抗原之存在或者測量CLDN18. 2抗原之量 的方法，其包括在允許抗體與CLDN18. 2之間形成復(fù)合物的條件下使所述樣品（和任選地， 對照樣品）與結(jié)合CLDN18. 2的本發(fā)明抗體相接觸。隨后檢測復(fù)合物的形成，其中所述樣品 與對照樣品相比，復(fù)合物形成之間的差異指示所述樣品中CLDN18. 2抗原是否存在。
[0207] 上文中描述的方法可特別地用于診斷CLDN18. 2相關(guān)疾病，例如癌疾病。優(yōu)選地， 樣品中CLDN18. 2的量高于參照或?qū)φ諛悠分蠧LDN18. 2的量指示所述樣品所來源的對象 (特別是人）中CLDN18. 2相關(guān)疾病的存在。
[0208] 當(dāng)用于上文所述的方法中時，可為本文所述的抗體提供發(fā)揮以下功能的標(biāo)記物： (i)提供可檢測信號；（ii)與第二標(biāo)記物相互作用以修飾所述第一或第二標(biāo)記物所提供的 可檢測信號，例如FRET(突光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)luorescence Resonance Energy Transfer); (iii)通過電荷、疏水性、形狀或其他物理參數(shù)影響遷移率（例如，電泳遷移率），或者（iv) 提供捕獲部分，例如親和力、抗體/抗原或離子絡(luò)合。適合作為標(biāo)記物的為以下結(jié)構(gòu)：例如 熒光標(biāo)記物、發(fā)光標(biāo)記物、發(fā)色團標(biāo)記物、放射性同位素標(biāo)記物、同位素標(biāo)記物，優(yōu)選穩(wěn)定的 同位素標(biāo)記物、同量異位素標(biāo)記物（isobaric label)、酶標(biāo)記物、顆粒標(biāo)記物（特別是金屬 顆粒標(biāo)記物、磁性顆粒標(biāo)記物、聚合物顆粒標(biāo)記物）、小有機分子（例如，生物素、受體的配 體或結(jié)合分子（例如，細(xì)胞黏附蛋白或凝集素））、可通過使用結(jié)合劑檢測的包含核酸和/或 氨基酸殘基的標(biāo)記物序列等。標(biāo)記物非限制性地包括硫酸鋇、碘西他酸、碘番酸、胺碘苯丙 酸隹丐（calcium ipodate)、泛影酸鈉、泛影葡胺、甲泛葡胺、酪泮酸鈉和放射診斷劑（包括正 電子發(fā)射體，（例如氣_18和碳-11)、Y發(fā)射體（例如，鵬-123、得_99m、鵬-131和鋼-111)、 核磁共振核素（例如，氟和釓））。
[0209] 根據(jù)本發(fā)明，"參照"（例如參照樣品或參照生物體）可用于與通過本發(fā)明方法獲 得的來自受試樣品或受試生物體的結(jié)果進行關(guān)聯(lián)和比較。所述參照生物體一般是健康生 物體，尤其是未患有疾?。ɡ纾┘膊。┑纳矬w。"參照值"或"參照水平"可通過測量 足夠大量的參照物而根據(jù)參照物來經(jīng)驗性地確定。優(yōu)選地，通過測量至少2個、優(yōu)選至少3 個、優(yōu)選至少5個、優(yōu)選至少8個、優(yōu)選至少12個、優(yōu)選至少20個、優(yōu)選至少30個、優(yōu)選至 少50個或優(yōu)選至少100個參照物來確定參照值。
[0210] 本文中使用的"降低"或"抑制"意為引起總體水平降低優(yōu)選5%或更高、10%或更 高、20%或更高、更優(yōu)選50%或更高并且最優(yōu)選75%或更高的能力。術(shù)語"抑制"或類似的 短語包括完全或基本完全的抑制，即降低至〇或基本降低至0。
[0211] 術(shù)語例如"升高"或"增強"優(yōu)選地涉及升高或增強約至少10%、優(yōu)選至少20%、 優(yōu)選至少30%、更優(yōu)選至少40%、更優(yōu)選至少50%、甚至更優(yōu)選至少80%并且最優(yōu)選至少 100%。
[0212] 本文所述的試劑、組合物和方法可用于診斷對象是否患病?？杀辉\斷的疾病涵蓋 所有表達(dá)CLDN18. 2的疾病。特別優(yōu)選的疾病是癌疾病，例如本文所述的癌疾病。
[0213] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"疾病"指任何病理狀態(tài)，包括癌疾病，特別是本文所述的那些癌 疾病形式。
[0214] 例如術(shù)語"正常組織"或"正常條件"中所用的術(shù)語"正常"指健康組織或者健康對 象中的條件，即，非病理條件，其中"健康"優(yōu)選地意為非癌性的。
