專利名稱：鑒定對(duì)用抗ErbB2抗體處理響應(yīng)的腫瘤的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定對(duì)用抗HER2抗體處理響應(yīng)的腫瘤的方法，以及治療患有這種腫瘤的患者的方法。
背景技術(shù)：
受體酪氨酸激酶的ErbB家族是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和存活的重要介導(dǎo)物。受體家族包括四個(gè)獨(dú)特成員，包括表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR或ErbB1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。
由erbB1基因編碼的EGFR已被暗示與人的惡性腫瘤發(fā)生相關(guān)。特別地，已經(jīng)在乳腺、膀胱、肺、頭部、頸和胃癌癥以及惡性膠質(zhì)瘤中觀察到EGFR表達(dá)升高。在通過(guò)自分泌刺激性路徑引起受體激活的同一腫瘤細(xì)胞中，EGFR受體表達(dá)升高通常與EGFR配基——轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α)——的生成增多相關(guān)。Baselga和Mendelsohn Pharmac.Ther.，64127-154(1994)。此外，表皮生長(zhǎng)因子受體相關(guān)蛋白(ERRP)已經(jīng)被描述，其中1583bp的cDNA片段克隆與小鼠EGFR和截短的大鼠EGFR具有90-95％的序列同源性(美國(guó)專利號(hào)6,399,743；和美國(guó)公開(kāi)號(hào)2003/0096373)。針對(duì)EGFR或其配基，TGF-α和EGF的單克隆抗體已經(jīng)被評(píng)價(jià)為在治療這種惡性腫瘤中作為治療劑。參見(jiàn)，例如Baselga和Mendelsohn.，同上文；Masui et al.，CancerResearch，441002-1007(1984)；和Wu et al.，J Clin.Invest.，951897-1905(1995)。
ErbB家族的第二個(gè)成員p185neu最早被鑒定為來(lái)自化學(xué)處理的大鼠的成神經(jīng)細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)化基因的產(chǎn)物。Neu原癌基因的活化形式由所編碼蛋白的跨膜區(qū)域中的點(diǎn)突變(纈氨酸變?yōu)楣劝彼?而產(chǎn)生。在乳腺和卵巢癌中觀察到neu的人同系物(HER2)發(fā)生擴(kuò)增，這與不理想的預(yù)后相關(guān)(Slamon et al.，Science，235177-182(1987)；Slamon et al，Science，244707-712(1989)；和美國(guó)專利號(hào)4,968,603)。迄今，還沒(méi)有報(bào)道在人的腫瘤中具有與neu原癌基因中的點(diǎn)突變類似的點(diǎn)突變。ErbB2的過(guò)度表達(dá)(常常，但不是一律由于基因擴(kuò)增)也在其他癌癥中觀察到，包括胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌和膀胱癌。參見(jiàn)，以及其它文獻(xiàn)，King etal.，Science，229974(1985)；Yokota et al.，Lancet，1765-767(1986)；Fukushigi etal.，Mol Cell Biol.，6955-958(1986)；Geurin et al.，Oncogene Res.，321-31(1988)；Cohen et al.，Oncogene，481-88(1989)；Yonemura et al.，CancerRes.，511034(1991)；Borst et al.，Gynecol.Oncol.，38364(1990)；Weiner et al.，Cancer Res.，50421-425(1990)；Kern et al.，Cancer Res.，505184(1990)；Parket al.，Cancer Res.，496605(1989)；Zhau et al.，Mol.Carcinog.，3354-357(1990)；Aasland et al.，Br.J.Cancer，57358-363(1988)；Williams et al.，Pathiobiology，5946-52(1991)；和McCann et al.，Cancer，6588-92(1990)。ErbB2可能在前列腺癌中過(guò)度表達(dá)(Gu et al.，Cancer Lett.，99185-9(1996)；Ross et al.，Hum.Pathol.，28827-33(1997)；Ross et al.，Cancer，792162-70(1997)；和Sadasivan et al.，J.Urol.，150126-31(1993))。ErbB2的過(guò)度表達(dá)可能會(huì)通過(guò)不依賴于配基地激活ErbB2或ErbB2同型二聚體，引起腫瘤生長(zhǎng)。
針對(duì)大鼠p185neu和人ErbB2蛋白質(zhì)產(chǎn)物的抗體已經(jīng)被描述。Drebin及其同事已經(jīng)制備出抗大鼠neu基因產(chǎn)物p185neu的抗體。參見(jiàn)，例如Drebinet al.，Cell，41695-706(1985)；Myers et al.，Meth.Enzym.，198277-290(1991)；和W094/22478。Drebin et al.，Oncogene，2273-277(1988)報(bào)道，與p185neu的兩個(gè)不同區(qū)域反應(yīng)的抗體的混合物對(duì)被植入裸鼠的neu轉(zhuǎn)化的NIH-3T3細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同的抗腫瘤作用。還參見(jiàn)1998年10月20日授權(quán)的美國(guó)專利5,824,311。
Hudziak等，Mol.Cell.Biol.，931165-1172(1989)描述了一系列抗ErbB2抗體的制備，采用人乳腺腫瘤細(xì)胞系SK-BR-3對(duì)其進(jìn)行鑒定。通過(guò)在72小時(shí)后對(duì)單細(xì)胞層進(jìn)行結(jié)晶紫染色，測(cè)定了SK-BR-3細(xì)胞在暴露于抗體后的相對(duì)細(xì)胞增殖。采用這種測(cè)定法，用稱為4D5的抗體獲得最大抑制作用，其抑制了56％的細(xì)胞增殖。在該測(cè)定中，該系列的其他抗體在較小程度降低細(xì)胞增殖。還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)抗體4D5能夠使過(guò)度表達(dá)ErbB2的乳腺腫瘤細(xì)胞系對(duì)TNF-α的細(xì)胞毒性作用變得敏感。還參見(jiàn)1997年10月14日授權(quán)的美國(guó)專利號(hào)5,677,171。在Hudziak et al中被討論的抗ErbB2抗體還在Fendlyet al.，Cancer Research，501550-1558(1990)；Kotts et al.，In Vitro，26(3)59A(1990)；Sarup et al.，Growth Regulation，172-82(1991)；Shepard et al.，JClin.Immunol.，11(3)117-127(1991)；Kumar et al.，Mol.Cell Biol.，11(2)979-986(1991)；Lewis et al.，Cancer Immunol.Immunother.，37255-263(1993)；Pietras et al.，Oncogene，91829-1838(1994)；Vitetta et al.，CancerResearch，545301-5309(1994)；Sliwkowski et al.，J.Biol.Chem.，269(20)14661-14665(1994)；Scott et al.，J.Biol.Chem.，26614300-5(1991)；D′souza etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，917202-7206(1994)；Lewis et al.，Cancer Research，561457-1465(1996)；和Schaefer et al.，Oncogene，151385-1394(1997)中被進(jìn)一步表征。
重組的人源化鼠抗ErbB2抗體4D5(huMAb4D5-8，rhuMAb HER2或HERCEPTIN；美國(guó)專利號(hào)5,821,337)在過(guò)度表達(dá)ErbB2的轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者中具有臨床活性，這些患者接受了廣泛的預(yù)先抗癌治療(Baselga et al.，J Clin Oncol.，14737-744(1996))。1998年9月25日HERCEPTIN獲得美國(guó)食品和藥品管理局的銷售許可，用于治療患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者，其腫瘤過(guò)度表達(dá)ErbB2蛋白。但是，并不是所有的過(guò)度表達(dá)ErbB2的腫瘤都對(duì)HERCEPTIN響應(yīng)。(Brockhoffet al.，Cytometry，44338-48(2001))。此外，臨床前的數(shù)據(jù)暗示，HERCEPTIN對(duì)于治療非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是治療上有效的。HER2蛋白在20-66％的被切除NSCLC腫瘤中過(guò)度表達(dá)，并且被證明在多個(gè)系列中預(yù)測(cè)不理想的患者結(jié)局(Azzoli，C.G.et al.，Semin.Oncol.，29(Suppl4)59-65(2002))。
其他具有各種性質(zhì)的抗ErbB2的抗體已經(jīng)被描述在Tagliabue et al.，Int.J.Cancer，47933-937(1991)；McKenzie et al.，Oncogene，4543-548(1989)；Maier et al.，Cancer Res.，515361-5369(1991)；Bacus et al.，MolecularCarciaogenesis，3350-362(1990)；Stancovski et al.，PNAS (USA)，888691-8695(1991)；Bacus et al.，Cancer Research，522580-2589(1992)；Xu et al.，Int.J.Cancer，53401-408(1993)；W094/00136；Kasprzyk et al.，CancerResearch，522771-2776(1992)；Hancock et al.，Cancer Res.，514575-4580(1991)；Shawver et al.，Cancer Res.，541367-1373(1994)；Arteaga et al.，Cancer Res.，543758-3765(1994)；Harwerth et al.，J.Biol.Chem.，26715160-15167(1992)；美國(guó)專利號(hào)5,783,186；和Klapper et al.，Oncogene，142099-2109(1997)中。單克隆抗體2C4在WO 01/00245中描述，在此引入作為參考。已經(jīng)證明2C4破壞HER2與其他ErbB受體家族成員發(fā)生二聚化(WO 01/00245)。
同源性篩選已經(jīng)鑒定了兩種其他的ErbB受體家族成員；ErbB3(美國(guó)專利號(hào)5,183,884和5,480,968，以及Kraus et al.，PNAS(USA)，869193-9197(1989))和ErbB4(歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?99,274；Plowman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，901746-1750(1993)；和Plowman et al.，Nature，366473-475(1993))。這兩種受體在至少某些乳腺癌細(xì)胞系中均表現(xiàn)為表達(dá)增加。
