抗-ErbB2抗體變異體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗-ErbB2抗體變異體或其抗原結(jié)合片段、對這些進行編碼的核酸分子及它們的用途。本發(fā)明的抗體變異體能夠以高的親和度與ErbB2相結(jié)合。因此，上述抗體變異體即使使用少量也能有效地預(yù)防或治療癌。
【專利說明】抗-ErbB2抗體變異體
[0001] 【相關(guān)申請的交叉引用】
[0002] 本申請是2013年4月26日提交的國際申請的國家階段，其要求2012年5月8日 提交的韓國專利申請No. 2012-0048805的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。 【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0003] 本發(fā)明涉及抗_ErbB2抗體變異體或其抗原結(jié)合片段、對這些進行編碼的核酸分 子及它們的用途。 【【背景技術(shù)】】
[0004] 眾所周知，HER2 (ErbB2)作為 EGFR (ErbBl)、HER3 (ErbB3)及 HER4 (ErbB4)等受 體酪氨酸激酶（receptor tyrosin kinase)的一個種類，存在于細胞膜，并對細胞的生 長、分化及生存起到重要的作用（Jaclyn et al. Clin Breast Cancer. 8:38-49(2008))。 HER2與其他HER家族蛋白不同，不會以依賴性的方式對配體進行活性化，而是始終以活性 化的狀態(tài)起作用，并且，通常在正常細胞中，在細胞膜中表達約20000個左右，但在癌細胞 中，過度表達約在正常細胞中的表達量的100倍即約20000000個左右（Shepard et al. J Clin Immunol. 11:117-127(1991))。這種 HER2 的過度表達不僅過度誘導(dǎo) HER2-HER2 同 型二聚體（homodimer)，還過度誘導(dǎo)與作為其他HER家族的HERl或HER3的異源二聚體 (heterodimer)，其結(jié)果，引發(fā)細胞的增殖及生長，促進變形為癌細胞（Mayumi et al.Clin Cancer Res. 12:7242-7251 (2006))。
[0005] 到目前為止，在乳腺癌（25-30 % )、卵巢癌（15-30% )、胃癌（23% )、肺癌 (11-32%)、腎癌（30-40%)、直腸癌（17-90 %)、胰腺癌（26-45 %)、膀胱癌（44%)、前 列腺癌（12% )及頭頸癌（29-39% )等多種癌細胞中報告了 HER2的過度表達（Cancer Tmmunol Immunother 53:166-175 (2004) ;Clin Cancer Res 12:4377s_4383s(2006) ;Br J Cancer 91:1195-1199(2004) ;Cancer 94:2584-2589(2002) ;Cancer 98:66-73(2003); Int J Oncol 27 :681-685(2005) ；Int J Pancreatol 17:15-21(1995) ；Int J Cancer 87:349-359(2000) ;Ann Oncol 12:S15-S19(2001) J Pathol 204:317-325(2004))。并 且，在子宮內(nèi)膜癌、涎腺癌、結(jié)腸癌及甲狀腺癌中觀察到了 HER2的過度表達（Science 229:974(1985) ；Lancet ： 1:765-767(1986) ；Mol Cell Biol.6:955-958(1986) ；0ncogene Res.3:21-31 (1988) ；0ncogene 4:81-88(1989) ；Cancer Res. 51:1034(1991) ；Gynecol. Oncol,38:364 (1990) ；Cancer Res. 50:421-425 (1990) ；Cancer Res. 50:5184 (1990)； Cancer Res.49:6605 (1989) ；Mol.Carcinog. 3:254-257 (1990) ；Br.J.Cancer 57:358-363(1988) ;Pathobiology59:46-52(1991) ;Cancer 65:88-92(1990))。
[0006] 將HER2作為祀的抗癌治療劑由美國基因泰克（Genentech)公司研發(fā)，且唯一的 是從1998年開始銷售的赫賽?。℉ereeptill?,曲妥珠單抗（Trastuzumab)，4D5)，適應(yīng) 癥為將過度表達HER2的轉(zhuǎn)移性乳腺癌或早期乳腺癌與其他抗癌劑一同并用用藥（J. Clin. Oncol. 17:2639-2264(1999))。已知赫賽汀作用于HER2的細胞外域IV，并抑制HER2-HER2 之間的同型二聚體的生成，抑制癌細胞的生存和增殖（Ann Oncol 18:977-984(2007))。
[0007] 但據(jù)報告，作為HER2靶抗癌治療劑，雖然赫賽汀已獲得成功，但當單獨用藥時，呈 現(xiàn)出12-34%左右的反應(yīng)效果，當并用用藥時，呈現(xiàn)出38-50%左右的反應(yīng)效果，并且，當單 獨用藥時，2-7%呈現(xiàn)出異常的心臟疾病，當并用用藥時，11-28%呈現(xiàn)出異常的心臟疾病， 而在10位女性中的一位左右因擔心會增加已具有的心臟疾病的危險而無法接受赫賽汀的 藥物治療（N Engl J Med 357:39-51 (2007))。因此，需要研發(fā)副作用少于赫賽汀的后續(xù)抗 體，當前，美國基因泰克（Genetech)公司所研發(fā)的奧密塔克（Omnitarg)在臨床第三階段 (Clin Cancer Res 12:4436s_4440s (2006))。但是，奧密塔克（Omnitarg)與赫賽汀相比， 雖然在副作用方面具有優(yōu)點，但存在功效下降的缺點?；谶@種理由，急需新的HER2抗體 或其改善的形態(tài)，例如親和性或功效等得到增加的4D5抗體變異體。
[0008] 通常，獲得對抗原的高親和度抗體由于露出的抗原的表面受限而變得困難。尤 其，這種現(xiàn)象在從幼稚（naive)噬菌體展示文庫執(zhí)行體外篩選（in vitro selection)時 更容易發(fā)生。因此，從幼稚噬菌體展示文庫通常所獲得的抗體的親和度僅為IO-IOOnM左右 (Iwai et al. Protein Eng Des Sel. 23:185-193 (2010))〇
[0009] 用于提高抗體的親和度的方法可分為隨機方法（random approach)和靶方法 (targeted approach) (Sheedy et al. Biotechnol Adv. 5 (4) :333-52 (2007))。祀突變誘 發(fā)（Targeted mutagenesis)為針對特定CDR或FR,即特定氨基酸給予突變的方法，可利用 革巴聚合酶鏈式反應(yīng)（targeted PCR)、Q)R步行（O)R walking)、定點誘變（site-directed mutagenesis)及⑶R祀熱點（O)R target hotspot)等方法。隨機突變誘發(fā)（Random mutagenesis)為針對可變域給予變異的方法，可利用易錯聚合酶鏈式反應(yīng)（error-prone PCR)、DNA 改組及鏈改組等方法（Kim et al. Adv Drug Deliv Rev. 58:657-667(2006))。將 利用這種方法制備的多種變異體制成文庫，并經(jīng)由通過在噬菌體的表面展示多種變異體 文庫，來進行篩選的過程。此外，也利用酵母展示及核糖體展示（Rader et al. Curr Opin Biotechnol.8:503-508(1997) ;Zahnd et al.J Biol Chem.279 (18):18870-18877(2004))。
[0010] 在本說明書全文中，參照了多篇論文及專利文獻，并表示了其引用。所引用的論文 及專利文獻的公開內(nèi)容全部插入于本說明書作為參照，從而更加明確地說明本發(fā)明所屬的

【技術(shù)領(lǐng)域】的水平及本發(fā)明的內(nèi)容。
[0011] 【發(fā)明概述】
[0012] 本發(fā)明人為了研發(fā)抗原親和度及癌細胞增殖抑制活性比對ErbB2的人源化抗體 的4D5得到改善的抗體變異體而努力。結(jié)果，制備了與母源抗體相比，表達更高的抗原親和 度和癌細胞增殖抑制活性的抗_ErbB2抗體變異體。
[0013] 因此，本發(fā)明的目的在于，提供抗-ErbB2抗體變異體或其抗原結(jié)合片段。
[0014] 本發(fā)明的再一目的在于，提供對上述抗體變異體或其抗原結(jié)合片段的重鏈可變域 進行編碼的核酸分子。