[0215] 根據(jù)本發(fā)明，"涉及表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞的疾病"意為與健康組織或器官中的狀 態(tài)相比，患病的組織或器官之細(xì)胞中的CLDN18. 2的表達(dá)優(yōu)選地提高。所述提高指提高至少 10%,特別是至少20%、至少50%、至少100%、至少200%、至少500%、至少1000%、至少 10000%或者甚至更高。在一個實施方案中，表達(dá)僅見于患病組織，而健康組織中的表達(dá)被 抑制。根據(jù)本發(fā)明，涉及或與表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞相關(guān)的疾病包括癌疾病，特別是本文所 述的那些癌形式。
[0216] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"腫瘤"或"腫瘤疾病"指由細(xì)胞的異常生長造成的膨脹或病變 (稱為贅生性細(xì)胞（neoplastic cell)或腫瘤細(xì)胞）。"腫瘤細(xì)胞"意為通過迅速的、不受控 的細(xì)胞增殖而生長并且在引起該新生長的刺激停止之后繼續(xù)生長的異常細(xì)胞。腫瘤表現(xiàn)為 部分或完全缺乏結(jié)構(gòu)性組織（structrual organization)和與正常組織的功能性協(xié)調(diào)，并 且通常形成獨特的組織團塊，其可以是良性的、惡化前的或惡性的。
[0217] 良性腫瘤是缺乏癌癥的所有三種惡性特性的腫瘤。因此，按照定義，良性腫瘤不會 以無限制的侵略性方式生長，不會侵襲周圍組織，并且不會擴散至非鄰近組織（轉(zhuǎn)移）。良 性腫瘤的一般實例包括痣和子宮肌瘤。
[0218] 術(shù)語"良性"意味著溫和且非進展性的疾病，事實上很多類型的良性腫瘤對健康無 害。然而，一些由于其缺乏癌癥的侵襲特性而被定義為"良性腫瘤"的瘤（neoplasm)仍然 可產(chǎn)生負(fù)面的健康影響。其實例包括產(chǎn)生"占位效應(yīng)（mass effect) "（壓迫重要器官（例 如血管））的腫瘤或者可過度產(chǎn)生某些激素的內(nèi)分泌組織的"功能性"腫瘤（實例包括甲狀 腺腺瘤、腎上腺皮質(zhì)腺瘤和垂體腺瘤）。
[0219] 良性腫瘤通常被抑制其能夠以惡性方式表現(xiàn)的外表面所圍繞。在一些情況中，某 些"良性"腫瘤由于腫瘤之瘤細(xì)胞的亞群中另外的遺傳改變而在后期可引起惡性癌癥。該現(xiàn) 象顯著的一個實例是管狀腺瘤，一種普通類型的結(jié)腸息肉，其是結(jié)腸癌的重要先兆。管狀腺 瘤中的細(xì)胞，如頻繁發(fā)展成癌癥的大部分腫瘤一樣，顯示細(xì)胞成熟和外觀的某些異常，統(tǒng)稱 為發(fā)育異常。這些細(xì)胞異常在很少或從不轉(zhuǎn)變?yōu)榘┬缘牧夹阅[瘤中未見，但是見于其他不 形成離散團塊的癌前組織異常（例如子宮頸的癌前病變）中。一些機構(gòu)傾向?qū)l(fā)育異常的 腫瘤稱為"惡化前的（pre-malignant) "，而對于很少或從不引起癌癥的腫瘤保留術(shù)語"良 性"。
[0220] 瘤是由于瘤形成（neoplasia)產(chǎn)生的異常組織團塊。瘤形成（希臘語，新生長） 是細(xì)胞的異常增殖。細(xì)胞生長過度并且與其周圍的正常組織缺乏協(xié)調(diào)。生長持續(xù)以相同的 過度方式進行，甚至在刺激停止之后仍然如此。這通常引起腫塊（lump)或腫瘤。瘤可以是 良性的、惡化前的或惡性的。
[0221] 根據(jù)本發(fā)明的"腫瘤的生長"或"腫瘤生長"涉及腫瘤尺寸增加的趨勢和/或腫瘤 細(xì)胞增殖的趨勢。
[0222] 癌癥（醫(yī)學(xué)術(shù)語：惡性瘤）是一類疾病，其中一組細(xì)胞展現(xiàn)出不受控制的生長（超 過正常限制的分裂）、侵襲（侵入并且破壞鄰近組織）并且有時轉(zhuǎn)移（通過淋巴或血液擴散 至身體中的其他位置）。癌癥的這三種惡性特性將它們與良性腫瘤區(qū)分開，良性腫瘤有自限 性，并且不會侵襲或轉(zhuǎn)移。大部分癌癥形成腫瘤，但是有一些（如白血?。┎皇恰?br> [0223] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"癌"和"腫瘤"或"癌疾病"和"腫瘤疾病"在本文中一般可互換 用于指其中細(xì)胞表現(xiàn)出不受控生長和任選地侵襲和/或轉(zhuǎn)移的疾病。