ErbB受體通常以各種組合的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，并且一般認(rèn)為異二聚化增加細(xì)胞對(duì)各種ErbB配基反應(yīng)的多樣性(Earp et al.，Breast CancerResearch and Treatment，35115-132(1995))。然而，這些受體聚集以及如何作用于信號(hào)傳遞的機(jī)制還未被充分了解(Brennan，P.J.et al.，Oncogene，196093-6101(2000))。EGFR被六個(gè)不同配基結(jié)合；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α)，雙調(diào)蛋白，肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(HB-EGF)，β-動(dòng)物纖維素(betacellulin)和上皮調(diào)節(jié)素(epiregulin)(Groenen et al.，GrowthFactors，11235-257(1994))。由對(duì)單個(gè)基因的可變剪接得到的heregulin蛋白家族是ErbB3和ErbB4的配基。Heregulin家族包括α、β和γheregulin(Holmes et al.，Science，2561205-1210(1992)，美國(guó)專利號(hào)5,641,869；和Schaefer et al.，Oncogene，151385-1394(1997))；neu分化因子(NDF)，神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子(GGFs)；乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性(acetylcholine receptor inducingactivity)(ARIA)；以及感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元衍生因子(sensory and motor neuronderived factor)(SMDF)。綜述參見(jiàn)Groenen et al.，Growth Factors，11235-257(1994)；Lemke，G.，Molec.&Cell.Neurosci.，7247-262(1996)和Lee etal.，Pharm.Rev.，4751-85(1995)。最近，三種其他的ErbB配基被鑒定；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2(neuregulin-2)(NRG-2)，其被報(bào)道能結(jié)合ErbB3或ErbB4(Chang etal.，Nature，387509-512(1997)；和Carraway et al.，Nature，387512-516(1997))；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3(neuregulin-3)，其結(jié)合ErbB4(Zhang etal.，PNAS(USA)，94(18)9562-7(1997))；和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-4(neuregulin-4)，其結(jié)合ErbB4(Harari et al.，Oncogene，182681-89(1999))HB-EGF、β-動(dòng)物纖維素和上皮調(diào)節(jié)素也結(jié)合ErbB4。
雖然EGF和TGFα不結(jié)合ErbB2，但是EGF刺激EGFR和ErbB2形成異二聚體，該異二聚體激活EGFR并導(dǎo)致ErbB2在異二聚體中發(fā)生轉(zhuǎn)磷酸作用。二聚化和/或轉(zhuǎn)磷酸作用似乎能夠激活ErbB2酪氨酸激酶。參見(jiàn)Earpet al.，同上文。同樣地，heregulin不與ErbB2結(jié)合，但是當(dāng)ErbB3與ErbB2共表達(dá)時(shí)，形成一種活性信號(hào)傳遞復(fù)合物(Nagy et al.，Cytometry，32120-31(1998)。針對(duì)ErbB2的抗體能夠破壞這一復(fù)合物(Sliwkowski et al.，J.Biol.Chem.，269(20)14661-14665(1994))。ErbB3是酪氨酸激酶缺陷的，因此需要異二聚化，優(yōu)選與ErbB2異二聚化，來(lái)具備信號(hào)轉(zhuǎn)換能力。(Graus-Porta et al.，EMBO J.，161647-55(1995))。此外，當(dāng)與ErbB2共表達(dá)時(shí)，ErbB3對(duì)heregulin(HRG)的親合性增加至較高的親合狀態(tài)。還參見(jiàn)Levi et al.，Journal of Neuroscience，151329-1340(1995)；Morrissey et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，921431-1435(1995)和Lewis et al.，Cancer Res.，561457-1465(1996)對(duì)于ErbB2-ErbB3蛋白質(zhì)復(fù)合物的描述。實(shí)際上，ErbB2是EGFR和ErbB3的優(yōu)選異二聚化伴侶。(Graus-Porta et al.，同上文)。如同ErbB3一樣，ErbB4與ErbB2形成活性信號(hào)傳遞復(fù)合物(Carraway和Cantley，Cell，785-8(1994))。ErbB2與EGFR或ErbB3的配基依賴的異二聚化可能促進(jìn)表達(dá)ErbB2的腫瘤的生長(zhǎng)。
已經(jīng)在來(lái)自原發(fā)性乳腺癌患者的腫瘤樣本中和膀胱癌中研究了ErbB受體和heregulin的表達(dá)以及HER2的磷酸化狀況(Esteva et al.，Pathol.Oncol.Res.，7171-177(2001)；Chow et al.，Clin.Cancer Res.，71957-1962(2001))。Thor et al.，J.Clin.Oncology，183230-3239(2000)，和DiGiovanna et al.，Cancer Res.，626667-6673(2002)已經(jīng)報(bào)道了在乳腺癌中，通過(guò)Her2/neu的活躍信號(hào)傳遞與臨床病理和患者結(jié)局之間的相關(guān)性。
發(fā)明概述一個(gè)方面，本發(fā)明涉及鑒定對(duì)用抗HER2抗體處理有響應(yīng)的腫瘤的方法。優(yōu)選地，該抗HER2抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基激活。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體是單克隆抗體2C4，更加優(yōu)選為rhuMAb 2C4。
獲得腫瘤樣本，并檢測(cè)該樣本中是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物。當(dāng)檢測(cè)到這種復(fù)合物時(shí)，腫瘤被鑒定為對(duì)用抗HER2抗體的處理有響應(yīng)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)用抗HER2抗體免疫沉淀任何含有HER2的蛋白質(zhì)復(fù)合物來(lái)檢測(cè)是否存在復(fù)合物。然后被免疫沉淀的復(fù)合物與選自由抗HER3抗體、抗HER1抗體和抗HER4抗體組成的組的抗體接觸，確定任何結(jié)合。如果確定抗HER3和/或抗HER1和/或抗HER4的抗體結(jié)合到被免疫沉淀的復(fù)合物上，即檢測(cè)到HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4復(fù)合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將腫瘤樣本與包含第一熒光團(tuán)的抗HER2的抗體接觸來(lái)檢測(cè)是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物。然后將腫瘤樣本與選自由抗HER3和/或抗HER1和/或抗HER4抗體組成的組的抗體接觸，其中所述抗體包含第二熒光團(tuán)。然后測(cè)定熒光共振能量轉(zhuǎn)移來(lái)確定第一熒光團(tuán)與第二熒光團(tuán)是否十分接近。如果第一熒光團(tuán)與第二熒光團(tuán)被確定十分接近，則檢測(cè)到存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物。
在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將腫瘤樣本與第一結(jié)合化合物接觸來(lái)檢測(cè)是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物。第一結(jié)合化合物包含特異地結(jié)合HER2的第一靶向結(jié)合部分。第一靶向結(jié)合部分優(yōu)選是抗HER2抗體或抗體片段。第一結(jié)合化合物進(jìn)一步包括通過(guò)可裂解接頭連接到第一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可檢測(cè)部分。
將腫瘤樣本與第二結(jié)合化合物接觸。第二結(jié)合化合物優(yōu)選包含特異地結(jié)合HER3或HER1或HER4和優(yōu)選不結(jié)合HER2的第二靶向結(jié)合部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二結(jié)合化合物結(jié)合HER3或HER1，并且不結(jié)合HER2或HER4。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二靶向結(jié)合部分包含抗HER3或抗HER1或抗HER4的抗體或抗體片段。第二結(jié)合化合物被激活時(shí)能夠斷裂第一結(jié)合化合物的可裂解接頭，從而當(dāng)?shù)谝唤Y(jié)合化合物與第二結(jié)合化合物十分接近時(shí)產(chǎn)生游離的可檢測(cè)部分。當(dāng)鑒定到存在游離的可檢測(cè)部分時(shí)，確定存在HER2/HER3或HER2/HER1或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)毛細(xì)管電泳確定是否存在游離的可檢測(cè)部分。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一結(jié)合化合物包含特異地結(jié)合HER1或HER3或HER4的第一靶向結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且第二結(jié)合化合物包含特異地結(jié)合HER2的第二靶向結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
在還有一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)評(píng)價(jià)ErbB受體磷酸化，例如通過(guò)免疫沉淀HER2蛋白質(zhì)，接著通過(guò)蛋白質(zhì)印跡免疫檢測(cè)磷酸酪氨酸，檢測(cè)HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物，以及所引起的HER2活化。
用于分析是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的腫瘤樣本優(yōu)選從患有該腫瘤的患者中獲得。該樣本例如可以通過(guò)活組織檢查獲得。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該樣本通過(guò)純化來(lái)自患者的循環(huán)的腫瘤細(xì)胞來(lái)獲得。在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，該樣本在從患者身上摘除腫瘤的手術(shù)過(guò)程中獲得。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤樣本是從哺乳動(dòng)物而不是最先發(fā)生該腫瘤的患者之外的哺乳動(dòng)物中獲得。優(yōu)選地，該樣本得自小鼠或另一種嚙齒類動(dòng)物。更加優(yōu)選地，該腫瘤是異種移植的腫瘤。該異種移植的腫瘤優(yōu)選通過(guò)將人的腫瘤碎片移植到小鼠或另一種嚙齒類動(dòng)物來(lái)制備。
在一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤是肺腫瘤，更加優(yōu)選是非小細(xì)胞肺癌腫瘤。在另一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤是乳腺腫瘤。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及檢測(cè)對(duì)用抑制HER2與ErbB受體家族另一成員結(jié)合的抗體的處理有響應(yīng)的腫瘤細(xì)胞的方法，包括步驟(a)提供包含HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)樣本；和(b)檢測(cè)生物學(xué)樣本中的ErbB受體的磷酸化，其中所述磷酸化表明腫瘤細(xì)胞對(duì)用抗體處理有響應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)ErbB2(HER2)受體的磷酸化。
如前所述，與HER2相關(guān)的其他成員是HER3、HER1和/或HER4，例如HER2和/或HER1。該方法還可以另外包含檢測(cè)是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的步驟，基本上如上所述。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及用于預(yù)測(cè)被診斷具有HER2陽(yáng)性腫瘤的受檢者對(duì)用抑制HER2與ErbB受體家族的另一個(gè)成員結(jié)合的抗體處理的反應(yīng)的方法，通過(guò)檢測(cè)在得自該受檢者的包含HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的生物樣本中HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成和/或ErbB受體的磷酸化。存在這種蛋白質(zhì)復(fù)合物和/或所述磷酸化表明個(gè)體可能對(duì)用抗體處理有響應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)到ErbB2(HER2)受體的磷酸化表明受檢者可能對(duì)用該抗體處理有響應(yīng)。