[0015] 本發(fā)明的另一目的在于，提供對上述抗體變異體或其抗原結(jié)合片段的輕鏈可變域 進行編碼的核酸分子。
[0016] 本發(fā)明的還有一目的在于，提供癌的預(yù)防或治療用藥劑學(xué)組合物。
[0017] 本發(fā)明的又一目的在于，提供癌的預(yù)防或治療方法。
[0018]


【發(fā)明內(nèi)容】
、發(fā)明要求保護范圍及附圖使本發(fā)明的其他目的及優(yōu)點更加明確。 【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0019] 圖1表示表達用于展示scFv的額外的轉(zhuǎn)錄體的載體的一部分?？勺x框可對OmpA 分泌信號序列、輕鏈可變域（VJ、連接序列（L)、重鏈可變域（Vh)、c-myc標簽序列及病毒衣 殼蛋白進行編碼。
[0020] 圖2為用于篩選生產(chǎn)與ErbB2相結(jié)合的scFv-ρ?π分子的E. COli克隆的單克隆 ELISA結(jié)構(gòu)的圖表。
[0021] 圖3對人源化抗體4D5的重鏈可變域（SEQ ID NO :1)、AH06和A058的重鏈可變域 (SEQ ID NO :3)、AH16 的重鏈可變域（SEQ ID NO :4)及 A091 的重鏈可變域（SEQ ID NO :6) 的氨基酸序列進行比較并示出。
[0022] 圖4對人源化抗體4D5、AH06、AH16的輕鏈可變域（SEQ ID NO :2)、A058的輕鏈可 變域（SEQ ID NO :5)及A091的輕鏈可變域（SEQ ID NO :7)的氨基酸序列進行比較并示出。
[0023] 圖5表示在動物細胞中生產(chǎn)及純化的本發(fā)明的抗-ErbB2抗體變異體的SDS-PAGE 結(jié)果。
[0024] 圖6至圖8表示對抗-ErbB2抗體變異體的細胞增殖抑制活性的分析結(jié)果。圖6 : D98W ;圖7 :A058和A091 ;圖8 :AH06和AH16。在NCI-N87細胞中經(jīng)6天的時間評價了純化 的 IgG。
[0025] 【發(fā)明詳述】
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的一實施方式，本發(fā)明提供抗_ErbB2抗體變異體或其抗原結(jié)合片段， 上述供抗_ErbB2抗體變異體或其抗原結(jié)合片段包含：（a)輕鏈可變域，以及（b)重鏈可變 域，具有選自主要由以下氨基酸取代組成的組中的2種以上的氨基酸取代：在SEQ ID NO :1 的氨基酸序列中，基于卡巴特編號系統(tǒng)（Kabat numbering system)的位置41的Pro被Arg 取代，位置96的Gly被Asn取代，位置97的Gly被Ala取代，位置98的Asp被Trp取代， 位置98的Asp被Lys取代，位置100b的Ala被Ser取代，位置100c的Met被Phe取代，位 置101的Asp被Ala取代，位置101的Asp被Val取代，位置102的Tyr被His取代，位置 102的Tyr被Leu取代。
[0027] 本發(fā)明人為了研發(fā)抗原親和度及癌細胞增殖抑制活性比對ErbB2的人源化抗體 的4D5得到改善的抗體變異體而努力。結(jié)果，制備了與母源抗體相比，表達更高的抗原親和 度和癌細胞增殖抑制活性的抗_ErbB2抗體變異體。
[0028] 以下，進行詳細說明。
[0029] 【I·抗_ErbB2抗體變異體及其抗原結(jié)合片段】
[0030] 本發(fā)明的抗體變異體對ErbB2具有特異性結(jié)合力。
[0031] 在本說明書中所使用的術(shù)語"抗體變異體（antibody variant) "是指包含對ErbB2 的人源化抗體4D5的重鏈可變域和/或輕鏈可變域中的分別取代2種以上的氨基酸的可變 域的氨基酸取代變異體。即，本發(fā)明通過取代母源抗體4D5的重鏈和/或輕鏈可變域中的 特定位置的氨基酸，來提供抗原親和力及癌細胞增殖抑制活性得到改善的抗體變異體。
[0032] 如在以下實施例中所確認，本發(fā)明的抗體變異體與作為母源抗體的4D5相比，對 ErbB2的親和力最大提高8倍（表5)，并且與4D5相比，以優(yōu)秀約3. 5倍的活性來抑制胃癌 細胞的增殖（圖8)。
[0033] 上述4D5抗體的重鏈可變域包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列，4D5抗體的輕鏈可 變域包含SEQ ID NO : 2的氨基酸序列。
[0034] 本發(fā)明的抗體變異體不僅包含完整的抗體形態(tài)，還包含抗體分子的抗體片段。
[0035] 完整的抗體為具有2個整體長度的輕鏈及2個整體長度的重鏈的結(jié)構(gòu)，各輕鏈以 二硫鍵方式與重鏈相連接。重鏈恒定區(qū)具有Υ、μ、α、δ及ε類型，作為亞類具有Y 1、 Y 2、Y 3、Y 4、α 1及α 2。輕鏈的恒定區(qū)具有κ及λ類型。
[0036] 抗體分子的抗原結(jié)合片段或抗體片段是指保持抗原結(jié)合功能的片段，包含F(xiàn)ab、 F(ab'）、F(ab'）2及Fv等?？贵w片段中的Fab作為具有輕鏈及重鏈的可變域和輕鏈的恒 定區(qū)及重鏈的第一個恒定區(qū)（Chi)的結(jié)構(gòu)，具有1個抗原結(jié)合部位。Fab'在重鏈Cm域的 C-末端包含具有1種以上的半胱氨酸殘基的鉸鏈區(qū)（hinge region),在這一方面與Fab有 所不同。Fab'的鉸鏈區(qū)的半胱氨酸殘基形成二硫鍵，并生成F(ab'）2抗體。Fv為僅具有重 鏈可變域及輕鏈可變域的最小的抗體片，用于生成Fv片段的重組技術(shù)公開于PCT國際公 開專利申請 W088/10649、W088/106630、W088/07085、W088/07086 及 W088/09344 中。雙鏈 Fv (two-chain Fv)以非共價鍵方式連接重鏈可變域與輕鏈可變域，單鏈Fv (single-chain Fv) -般通過連接肽將重鏈的可變域與單鏈的可變域以共價鍵方式相連接，或者在C-末端 直接連接，從而可像雙鏈Fv-樣形成如同二聚體的結(jié)構(gòu)。這種抗體片段可利用蛋白水解酶 獲得（例如，若利用木瓜蛋白酶限制切割整個抗體，則可獲得Fab，若利用胃蛋白酶切割，則 可獲得F (ab'）2片段），優(yōu)選地，可通過基因重組技術(shù)制備。
[0037] 在本發(fā)明中，抗體優(yōu)選為Fv形態(tài)或完整的抗體形態(tài)。并且，重鏈恒定區(qū)可選自Y、 μ、α、δ或ε中的一種同型。恒定區(qū)優(yōu)選為Yl(IgGl)、Y3(IgG3)或Y4(IgG4)。輕鏈 恒定區(qū)可以為κ或λ型。
[0038] 在本說明書中所說明的術(shù)語"重鏈"是指包含用于對抗原賦予特異性的具有充分 的可變域序列的氨基酸序列的可變域V h及包含3個恒定域Cm、Ch2及Ch3的整體長度重鏈及 其片段。并且，在本說明書中所說明的術(shù)語"輕鏈"是指包含用于對抗原賦予特異性的具有 充分的可變域序列的氨基酸序列的可變域 '及恒定域Q的整體長度輕鏈及其片段。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，上述重鏈可變域包含以下氨基酸取代：
[0040] (i)在SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中，基于卡巴特編號系統(tǒng)的位置98的Asp被Trp 取代，位置100c的Met被Phe取代，位置101的Asp被Ala取代，位置102的Tyr被Leu取 代（SEQ ID NO :3);
[0041] (ii)在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中，基于卡巴特編號系統(tǒng)的位置96的Gly被 Asn取代，位置97的Gly被Ala取代，位置98的Asp被Lys取代，位置100b的Ala被Ser 取代，位置100c的Met被Phe取代，位置101的Asp被Val取代，位置102的Tyr被His取 代（SEQ ID NO :4);或
[0042] (iii)在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中，基于卡巴特編號系統(tǒng)的位置41的Pro被 Arg取代，位置98的Asp被Trp取代，位置100c的Met被Phe取代，位置101的Asp被Ala 取代，位置102的Tyr被Leu取代（SEQ ID NO :6)。