[0224] 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的"癌疾病"以表達(dá)CLDN18. 2的細(xì)胞為特征。表達(dá)CLDN18. 2 的細(xì)胞優(yōu)選地為癌細(xì)胞，優(yōu)選為本文所述的腫瘤和癌。優(yōu)選地，該細(xì)胞是除胃細(xì)胞之外的細(xì) 胞。
[0225] 將癌癥通過類似腫瘤的細(xì)胞類型和由此假定腫瘤來源之組織進行分類。它們分別 是組織學(xué)和位置。
[0226] 根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語"癌"包括白血病、精原細(xì)胞瘤、黑色素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、成神 經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、腎上腺癌、甲狀腺癌、血液癌癥、皮膚癌、 腦癌、宮頸癌、腸癌、肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、腸癌、頭頸癌、胃腸癌、淋巴結(jié)癌、食管癌、結(jié)腸直腸 癌、胰腺癌、耳鼻喉（ENT)癌、乳腺癌、前列腺癌、子宮癌、卵巢癌和肺癌，及其轉(zhuǎn)移。其實例 有肺癌、乳癌（mamma carcinomas)、前列腺癌、結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌、宮頸癌或上述各類癌或腫 瘤的轉(zhuǎn)移。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語癌還包括癌轉(zhuǎn)移。
[0227] 肺癌的主要類型是小細(xì)胞肺癌（SCLC)和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)。有三種主要亞型 的非小細(xì)胞肺癌：鱗狀細(xì)胞肺癌、腺癌和大細(xì)胞肺癌。腺癌占肺癌的約10%。與小細(xì)胞肺 癌和鱗狀細(xì)胞肺癌（二者均傾向于位于更中心的位置）相反，這種癌通常見于肺的外周。
[0228] 根據(jù)本發(fā)明，"癌（carcinoma) "是源于上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。該組表示最常見的 癌癥，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和結(jié)腸癌的常見形式。
[0229] "轉(zhuǎn)移"指癌細(xì)胞從其原始部位擴散到身體的其他部位。轉(zhuǎn)移的形成是非常復(fù)雜的 過程，并依賴于惡性細(xì)胞從原發(fā)腫瘤中脫離、侵襲胞外基質(zhì)、透過內(nèi)皮基底膜以進入體腔和 血管以及其后由血液轉(zhuǎn)運后浸潤靶器官。最后，新腫瘤（即繼發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤）在靶 部位的生長依賴于血管發(fā)生。腫瘤轉(zhuǎn)移經(jīng)常甚至在切除原發(fā)腫瘤后發(fā)生，因為腫瘤細(xì)胞或 組分可能殘留并發(fā)展出轉(zhuǎn)移潛力。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語"轉(zhuǎn)移"涉及"遠(yuǎn) 端轉(zhuǎn)移"，這涉及遠(yuǎn)離原發(fā)腫瘤和局部淋巴結(jié)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移。
[0230] 繼發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤的細(xì)胞與原始腫瘤中的細(xì)胞類似。這意味著例如如果卵巢癌 轉(zhuǎn)移至肝，則所述繼發(fā)性腫瘤由異常的卵巢細(xì)胞（而不是異常的肝細(xì)胞）構(gòu)成。則肝中的 腫瘤被稱為轉(zhuǎn)移性卵巢癌（而不是肝癌）。