在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)檢測(cè)受檢者的循環(huán)的腫瘤細(xì)胞中的ErbB受體的磷酸化，鑒定對(duì)用抗HER2抗體處理有響應(yīng)的受檢者。存在這種磷酸化表明受檢者可能對(duì)用抗HER2抗體的處理有響應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)ErbB2(HER2)磷酸化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受檢者是人。在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包含用抗HER2抗體治療受檢者，優(yōu)選使用rhuMAb 2C4。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種制品，其包含含有結(jié)合HER2的抗體的容器和關(guān)于將該抗體施用給患有腫瘤的患者中的說(shuō)明書(shū)。優(yōu)選地，該腫瘤已經(jīng)被確定包含HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該容器含有阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該容器含有單克隆抗體2C4，更加優(yōu)選為rhuMAb 2C4。
在還有一個(gè)方面，本發(fā)明提供治療患者的方法，包含給患者施用治療有效量的結(jié)合HER2的抗體。優(yōu)選地，該患者患有被確定包含HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體的腫瘤。
在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體是單克隆抗體2C4，更加優(yōu)選為rhuMAb 2C4。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供治療患者的方法，包含給患者施用治療有效量的結(jié)合HER2的抗體。優(yōu)選地，該患者患有被確定具有被磷酸化的ErbB受體的腫瘤。
在一個(gè)實(shí)施方案中，被磷酸化的ErbB受體是HER2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體是單克隆抗體2C3，更加優(yōu)選為rhuMAb 2C4。
附圖簡(jiǎn)介附

圖1A和1B描述鼠單克隆抗體2C4的輕鏈可變區(qū)(VL)(附圖1A)和重鏈可變區(qū)(VH)(附圖1B)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對(duì)(分別為SEQ ID No.1和2)，2C4的人源化形式574的VL和VH結(jié)構(gòu)域(分別為SEQ ID No.3和4)以及人VL和VH的共有片段(humκ1，輕鏈κ亞群I；humIII，重鏈亞群III)(分別為SEQ ID No.5和6)。星號(hào)表示在2C4的人源化形式574和鼠單克隆抗體2C4之間或者在2C4的人源化形式574和人框架之間的差異?；パa(bǔ)決定區(qū)(CDR)在括號(hào)內(nèi)。
附圖2A和2B表示在表達(dá)低水平/正常水平ErbB2的MCF7細(xì)胞(附圖2A)和表達(dá)高水平的ErbB2的SK-BR-3細(xì)胞(附圖2B)中，單克隆抗體2C4、HERCEPTIN抗體或抗EGFR抗體對(duì)heregulin(HRG)依賴的ErbB2與ErbB3結(jié)合的影響；參見(jiàn)下面的實(shí)施例2。
附圖3是表明在來(lái)自非小細(xì)胞肺癌異種移植外植體的蛋白質(zhì)提取物中存在HER1/HER2和HER2/HER3異二聚體的免疫印跡。
附圖4是表明在來(lái)自非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)異種移植外植體的蛋白質(zhì)提取物中存在HER2磷酸化的免疫印跡。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述本發(fā)明部分地基于對(duì)抗HER2抗體rhuMAb 2C4的響應(yīng)與腫瘤細(xì)胞中存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和或HER2/HER4異二聚體、和/或ErbB受體磷酸化相關(guān)的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)。因此，基于存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體、和/或ErbB受體磷酸化，腫瘤可以被鑒定為對(duì)用抗HER2抗體的處理有響應(yīng)，特別是具有抗HER2抗體2C4的一種或多種生物學(xué)活性的抗HER2抗體。HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體，和/或ErbB受體磷酸化可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)鑒定。通過(guò)鑒定對(duì)用抗HER2的抗體處理響應(yīng)的特定腫瘤和腫瘤類型，可以鑒定將可能會(huì)從這種處理中最獲益的患者。此外，還可以鑒定可能無(wú)法從使用單克隆抗體2C4的治療中獲益的患者。
定義“ErbB受體”是受體蛋白酪氨酸激酶，其屬于ErbB受體家族，包括EGFR(ErbB1)、ERRP、ErbB2、ErbB3和ErbB4受體以及將來(lái)將被鑒定的該家族的其他成員。ErbB受體通常包含可能結(jié)合ErbB配基的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域；親脂性跨膜結(jié)構(gòu)域；保守的細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域；和具有多個(gè)可以被磷酸化的酪氨酸殘基的羧基端信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。ErbB受體可以是“天然序列”的ErbB受體或其“氨基酸序列變體”。優(yōu)選地，ErbB受體是天然序列的人ErbB受體。因此，“ErbB受體家族成員”是EGFR(ErbB1)、ErbB2、ErbB3、ErbB4或任何其他目前已知或者將來(lái)將被鑒定的ErbB受體。優(yōu)選地，該成員是EGFR(ErbB1)、ErbB2、ErbB3、或ErbB4。
術(shù)語(yǔ)“ErbB1”、“表皮生長(zhǎng)因子受體”、“EGFR”和“HER1”在此被互換使用，是指被公開(kāi)在如Carpenter et al.，Ann.Rev.Biochem.，56881-914(1987)中的EGFR，包括其天然存在的突變形式(例如Humphrey et al.，PNAS(USA)，874207-4211(1990)中的缺失突變EGFR)。erbB1是指編碼EGFR蛋白產(chǎn)物的基因?？笻ER1的抗體被描述在例如Murthy et al.，Arch.Biochem.Biophys.，252549-560(1987)和WO 95/25167中。
術(shù)語(yǔ)“ERRP”、“EGF受體相關(guān)蛋白”、“EGFR相關(guān)蛋白”和“表皮生長(zhǎng)因子受體相關(guān)蛋白”在此被互換使用，是指公開(kāi)在例如美國(guó)專利號(hào)6,399,743和美國(guó)公開(kāi)號(hào)2003/0096373中的ERRP。
表達(dá)法“ErbB2”和“HER2”在此被互換使用，是指在例如Semba et al.，PNAS(USA)，826497-6501(1985)和Yamamoto et al.，Nature，319230-234(1986)(Genebank登錄號(hào)X03363)中被描述的人HER2蛋白。術(shù)語(yǔ)“erbB2”是指編碼人ErbB2的基因，而“neu”是指編碼大鼠p185neu的基因。優(yōu)選的ErbB2是天然序列的人ErbB2。
“ErbB3”和“HER3”是指如在美國(guó)專利號(hào)5,183,884和5,480,968以及Kraus et al.，PNAS (USA)，869193-9197(1989)中公開(kāi)的受體多肽?？笶rbB3的抗體在本領(lǐng)域是已知的，被描述在例如美國(guó)專利號(hào)5,183,884、5,480,968和WO97/35885中。
術(shù)語(yǔ)“ErbB4”和“HER4”在此是指在如歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?99,274；Plowman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，901746-1750(1993)和Plowman et al.，Nature，366473-475(1993)中所描述的受體多肽，包括其同種型，例如被公開(kāi)在1999年4月22日公開(kāi)的WO 99/19488中?？笻ER4的抗體被描述在例如WO 02/18444中。
ErbB受體的抗體可以從許多地方購(gòu)買(mǎi)得到，包括例如Santa CruzBiotechnology，Inc.，California，USA有限公司。
所用“ErbB配基”是指結(jié)合和/或激活ErbB受體的多肽。ErbB配基是天然序列的人ErbB配基，例如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)(Savage et al.，J.Biol.Chem.，2477612-7621(1972))；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α)(Marquardt et al.，Science，2231079-1082(1984))；雙調(diào)蛋白也稱作雪旺氏瘤(schwanoma)或角質(zhì)細(xì)胞自分泌生長(zhǎng)因子(keratinocyte autocrine growth factor)(Shoyab et al.，Science，2431074-1076(1989)；Kimura et al.，Nature，348257-260(1990)；和Cook etal.，Mol.Cell.Biol.，112547-2557(1991))；β-動(dòng)物纖維素(Shing et al.，Science，2591604-1607(1993)；和Sasada et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1901173(1993))；肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(HB-EGF)(Higashiyama et al.，Science，251936-939(1991))；上皮調(diào)節(jié)素(Toyoda et al.，J.Biol.Chem.，2707495-7500(1995)；和Komurasaki et al.，Oncogene，152841-2848(1997))；heregulin(參見(jiàn)下面)；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2(NRG-2)(Carraway et al.，Nature，387512-516(1997))；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3(NRG-3)(Zhang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，949562-9567(1997))；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-4(NRG-4)(Harari et al.，Oncogene，182681-89(1999))或cripto(CR-1)(Kannan et al.，J.Biol.Chem.，272(6)3330-3335(1997))。結(jié)合EGFR的ErbB配基包括EGF、TGF-α、雙調(diào)蛋白、β-動(dòng)物纖維素、HB-EGF和上皮調(diào)節(jié)素。結(jié)合ErbB3的ErbB配基包括heregulin。能夠結(jié)合ErbB4的ErbB配基包括β-動(dòng)物纖維素、上皮調(diào)節(jié)素、HB-EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4和heregulin。ErbB配基還可以是合成的ErbB配基。合成的配基可以特異于特定的ErbB受體，或者能夠識(shí)別特定的ErbB受體復(fù)合物。合成配基的一個(gè)例子是合成的heregulin/egf嵌合雙調(diào)素(biregulin)(參見(jiàn)，例如Jones et al.，F(xiàn)EBS Letters，447227-231(1999)，在此引入作為參考)。
在此所用的“Heregulin”(HRG)是指由在美國(guó)專利號(hào)5,641,869或Marchionni et al.，Nature，362312-318(1993)中公開(kāi)的heregulin基因產(chǎn)物所編碼的多肽。Heregulin的例子包括heregulin-α、heregulin-β1、heregulin-β2和heregulin-β3(Holmes et al.，Science，2561205-1210(1992)；和美國(guó)專利號(hào)5,641,869)；neu分化因子(NDF)(Peles et al.，Cell，69205-216(1992))；乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性(ARIA)(Falls et al.，Cell，72801-815(1993))；神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子(GGF)(Marchionni et al.，Nature，362312-318(1993))；感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元衍生因子(SMDF)(Ho et al.，J.Biol.Chem.，27014523-14532(1995))；γ-heregulin(Schaefer et al.，Oncogene，151385-1394(1997))。該術(shù)語(yǔ)包括天然序列的HRG多肽的生物學(xué)活性片段和/或氨基酸序列變體，例如其EGF樣結(jié)構(gòu)域片段(例如，HRGβ1177-244)。
