專利名稱：一種檢測抗體亞型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測抗體亞型的方法。
(二)
背景技術(shù)：
1975年英國劍橋的科學(xué)家Kohler和Milstein通過雜交瘤技術(shù)建立了單克隆抗 體，其特點是理化性狀高度均一，生物活性單一，與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)，便于人為處理和 質(zhì)量控制，且來源相對容易。這些優(yōu)點使它一問世就受到高度重視，可謂是免疫學(xué)乃至醫(yī)學(xué) 史上的一個里程碑。經(jīng)過不斷的發(fā)展，單克隆抗體、多克隆抗體和基因工程抗體現(xiàn)已廣泛應(yīng) 用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。抗體的主要用途包括l.作為研究工作中的探針或親合層析 的配體，用于生物學(xué)及醫(yī)學(xué)的研究以及工業(yè)純化；2.作為醫(yī)學(xué)檢驗試劑或動植物病原、食 品菌原等檢驗試劑，用于實驗室、臨床診斷產(chǎn)品及影象診斷試劑的開發(fā)，并發(fā)展動物疫苗； 3.作為生物治療的導(dǎo)向武器或免疫抑制劑，用于臨床治療。 然而，抗體的各種用途往往對其亞型等信息要求較高。目前抗體分型多采用基于 抗各亞型抗體制備的試劑盒或?qū)游鲈嚰垪l，由于針對各亞型單克隆抗體的抗體篩選十分不 易，因此分型所用試劑和耗材價格均非常昂貴。 作為組合化學(xué)技術(shù)發(fā)展的最新成果，核酸適體(即tamer)與靶分子高特異性、高 親和力的結(jié)合已經(jīng)得到確認(rèn)。此外，從寡核苷酸文庫中篩選出的核酸適體還具有許多優(yōu)勢 a.適體通過體外篩選制備，不依賴動物、細(xì)胞，篩選成本低；b.本身是寡核苷酸，分子量較 小可以化學(xué)合成，節(jié)約生產(chǎn)成本，且合成精確度高，重復(fù)性強(qiáng)，批間差異?。籧.能區(qū)別靶標(biāo) 間的微小差異；d.其與靶標(biāo)間的親和性和特異性高于抗原抗體；e.穩(wěn)定性好，易于保存，對 高溫和劇烈條件不敏感；f.適體的變性是可逆的，變性的適體可在數(shù)分鐘內(nèi)再生，因而可 反復(fù)使用；g.化學(xué)修飾及標(biāo)記非常容易實現(xiàn)。因此，寡核苷酸適體在生物分子分離、分析方 面具有良好的應(yīng)用前景。
(三)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測抗體亞型的方法，該方法檢測抗體亞型的成本 低、質(zhì)量穩(wěn)定、效率高，而且能檢測任何來源的抗體。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種檢測抗體亞型的方法，其特征在于采用核酸適體即 即tamer作為亞型檢測試劑進(jìn)行抗體亞型檢測，包括以下步驟
(1)抗體亞型檢測用核酸適體的篩選；
(2)檢測介質(zhì)上核酸適體的包被；
(3)抗體亞型的檢測分析。 上述所說的作為亞型檢測試劑的核酸適體為針對抗體及抗體不同亞型的特異核 酸適體。 上述所說的核酸適體為通過體外篩選獲得與抗體以及抗體不同亞型有特異結(jié)合 能力的核酸序列。
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上述所說的核酸適體為與抗體以及抗體不同亞型具有特異性結(jié)合能力的DNA序列或RNA序列。 上述所說的步驟(3)所說的抗體亞型的檢測分析采用E1AA即enzymelinkedaptamer assay、層析試紙條艮卩l(xiāng)ateral flow strip或液相芯片艮卩l(xiāng)iquid chip的方f去。
上述所說的抗體包括人源、鼠源、兔源、羊源、豬源、雞源抗體。 本發(fā)明的技術(shù)效果本發(fā)明所涉一種檢測抗體亞型的方法，是以核酸適體為檢測試劑的抗體亞型檢測法，即采用針對各亞型單克隆抗體的核酸適體作為亞型檢測試劑，利用EIAA(enzyme linked aptamer assay)或?qū)游鲈嚰垪l(lateral flow strip)或液相芯片(liquid chip)的方法檢測抗體亞型，具有檢測成本低、質(zhì)量穩(wěn)定、效率高的特點，而且能檢測任何來源的抗體。
具體實施例方式實施例1 :一種檢測抗體亞型的方法，即基于抗體亞型特異性核酸適體的小鼠源