[0231] 當(dāng)某人再次被過去所患病癥影響時，則發(fā)生再發(fā)（relapse)或復(fù)發(fā) (recurrence)。例如，如果患者已經(jīng)患有癌疾病，并已接受所述疾病的成功治療，而再次發(fā) 生所述疾病，則所述新發(fā)疾病可被認(rèn)為是再發(fā)或復(fù)發(fā)。然而，根據(jù)本發(fā)明，癌疾病的再發(fā)或 復(fù)發(fā)可以（但不是必須地）發(fā)生在原始癌疾病的部位。因此，例如，如果患者已患有卵巢腫 瘤，并已接受成功的治療，則再發(fā)或復(fù)發(fā)可以是發(fā)生卵巢腫瘤或發(fā)生非卵巢部位的腫瘤。腫 瘤的再發(fā)或復(fù)發(fā)還包括其中腫瘤發(fā)生在不同于原始腫瘤的部位以及發(fā)生在原始腫瘤的部 位的情況。優(yōu)選地，原來的腫瘤（患者已針對其接受了治療）是原發(fā)腫瘤，而在不同于原始 腫瘤部位之部位的腫瘤是繼發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤。
[0232] "治療"意為向?qū)ο笫┯没衔锘蚪M合物以預(yù)防或消除疾病，包括使對象中的腫瘤 的尺寸或腫瘤的數(shù)目降低；阻滯或減緩對象中的疾病；抑制或減緩對象中新疾病的發(fā)展； 降低目前患有或先前曾患有疾病之對象中的癥狀和/或復(fù)發(fā)的頻率或嚴(yán)重程度；和/或延 長（即，提高）所述對象的壽命。
[0233] 特別地，術(shù)語"疾病的治療"包括疾病或其癥狀的治愈、縮短持續(xù)時間、減輕、預(yù)防、 減緩或抑制進展或惡化，或者預(yù)防或延緩發(fā)病。
[0234] "處于風(fēng)險"意為被鑒定為與一般人群相比具有高于疾病（特別是癌癥）發(fā)生正常 幾率的對象（即，患者）。此外，已患有或目前患有疾病（特別是癌癥）的對象是具有升高 的疾病發(fā)生風(fēng)險的對象，因為該對象可能繼續(xù)發(fā)生疾病。目前已患有或曾患有癌癥的對象 還具有升商的癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險。
[0235] 術(shù)語"免疫治療"涉及與特異性免疫反應(yīng)相關(guān)的治療。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語 例如"保護"、"預(yù)防"、"預(yù)防性的（prophylactic) "、"預(yù)防的（preventive) "或"保護性的 (protective) "涉及在對象中預(yù)防或治療或者預(yù)防并治療疾病的發(fā)生和/或傳播，特別地 減少對象將發(fā)生疾病的機會或者延遲疾病的發(fā)展。例如，有處于患如上所述腫瘤之風(fēng)險的 人可以是預(yù)防腫瘤之治療的候選者。免疫治療可以使用任意多種技術(shù)進行，其中藥劑起到 去除患者中表達(dá)抗原之細(xì)胞的作用。
[0236] 在某些實施方案中，免疫治療可以是主動免疫治療,其中治療依賴于通過施用免 疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑（例如,免疫反應(yīng)肽和核酸）在體內(nèi)刺激內(nèi)源宿主免疫系統(tǒng)針對患病細(xì)胞產(chǎn) 生反應(yīng)。
[0237] 在另一些實施方案中，免疫治療可以是被動免疫治療，其中治療涉及遞送具有成 熟的腫瘤免疫反應(yīng)性的藥劑（例如，抗體），其可直接或間接介導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)并且不必依賴 于完整的宿主免疫系統(tǒng)。
[0238] 術(shù)語"體內(nèi)"涉及對象中的情況。
[0239] 可互換地使用術(shù)語"對象"、"個體"、"生物體"或"患者"，其涉及脊椎動物，優(yōu)選哺 乳動物。例如，在本發(fā)明的上下中，哺乳動物是人、非人靈長類、家養(yǎng)動物（domesticated animal)(例如，犬、貓、綿羊、牛、山羊、豬、馬等）、實驗動物（例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠等） 以及圈養(yǎng)的動物（例如，動物園的動物）。本文使用的術(shù)語"動物"還包括人。術(shù)語"對象" 還可包括患者，即，患病的動物，優(yōu)選人，所述疾病優(yōu)選本文所述的疾病。