“ErbB異低聚物”在此是包含至少兩種不同ErbB受體的非共價(jià)結(jié)合的低聚體。“ErbB二聚體”是包含兩種不同ErbB受體的非共價(jià)結(jié)合的低聚體。當(dāng)表達(dá)兩種或更多種ErbB受體的細(xì)胞被暴露于ErbB配基時(shí)，形成這種復(fù)合物。ErbB低聚體，例如ErbB二聚體，可以通過(guò)免疫沉淀來(lái)分離并通過(guò)例如在Sliwkowski et al.，J.Biol.Chem.，269(20)14661-14665(1994)中描述的SDS-PAGE來(lái)分析。這種ErbB異低聚體的例子包括EGFR-ErbB2(也稱作為HER1/HER2)，ErbB2-ErbB3(HER2/HER3)和ErbB3-ErbB4(HER3/HER4)復(fù)合物。此外，ErbB異低聚體可以包含兩個(gè)或更多個(gè)與不同ErbB受體例如ErbB3、ErbB4或EGFR(ErbB1)結(jié)合的ErbB2受體。其他蛋白質(zhì)，例如細(xì)胞因子受體亞單位(例如gpl30)可以被包括在異低聚體中。
“ErbB受體的配基活化”是指受結(jié)合到包含目的ErbB受體的ErbB異低聚體上的ErbB配基調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如由ErbB受體的細(xì)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化ErbB受體或底物多肽中的酪氨酸殘基所引起的)。一般地，這涉及ErbB配基結(jié)合到ErbB異低聚體上，激活異低聚體中的一個(gè)或多個(gè)ErbB受體的激酶結(jié)構(gòu)域，從而導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)ErbB受體的中的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化和/或在額外的底物多肽中的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化?？梢圆捎酶鞣N酪氨酸磷酸化分析來(lái)量化ErbB受體活化。
“天然序列”多肽是具有與來(lái)自自然界的多肽(例如ErbB受體或ErbB配基)相同的氨基酸序列的多肽。這種天然序列多肽可以從自然界中分離或者可以通過(guò)重組或合成方法制備。因此，天然序列的多肽具有天然發(fā)生的人多肽、鼠多肽或來(lái)自任何其他哺乳動(dòng)物物種的多肽的氨基酸序列。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列變體”是指具有在一定程度上與天然序列多肽有區(qū)別的氨基酸序列的多肽。通常，氨基酸序列變體將與天然ErbB配基的至少一個(gè)受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者與天然ErbB受體的至少一個(gè)配基結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有至少約70％同源性，和優(yōu)選地至少約80％，更加優(yōu)選地，與這種受體或配基結(jié)合結(jié)構(gòu)域至少約90％同源。氨基酸序列變體在天然氨基酸序列的氨基酸序列中的某些位點(diǎn)上具有取代、缺失和/或插入。
“同源性”被定義為在必要時(shí)進(jìn)行序列比對(duì)和引入缺口以獲取最大的百分比同一性后氨基酸序列變體中的相同殘基的百分比。用于比對(duì)的方法和計(jì)算機(jī)程序在本領(lǐng)域是已熟知的。一種這種計(jì)算機(jī)程序是“Align 2”，由Genentech，Inc.創(chuàng)作，已經(jīng)在1991年12月10日在華盛頓，DC 20559，美國(guó)版權(quán)局與用戶文檔(user documentation)一起提交。
術(shù)語(yǔ)“抗體”在此以最廣泛的意義被使用，特別地涵蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多重特異性抗體(例如雙特異性抗體)，和抗體片段，只要其具有期望的生物學(xué)活性。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指從基本上同型的抗體的群體中獲得的抗體，即包含群體的各個(gè)抗體除了以少量存在的可能天然發(fā)生的突變外，是相同的。單克隆抗體是高度特異的，針對(duì)單一的抗原位點(diǎn)。此外，與包含針對(duì)不同抗原決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑形成對(duì)比的是，各個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一抗原決定簇。除了其特異性外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)在于可以不受其他抗體污染地被合成。修飾語(yǔ)“單克隆”表示從基本上同型的抗體群體中獲得的抗體的特征，而不被解釋為需要通過(guò)任何特定方法來(lái)生產(chǎn)抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明將被使用的單克隆抗體可以通過(guò)最早由Kohler et al.，Nature，256495(1975)所描述的雜交瘤方法來(lái)制備，或者通過(guò)重組DNA方法(參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)4,816,567)來(lái)制備。還可以采用在例如Clackson et al.，Nature，352624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)中描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)中分離“單克隆抗體”。
單克隆抗體在此特別地包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來(lái)自特定物種或者屬于特定的抗體種類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，而該鏈的剩余部分與來(lái)自另一物種或者屬于另一抗體種類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或相似，以及這種抗體的片段，只要這些片段展示出期望的生物學(xué)活性(美國(guó)專利號(hào)4,816,567；和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。在此的目的嵌合抗體包括含有衍生自非人靈長(zhǎng)類(例如舊大陸猴(Old World Monkey)，猿等)的可變結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合序列和人的恒定區(qū)序列的“靈長(zhǎng)類化”抗體。
“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2、和Fv片段；微型雙功能抗體(diabodies)；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多重特異性抗體。
“完整的”抗體是包含抗原結(jié)合可變區(qū)以及輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域CH1，CH2和CH3的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序列的恒定結(jié)構(gòu)域(例如人天然序列的恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。優(yōu)選地，完整的抗體具有一種或多種效應(yīng)子功能。
抗體的“效應(yīng)子功能”是指那些可歸結(jié)于抗體的Fc區(qū)域(天然序列的Fc區(qū)域或氨基酸序列變體的Fc區(qū)域)的生物學(xué)活性?？贵w效應(yīng)子功能的例子包括Clq結(jié)合；補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體；BCR)的下調(diào)等。
根據(jù)重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，完整抗體抗原被分成不同“種類”。有五個(gè)主要的完整抗體的種類IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，并且這些中的部分還抗原進(jìn)一步分成“亞類”(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同抗體種類的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別被稱為α、δ、ε、γ和μ。不同種類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是已熟知的。
“抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”和“ADCC”是指一種細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性的細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然殺傷(NK)細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，并隨后引起靶細(xì)胞的溶解。用于介導(dǎo)ADCC的初級(jí)細(xì)胞NK細(xì)胞僅表達(dá)FcγRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcγRI，F(xiàn)cγRII和FcγRIII。造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)被總結(jié)在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9457-92(1991)的第464頁(yè)的表3中。為了評(píng)價(jià)目的分子的ADCC活性，進(jìn)行例如在美國(guó)專利號(hào)5,500,362或5,821,337中描述的體外ADCC分析?？捎糜谶@種分析的有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。可選擇地或者另外地，可以在體內(nèi)評(píng)價(jià)目的分子的ADCC活性，例如在如Clynes et al.，PNAS(USA)，95652-656(1998)中披露的動(dòng)物模型中。
“人的效應(yīng)細(xì)胞”是白細(xì)胞，其表達(dá)一種或多種FcR并且行使效應(yīng)子功能。優(yōu)選地，該細(xì)胞至少表達(dá)FcγRIII并且行使ADCC效應(yīng)子功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞；而PBMC和NK細(xì)胞是優(yōu)選的。效應(yīng)子細(xì)胞可以從其天然來(lái)源中分離，例如如在此描述地來(lái)自血液或PBMC。
術(shù)語(yǔ)“Fc受體”或“FcR”用于描述一種結(jié)合到抗體的Fc區(qū)域的受體。優(yōu)選的FcR是人FcR的天然序列。此外優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcR(γ受體)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。FcγRII受體包括FcγRII A(“活化受體”)和FcγRII B(“抑制受體”)，具有相似的氨基酸序列，主要區(qū)別在于其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?；罨荏wFcγRII A在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有一個(gè)以免疫受體酪氨酸為基礎(chǔ)的活化基序(an immunoreceptor tyrosine-based activationmotif)(ITAM)。抑制受體FcγRII B在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有一個(gè)免疫受體酪氨酸為基礎(chǔ)的抑制基序(an immunoreceptor tyrosine-based inhibitionmotif)(ITIM)。(參見(jiàn)綜述，M.Daeron，Annu.Rev.Immunol.，15203-234(1997))。FcR在Ravetch和Kinet，Anne.Rev.Immunol.，9457-92(1991)；Capel et al.，，Immunomethods，425-34(1994)；和de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.，126330-41(1995)中被評(píng)述。其他的FcR，包括將來(lái)將被鑒定的那些，都被包含在此處的術(shù)語(yǔ)“FcR”中。該術(shù)語(yǔ)還包括新生兒的受體，F(xiàn)cRn，其負(fù)責(zé)將母體的IgG轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒(Guyer et al.，J.Immunol.，117587(1976)和Kim et al.，J.ImmunoL，24249(1994))。