[0043] 在本說明書中，在說明上述重鏈可變域的氨基酸取代的過程中所提及的基于卡巴 特編號系統(tǒng)的位置41是指SEQ ID NO: 1的第41位氨基酸，即Pro,位置96是指SEQ ID NO: 1的第100位氨基酸，即Gly，位置97是指SEQ ID NO : 1的第101位氨基酸，即Gly，位置98 是指SEQ ID NO :1的第102位氨基酸，即Asp，位置IOOb是指SEQ ID NO :1的第106位氨 基酸，即Ala，位置IOOc是指SEQ ID NO: 1的第107位氨基酸，即Met，位置101是指SEQ ID NO :1的第108位氨基酸，即Asp，位置102是指SEQ ID NO :1的第109位氨基酸，即Tyr。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，上述輕鏈可變域包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列或包含 以下氨基酸取代：2種以上的氨基酸取代選自主要由以下取代組成的組中，在SEQ ID NO :2 的氨基酸序列中，基于卡巴特編號系統(tǒng)的位置50的Ser被Thr取代，位置51的Ala被Thr 取代，位置52的Ser被Thr取代，位置53的Phe被Trp取代，位置54的Leu被Pro取代， 位置72的Thr被Ser取代，位置91的His被Tyr取代，位置93的Thr被Gln取代，位置93 的Thr被Asn取代，位置96的Pro被Ala取代，位置96的Pro被Val取代，位置97的Thr 被Ser取代。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選實例，上述輕鏈可變域包含以下氨基酸取代：
[0046] (i)在SEQ ID NO :2的氨基酸序列中，基于卡巴特編號系統(tǒng)的位置93的Thr被Gln 取代，位置96的Pro被Ala取代，位置97的Thr被Ser取代（SEQ ID NO :5);或
[0047] (ii)在SEQ ID NO :2的氨基酸序列中，基于卡巴特編號系統(tǒng)的位置50的Ser被 Thr取代，位置51的Ala被Thr取代，位置52的Ser被Thr取代，位置53的Phe被Trp取 代，位置54的Leu被Pro取代，位置72的Thr被Ser取代，位置91的His被Tyr取代，位 置93的Thr被Asn取代，位置96的Pro被Val取代（SEQ ID NO : 7)。
[0048] 在本說明書中，在說明上述輕鏈可變域的氨基酸取代的過程中所提及的基于卡巴 特編號系統(tǒng)的位置50是指SEQ ID NO :2的第50位氨基酸，S卩Ser，位置51是指SEQ ID NO: 2的第51位氨基酸，即Ala，位置52是指SEQ ID NO :2的第52位氨基酸，即Ser，位置53是 指SEQ ID NO : 2的第53位氨基酸，即Phe，位置54是指SEQ ID NO : 2的第54位氨基酸，即 Leu，位置72是指SEQ ID NO :2的第72位氨基酸，即Thr，位置91是指SEQ ID NO :2的第 91位氨基酸，即His，位置93是指SEQ ID NO :2的第93位氨基酸，即Thr，位置96是指SEQ ID NO :2的第96位氨基酸，即Pro,位置97是指SEQ ID NO :2的第97位氨基酸，即Thr。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，本發(fā)明的抗體變異體或其抗原結(jié)合片段包含：(a)重鏈 可變域，選自主要由SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4及SEQ ID NO :6組成的組中；以及（b)輕 鏈可變域，選自主要由SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :5及SEQ ID NO :7組成的組中。
[0050] 根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選實例，本發(fā)明的抗體變異體或其抗原結(jié)合片段包含以下輕鏈 可變域及重鏈可變域：
[0051] ⑴SEQ ID NO : 2的輕鏈可變域及SEQ ID NO : 3的重鏈可變域；
[0052] (ii) SEQ ID NO :2的輕鏈可變域及SEQ ID NO :4的重鏈可變域；
[0053] (iii) SEQ ID NO :5的輕鏈可變域及SEQ ID NO :3的重鏈可變域；或
[0054] (iv) SEQ ID NO :7的輕鏈可變域及SEQ ID NO :6的重鏈可變域。
[0055] 本發(fā)明的抗體包含單一克隆抗體、多特異性抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗 體、單鏈Fvs(scFV)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab'）片段、二硫鍵Fvs(sdFV)及抗-獨特型 (抗-Id)抗體和上述抗體的表位結(jié)合片段等，但并不局限于此。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，本發(fā)明的抗體為人源化抗體（humanized antibody)。
[0057] 本發(fā)明的抗體變異體或抗體片段在可特異性地識別HER2的范圍內(nèi)，包含在本說 明書中所記載的本發(fā)明的抗_ErbB2抗體變異體序列，還包含其生物學(xué)等同物。例如，為了 更加改善抗體的結(jié)合親和度和/或其他生物學(xué)特性，可使抗體的氨基酸序列發(fā)生追加的變 化。這種變形包含例如抗體的氨基酸序列殘基的缺失、插入和/或取代。這種氨基酸變異可 基于氨基酸側(cè)鏈取代體的相對類似性，例如，疏水性、親水性、電荷、大小等實現(xiàn)。根據(jù)氨基 酸側(cè)鏈取代體的大小、形狀及種類的分析，可知精氨酸、賴氨酸和組氨酸全部為帶有陽電荷 的殘基；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸的大小類似；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的形狀類似。因 此，基于這種考慮事項，可將精氨酸、賴氨酸和組氨酸、丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸、苯丙氨酸、 色氨酸和酪氨酸視為生物學(xué)功能等同物。
[0058] 在導(dǎo)入變異的過程中，可考慮氨基酸的疏水性指數(shù)（hydropathic index)。各氨 基酸根據(jù)疏水性和電荷賦予疏水性指數(shù)：異亮氨酸（+4. 5)、纈氨酸（+4. 2)、亮氨酸（+3. 8)、 苯丙氨酸（+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸（+2. 5)、蛋氨酸（+1.9)、丙氨酸（+1.8)、甘氨酸 (_〇. 4)、蘇氨酸（-0. 7);絲氨酸（-0. 8)、色氨酸（-0. 9)、酪氨酸（-1. 3)、脯氨酸（-1. 6)、組 氨酸（-3. 2)、谷氨酸（-3. 5)、谷氨酰胺（-3. 5)、天冬氨酸（-3. 5)、天冬酰胺（-3. 5)、賴氨酸 (-3. 9)及精氨酸（-4. 5)。
[0059] 在賦予蛋白質(zhì)的相互的生物學(xué)功能（interactive biological function)的過程 中，疏水性氨基酸指數(shù)非常重要。只有利用具有類似的疏水性指數(shù)的氨基酸取代，才能保持 類似的生物學(xué)活性，這是公知的事實。在參照疏水性指數(shù)導(dǎo)入變異的情況下，在呈現(xiàn)優(yōu)選為 〒2以內(nèi)，更優(yōu)選為〒1以內(nèi)，尤其優(yōu)選為〒0. 5以內(nèi)的疏水性指數(shù)差異的氨基酸之間進行 取代。
[0060] 另一方面，眾所周知，具有類似的親水性值（hydrophilicity value)的氨基酸 之間的取代引起具有等同的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。如美國專利第4554101號所公開，將 以下親水性值賦予各氨基酸殘基：精氨酸（+3. 0)、賴氨酸（+3. 0)、天冬氨酸（+3. 0〒1)、 谷氨酸（+3. 0〒1)、絲氨酸（+0. 3)、天冬酰胺（+0. 2)、谷氨酰胺（+0. 2)、甘氨酸（0)、蘇氨 酸（-0.4)、脯氨酸（-0.5〒1)、丙氨酸（-0.5)、組氨酸（-0.5)、半胱氨酸（-1.0)、蛋氨酸 (-1. 3)、纈氨酸（-1. 5)、亮氨酸（-1. 8)、異亮氨酸（-1. 8)、酪氨酸（-2. 3)、苯丙氨酸（-2. 5) 及色氨酸（-3. 4)。
[0061] 使分子的活性在整體上不會發(fā)生變更的蛋白質(zhì)中的氨基酸交換已公知于該領(lǐng)域 中（!1.他11四1:11，1?.1^!1;[11，1116?1'0七6；[118，六0&(16111；^?代88，他￥￥0^，1979)。最普遍發(fā)生的 交換為氛基酸殘基 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/ Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 及 Asp/Gly 之間的交換。