[0240] 根據(jù)本發(fā)明，"樣品"可以是根據(jù)本發(fā)明可用的任何樣品，特別是生物樣品，例如組 織樣品（包括體液）和/或細(xì)胞樣品，并可以以常規(guī)方式獲得，例如通過組織活檢（包括鉆 孔活檢）和通過采集血液、支氣管抽出物、痰、尿、排泄物或其他體液。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"樣 品"還包括經(jīng)加工的樣品，例如生物樣品的級分或分離物，例如核酸和肽/蛋白質(zhì)分離物。 優(yōu)選地，樣品包含待檢測（例如，待進行癌癥診斷）器官的細(xì)胞或組織。例如，如果待診斷 癌癥為肺癌，則樣品可包含從肺獲得的細(xì)胞或組織。
[0241] 根據(jù)本發(fā)明，樣品可以是例如來自含有腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞或者懷疑含有腫瘤細(xì)胞 或癌細(xì)胞之患者的身體樣品的樣品。所述身體樣品可以是任何組織樣品，例如血液、從原發(fā) 腫瘤或從腫瘤轉(zhuǎn)移獲得的組織樣品，或者任何其他包含腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞的樣品。
[0242] 通過下文的附圖和實施例對本發(fā)明進行了詳細(xì)描述，其僅用于說明目的并且無意 于進行限制。由于該描述和實施例，同樣包括于本發(fā)明中的其他實施方案對于本領(lǐng)域技術(shù) 人員而言是明顯的。
[0243] 附圖：
[0244] 圖1 :密蛋白18蛋白質(zhì)（人/小鼠）的序列比對
[0245] 該序列比對示出人與小鼠密蛋白18. 2之間和人密蛋白18. 1與密蛋白18. 2之間 的高同源性。
[0246] 圖2 :用于對小鼠進行免疫接種的包含CLDN18. 2的C-端部分（aal91_261)的重 組蛋白
[0247] 圖3 :43_14A和35-22A抗體的序列分析 實施例
[0248] 本文中描述或以本身已知的方式和例如在Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 2 版（1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，N.Y.中所描述的方式實施本文中使用的技術(shù)和方法。除非具體指明，否則根據(jù)制 造商說明實施所有包括試劑盒和試劑之使用的方法。
[0249] 實施例1 :單克隆抗體的產(chǎn)生
[0250] 該項目的目的是產(chǎn)生小鼠 CLDN-18特異性單克隆抗體，其能夠在胃CA、食管CA、胰 腺CA和肺CA FFPE組織中檢測表達(dá)CLDN18. 2的腫瘤細(xì)胞。
[0251] 為了產(chǎn)生高特異性，高親和力診斷性CLDN18. 2抗體，有必要用變化廣泛的不同免 疫原和佐劑開始免疫接種方案。在該項目期間，采用多種免疫接種策略對約100只小鼠 (C57B1/6和Balb/c)進行接種，以引發(fā)a -CLDN18免疫應(yīng)答。
[0252] 為了引發(fā)小鼠免疫系統(tǒng)并克服免疫耐受，我們采用病毒樣顆粒（VLP)、肽綴合物和 重組蛋白，所述重組蛋白編碼人CLDN18. 2的不同部分，其表達(dá)為與不同表達(dá)伴侶（標(biāo)簽） 的重組融合蛋白。
[0253] 在13種不同的免疫接種策略中，用帶有HIS-標(biāo)簽的CLDN18C端重組蛋白（參見圖 2;免疫接種#20)與多種佐劑的組合處理小鼠得到了最佳結(jié)果（參見表1，下文，融合35)。
[0254] 由4步免疫接種策略（30天）得到了一個候選物（35-22A)。按照7步免疫接種方 案（79天）產(chǎn)生了另一個候選物（43-14A)(參見表1，下文，融合43)。
[0255] 在脾切除術(shù)前兩天，對小鼠進行加強免疫以激活靶B細(xì)胞。
[0256] 在融合當(dāng)天，分離小鼠脾細(xì)胞，并與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系A(chǔ)g8. 653融合。我們按照 Kfihler和Milstein 1975公開的標(biāo)準(zhǔn)方案進行小鼠細(xì)胞與骨髓瘤的融合。HAT選擇之后， 在ELISA中測試上清液是否分泌識別用于免疫接種之抗原的抗體。
[0257] 對ELISA陽性上清液的雜交瘤細(xì)胞進行亞克隆，以產(chǎn)生單克隆雜交瘤，并且在 ELISA中對亞克隆的雜交瘤細(xì)胞的上清液進行再次篩選。擴增陽性克隆的雜交瘤細(xì)胞并對 上清液進行進一步分析。