“補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性”或者“CDC”是指存在補(bǔ)體時(shí)，分子溶解靶點(diǎn)的能力。補(bǔ)體活化路徑由補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)結(jié)合到與關(guān)聯(lián)抗原復(fù)合的分子(例如，一種抗體)上起始。為了評(píng)價(jià)補(bǔ)體活化，可進(jìn)行如在Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods，202163(1996)中描述的CDC分析。
“天然抗體”通常是約150,000道爾頓的由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成的異四聚糖蛋白。每條輕鏈通過(guò)共價(jià)二硫鍵連接到重鏈上，而且二硫鍵的數(shù)量隨著不同免疫球蛋白同種型的重鏈而變化。每條重鏈和輕鏈還具有規(guī)則的間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在其一端具有可變結(jié)構(gòu)域(VH)，隨后是大量的恒定結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈在其一端具有可變結(jié)構(gòu)域(VL)，并在另一端具有恒定結(jié)構(gòu)域。輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域?qū)?zhǔn)(align)重鏈的第一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域，而輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域?qū)?zhǔn)重鏈的可變結(jié)構(gòu)域。一般認(rèn)為，特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間形成一個(gè)界面。
術(shù)語(yǔ)“可變的”是指可變結(jié)構(gòu)域的某些部分在抗體的序列中廣泛地變化，被用于每一特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性。但是，可變性不是均勻地分布在抗體的可變結(jié)構(gòu)域中。其集中在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域上的稱為高變區(qū)(hypervariable region)的三個(gè)片段上。可變結(jié)構(gòu)域的更加高度保守部分稱作骨架區(qū)(framework region)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域每個(gè)都包含四個(gè)FR，大部分采用β片層構(gòu)型，由三個(gè)高變區(qū)連接，形成環(huán)狀連接，有時(shí)形成β片層結(jié)構(gòu)的一部分。各條鏈中的高變區(qū)通過(guò)FR被緊密地固定在一起，并與其他鏈的高變區(qū)一起導(dǎo)致抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見(jiàn)Kabat et al.，具有免疫學(xué)意義的蛋白質(zhì)的序列(Sequences of Proteins ofimmunological Interest)，第5版.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))。恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與將抗體與抗原的結(jié)合，但是具有各種效應(yīng)子功能，例如參與抗體在抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)中的作用。
當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”是指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包含來(lái)自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat et al.，具有免疫學(xué)意義的蛋白質(zhì)的序列，第5版.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))和/或來(lái)自“高變區(qū)環(huán)”(“hypervariable loop”)的那些殘基(例如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196901-917(1987))。“骨架區(qū)”或“FR”殘基是那些如在此所定義的高變區(qū)殘基之外的可變結(jié)構(gòu)域殘基。
木瓜蛋白酶消化抗體生成兩種相同的抗原結(jié)合片段，稱作“Fab”片段，每個(gè)片段具有一個(gè)單一的抗原結(jié)合位點(diǎn)和殘余的“Fc”片段，其名稱反映其很容易結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理生成具有兩抗原結(jié)合位點(diǎn)的F(ab′)2片段，并且仍能夠與抗原交聯(lián)。
“Fv”是最小的抗體片段，其含有完整的抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)。該區(qū)域由以緊密和非共價(jià)連接的由一條重鏈和一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域組成的二聚體組成。是在這一構(gòu)型中，各個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的三個(gè)高變區(qū)相互作用來(lái)確定VH-VL二聚體表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)。總的來(lái)說(shuō)，六個(gè)超變區(qū)將抗原結(jié)合特異性賦予給抗體。但是，即使是單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(或者僅包含三個(gè)特異于抗原的高變區(qū)的Fv的一半)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，雖然其親合性低于完整結(jié)合位點(diǎn)。
Fab片段還含有輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域以及重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)。Fab′片段與Fab片段的不同在于在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基端增加少數(shù)殘基，包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab′-SH在此是指恒定結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基帶有至少一個(gè)游離巰基的Fab′。F(ab′)2抗體片段最初以一對(duì)之間具有鉸鏈半胱氨酸的Fab′片段生成?？贵w片段的其他化學(xué)偶聯(lián)也是已知的。
根據(jù)恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，來(lái)自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體的“輕鏈”被劃歸入兩種明顯區(qū)別的種類之一，稱作kappa(κ)和lambda(λ)。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域在單一的多肽鏈中存在。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽還包含VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，使scFv形成期望的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)。對(duì)scFv的綜述，參見(jiàn)Plückthun在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113中的文章，Rosenburg和Moore編輯，Springer-Verlag，New York，269-315(1994)?？笶rbB2抗體的scFv片段被描述在WO 93/16185；美國(guó)專利號(hào)5,571,894；和美國(guó)專利號(hào)5,587,458中。
術(shù)語(yǔ)“微型雙功能抗體”是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，該片段包含在同一多肽鏈(VH-VL)上連接到可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(VL)的可變重鏈結(jié)構(gòu)域(VH)。通過(guò)使用接頭，該接頭非常之短，以致于無(wú)法使同一鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，結(jié)構(gòu)域被迫與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。微型雙功能抗體在例如EP404，097；WO 93/11161；和Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)中被更充分地描述。
非人(例如嚙齒類動(dòng)物)抗體的“人源化”形式是含有來(lái)自非人類的免疫球蛋白的最短序列的嵌合抗體。人源化抗原的大部分是人的免疫球蛋白(受體抗體)，其中來(lái)自受體的高變區(qū)的殘基被來(lái)自具有期望特異性、親合性和能力的非人類物種的高變區(qū)(供體抗體)的殘基替代，非人類物種例如小鼠、大鼠、兔或非人類的靈長(zhǎng)類。在某些情況下，人免疫球蛋白的骨架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人類的殘基替代。此外，人源化抗體可能包含不存在于受體抗體或供體抗體中的殘基。進(jìn)行這些修飾來(lái)進(jìn)一步改善抗體性能。一般地，人源化抗體將包含至少一個(gè)，和典型地兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部，其中對(duì)應(yīng)于非人類的免疫球蛋白的高變區(qū)環(huán)的全部或基本上全部和FR的全部或基本上全部是人的免疫球蛋白序列的那些部分。人源化抗體可選擇地還包含至少免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)的一部分。更加詳細(xì)的描述，參見(jiàn)Jones et al.，Nature，321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)。
人源化的抗ErbB2的抗體包括在美國(guó)專利號(hào)5,821,337的表3中描述的huMAb4D5-1，huMAb4D5-2，huMAb4D5-3，huMAb4D5-4，huMAb4D5-5，huMAb4D5-6，huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN)，在此明確引入作為參考；在下面描述的人源化520C9(WO 93/21319)和人源化2C4抗體。
“分離的”抗體是從其天然環(huán)境的組分中鑒定和分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染物組分是妨礙該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可能包括酶、激素和其他蛋白的或非蛋白溶解物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體被純化(1)如通過(guò)Lowry方法所測(cè)定的，至超過(guò)95％的抗體重量，最優(yōu)選重量超過(guò)99％，(2)以達(dá)到足以通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)N-末端殘基或內(nèi)在氨基酸序列的程度，或(3)以在還原或非還原條件下采用考馬斯蘭或者優(yōu)選銀染通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定達(dá)到均一性。被分離的抗體包括在重組細(xì)胞中的原位抗體，這是由于抗體天然環(huán)境中的至少一個(gè)組分將不存在。但是，一般地，被分離的抗體將通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備。
“結(jié)合”目的抗原例如ErbB2抗原的抗體，是能夠以足夠的親合性結(jié)合該抗原使得該抗體可用于靶向表達(dá)該抗原的細(xì)胞的抗體。如果抗體是結(jié)合ErbB2的抗體，該抗體通常將優(yōu)先地結(jié)合ErbB2而不是其他ErbB受體，并且是不會(huì)顯著地與其他蛋白例如EGFR，ErbB3或ErbB4交叉反應(yīng)的抗體。在這樣的實(shí)施方案中，通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)，抗體與這些非ErbB2蛋白質(zhì)的結(jié)合程度(例如與內(nèi)源受體的細(xì)胞表面結(jié)合)將小于10％。有時(shí)，抗ErbB2的抗體不會(huì)顯著地與大鼠neu蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，例如在Schecter et al.，Nature，312513(1984)和Drebin et al.，Nature，312545-548(1984)中所描述。