[0062] 若考慮如上所述的具有生物學(xué)等同活性的變異，則本發(fā)明的抗體或?qū)@些進行 編碼的核酸分子被解釋為包含記載于序列表的序列和呈現(xiàn)實質(zhì)上的等同性（substantial identity)的序列。上述的實質(zhì)上的等同性進行比對，使得如上所述的本發(fā)明的序列盡 可能與任意的其他序列相對應(yīng)，在利用該領(lǐng)域中通常所使用的算法來分析比對的序列 的情況下，是指呈現(xiàn)最小61 %的同源性，更優(yōu)選為70 %的同源性，尤其優(yōu)選為80 %的同 源性，最優(yōu)選為90%的同源性的序列。用于比較序列的比對方法公知在該領(lǐng)域中。對 于比對的多種方法及算法公開在 Smith and Waterman，Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and ffunsch, J. Mol. Bio. 48:443 (1970) ；Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24 :307-31(1988) ；Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988) ；Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989) ；Corpet et al. , Nuc.Acids Res. 16:10881-90 (1988)； Huang et al. , Comp. AppI. BioSci.8:155-65 (1992)及 Pearson et al. , Meth.Mol. Biol.24:307-31(1994). NCBI BasicLocal Alignment Search Tool (BLAST)(Altschul et al.，J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))可在 NBCI 等中訪問，可在互聯(lián)網(wǎng)上以與 blastp、 blastn、blastx、tblastn及tblastx之類的序列分析程序聯(lián)動的方式利用。BLSAT可在www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/中訪問。利用該程序的序列同源性比較方法可在www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/blast_help. html 中石角認。
[0063] 根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的抗體變異體或抗體片段可以為與功能性分子相結(jié)合的免疫 接合體。HER2為在癌細胞的表面表達的分子，因而本發(fā)明的免疫接合體，即抗體變異體-功 能性分子可利用于過度表達HER2的癌的預(yù)防、治療及診斷。上述功能性分子包含化學(xué)物 質(zhì)、放射性核素、免疫治療劑、細胞因子、趨化因子、毒素、生物作用劑及酶抑制物質(zhì)等。
[0064]用于與本發(fā)明的抗體變異體或其片段耦合的優(yōu)選的功能性分子為化學(xué)物質(zhì)、細 胞因子或趨化因子，更優(yōu)選為化學(xué)物質(zhì)。上述化學(xué)物質(zhì)為抗癌劑，例如，阿雪維菌素、阿柔 比星、阿考達唑、山油柑堿、阿多來新、阿拉諾新、阿地白介素、別嘌醇鈉、六甲蜜胺、氨魯米 特、氨萘非特、聚肌胞、安吖啶、雄激素、蛇形菌素、阿非迪霉素甘氨酸、亮氨酸溶肉瘤素、天 冬酰胺酶、5-阿扎胞苷、硫唑嘌呤、卡介苗（BCG)、貝克葉酸拮抗劑、β -2-硫代鳥嘌呤脫氧 核式、鹽酸比生群、硫酸博萊霉素、白消安、丁硫氨酸亞砜胺、BWA773U82、BW 502U83/HC1、 BW 7U85甲磺酸、腦酰胺酶（ceracemide)、卡貝替姆、卡鉬、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、氯喹喔 啉磺酰胺、氯脲霉素、色霉素 A3、順鉬、克拉屈濱、皮質(zhì)類固醇、短小棒狀桿菌、CPT-11、克立 那托、環(huán)胞苷、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、色他巴、道比什馬來酸酯、達卡巴嗪、更生霉素、鹽酸柔 紅霉素、地西他濱、右丙亞胺、衛(wèi)康醇、地吖醌、二溴衛(wèi)矛醇、膜海鞘素 B、二乙基二硫代氨基 甲酸酯、肌苷二醛、二氫-5-氮雜胞苷、阿霉素、棘霉素、依達曲沙、依地福新、依氟鳥氨酸、 埃利奧特氏溶液、依沙蘆星、表柔比星、依索比星、磷酸雌二醇氮芥、雌激素、依他硝唑、氨磷 汀、依托泊苷、法倔唑、法扎拉濱、芬維A胺、非格司亭、非那雄胺、黃酮醋酸、氟尿苷、磷酸氟 達拉濱、5-氟尿嘧啶濱、全氟碳》$111 〇8〇1?)、氟他胺、硝酸鎵、吉西他濱、醋酸戈舍瑞林、 七磺酰胺（hepsulfam)、六亞甲基二乙酰胺、高三尖杉酯堿、硫酸肼、4-羥雄留烯二酮、羥基 脲、鹽酸伊達比星、異環(huán)磷酰胺、干擾素 α、干擾素 β、干擾素 Y、白細胞介素-La和β、白 細胞介素-3、白細胞介素_4、白細胞介素_6、4_甘薯苦醇、異丙鉬、異維甲酸、亞葉酸鈣、醋 酸亮丙瑞林、左旋咪唑、柔紅霉素脂質(zhì)體、脂質(zhì)體莢膜的阿霉素、洛莫司汀、氯尼達明、美登 素、鹽酸氮芥、美法侖、美諾立爾、美巴龍、6-巰基嘌呤、美司鈉、卡介苗的甲醇提取殘渣、氨 甲喋呤、N-甲基甲酰胺、米非司酮、米托胍腙、絲裂霉素-C、米托坦、鹽酸米托蒽醌、單核細 胞/巨噬細胞菌落-刺激因子、大麻隆、萘福昔定、新制癌菌素、醋酸奧曲肽、奧馬鉬、奧沙 利鉬、紫杉醇、鏟形跗、噴司他丁、哌嗪雙酮、哌泊溴烷、吡柔比星、吡曲克辛、鹽酸吡羅蒽醌、 ΡΙΧΥ-321、普卡霉素、嚇吩姆鈉、潑尼莫司汀、甲基芐肼、孕酮、吡唑呋喃菌素、雷佐生、沙格 司亭、司莫司汀、鍺螺胺、螺莫司汀、鏈黑菌素、鏈佐星、磺氯苯脲、蘇拉明鈉、他莫昔芬、替加 氟、替尼泊苷、對苯二甲酸脒（terephthalamidine)、替羅昔隆、硫鳥噪呤、噻替派、胸腺啼陡 核苷注射液、噻唑呋林、拓撲替康、托瑞米芬、維甲酸、鹽酸三氟拉嗪、曲氟尿苷、三甲曲沙、 腫瘤壞死因子、烏拉莫司汀、硫酸長春堿、硫酸長春新堿、長春地辛、長春瑞濱、長春利定、吉 雄864(Yoshi864)、佐柔比星、阿糖胞苷、依托泊苷、美法侖、泰索帝、紫杉醇及它們的混合 物，但并不局限于此。
[0065] 【II·核酸分子及重組載體】
[0066] 根據(jù)本發(fā)明的再一實施方式，本發(fā)明提供對本發(fā)明的抗體變異體或其抗原結(jié)合片 段的重鏈可變域進行編碼的核酸分子。
[0067] 根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，本發(fā)明提供對本發(fā)明的抗體變異體或其抗原結(jié)合片 段的輕鏈可變域進行編碼的核酸分子。
[0068] 在本說明書中所說明的術(shù)語"核酸分子"具有包含DNA(gDNA及cDNA)及RNA分 子的含義，在核酸分子中，作為基本組成單位的核苷酸不僅包含天然的核苷酸，還包含糖或 喊基部位發(fā)生變形的類似物（analogue) (Scheit，Nucleotide Analogs，John Wiley，New York(1980) ;Uhlman 及 Peyman，Chemical Reviews，90:543-584 (1990))。本發(fā)明的對重鏈 及輕鏈可變域進行編碼的核酸分子的序列可發(fā)生變形。上述變形包括核苷酸的添加、缺失 或非保守取代或保守取代。
[0069] 根據(jù)本發(fā)明的一實例，對上述重鏈可變域進行編碼的核酸分子為對由SEQ ID NO : 3、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的氨基酸序列組成的重鏈可變域進行編碼的核酸分子，對 上述輕鏈可變域進行編碼的核酸分子為對由SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :7 的氨基酸序列組成的輕鏈可變域進行編碼的核酸分子。
[0070] 根據(jù)本發(fā)明的一實例，本發(fā)明的核酸分子可以為包含于對整個重鏈區(qū)域進行編碼 的核酸分子或?qū)φ麄€輕鏈區(qū)域進行編碼的核酸分子內(nèi)的形態(tài)。
[0071] 本發(fā)明的核酸分子解釋為還包含對如上所述的核苷酸序列呈現(xiàn)出實質(zhì)上的等同 性的核苷酸序列。上述的實質(zhì)上的等同性以使上述的本發(fā)明的核苷酸序列盡可能與任意其 他序列相對應(yīng)的方式進行比對，利用該領(lǐng)域中通常所使用的算法來分析所比對的序列的情 況下，是指呈現(xiàn)出最小80%的同源性，更優(yōu)選為最小90%的同源性，最優(yōu)選為最小95%的 同源性的核苷酸序列。