[0258] 實施例2 :單克隆雜交瘤上清液的Western印跡篩選
[0259] 為了回答上清液中的ELISA陽性抗體是否能夠與來自穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的表達(dá)密蛋白 18之HEK293細(xì)胞之重組密蛋白18或蛋白質(zhì)裂解物相結(jié)合的問題，進行Western印跡分 析。擴增在Western印跡分析中能夠與密蛋白18特異性結(jié)合的抗體。凍存細(xì)胞，并通過 MABselect(FPLC)純化抗體。對通過Western印跡篩選選擇的抗體進行純化并通過免疫組 化評價其與福爾馬林固定的石蠟包埋組織（FFPE)中的其抗原的結(jié)合能力。
[0260] 實施例3 :組織學(xué)分析-Western印跡陽性抗體的第一篩選
[0261] 該實驗的目的是檢測抗體對CLDN18的特異性和靈敏度。通過使用表達(dá)CLDN18的 FFPE正常胃組織來完成該實驗。
[0262] 在第一個實驗中，在人胃FFPE切片上以0. 5 ii g/ml的濃度分析Western印跡測試 的經(jīng)純化抗體。在多種正常胃組織上將表現(xiàn)良好并且未產(chǎn)生大量背景的抗體進一步滴定 至0. 2&0. I ii g/ml以測試靈敏度和特異性。在后來的研究階段中，直接以0. 2 ii g/ml的濃 度對新產(chǎn)生的抗體進行測試，這是因為最佳抗體已在0. g/ml下表現(xiàn)得非常好并充當(dāng)基 準(zhǔn)。選擇在受試人胃組織的粘膜上皮上產(chǎn)生強信號而在相鄰粘膜組織上無背景的抗體進行 進一步滴定實驗及特異性分析。有兩種抗體表現(xiàn)突出：35-22A和43-14A。參見下表2和3。
[0263] 在癌組織上對在受試正常胃組織上產(chǎn)生強信號的抗體進行進一步分析。使相應(yīng) 的雜交瘤細(xì)胞適應(yīng)于不含血清的培養(yǎng)基。使用mumAb 43-14A產(chǎn)生的信號比使用mumAb 35-22A產(chǎn)生的信號稍強；參見下表4。
[0264] 實施例4 :組織學(xué)深度分析和抗體表征
[0265] 使用無血清產(chǎn)生的抗體對胃CA組織微陣列（TMA)進行染色。分析染色案例的量、 信號強度和陽性腫瘤細(xì)胞的量。
[0266] mumAb 35-22A和43-14A的染色強度優(yōu)異。染色模式?jīng)]有顯著差異，并且受試抗體 35-22A與43-14A之間在染色強度方面僅檢測到細(xì)微的差異。
[0267] 實施例5 :使用正常組織組（panel)分析抗體特異性
[0268] 在多種相關(guān)正常組織上對所選抗體進行檢測，以確保高CLDN18靶特異性；參見下 表5A和5B。
[0269] 在先前的實驗中，沒有觀察到抗體35-22A與43-14A之間在染色模式和染色強度 方面的顯著差異。因此，用更貼近臨床的方案對抗體進行染色實驗。為了模擬在標(biāo)準(zhǔn)病理 學(xué)實驗室中采用的染色方法，構(gòu)建具有短時（1小時）第一抗體孵育步驟的一天方案。
[0270] 在所有分析的案例中，mumAb 43-14A均表現(xiàn)極佳，并且甚至比mumAb 35-22A更 好；參見下表6。
[0271] 實施例6 :在相關(guān)組織-呼吸系統(tǒng)上皮上進行的深度分析
[0272] 另在多種相關(guān)呼吸系統(tǒng)組織上對mumAb 43-14A進行分析以確保其特異性，尤其 是在肺/支氣管的靶組織中。對于這些組織而言，報道了 CLDN18.1的表達(dá)。為了分析診斷 抗體是否與肺/支氣管表達(dá)的CLDN18. 1同種型交叉反應(yīng)，對全部可得到的肺/支氣管組織 進行篩選。用肺和支氣管組織未檢測到信號；參見下表7。抗體43-14A不識別在這些呼吸 系統(tǒng)組織中表達(dá)的CLDN18同種型。
[0273] 實施例7 :mumAb 43-14A和35-22A的表位作圖
[0274] 進行肽ELISA以鑒定CLDN18. 2上的抗體結(jié)合表位。對每個經(jīng)純化抗體進行涵蓋 CLDN18. 2的C端序列的重疊肽測試。35-22A和43-14A均示出與作圖為肽TEDEVQSYPSKHDYV 的表位特異性結(jié)合。以下序列被確定為反應(yīng)序列：EVQSYPSKHDYV。
[0275] 實施例8 :mumAb 43-14A和35-22A的序列分析