阻斷ErbB受體的配基活化的抗體是降低或阻止上文定義的這種活化的抗體，其中該抗體實(shí)質(zhì)上能夠比單克隆抗體4D5更加有效地阻斷ErbB受體的配基活化，例如，與單克隆抗體7F3或2C4或其Fab片段大約一樣有效，和優(yōu)選地與單克隆抗體2C4或其Fab片段大約一樣有效。例如，阻斷ErbB受體的配基活化的抗體是在阻斷ErbB異低聚體形成上比4D5有效約50-100％的抗體。阻斷ErbB受體的配基活化可以通過(guò)任何手段發(fā)生，例如，通過(guò)干擾配基結(jié)合ErbB受體、ErbB復(fù)合物形成、ErbB復(fù)合物中ErbB受體的酪氨酸激酶活性和/或ErbB中或者通過(guò)ErbB受體的酪氨酸激酶殘基的磷酸化。阻斷ErbB受體的配基活化的抗體的例子包括單克隆抗體2C4和7F3(其阻斷ErbB2/ErbB3和ErbB2/ErbB4異低聚體的HRG活化；和EGFR/ErbB2異低聚體的EGF，TGF-α，雙調(diào)蛋白，HB-EGF和/或上皮調(diào)節(jié)素活化)；和L26，L96和L288抗體(Klapper et al.，Oncogene，142099-2109(1997))，其阻斷EGF和NDF結(jié)合到表達(dá)EGFR，ErbB2，ErbB3和ErbB4的T47D細(xì)胞上。
具有指定抗體例如稱作2C4的單克隆抗體的“生物學(xué)特征”的抗體，是具有一種或多種使其區(qū)別于結(jié)合到相同抗原(例如ErbB2)上的其它抗體的生物學(xué)特征的抗體。例如具有2C4的生物學(xué)特征的抗體，可能阻斷包含ErbB2和ErbB3，ErbB1或ErbB4的ErbB異低聚體的HRG活化；阻斷包含EGFR和ErbB2的ErbB受體的EGF，TGF-α，HB-EGF，上皮調(diào)節(jié)素和/或雙調(diào)蛋白的活化；阻斷MAPK的EGF，TGF-α和/或HRG介導(dǎo)的活化；和/或結(jié)合到ErbB2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的被2C4結(jié)合的相同表位上，(例如阻斷單克隆抗體2C4結(jié)合到ErbB2上的抗體)。
除非另外指出，用語(yǔ)“單克隆抗體2C4”是指具有下面的實(shí)施例的鼠2C4抗體的抗原結(jié)合殘基的或衍生自該鼠2C4抗體的抗體。例如，單克隆抗體2C4可以是鼠單克隆抗體2C4或其變體，例如人源化抗體2C4，具有鼠單克隆抗體2C4的抗原結(jié)合氨基酸殘基。人源化2C4抗體的例子在本文和WO 01/00245中提供，WO 01/00245在此全文引入作為參考。除非另外指出，在此所用的用語(yǔ)“rhuMAb 2C4”是指包含被融合到任選由中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞表達(dá)的人輕鏈和重鏈IgGl(非A同種異型)恒定區(qū)序列的，分別為SEQ ID No.3和4的可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)序列的抗體。
除非另外指出，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體4D5”是指具有鼠4D5抗體(ATCC CRL10463)的抗原結(jié)合殘基的或者衍生自該抗體的抗體。例如，單克隆抗體4D5可以是鼠單克隆抗體4D5或其變體，例如具有鼠單克隆抗體4D5的抗原結(jié)合殘基的人源化4D5。示例性的人源化4D5抗體包括在美國(guó)專利號(hào)5,821,337中的huMAb4D5-1，huMAb4D5-2，huMAb4D5-3，huMAb4D5-4，huMAb4D5-5，huMAb4D5-6，huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN)，huMAb4D5-8(HERCEPTIN)是優(yōu)選的人源化4D5抗體。
“生長(zhǎng)抑制劑”用于此是指在體外或體內(nèi)抑制細(xì)胞，特別是表達(dá)ErbB的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的化合物或組合物。因此，生長(zhǎng)抑制劑是在S期顯著降低表達(dá)ErbB的細(xì)胞的比例的試劑。生長(zhǎng)抑制劑的例子包括阻斷細(xì)胞周期行進(jìn)(在S期之外的地方)的試劑，例如誘導(dǎo)G1停滯和M期停滯的試劑。經(jīng)典M期阻斷劑包括長(zhǎng)春花堿(vincas)(長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿)，紫杉烷二萜(taxane)，和II型拓?fù)湟种苿绨⒚顾?，表柔比?epirubicin)，柔紅霉素，依托泊苷(etoposide)和博萊霉素。那些阻滯G1期的試劑還延伸到S期阻滯，例如DNA烷基化試劑例如三苯氧胺，強(qiáng)的松，氮烯米胺(dacarbazine)，雙氯乙基甲胺，順鉑，氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。更加詳細(xì)的信息可見(jiàn)“癌癥的分子基礎(chǔ)”，Mendelsohn和Israel編輯，第1章，由Murakami等編寫(xiě)的標(biāo)題為“細(xì)胞周期調(diào)控，癌基因和抗腫瘤藥”，(WB SaundersPhiladelphia，1995)，特別是第13頁(yè)。
“生長(zhǎng)抑制”的抗體的例子是那些結(jié)合到ErbB2并且抑制過(guò)度表達(dá)ErbB2的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抗體。優(yōu)選的生長(zhǎng)抑制抗ErbB2的抗體以大約0.5-30μg/ml的抗體濃度抑制細(xì)胞培養(yǎng)物中20％以上的SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，優(yōu)選超過(guò)50％(例如從約50％到約100％)，其中生長(zhǎng)抑制作用是在將SK-BR-3細(xì)胞暴露于抗體6天后測(cè)定的(參見(jiàn)1997年10月14日授權(quán)的美國(guó)專利號(hào)5,677,171)。SK-BR-3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制分析在該專利和下面中被更加詳細(xì)地描述。優(yōu)選的生長(zhǎng)抑制抗體是單克隆抗體4D5，例如人源化的4D5。
“誘導(dǎo)細(xì)胞死亡”的抗體是使活細(xì)胞不能存活的抗體。細(xì)胞通常是表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞，特別地該細(xì)胞過(guò)度表達(dá)ErbB2受體。優(yōu)選地，該細(xì)胞是癌細(xì)胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、大腸、甲狀腺、胰腺或膀胱細(xì)胞。在體外，細(xì)胞可以是SK-BR-3，BT474，Calu 3細(xì)胞，MDA-MB-453，MDA-MB-361或SKOV3細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)在缺乏補(bǔ)體和免疫效應(yīng)細(xì)胞的情況下測(cè)定體外細(xì)胞死亡，來(lái)區(qū)分由抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)或由補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)引起的細(xì)胞死亡。因此，可以采用加熱滅活血清(即缺乏補(bǔ)體)和缺乏免疫效應(yīng)細(xì)胞時(shí)進(jìn)行細(xì)胞死亡的分析。為了確定抗體是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，可以相對(duì)于未被處理的細(xì)胞評(píng)價(jià)膜完整性的缺失，通過(guò)碘化丙錠(PI)、臺(tái)盼蘭(參見(jiàn)Moore et al.，Cytotechnology，171-11(1995))或7AAD的攝取來(lái)評(píng)價(jià)膜完整性的喪失。優(yōu)選的誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抗體是那些在BT474細(xì)胞中在PI攝取分析試驗(yàn)中誘導(dǎo)PI攝取的抗體(參見(jiàn)下文)。
“誘導(dǎo)凋亡”的抗體是那些誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡的抗體，由膜聯(lián)蛋白V結(jié)合、DNA斷裂、細(xì)胞收縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、細(xì)胞破裂和/或膜泡形成(稱作凋亡小體)確定細(xì)胞程序性死亡。細(xì)胞通常是過(guò)度表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞。優(yōu)選地，細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、大腸、甲狀腺、胰腺或膀胱細(xì)胞。在體外，細(xì)胞可以是SK-BR-3，BT474，Calu 3細(xì)胞，MDA-MB-453，MDA-MB-361或SKOV3細(xì)胞。有多種方法可用于評(píng)價(jià)與凋亡相關(guān)的細(xì)胞事件。例如，通過(guò)膜聯(lián)蛋白結(jié)合檢測(cè)磷脂酰絲氨酸(PS)的轉(zhuǎn)移；通過(guò)DNA梯(laddering)評(píng)價(jià)DNA斷裂；并且核/染色質(zhì)濃縮以及DNA斷裂可通過(guò)亞二倍體細(xì)胞中的任何增加來(lái)評(píng)價(jià)。優(yōu)選地，誘導(dǎo)凋亡的抗體是在BT474細(xì)胞的膜聯(lián)蛋白結(jié)合分析中，引起相對(duì)于未處理細(xì)胞約2-50倍，優(yōu)選約5-50倍，和最優(yōu)選約10-50倍的膜聯(lián)蛋白結(jié)合的誘導(dǎo)(見(jiàn)下文)。有時(shí)，前凋亡抗體(pro-apoptotic antibody)是還會(huì)進(jìn)一步阻斷ErbB受體的ErbB配基活化的抗體(例如7F3抗體)；即與單克隆抗體2C4具有共同生物學(xué)特征的抗體。在其他情形下，抗體是不會(huì)顯著地阻斷ErbB受體的ErbB配基活化的抗體(例如7C2)。此外，抗體是如7C2的抗體，其在誘導(dǎo)凋亡時(shí)，不誘導(dǎo)在S期的細(xì)胞百分率的大量減少(例如相對(duì)于對(duì)照，僅誘導(dǎo)這些細(xì)胞的百分率的0-10％的減少)。
“表位2C4”是抗體2C4結(jié)合的ErbB2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域。為了篩選結(jié)合2C4表位的抗體，可以進(jìn)行常規(guī)的交叉阻斷分析，例如在“抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和DavidLane(1988)”中描述的分析。此外，可進(jìn)行表位作圖來(lái)評(píng)價(jià)抗體是否結(jié)合到ErbB2的2C4表位上(例如，ErbB2的從約殘基22到約殘基584中的任何一個(gè)或多個(gè)殘基，包括殘基22和殘基584；參見(jiàn)附圖1A-B)。
“表位4D5”是抗體4D5(ATCC CRL 10463)結(jié)合的ErbB2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域。該表位鄰近ErbB2的跨膜結(jié)構(gòu)域。為了篩選結(jié)合4D5表位的抗體，可以進(jìn)行常規(guī)的交叉阻斷分析，例如在“抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，ColdSpring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)”中描述的分析。此外，可進(jìn)行表位作圖來(lái)評(píng)價(jià)抗體是否結(jié)合到ErbB2的4D5表位上(例如，從約殘基529到約殘基625中的任何一個(gè)或多個(gè)殘基，包括殘基529和殘基625；參見(jiàn)附圖1A-B)。
“表位3H4”是抗體3H4結(jié)合的ErbB2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域。該表位包括在ErbB2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的氨基酸序列中的從約541到約599的殘基，包括殘基541和殘基599，參見(jiàn)附圖1A-B。
“表位7C2/7F3”是在ErbB2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的N末端的區(qū)域，被7C2和/或7F3抗體(都保藏在ATCC中，見(jiàn)下文)結(jié)合。為了篩選結(jié)合到7C2/7F3表位的抗體，可以進(jìn)行常規(guī)的交叉阻斷分析，例如在“抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)”中描述的分析。此外，可以進(jìn)行表位作圖來(lái)確定該抗體是否結(jié)合到ErbB2上的7C2/7F3表位上(例如，在ErbB2的約殘基22到約殘基53的區(qū)域上的任何一個(gè)或多個(gè)殘基；參見(jiàn)附圖1A-B)。
用于處理目的的“哺乳動(dòng)物”是指被分類為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括人，家養(yǎng)動(dòng)物和役使動(dòng)物，和動(dòng)物園、比賽、或?qū)櫸飫?dòng)物，例如狗、馬、貓、奶牛等。優(yōu)選，該哺乳動(dòng)物是人。