[0072] 根據(jù)本發(fā)明的還有一實施方式，本發(fā)明提供重組載體，上述重組載體包含（a)對 本發(fā)明的重鏈可變域進行編碼的核酸分子以及（b)對本發(fā)明的輕鏈可變域進行編碼的核 酸分子。
[0073] 在本說明書中所說明的術(shù)語"載體"作為在宿主細胞中用于表達靶基因的方式，包 含質(zhì)粒載體、粘粒載體、噬菌體載體、腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及腺相關(guān)病毒載體之類 的病毒載體等，優(yōu)選為質(zhì)粒載體。
[0074] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，在本發(fā)明的載體中，對輕鏈可變域進行編碼的核酸分子 及對重鏈可變域進行編碼的核酸分子與啟動子有效地結(jié)合（operatively linked)。
[0075] 在本說明書中所說明的術(shù)語"有效地結(jié)合"是指核酸表達調(diào)節(jié)序列（例如，啟動 子、信號序列或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合位置的陣列）和其他核酸序列之間的功能性結(jié)合，由此， 上述調(diào)節(jié)序列調(diào)節(jié)其他上述核酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
[0076] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，本發(fā)明的重組載體包含（a)對選自主要由SEQ ID NO :3、 SEQ ID NO :4及SEQ ID NO :6組成的組中的重鏈可變域進行編碼的核酸分子以及（b)對選 自主要由SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :5及SEQ ID NO :7組成的組中的輕鏈可變域進行編碼 的核酸分子。
[0077] 根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選實例，本發(fā)明的重組載體包含以下核酸分子：
[0078] (i)對SEQ ID NO :3的重鏈可變域進行編碼的核酸分子以及對SEQ ID NO :2的輕 鏈可變域進行編碼的核酸分子；
[0079] (ii)對SEQ ID NO :4的重鏈可變域進行編碼的核酸分子以及對SEQ ID NO :2的 輕鏈可變域進行編碼的核酸分子；
[0080] (iii)對SEQ ID NO :3的重鏈可變域進行編碼的核酸分子以及對SEQ ID NO :5的 輕鏈可變域進行編碼的核酸分子；或
[0081] (iv)對SEQ ID NO :6的重鏈可變域進行編碼的核酸分子以及對SEQ ID NO :7的 輕鏈可變域進行編碼的核酸分子。
[0082] 本發(fā)明的重組載體系統(tǒng)可通過該領(lǐng)域中公知的多種方法構(gòu)建，與其相關(guān)的具體 方法公開于 Sambrook et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)，該文獻作為參照插入于本說明書中。
[0083] 典型地，本發(fā)明的載體可由用于克隆的載體或用于表達的載體構(gòu)建。并且，本發(fā) 明的載體可將原核細胞或真核細胞作為宿主來構(gòu)建。例如，在本發(fā)明的載體為表達載體， 且將原核細胞作為宿主的情況下，通常包含可使轉(zhuǎn)錄進行的強力的啟動子（例如，tac啟動 子、Iac啟動子、lacUV5啟動子、Ipp啟動子、pLX啟動子、pRX啟動子、rac5啟動子、amp 啟動子、recA啟動子、SP6啟動子、trp啟動子及T7啟動子等）、用于開始翻譯的核糖體結(jié) 合位置及轉(zhuǎn)錄/翻譯結(jié)束序列。在利用E. coli(例如，HB101、BL21、DH5a等）作為宿主 細胞的情況下，可以利用E. coli色氨酸生物合成途徑的啟動子及操縱子部位（Yanofsky， C.，J. Bacteriol.，（1984) 158:1018-1024)和噬菌體 λ 的向左啟動子（pL λ 啟動子、 Herskowitz，I. and Hagen，D. , Ann. Rev. Genet. , (1980) 14:399-445)作為調(diào)節(jié)部位。在利 用芽孢桿菌作為宿主細胞的情況下，可以利用能夠在蘇云金桿菌的毒素蛋白基因的啟動子 (Appl. Environ. Microbiol. (1998)64:3932-3938 ；Mol.Gen.Genet. (1996)250:734-741) 或芽孢桿菌中表達的任何啟動子作為調(diào)節(jié)部位。
[0084] 另一方面，本發(fā)明的重組載體能夠以操作該領(lǐng)域中常使用的質(zhì)粒（例如，pCL、 pSClOl、pGVl 106、pACYC177、ColEl、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、 pIJ61、pLAFRl、pHV14、pGEX 系列、pET 系列及 pUC19 等）、噬菌體（例如，λ gt4. λ B、 λ -Charon、λ Λ ζ?及Μ13等）或病毒（例如，SV40等）的方式制成。
[0085] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，本發(fā)明的重組載體能夠以操作pCL表達載體，優(yōu)選地，操 作PCLS05 (韓國申請?zhí)柕?0-2011-0056685號）表達載體的方式制成。
[0086] 另一方面，本發(fā)明的載體為表達載體，且在將真核細胞作為宿主的情況下，可利用 來源于哺乳動物細胞的基因組的啟動子（例如：金屬硫蛋白啟動子、肌動蛋白啟動子、 人血紅蛋白啟動子及人肌酸啟動子）或來源于哺乳動物病毒的啟動子（例如：腺病毒后期 啟動子、牛痘病毒7. 5Κ啟動子、SV40啟動子、巨細胞病毒（CMV)啟動子、HSV的tk啟動子、 小鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV)啟動子、HIV的LTR啟動子、莫洛尼病毒的啟動子、EB病毒（EBV) 的啟動子及勞斯肉瘤病毒（RSV)的啟動子），且通常具有多聚腺苷酸化序列作為轉(zhuǎn)錄結(jié)束 序列。在一實例中，本發(fā)明的重組載體包含CMV啟動子。
[0087] 本發(fā)明的重組載體為了使從其表達的抗體的純化變得容易，也可與其他序列相融 合。融合的序列例如有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（美國法瑪西亞公司（Pharmacia, USA))、麥芽 糖結(jié)合蛋白（美國NEB公司（NEB，USA))、FLAG(美國IBI公司（IBI，USA))及6x His(六 聚組氨酸（hexahistidine);美國Quiagen公司（Quiagen，USA))等。并且，由于借助本發(fā) 明的載體所表達的蛋白質(zhì)為抗體，因而即使沒有用于純化的追加的序列，所表達的抗體也 可通過蛋白A柱等容易純化。
[0088] 另一方面，本發(fā)明的重組載體包含該領(lǐng)域中通常所利用的抗生素抗性基因作為選 擇標記，例如，具有對于氨芐西林、慶大霉素、羧芐青霉素、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素、遺傳 霉素、新霉素及四環(huán)素的抗性基因。
[0089] 表達本發(fā)明的抗體變異體的載體可使用使輕鏈和重鏈在一個載體一同表達的載 體系統(tǒng)或使輕鏈和重鏈分別在單獨的載體中表達的系統(tǒng)。在后者的情況下，兩個載體通過 共轉(zhuǎn)化（co-transfomation)及祀轉(zhuǎn)化（targeted transformation)向宿主細胞導(dǎo)入。共轉(zhuǎn) 化為向宿主細胞一同導(dǎo)入對輕鏈及重鏈進行編碼的各載體DNA之后，篩選對輕鏈和重鏈都 進行表達的細胞的方法。靶轉(zhuǎn)化為對轉(zhuǎn)化為包含輕鏈（或重鏈）的載體的細胞進行篩選， 并再次將表達輕鏈的所篩選的細胞轉(zhuǎn)化為包含重鏈（或輕鏈）的載體，從而最終篩選對輕 鏈及重鏈都進行表達的細胞的方法。在以下實施例中，利用在一個載體中一同表達輕鏈和 重鏈的載體系統(tǒng)，來制備了抗體。
[0090]【III·轉(zhuǎn)化體】
[0091] 根據(jù)本發(fā)明的又一實施方式，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)化為本發(fā)明的重組載體的宿主細胞。