[0276] 抗體43-14A和35-22A的序列分析示于圖3中。
[0277] 實施例9 :對不同癌組織進行染色
[0278] 在4%福爾馬林緩沖固定的石蠟包埋樣品載片上進行免疫組化（IHC)。石蠟包埋 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進行。
[0279] 在脫石蠟化之后，通過在120°C的補充有0.05 % Tween-20 (pH 6.0)的IOmM檸 檬酸中煮沸10分鐘來對所有載片進行抗原修復(fù)，接著淬滅（用2% H2O2)封閉并用0. 2至 0. g/ml診斷小鼠抗CLNDN18. 2單克隆抗體43-14A或35-22A在4°C下孵育過夜。使用基 于聚合物的 Powervision 抗體（Power Vision HRP 山羊抗小鼠；Immunologic，Duiven，The Netherlands)和底物顯色液（VectorRed ;Vector Labs，Burlingame，USA)用辣根過氧化 物酶標(biāo)記的第二抗體對抗體結(jié)合進行可視化。然后，用Mayer的蘇木精（Carl Roth GmbH, Karlsruhe，Germany)對切片進行復(fù)染，并由評定者進行評價。
[0280] 組織學(xué)評估
[0281] 考慮每個切片的陽性染色腫瘤細(xì)胞與所有可見腫瘤細(xì)胞的相對比例，分析所有樣 品。將染色強度分為陰性（_)、弱陽性（1+)、中度陽性（2+)和強陽性（3+)。只有膜染色被 視為是陽性的。人胃組織作為每個染色的陽性對照。由于PanIN(胰腺上皮內(nèi)瘤變）是頻 現(xiàn)的強陽性，也將這些區(qū)域視為強陽性（3+)的染色強度內(nèi)參。
[0282] 在胰腺癌組織、食管癌組織和胃癌組織中，兩種抗體均產(chǎn)生強的膜信號（表8)，或 者抗體43-14A在肺癌組織中產(chǎn)生強的膜信號（表9)。不同腫瘤情況之間，陽性腫瘤細(xì)胞的 數(shù)目在個體之間不同。所分析的樣品最大部分為2+至3+陽性。
[0283]

【權(quán)利要求】
1. 抗體或其抗原結(jié)合片段，其 (i) 與具有氨基酸序列 TEDEVQSYPSKHDYV(SEQ ID NO :5)或EVQSYPSKHDYV(SEQ ID NO : 6)的肽相結(jié)合，和/或 (ii) 與密蛋白18.2(CLDN18.2)相結(jié)合，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段通過至少與 CLDN18. 2 中具有氨基酸序列 TEDEVQSYPSKHDYV(SEQID NO :5)或EVQSYPSKHDYV(SEQ ID NO : 6)的表位相結(jié)合從而與CLDN18. 2相結(jié)合。
2. 權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述CLDN18. 2是細(xì)胞表面膜結(jié)合的 CLDN18. 2。
3. 權(quán)利要求1或2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述CLDN18. 2存在于癌細(xì)胞 上。
4. 權(quán)利要求3所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述癌細(xì)胞是表達(dá)CLDN18. 2的癌細(xì) 胞。
5. 權(quán)利要求3或4所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述癌細(xì)胞選自胃癌細(xì)胞、食管 癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、頭頸癌細(xì)胞和膽囊癌 細(xì)胞。
6. 權(quán)利要求1至5中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其不與除胃上皮細(xì)胞以外 的非癌細(xì)胞相結(jié)合。
7. 權(quán)利要求1至6中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其不與非癌肺細(xì)胞相結(jié)合。
8. 權(quán)利要求1至5中任一項所述的抗體，其為嵌合抗體、人抗體或人源化抗體。
9. 權(quán)利要求1至8中任一項所述的抗體，其為單克隆抗體。