“對(duì)處理有響應(yīng)”的腫瘤在公認(rèn)的動(dòng)物模型或人臨床試驗(yàn)中，表現(xiàn)出對(duì)抗ErbB的抗體處理的響應(yīng)相對(duì)于與未處理或用安慰劑處理具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上意義的顯著改善，或者對(duì)抗ErbB的抗體的最初處理有響應(yīng)，但是繼續(xù)處理時(shí)仍然生長(zhǎng)。
術(shù)語(yǔ)“處理”(treat)或“處理”(treatment)是指治療性處理和預(yù)防性(prophylactic)或預(yù)防性(preventative)措施，其中目的在于防止或減緩(減輕)不期望的生理變化或紊亂，例如癌癥發(fā)生或擴(kuò)散。對(duì)于本發(fā)明的目的，有益的或期望的臨床結(jié)果包括，但是不限于，無(wú)論是可檢測(cè)的或不可檢測(cè)的，癥狀緩和，疾病程度降低，疾病狀態(tài)穩(wěn)定(即，未惡化)，延遲或減緩疾病進(jìn)展，改善或減輕疾病狀態(tài)，和消除(無(wú)論部分地或完全地)?！疤幚怼边€指相對(duì)于未接受處理的預(yù)期存活時(shí)間，延長(zhǎng)存活。那些需要處理的包括那些已經(jīng)患有病癥或者紊亂的以及那些傾向于患有病癥或者紊亂的或者那些其中這些病癥或紊亂將被預(yù)防的。
“紊亂”是將從本發(fā)明的處理中獲益的任何病癥。這包括慢性和急性的病癥或疾病，包括那些使哺乳動(dòng)物傾向于所述紊亂的病理癥狀。在此將被處理的紊亂的非限制性例子包括良性和惡性腫瘤；白血病和淋巴惡性腫瘤，特別是乳腺、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、大腸、甲狀腺、胰腺、前列腺或膀胱癌；神經(jīng)元的、神經(jīng)膠質(zhì)的、星形膠質(zhì)的、下丘腦的和其他腺體、巨噬細(xì)胞的、上皮的、基質(zhì)的和囊胚的紊亂；和炎癥性的、血管生成的和免疫學(xué)的紊亂。按照本發(fā)明的將被處理的優(yōu)選紊亂是惡性腫瘤。
術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指足以有效治療哺乳動(dòng)物中的疾病或紊亂的藥物含量。在癌癥的情況下，藥物的治療有效量可能減少癌細(xì)胞的數(shù)量；降低腫瘤的大??；抑制(即減緩到一定程度和優(yōu)選阻止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)到周?chē)鞴僦?；抑?即減緩到一定程度和優(yōu)選阻止)腫瘤轉(zhuǎn)移；在某種程度上抑制腫瘤生長(zhǎng)；和/或在一定程度上減輕一種或多種與癌癥相關(guān)的癥狀。在藥物可能阻止生長(zhǎng)和/或殺死存在的癌癥細(xì)胞的程度上，它可以是抑制細(xì)胞性的和/或細(xì)胞毒性的。對(duì)于癌癥治療，例如可以通過(guò)估計(jì)疾病進(jìn)展時(shí)間(TTP)和/或測(cè)定反應(yīng)率(RR)來(lái)測(cè)量效率。
術(shù)語(yǔ)“癌癥”和“癌癥的”是指或者描述哺乳動(dòng)物中的一種生理狀態(tài)，其典型特征在于不受調(diào)控的細(xì)胞生長(zhǎng)?！澳[瘤”包含一種或多種癌細(xì)胞。癌癥的例子包括，但是不限于癌、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴惡性腫瘤。這種癌癥的更加特別的例子包括鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)，肺癌包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌(“NSCLC”)，肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌，腹膜癌，肝細(xì)胞癌，胃的或胃癌包括胃腸癌，胰腺癌，惡性膠質(zhì)瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細(xì)胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎臟或腎的癌，前列腺癌，陰門(mén)癌，甲狀腺癌，肝癌，肛門(mén)癌，陰莖癌，以及頭部和頸部癌。
“表達(dá)ErbB的癌癥”是包含細(xì)胞表面存在ErbB蛋白的細(xì)胞的癌癥?！氨磉_(dá)ErbB2的癌癥”是在其細(xì)胞表面生成足夠水平ErbB2的癌癥，使得抗ErbB2的抗體可以結(jié)合到那里并對(duì)該癌癥具有治療作用。
“特征在于過(guò)度活化”ErbB受體的癌癥是在癌癥細(xì)胞中ErbB受體活化的程度顯著超過(guò)該受體在相同組織類型的非癌癥細(xì)胞中的活化水平的癌癥。這種過(guò)度活化可能由ErbB受體的過(guò)度表達(dá)、和/或在癌癥細(xì)胞中可用于激活ErbB受體的ErbB配基高于正常水平所導(dǎo)致的。這種過(guò)度活化可能引起癌細(xì)胞的惡性狀況和/或由癌細(xì)胞的惡性狀態(tài)引起。在一些實(shí)施方案中，對(duì)癌癥進(jìn)行診斷或預(yù)測(cè)分析來(lái)確定是否發(fā)生會(huì)導(dǎo)致ErbB受體的這種過(guò)度活化的ErbB受體的增殖和/或過(guò)度表達(dá)。可選擇地，或另外地，對(duì)癌癥進(jìn)行診斷或預(yù)測(cè)分析來(lái)確定癌癥中是否發(fā)生會(huì)導(dǎo)致受體過(guò)度活化的ErbB配基的擴(kuò)增和/或過(guò)度表達(dá)。在這種癌癥的亞群中，受體的過(guò)度活化可能源自自分泌刺激路徑。
在“自分泌”刺激路徑中，通過(guò)既生成ErbB配基也生成其關(guān)聯(lián)ErbB受體的癌癥細(xì)胞發(fā)生自我刺激。例如，癌癥可能表達(dá)或過(guò)度表達(dá)EGFR，以及還表達(dá)或過(guò)度表達(dá)EGFR配基(例如，EGF，TGF-α或HB-EGF)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥可能表達(dá)或過(guò)度表達(dá)ErbB2，以及表達(dá)或過(guò)度表達(dá)heregulin(例如γ-HRG)。
“過(guò)度表達(dá)”ErbB受體的癌癥是相對(duì)于相同組織類型的非癌癥細(xì)胞，在該細(xì)胞表面上具有顯著較高水平的ErbB受體，例如ErbB2。這種過(guò)度表達(dá)可能通過(guò)基因擴(kuò)增或通過(guò)轉(zhuǎn)錄或翻譯增強(qiáng)而引起。ErbB受體過(guò)度表達(dá)可以通過(guò)評(píng)價(jià)存在于細(xì)胞表面的ErbB蛋白質(zhì)水平的升高在診斷或預(yù)測(cè)分析中被確定(例如通過(guò)免疫組織化學(xué)分析；IHC)。可選擇地或另外地，可以測(cè)量細(xì)胞中編碼ErbB的核酸的水平，例如通過(guò)熒光原位雜交(FISH；參見(jiàn)1998年10月公開(kāi)的WO 98/45479)，DNA印跡，或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，例如實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)?？梢酝ㄟ^(guò)評(píng)價(jià)患者中，例如腫瘤活組織檢查中的配基水平(或者編碼其的核酸)，或通過(guò)各種診斷分析例如IHC，F(xiàn)ISH，DNA印跡，PCR或上述的體內(nèi)分析來(lái)診斷性地確定ErbB配基的過(guò)度表達(dá)。還可以檢測(cè)生物學(xué)液體例如血清中的脫落抗原(shed antigen)(例如ErbB的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)來(lái)研究ErbB受體的過(guò)度表達(dá)(參見(jiàn)例如1990年6月12日授權(quán)的美國(guó)專利號(hào)4,933,294；1991年4月18日公開(kāi)的WO 91/05264；1995年3月28日授權(quán)的美國(guó)專利號(hào)5,401,638；和Sias et al.，J.Immunol.Methods，13273-80(1990))。除了上述分析，各種其他的體內(nèi)分析對(duì)熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是可獲得的。例如，可以將患者體內(nèi)的細(xì)胞暴露于抗體，該抗體可選擇地用可檢測(cè)標(biāo)記，例如放射性同位素標(biāo)記，并可以評(píng)價(jià)抗體與患者體內(nèi)細(xì)胞的結(jié)合，例如通過(guò)外部掃描放射性或者通過(guò)分析從預(yù)先暴露于抗體的患者中獲得的活組織檢查。
過(guò)度表達(dá)HER2的腫瘤可以通過(guò)對(duì)應(yīng)于每個(gè)細(xì)胞表達(dá)的HER2分子的拷貝數(shù)的免疫組織化學(xué)分值來(lái)估計(jì)，可以從生物化學(xué)上測(cè)定0＝0-10,000拷貝/細(xì)胞，1+＝至少約200,000拷貝/細(xì)胞，2+＝至少約500,000拷貝/細(xì)胞，3+＝至少約2,000,000拷貝/細(xì)胞。水平為3+的HER2的過(guò)度表達(dá)會(huì)引起酪氨酸激酶發(fā)生不依賴于配基的活化(Hudziak et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847159-7163 )，在大約30％的乳腺癌中發(fā)生，并且在這些患者中，不復(fù)發(fā)存活和總存活下降(Slamon et al.，Science，244707-712 ；Slamonet al.，Science，235177-182 )。
相反，“不具有ErbB2受體過(guò)度表達(dá)特征”的癌癥是在診斷性分析中與相同組織類型的非癌癥細(xì)胞相比不表達(dá)高于正常ErbB2受體水平的ErbB2受體的癌癥。
“不依賴于激素”的癌癥是其增殖不依賴于與由癌癥中細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合的激素存在與否。在施用降低腫瘤中或附近的激素濃度的藥物或手術(shù)方案時(shí)，這種癌癥不會(huì)發(fā)生臨床退化。不依賴于激素的癌癥的例子包括不依賴于雄激素的前列腺癌，不依賴于雌激素的乳腺癌，子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌。這種癌癥可能開(kāi)始于激素依賴的腫瘤，并在抗激素治療后由激素敏感階段發(fā)展到激素難治的腫瘤。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性劑”是指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或?qū)е录?xì)胞破壞的一種物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)想要包括放射性同位素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32和Lu的放射性同位素)，化學(xué)治療劑，和毒素例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或變體。
“化學(xué)治療劑”是在癌癥治療中有用的化學(xué)化合物?；瘜W(xué)治療劑的例子包括烷基化劑例如三胺磷和環(huán)磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸鹽例如白消安，二丙胺磺酯和哌泊舒凡；氮丙啶例如芐替哌(benzodopa)，卡巴醌(carboquone)，四甲尿烷亞胺(meturedopa)，和烏瑞替哌(uredopa)；氮丙啶methylamelamine和包括六甲嘧胺(altretamine)，曲他胺(triethylenemelamine)，三亞乙基磷酰胺，塞替哌(triethylenethiophosphaoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥例如苯丁酸氮芥，萘氮芥(chlomaphazine)，cholophosphamide，雌莫司汀(estramustine)，異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)，雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)，鹽酸甲氧氮芥，苯丙氨酸氮芥，新氮芥，苯芥膽固醇，松龍苯芥(prednimustine)，三芥環(huán)磷酰胺，尿嘧啶芥；亞硝基脲(nitrosurea)例如亞硝基脲氮芥，氯脲霉素，福泰氮芥(fotemustine)，羅莫司丁(lomustine)，尼莫司啶(nimustine)，雷尼司啶(ranimustine)；抗生素例如阿克拉霉素，放射菌素，authramycin，重氮絲氨酸，博來(lái)霉素，cactinomycin，加利車(chē)霉素，carabicin，洋紅霉素，嗜癌菌素(carzinophilin)，色霉素，放線菌素D，柔紅霉素，二乙氧醋酰阿霉素，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，阿霉素，表柔比星，去羥阿霉素，伊達(dá)比星，麻西羅霉素，絲裂菌素，霉酚酸，諾加拉霉素，橄欖霉素，培來(lái)霉素，potfiromycin，嘌呤霉素，quelamycin，rodorubicin，鏈黑菌素，鏈脲霉素，殺結(jié)核菌素，百士欣，新制癌素，佐柔比星；抗代謝物例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物例如二甲葉酸，氨甲蝶呤，蝶酰三谷氨酸，曲美沙特；嘌呤類似物例如氟達(dá)拉賓(fludarabine)，6-巰基嘌呤，硫唑鳥(niǎo)嘌呤，硫鳥(niǎo)嘌呤；嘧啶類似物例如環(huán)胞苷(ancitabine)，氮雜胞苷(azacitidine)，6-氮雜尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷(cytarabine)，雙脫氧尿苷，去氧氟尿苷，依諾他賓(enocitabine)，氟尿嘧啶脫氧核苷(floxuridine)，5-FU；雄性激素例如卡魯睪酮，羥甲雄酮丙酸酯，環(huán)硫雄醇(epitiostanol)，甲環(huán)硫甾烷，睪內(nèi)脂(testolactone)；抗腎上腺素例如氨基苯乙哌啶酮，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；葉酸補(bǔ)充物例如frolinic acid；醋葡內(nèi)酯；aldophosphamide glycoside；氨基乙酰丙酸；胺苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比山群(bisantrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate)；defofamine；脫羰秋水仙堿(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfomithine；醋酸羥嗶咔唑；環(huán)氧甘醚；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明(lonidamine)；丙米腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫匹達(dá)謀(mopidamol)；二胺硝吖啶；噴司他??