[0092] 能夠穩(wěn)定且連續(xù)地克隆及表達本發(fā)明的載體的宿主細胞公知于該領(lǐng)域中，從而 可利用任何宿主細胞，例如，包含大腸桿菌（Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌及蘇云金 桿菌之類的芽孢桿菌屬菌株、鏈霉菌（Streptomyces)、假單胞菌（Pseudomonas)(例如，惡 臭假單胞菌（Pseudomonas putida))、奇異變形桿菌（Proteus mirabiIis)或葡萄球菌 (Staphylococcus)(例如，肉葡萄球菌（Staphylocus carnosus))之類的原核宿主細胞，但 并不局限于此。
[0093] 上述載體的適合的真核細胞宿主細胞可利用曲霉菌（Aspergillus species)之類 的真菌、畢赤酵母（Pichia pastoris)、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母 (Schizosaccharomyces)及粗糙脈孢菌（Neurospora crassa)之類的酵母、其余低等真核 細胞、來源于昆蟲的細胞之類的高等真核生物的細胞和來源于植物或哺乳動物的細胞。優(yōu) 選地，宿主細胞可以為猴腎細胞7 (C0S7:monkey kidney cells)、NSO細胞、SP2/0、中國倉 鼠卵巢（CH0 :Chinese hamster ovary)細胞、W138、幼倉鼠腎（BHK :baby hamster kidney) 細胞、MDCK、骨髓瘤細胞系、HuT 78細胞或293細胞，更優(yōu)選為中國倉鼠卵巢細胞。
[0094] 在利用E. coli等微生物的情況下，生產(chǎn)率與動物細胞等相比相對高，但由于糖基 化（glycosylation)問題而在完整（intact)的Ig形態(tài)的抗體生產(chǎn)中并不優(yōu)選,但可使用 于Fab及Fv等的生產(chǎn)。
[0095] 在本說明書中，作為宿主細胞的"轉(zhuǎn)化"和/或"轉(zhuǎn)染"包括向有機體、細胞、組織 或器官導(dǎo)入核算的任何方法，能夠選擇如該領(lǐng)域中所公知的適合不同宿主細胞的標準技術(shù) 來執(zhí)行。作為這種方法，包括電穿孔（electroporation)、原生質(zhì)體融合、磷酸|丐（CaPO 4)沉 淀、氯化鈣（CaCl2)沉淀、利用碳化硅纖維的攪拌、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、PEG、硫酸葡聚糖、月旨 質(zhì)體及干燥/抑制介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法等，但并不局限于此。
[0096] 【IV·抗_ErbB2抗體變異體或其抗原結(jié)合片段的制備方法】
[0097] 根據(jù)本發(fā)明的又一實施方式，本發(fā)明提供抗_ErbB2抗體變異體或其抗原結(jié)合片 段的制備方法，上述抗_ErbB2抗體變異體或其抗原結(jié)合片段的制備方法包括：步驟（a)，培 養(yǎng)轉(zhuǎn)化為本發(fā)明的重組載體的宿主細胞，以及步驟（b)，在上述宿主細胞中表達抗-ErbB2 抗體變異體或其抗原結(jié)合片段。
[0098] 制備在上述抗體的過程中得到轉(zhuǎn)化的宿主細胞的培養(yǎng)可根據(jù)該領(lǐng)域中公知的適 當?shù)呐囵B(yǎng)基和培養(yǎng)條件來實現(xiàn)。有關(guān)這種培養(yǎng)過程，只要是本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通 技術(shù)人員，就能根據(jù)所選擇的菌株容易地調(diào)整并使用。這種多樣的培養(yǎng)方法公開于多個 文獻（例如，James M. Lee, Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions，138-176)中。細胞培養(yǎng)根據(jù)細胞的生長方式區(qū)分為懸浮培養(yǎng)和附著培養(yǎng)，并根據(jù) 培養(yǎng)方法區(qū)分為分批式、補料分批式及連續(xù)培養(yǎng)式的方法。使用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基需適當?shù)?滿足特定的菌株的要求條件。
[0099] 就動物細胞培養(yǎng)而言，上述培養(yǎng)基包含多種碳源、氮源及微量元素成分?？墒褂玫?碳源的例包含葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉及纖維素之類的碳水化合物、大豆油、 葵花籽油、蓖麻油及椰子油之類的脂肪、棕櫚酸、硬脂酸及亞油酸之類的脂肪酸、甘油及乙 醇之類的酒精和乙酸之類的有機酸。這些碳源可單獨或組合使用。可使用的氮源的例包含 蛋白胨、酵母提取物、麥芽提取物、玉米浸漬液（CSL)及大豆小麥之類的有機氮源及尿素、 硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨之類的無機氮源。這些氮源可單獨或組合使用。上 述培養(yǎng)基可包含KH 2P04、K2HPO4及對應(yīng)的含鈉鹽作為磷源。并且，可包含硫酸鎂或硫酸鐵之 類的金屬鹽。此外，可包含氨基酸、維生素及適當?shù)那绑w等。
[0100] 在培養(yǎng)的過程中，能夠以適當?shù)姆绞较蚺囵B(yǎng)液添加氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸 及硫酸之類的化合物，從而調(diào)整培養(yǎng)液的pH。并且，在培養(yǎng)的過程中，可使用聚乙二醇酯 (polyglycol ester)之類的消泡劑，來抑制氣泡的生成。并且，為了維持培養(yǎng)液的有氧狀 態(tài)，向培養(yǎng)液內(nèi)注入氧或含氧氣體（例如，空氣）。培養(yǎng)液的溫度通常在20°C至45°C范圍 內(nèi)，優(yōu)選在25°C至40°C范圍內(nèi)。
[0101] 通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞來獲得的抗體能夠以未純化的狀態(tài)使用，并且還能利用 多種通常的方法，例如透析、鹽沉淀及色譜法等，來純化為高純度并使用。其中，最常使用利 用色譜法的方法，柱的種類和順序可根據(jù)抗體的特性、培養(yǎng)方法等，選自離子交換色譜法、 尺寸排阻色譜、親和性色譜法等。
[0102] 【V.癌的預(yù)防或治療用藥劑學(xué)組合物】
[0103] 根據(jù)本發(fā)明的又一實施方式，本發(fā)明提供癌的預(yù)防或治療用藥劑學(xué)組合物，上述 癌的預(yù)防或治療用藥劑學(xué)組合物包含：(a)藥劑學(xué)有效量的本發(fā)明的抗-ErbB2抗體變異體 或其抗原結(jié)合片段，以及（b)藥劑學(xué)上接受的載體。
[0104] 根據(jù)本發(fā)明的又一實施方式，本發(fā)明提供癌的預(yù)防或治療方法，上述癌的預(yù)防或 治療方法包括將治療學(xué)有效量的上述藥劑學(xué)組合物給個體用藥的步驟。
[0105] 在本說明書中所使用的術(shù)語"預(yù)防"使用為包括完全或部分抑制或延遲疾病的進 行且延遲轉(zhuǎn)換為更嚴重的疾病的情況的最廣的含義，術(shù)語"治療"包括癌細胞的部分或整體 破壞，還包括癌生長的部分或完全的抑制。
[0106] 根據(jù)本發(fā)明的一實例，上述癌為過度表達HER2的癌。在一特定例中，上述癌選自 主要由乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、腎癌、直腸癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、頭頸癌、子宮 內(nèi)膜癌、涎腺癌、大腸癌及甲狀腺癌組成的組中。在其他實例中，上述癌為乳腺癌或胃癌。在 本說明書中所說明的術(shù)語"過度表達HER2的癌"為與相同組織類型的非-癌性細胞相比， 在癌細胞的表面具有顯著且更高水平的HER2的癌。這種過度表達可根據(jù)基因擴增或轉(zhuǎn)錄 或翻譯的增加而發(fā)生。