10. -種抗體，其選自： (i) 由以如下登記號保藏之克隆產(chǎn)生的或能夠從其獲得的抗體：DSM ACC3144(muAB 43-14A)或 DSM ACC3143(muAB 35-22A); (ii) 為（i)中所述抗體的嵌合形式或人源化形式的抗體； (iii) 具有（i)中所述抗體之特異性的抗體； 以及 (iv) 包含（i)中所述抗體之抗原結(jié)合部分或抗原結(jié)合位點的抗體； 或者 (i)至（iv)中任一項所述抗體的抗原結(jié)合片段。
11. 權(quán)利要求10所述的抗體，其中（i)中所述抗體的抗原結(jié)合部分或抗原結(jié)合位點包 含（i)中所述抗體的可變區(qū)。
12. -種綴合物，其包含與至少一個可檢測標(biāo)記物偶聯(lián)的權(quán)利要求1至11中任一項的 抗體或抗原結(jié)合片段。
13. -種雜交瘤，其能夠產(chǎn)生權(quán)利要求1至11中任一項所述的抗體。
14. 以登記號 DSM ACC3144(muAB 43-14A)或 DSM ACC3143(muAB 35-22A)保藏的雜交 瘤。
15. -種用于在樣品中檢測CLDN18. 2或測定CLDN18. 2的量的方法，其包括以下步驟： (i)使樣品與權(quán)利要求1至11中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段或者權(quán)利要求12 所述的綴合物相接觸，和 (ii)檢測所述抗體、所述抗原結(jié)合片段或所述綴合物與CLDN18. 2之間復(fù)合物的形成 或測定復(fù)合物的量。
16. -種用于確定細(xì)胞是否表達(dá)CLDN18. 2的方法，其包括以下步驟： (i) 使細(xì)胞樣品與權(quán)利要求1至11中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段或者權(quán)利要求 12所述的綴合物相接觸，和 (ii) 檢測所述抗體、所述抗原結(jié)合片段或所述綴合物與所述樣品中的細(xì)胞所表達(dá)的 CLDN18. 2之間復(fù)合物的形成。
17. -種用于診斷、檢測或監(jiān)測癌癥的方法，其包括以下步驟： (i) 使生物樣品與權(quán)利要求1至11中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段或者權(quán)利要求 12所述的綴合物相接觸，和 (ii) 檢測所述抗體、所述抗原結(jié)合片段或所述綴合物與CLDN18. 2之間復(fù)合物的形成 和/或測定復(fù)合物的量。
18. -種用于確定癌癥是否能夠通過靶向CLDN18. 2的癌癥療法來治療的方法，其包括 以下步驟： (i) 使包含癌細(xì)胞的樣品與權(quán)利要求1至11中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段或者 權(quán)利要求12所述的綴合物相接觸，和 (ii) 檢測所述抗體、所述抗原結(jié)合片段或所述綴合物與CLDN18. 2之間復(fù)合物的形成。
19. 一種診斷測試試劑盒，其包含權(quán)利要求1至11中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片 段或者權(quán)利要求12所述的綴合物。
20. 權(quán)利要求1至11中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段，權(quán)利要求12所述的綴合 物，權(quán)利要求13或14所述的雜交瘤，或權(quán)利要求15至18中任一項所述的方法，其中所述 CLDN18. 2包含序列表的SEQ ID NO :2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的變體。
【文檔編號】C07K16/30GK104321345SQ201380024247
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2013年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月9日
【發(fā)明者】烏爾·沙欣, 厄茲萊姆·圖雷奇, 里塔·米特納赫特-克勞斯, 斯特凡·韋爾 申請人:加尼梅德藥物公司, 約翰·古騰堡大學(xué)美因茲醫(yī)學(xué)大學(xué)轉(zhuǎn)化腫瘤學(xué)公司