抗體亞型檢測方法 文庫的合成及擴(kuò)增 ssDNA文庫通過化學(xué)合成法制備，其兩端為固定序列，中間為35個堿基的隨機(jī)序列5，CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-(N35)-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT 3'，庫容量1014以上；引物1 :5' CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT 3'，引物2 :5' ATCCGCCTGATTAGCGATACT 3'。
用以上合成的ssDNA文庫為模板，以引物1、引物2不對稱擴(kuò)增ssDNA文庫，即采用不對稱PCR，引物1/引物2濃度比100 : l，擴(kuò)增條件為94t:預(yù)變性3min，然后94。C變性30s，65t:退火45s，循環(huán)35次，72t:延伸lmin，最后72。C延伸7min。將獲得的產(chǎn)物主要為ssDNA，于95t:作用3min，于冰中2min，室溫放置10min，即為ssDNA文庫。
抗體亞型特異性核酸適體的篩選 以小鼠IgGl抗體亞型為篩選耙標(biāo)，將小鼠IgGl抗體亞型包被于96孔板，以小鼠IgG2a、2b、3抗體亞型為反篩對象，將其與以上制備的初級ssDNA文庫作用，吸取未結(jié)合部分再與小鼠IgGl抗體亞型孵育，洗去未與小鼠IgGl抗體亞型結(jié)合的部分，然后將已結(jié)合的ssDNA洗脫下來，作為次級ssDNA文庫參與下輪篩選。重復(fù)篩選15輪。多克隆核酸適體經(jīng)克隆測序及親和力分析，得到可用于小鼠IgGl抗體亞型檢測的核酸適體。同法還可分別篩選得到與小鼠IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgM、K即pa等抗體亞型有特異性高親和力的核酸適體。
抗體亞型檢測 采用E1AA(enzyme linked即tamer assay)方法。合成上述用于小鼠IgGl等抗體亞型檢測的核酸適體，并將3'端用氨基修飾；購買偶聯(lián)有氨基的酶標(biāo)板，通過PDITC溶液的介導(dǎo)，分別將針對不同小鼠抗體亞型的3' -NH2-ssDNA核酸適體固定于酶標(biāo)板的不同孔，封閉過剩的活性位點；向固定有核酸適體的酶標(biāo)板孔中加入待檢鼠源單克隆雜交瘤細(xì)胞上清，孵育，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠二抗，與底物TMB作用后測0D值。0D值高于0. 2的孔所對應(yīng)的亞型即為待檢小鼠源單克隆抗體亞型。 實施例2 :—種檢測抗體亞型的方法，即基于抗體亞型特異性核酸適體的大鼠源抗體亞型檢測方法采用組合化學(xué)法合成含30個隨機(jī)序列的單鏈DNA文庫5' -GTCACTGTCTTCATAGGTTG-N30-GAATCAGTGAGACATCCC 3'，經(jīng)8 %變性聚丙烯酰胺膠純化后，通過引物1 (5' -GTCACTGTCTTCATAGGTTG-3 ，)和引物2 (5' -TTCTAATACGACTCACTATAGGGATGTCTCACTGATTC-3')擴(kuò)增；用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄合成RNA， DNA模板用無RNA酶的DNA酶消化，酚_氯仿_異戊醇抽提，乙醇沉淀RNA，溶解后用8%變性聚丙烯酰胺膠純化，即為初級RNA文庫。 以大鼠IgM抗體亞型為篩選耙標(biāo)，將大鼠IgM抗體亞型包被于96孔板，與以上制備的初級RNA文庫作用，洗去未結(jié)合的部分，然后將已結(jié)合RNA洗脫下來，作為次級RNA文庫參與下輪篩選。重復(fù)篩選15輪。多克隆核酸適體經(jīng)克隆測序及親和力分析，得到可用于大鼠IgM抗體亞型檢測的核酸適體。同法還可分別篩選得到與大鼠IgG各亞型、K即pa輕鏈有特異性高親和力的核酸適體。 抗體亞型檢測采用層析試紙條(lateral flow strip)方法試紙條組裝將篩選獲得的k-IgM和k-IgG四種亞型(IgGl、 IgG2a、 IgG2b、 IgG2c)的特異核酸適體(即tamer—M、即tamer—gl、即tamer—g2a、即tamer—g2b、即tamer—g2c)分別固定在石宵酸纖維素膜相應(yīng)位置的檢測線上，用抗k輕鏈通用型核酸適體(即tamer-k)標(biāo)記膠體金后包被在膠體金墊上，按樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸水墊的順序組裝成層析試紙條。
檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中Ig類型和亞型將試紙條插入細(xì)胞培養(yǎng)上清中，樣品通過樣品墊與膠體金墊中膠體金標(biāo)記的即tamer-k結(jié)合，隨著液體流動，至硝酸纖維素膜上的即t咖er-M或即t咖er-gl或即t咖er-g2a或即t咖er-g2b或即t咖er-g2c結(jié)合，形成膠體金核酸適體_抗體_核酸適體復(fù)合物而沉淀顯色，根據(jù)顯色的位置判定其抗體相應(yīng)類型和亞型。