[0107] 包含于本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的藥劑學(xué)上接受的載體作為在進行制劑時，通常所 利用的載體，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、 明膠、娃酸I丐、微晶纖維素、聚乙烯批咯燒酮（polyvinylpyrrolidone)、纖維素、水、糖楽、甲 基纖維素 （methyl cellulose)、輕苯甲醋（methyl hydroxybenzoate)、輕苯丙醋（propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸鎂及礦物油等，但并不局限于此。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合 物除了上述成分之外還可以包含潤滑劑、潤濕劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、保存劑 等。藥劑學(xué)上接受的適合的載體及制劑已在Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed.，1995)中進行了詳細的記載。
[0108] 本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物能夠以口服或非口服方式進行用藥，非口服用藥的情況 下，能夠以靜脈內(nèi)注入、皮下注入、肌肉注入、腹腔注入、內(nèi)皮用藥、局部用藥、脾內(nèi)用藥、肺 內(nèi)用藥及直腸內(nèi)用藥等方式進行用藥。當口服用藥時，由于蛋白質(zhì)或肽被消化，因而口服用 組合物需涂敷活性藥劑或以從胃的分解中得到保護的方式進行劑型化。并且，藥劑學(xué)組合 物可借助能夠使活性物質(zhì)向靶細胞移動的任意裝置進行用藥。
[0109] 本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的適當?shù)挠盟幜靠筛鶕?jù)制劑化方法、用藥方式、患者的年 齡、體重、性別、病態(tài)、飲食、用藥時間、用藥途徑、排泄速度及反應(yīng)靈敏性之類的因素而不 同，通常，熟練的醫(yī)生可針對所需的治療或預(yù)防容易地決定或處方有效的用藥量。根據(jù)本發(fā) 明的優(yōu)選實例，本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的一天的用藥量為0. 〇〇l-l〇〇mg/kg (體重）。在本說 明書中，術(shù)語"藥劑學(xué)有效量"是指針對預(yù)防或治療癌充分的量。
[0110] 本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物可根據(jù)本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員能夠容易地 實施的方法，利用藥劑學(xué)上接受的載體和/或賦形劑，來進行制劑化，從而制備為單位容量 形態(tài)，或者裝入大容量容器內(nèi)而制備。此時，劑型也可以為油性或水性介質(zhì)中的溶液、懸浮 液或乳化液形態(tài)，浸膏劑、散劑、粉劑、顆粒劑、片劑或膠囊劑形態(tài)，還可包含分散劑或穩(wěn)定 劑。
[0111] 本發(fā)明的組合物可作為個別治療劑進行用藥，或者以與其他治療劑并用的方式進 行用藥，且能夠與現(xiàn)有的治療劑依次或一同進行用藥。
[0112] 抗體變異體能夠以抗體變異體-治療劑（功能性分子）結(jié)合體形態(tài)向生物體內(nèi)投 入，從而利用于癌的治療，而相關(guān)說明見上述內(nèi)容。向特異性靶部位進行藥劑的靶向化時適 當且優(yōu)選的多種條件已在例如文獻Trouet et al. ,Plenum Press，New York and London， (1982) 19-30中進行了報告。
[0113] 歸納本發(fā)明的特征及優(yōu)點如下。
[0114] (a)本發(fā)明的抗體變異體以高的親和度與ErbB2相結(jié)合。尤其，本發(fā)明的抗體變異 體對ErbB2的親和度與現(xiàn)有的市場上所銷售的抗體治療劑，即4D5相比，改善了最多8倍。
[0115] (b)本發(fā)明的抗體變異體呈現(xiàn)優(yōu)秀的癌細胞增殖抑制活性。尤其，本發(fā)明的抗體變 異體的胃癌細胞株增殖抑制活性與4D5相比，優(yōu)秀約3. 5倍。
[0116] (c)因此，本發(fā)明的抗體變異體即使使用少量，也能有效地預(yù)防或治療癌。
[0117] 以下，將通過實施例對本發(fā)明進行更為詳細的說明。這些實施例僅用于更加具體 地說明本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的要點，本發(fā)明的范圍并不局限于這些實施例，而這對于本發(fā)明 所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。 【實施例】
[0118] 【實施例1 :具有多種⑶R殘基的噬菌體-展示的SCFv文庫制作】
[0119] 使用以scFv與pill相結(jié)合的形態(tài)生成展示的噬菌粒載體，制作了噬菌體-展示 的scFv文庫。將上述載體的大致結(jié)構(gòu)圖示在了圖1中。上述載體包含在IPTG-誘導(dǎo)性Plac 啟動子的控制下的抗體的可變域，連接序列為GGGGSGGGSGGSS(SEQ ID N0:8)。成為母源 抗體的抗_ErbB2抗體（4D5)的制備方法及可變域序列公知在美國專利第5821337號及第 6054297 號中。
[0120] 使用scFv展示載體的唯一的"停止模板"版本來生成了文庫。在本實施例中，使用 了 TGA終止密碼子插入于輕鏈的卡巴特殘基48的模板pCMTG噬菌粒載體（韓國IG治療公 司（Therapy Co.))。重鏈⑶R3中未導(dǎo)入終止密碼子。在實現(xiàn)多樣化的位置，使用具有NNK 密碼子的引發(fā)突變的寡核苷酸（oligonucleotide)來導(dǎo)入⑶R多樣性，并去除了終止密碼 子。由此，生成了對與同種二聚物化c-myc及pill相融合的scFv文庫成員進行編碼的可 讀框。
[0121] 使重鏈⑶R3及輕鏈⑶R3區(qū)優(yōu)先發(fā)生變化。為了使重鏈⑶R3區(qū)發(fā)生變化，使用 HF(序列號19)和LN01_R引物（序列號9)、HF(序列號19)和LN02_R引物（序列號10) 來執(zhí)行了聚合酶鏈式反應(yīng)。使用C1000熱循環(huán)儀（Thermal cycler)(美國伯樂（Bio-Rad) 公司），根據(jù)制造商的說明，利用Ex taq (日本塔卡拉（Takara)公司）進行擴增過程如下： 循環(huán)實施了 27次的在95°C溫度下變性20秒鐘，在57°C溫度下引物結(jié)合30秒鐘，并在72°C 溫度下延伸45秒鐘的擴增過程。并且，為了改變輕鏈⑶R3區(qū)，利用LN03_F(序列號11)和 LR引物（序列號17)、LN04_F(序列號12)和LR引物對，實施聚合酶鏈式反應(yīng)如下：循環(huán)實 施了 27次的在95 °C溫度下變性20秒鐘，在57 °C溫度下引物結(jié)合30秒鐘，并在72 °C溫度下 延伸45秒鐘的擴增過程。
[0122] 為了制作將重鏈⑶R3和輕鏈⑶R3變異體中篩選的抗體作為模板，將輕鏈⑶R2作 為靶，并使用NNK密碼子來隨機誘導(dǎo)突變的文庫，執(zhí)行了兩次聚合酶鏈式反應(yīng)過程。聚合酶 鏈式反應(yīng)循環(huán)實施了 27次的在95°C溫度下變性20秒鐘，在57°C溫度下引物結(jié)合30秒鐘， 并在72°C溫度下延伸45秒鐘的擴增過程。使用LF(序列號18)作為正向引物，使用以1:1 的比率混合LN05_R(序列號13)和LN06_R(序列號14)的引物作為反向引物，來獲得A片 段，并使用LN0506_F(序列號15)和HR引物（序列號20)來獲得了 B片段。將A片段和B 片段作為模板，利用LF (序列號18)和HR引物（序列號20)對執(zhí)行了聚合酶鏈式反應(yīng)。此 夕卜，將在重鏈⑶R3和兩個輕鏈（⑶RL2、⑶RL3)變異體中篩選的抗體作為模板，使用LF (序 列號18)和LN07_R引物（序列號16)追加制作了文庫。
[0123] 為了將從上述文庫篩選的重鏈⑶R3、輕鏈⑶R3、輕鏈⑶R2變異抗體作為模板，將 CDR和構(gòu)架區(qū)全部作為靶，來隨機誘導(dǎo)突變而執(zhí)行易錯聚合酶鏈式反應(yīng)，為了通過執(zhí)行易錯 聚合酶鏈式反應(yīng)來制作抗體文庫，分兩次執(zhí)行了如下的聚合酶鏈式反應(yīng)過程：第一個聚合 酶鏈式反應(yīng)使用GeneMorpII隨機突變試劑盒（Random mutagenesis kit，美國斯特拉塔根 (Stratagene)公司），來循環(huán)執(zhí)行了 32次的在95°C溫度下變性20秒鐘，在57°C溫度下引 物結(jié)合30秒鐘，并在72 °C溫度下延伸45秒鐘的擴增過程，第二個聚合酶鏈式反應(yīng)使用Ex taq(日本塔卡拉（Takara)公司），來循環(huán)執(zhí)行了 20次的在95°C溫度下變性20秒鐘，在 58°C溫度下引物結(jié)合30秒鐘，并在72°C溫度下延伸45秒鐘的擴增過程；首先，使用LF (序 列號18)和LR(序列號17)，利用包含輕鏈的片段和HF(序列號19)和HR引物（序列號20) 對，通過聚合酶鏈式反應(yīng)分別擴增了包含重鏈的片段。將輕鏈和重鏈兩個片段利用LF(序 列號18)和HR引物（序列號20)對實施聚合酶鏈式反應(yīng)，從而獲得scFv形態(tài)的片段并制 作了文庫。將用于聚合酶鏈式反應(yīng)的引物的序列表示在表1中。