實施例3 :—種檢測抗體亞型的方法，即基于抗體亞型特異性核酸適體的人源抗
體亞型檢測方法 文庫的合成及擴(kuò)增 ssDNA文庫通過化學(xué)合成法制備，其兩端為固定序列，中間為35個堿基的隨機(jī)序列5，CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-(N35)-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT 3'，庫容量1014以上；引物1 :5' CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT 3'，引物2 :5' ATCCGCCTGATTAGCGATACT 3'。
用以上合成的ssDNA文庫為模板，以引物1、引物2不對稱擴(kuò)增ssDNA文庫，即采用不對稱PCR，引物1/引物2濃度比100 : l，擴(kuò)增條件為94t:預(yù)變性3min，然后94。C變性30s，65t:退火45s，循環(huán)35次，72t:延伸lmin，最后72。C延伸7min。將獲得的產(chǎn)物主要為ssDNA，于95t:作用3min，于冰中2min，室溫放置10min，即為ssDNA文庫。
抗體亞型特異性核酸適體的篩選 以人IgGl抗體亞型為篩選耙標(biāo)，將人IgGl抗體亞型包被于96孔板，與以上制備的初級ssDNA文庫作用，洗去未結(jié)合的部分，然后將已結(jié)合的ssDNA洗脫下來，作為次級ssDNA文庫參與下輪篩選。重復(fù)篩選15輪。多克隆核酸適體經(jīng)克隆測序及親和力分析，得到可用于人IgGl抗體亞型檢測的核酸適體。同法還可分別篩選得到與人IgG2、IgG3、IgG4、IgM、 K即pa等抗體亞型有特異性高親和力的核酸適體。
抗體亞型檢測 采用液相芯片(liquid chip)的方法。取帶有多種獨(dú)特?zé)晒夤庾V的氨基熒光微球2. 5X 106個，用雙功能試劑戊二醛修飾活化；漂洗后的活化微球在偶聯(lián)緩沖液(0. 05mol/LPBS，pH7. 5)中與合成并經(jīng)氨基修飾的上述核酸適體(3'端修飾)振蕩孵育2h ;封閉微球表面的未結(jié)合位點；加入待測的人源抗體，與FITC標(biāo)記的抗人二抗室溫孵育30min，清洗后用流式細(xì)胞儀分析待測抗體亞型。
權(quán)利要求
一種檢測抗體亞型的方法，其特征在于采用核酸適體即aptamer作為亞型檢測試劑進(jìn)行抗體亞型檢測，包括以下步驟(1)抗體亞型檢測用核酸適體的篩選；(2)檢測介質(zhì)上核酸適體的包被；(3)抗體亞型的檢測分析。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所說的一種檢測抗體亞型的方法，其特征在于所說的作為亞型檢測 試劑的核酸適體為針對抗體及抗體不同亞型的特異核酸適體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所說的一種檢測抗體亞型的方法，其特征在于所說的核酸適體 為通過體外篩選獲得與抗體以及抗體不同亞型有特異結(jié)合能力的核酸序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所說的一種檢測抗體亞型的方法，其特征在于所說的核酸適體為與 抗體及抗體不同亞型具有特異性結(jié)合能力的DNA序列或RNA序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所說的一種檢測抗體亞型的方法，其特征在于所說的步驟(3)所說 的抗體亞型的檢測分析采用EIAA即enzymelinked aptamer assay、層析試紙條即lateral flow strip或液相芯片即liquid chip的方法。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所說的一種檢測抗體亞型的方法，其特征在于所說的抗體包括人 源、鼠源、兔源、羊源、豬源、雞源抗體。
全文摘要
一種檢測抗體亞型的方法，其特征在于采用核酸適體即aptamer作為亞型檢測試劑進(jìn)行抗體亞型檢測，包括以下步驟(1)抗體亞型檢測用核酸適體的篩選；(2)檢測介質(zhì)上核酸適體的包被；(3)抗體亞型的檢測分析。該方法檢測抗體亞型的成本低、質(zhì)量穩(wěn)定、效率高，而且能檢測任何來源的抗體。
文檔編號C12Q1/68GK101782571SQ20091022415
公開日2010年7月21日 申請日期2009年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月26日
發(fā)明者吳淑慶, 弓景波, 張良, 楊在明 申請人:國家納米技術(shù)與工程研究院