[0124] 【表1】
[0125]

【權(quán)利要求】
1. 一種抗_ErbB2抗體變異體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于， 包含： (a) 輕鏈可變域，以及 (b) 重鏈可變域，具有選自主要由以下氨基酸取代組成的組中的2種以上的氨基酸取 代： 在SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中，基于卡巴特編號系統(tǒng)的 位置41的Pro被Arg取代， 位置96的Gly被Asn取代， 位置97的Gly被Ala取代， 位置98的Asp被Trp取代， 位置98的Asp被Lys取代， 位置100b的Ala被Ser取代， 位置100c的Met被Phe取代， 位置101的Asp被Ala取代， 位置101的Asp被Val取代， 位置102的Tyr被His取代，及 位置102的Tyr被Leu取代。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗_ErbB2抗體變異體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，上述 重鏈可變域包含在SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中，基于卡巴特編號系統(tǒng)的 位置98的Asp被Trp取代， 位置100c的Met被Phe取代， 位置101的Asp被Ala取代，及 位置102的Tyr被Leu取代。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗_ErbB2抗體變異體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，上述 重鏈可變域包含在SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中，基于卡巴特編號系統(tǒng)的 位置96的Gly被Asn取代， 位置97的Gly被Ala取代， 位置98的Asp被Lys取代， 位置100b的Ala被Ser取代， 位置100c的Met被Phe取代， 位置101的Asp被Val取代，及 位置102的Tyr被His取代。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗_ErbB2抗體變異體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，上述 重鏈可變域包含在SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中，基于卡巴特編號系統(tǒng)的 位置41的Pro被Arg取代， 位置98的Asp被Trp取代， 位置100c的Met被Phe取代， 位置101的Asp被Ala取代，及 位置102的Tyr被Leu取代。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗_ErbB2抗體變異體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，上述 輕鏈可變域具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列或選自主要由以下氨基酸取代組成的組中的2 種以上的氨基酸取代： 在SEQ ID NO :2的氨基酸序列中，基于卡巴特編號系統(tǒng)的 位置50的Ser被Thr取代， 位置51的Ala被Thr取代， 位置52的Ser被Thr取代， 位置53的Phe被Trp取代， 位置54的Leu被Pro取代， 位置72的Thr被Ser取代， 位置91的His被Tyr取代， 位置93的Thr被Gin取代， 位置93的Thr被Asn取代， 位置96的Pro被Ala取代， 位置96的Pro被Val取代，及 位置97的Thr被Ser取代。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗-ErbB2抗體變異體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，上述 輕鏈可變域包含在SEQ ID NO :2的氨基酸序列中，基于卡巴特編號系統(tǒng)的 位置93的Thr被Gin取代， 位置96的Pro被Ala取代，及 位置97的Thr被Ser取代。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗-ErbB2抗體變異體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，上述 輕鏈可變域包含在SEQ ID NO :2的氨基酸序列中，基于卡巴特編號系統(tǒng)的 位置50的Ser被Thr取代， 位置51的Ala被Thr取代， 位置52的Ser被Thr取代， 位置53的Phe被Trp取代， 位置54的Leu被Pro取代， 位置72的Thr被Ser取代， 位置91的His被Tyr取代， 位置93的Thr被Asn取代，及 位置96的Pro被Val取代。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗_ErbB2抗體變異體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，包含 以下輕鏈可變域及重鏈可變域： (i) 由SEQ ID N0:2的氨基酸序列組成的輕鏈可變域及由SEQ ID N0:3的氨基酸序列 組成的重鏈可變域； (ii) 由SEQ ID NO :2的氨基酸序列組成的輕鏈可變域及SEQ ID NO :4的氨基酸序列 組成的重鏈可變域； (iii) 由SEQ ID N0:5的氨基酸序列組成的輕鏈可變域及由SEQ ID N0:3的氨基酸序 列組成的重鏈可變域；以及 (iv)由SEQ ID NO :7的氨基酸序列組成的輕鏈可變域及由SEQ ID NO :6的氨基酸序 列組成的重鏈可變域。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗_ErbB2抗體變異體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，上述 抗體為人源化抗體。
10. -種核酸分子，其特征在于，對權(quán)利要求1至9中任一項所述的抗-ErbB2抗體變異 體或其抗原結(jié)合片段的重鏈可變域進行編碼。
11. 一種核酸分子，其特征在于，對權(quán)利要求1至9中任一項所述的抗-ErbB2抗體變異 體或其抗原結(jié)合片段的輕鏈可變域進行編碼。
12. -種癌的預(yù)防或治療用藥劑學(xué)組合物，其特征在于，包含： (a) 藥劑學(xué)有效量的權(quán)利要求1至9中任一項所述的抗-ErbB2抗體變異體或其抗原結(jié) 合片段；以及 (b) 藥劑學(xué)上接受的載體。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的癌的預(yù)防或治療用藥劑學(xué)組合物，其特征在于，上述癌為 選自主要由乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、腎癌、直腸癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、頭頸癌、 子宮內(nèi)膜癌、涎腺癌、大腸癌及甲狀腺癌組成的組中的癌。
14. 一種癌的預(yù)防或治療方法，其特征在于， 包括將藥劑學(xué)組合物按治療學(xué)有效量給個體用藥的步驟； 上述藥劑學(xué)組合物包含： (a) 權(quán)利要求1至9中任一項所述的抗-ErbB2抗體變異體或其抗原結(jié)合片段，以及 (b) 藥劑學(xué)上接受的載體。
【文檔編號】C07K16/30GK104271603SQ201380024055
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2013年4月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月8日
【發(fā)明者】文昇基, 樸昭羅, 安基榮 申請人:株式會社鐘根堂