；苯來(lái)美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；足葉草肼；2-足葉草肼；甲基芐肼；PSK；丙亞胺(razoxane)；西作非蘭；螺旋鍺(spirogermanium)；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2′，2″-三氯乙胺；氨基甲酸乙酯(urethan)；長(zhǎng)春地辛(vindesine)；氮烯米胺；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；三胺硫磷；紫杉烷二萜(taxane)，例如泰素(paclitaxel)(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和多西他賽(docetaxel)(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥(niǎo)嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑類似物例如順鉑和卡鉑(carboplatin)；長(zhǎng)春堿；鉑；依托泊甙(etoposide)(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂菌素C；米托蒽醌；長(zhǎng)春新堿；失碳長(zhǎng)春堿(vinorelbine)；異長(zhǎng)春花堿(navelbine)；鹽酸米托蒽醌；替尼泊甙(teniposide)；柔紅霉素；氨基蝶呤；希羅達(dá)(xeloda)；伊本膦酸鈉(ibandronate)；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DMFO)；視黃酸；埃斯波霉素；卡培他濱(capecitabine)；以及任何上述的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在該定義中還包括的是作為調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤作用的抗激素試劑，例如抗雌激素，包括例如三苯氧胺，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶(aromatase)抑制性4(5)-咪唑，4-羥基三苯氧胺，曲奧昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，奧那斯酮(onapristone)，和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；和抗雄性激素的例如氟他胺(flutamide)，尼魯米特(nilutamide)，比卡魯胺(bicalutamide)，利普安(leuprolide)和性瑞林(goserelin)及其任何上述的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“靶向EGFR的藥物”是指結(jié)合到EGFR和任選地抑制EGFR活化的治療劑。這種試劑的例子包括結(jié)合EGFR的抗體和小分子。結(jié)合到EGFR的抗體的例子包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)，MAb455(ATCC CRL HB8507)，MAb 225(ATCC CRL 8508)，MAb 528(ATCC CRL8509)(參見(jiàn)美國(guó)專利4,943,533，Mendelsohn等)及其變體，例如嵌合的225(C225或Cetuximab；ERBUTIX)和改造的人225(H225)(參見(jiàn)WO 96/40210，Imclone Systems Inc.)；結(jié)合II型突變EGFR的抗體(美國(guó)專利5,212,290)；結(jié)合EGFR的人源化的和嵌合的抗體被描述在美國(guó)專利5,891,996；以及結(jié)合EGFR的人抗體，例如ABX-EGF(參見(jiàn)WO 98/50433，Abgenix)?？笶GFR的抗體可以與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)，從而產(chǎn)生一種免疫偶聯(lián)物(參見(jiàn)，例如EP659，439A2，Merck Patent GmbH)。結(jié)合EGFR的小分子的例子包括ZD1839或Gefitinib(IRESSATM；Astra Zeneca)，CP-358774(TARCEVATM；Genentech/OSI)和AG1478，AG1571(SU 5271；Sugen)。
“酪氨酸激酶抑制劑”是在一定程度上抑制酪氨酸激酶例如ErbB受體的酪氨酸激酶活性的分子。這種抑制劑的例子包括在前面的段落中指出的靶向EGFR的藥物以及喹唑啉，例如PD153035，4-(3-氯苯胺基)喹唑啉，吡啶并嘧啶(pyridopyrimidines)，嘧啶并嘧啶(pyrimidopyrimidines)，吡咯并嘧啶(pyrrolopyrimidines)，例如CGP 59326，CGP 60261和CGP 62706，和吡唑啉酮嘧啶(pyrazolopyrimidines)，4-(苯胺)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，姜黃色素(二阿魏酰甲烷，4，5-二(4-氟苯胺基)苯鄰二甲酰亞胺)，含有硝基噻吩成分的tyrphostines；PD-0183805(Warner-Lamber)；反義分子(例如，那些結(jié)合到編碼ErbB的核酸上的分子)；喹喔啉(美國(guó)專利5,804,396)；tryphostins(美國(guó)專利5,804,396)；ZD6474(Astra Zeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；泛-ErbB抑制劑例如CI-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS 3521；Isis/Lilly)；Imatinibmesylate(Gleevac；Novartis)；PKI 166(Novartis)；GW2016(Glaxo SmithKline)；CI-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；Semaxanib(Sugen)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；INC-1C11(Imclone)；或在任何下列專利申請(qǐng)中描述的美國(guó)專利5,804,396；WO 99/09016(AmericanCyanimid)；WO 98/43960(American Cyanamid)；WO 97/38983(WarnerLambert)；WO 99/06378(Warner Lambert)；WO 99/06396(Warner Lambert)；WO 96/30347(Pfizer，Inc)；WO 96/33978(Zeneca)；WO 96/3397(Zeneca)；和WO 96/33980(Zeneca)。
“抗血管生成劑”是指阻斷或在一定程度上干擾血管發(fā)育的化合物?？寡苌傻囊蜃永缈梢允墙Y(jié)合到參與促進(jìn)血管生成的生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子受體上的小分子或抗體。優(yōu)選的抗血管生成的因子在此是一種結(jié)合到血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)上的抗體。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”是由一個(gè)細(xì)胞群體釋放并作為細(xì)胞間的介體作用于另一種細(xì)胞的蛋白質(zhì)的通稱。這種細(xì)胞因子的例子為淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。在細(xì)胞因子中所包括的有生長(zhǎng)激素例如人生長(zhǎng)激素，N-甲硫氨酰人生長(zhǎng)激素，和牛生長(zhǎng)激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素例如促濾泡激素(FSH)，促甲狀腺素(TSH)，和黃體生成素(LH)；肝生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；促乳素；胎盤(pán)催乳激素；腫瘤壞死因子-α和-β；米勒管抑制物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子例如NGF-β；血小板生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II；促紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factor)；干擾素例如干擾素-α，-β和-γ；集落刺激因子(CSF)例如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF)；和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)例如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12；腫瘤壞死因子例如TNF-α或TNF-β；和其他的多肽因子包括LIF和試劑盒配基(kitligand)(KL)。如在此所用，術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子包括來(lái)自天然來(lái)源或來(lái)自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)和天然序列的細(xì)胞因子的生物活性等價(jià)物。
用在本申請(qǐng)中的術(shù)語(yǔ)“前體藥物”是指藥學(xué)活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，其相對(duì)于親本藥物(parent drug)對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小，能夠被酶催化激活或者被轉(zhuǎn)化為更有活性的親本藥物形式。參見(jiàn)，例如Wilman，“癌癥化學(xué)治療中的前體藥物”Biochemical Society Transactions，14，375-382，615th Meeting Belfast(1986)和Stella等，“前體藥物用于靶向藥物遞送的化學(xué)方法”，Directed Drug Delivery，Borchardt等編輯，247-267，Humana Press(1985)。本發(fā)明的前體藥物包括，但是不限于可以被轉(zhuǎn)化為更有活性的無(wú)細(xì)胞毒性的藥物的，含有磷酸鹽的前體藥物，含有硫代磷酸鹽的前體藥物，含有硫酸鹽的前體藥物，含有肽的前體藥物，D-氨基酸修飾的前體藥物，糖基化的前體藥物，含有β-內(nèi)酰胺的前體藥物，含有任選被取代的苯氧基乙酰胺的前體藥物或者含有可選擇地被取代的苯基乙酰胺的前體藥物，5-氟胞嘧啶以及其他的5-氟尿嘧啶藥物前體?？梢员谎苌鸀榍绑w藥物形式用于本發(fā)明的細(xì)胞毒性藥物的例子包括，但是不限于那些上面描述的化學(xué)治療劑。
“脂質(zhì)體”是由各種類型脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑組成的小泡，其可被用于將藥物(例如在此公開(kāi)的抗ErbB2的抗體和，任選地化學(xué)治療劑)遞送給哺乳動(dòng)物。脂質(zhì)體的組分通常以雙分子層的結(jié)構(gòu)排列，類似于生物膜的脂排列。
術(shù)語(yǔ)“包裝插入物(package insert)”是用于指通常包括在治療性產(chǎn)品的商業(yè)包裝中的說(shuō)明書(shū)，其包含關(guān)于適應(yīng)癥、用法、劑量、施用方法、禁忌征候的信息和/或關(guān)于使用該治療性產(chǎn)品的警告。
“心臟防護(hù)劑”是一種防止或減少與給患者施用藥物相關(guān)的心肌機(jī)能障礙(即心肌病和/或充血性心力衰竭)的化合物或組合物，這些藥物例如蒽環(huán)霉素抗生素和/或抗ErbB2的抗體。心臟防護(hù)劑可能例如阻斷或降低自由基介導(dǎo)的心臟毒性作用和/或防止或減少氧化應(yīng)激損傷。包括在本定義中的心臟防護(hù)劑的例子包括鐵離子螯合劑右丙亞胺(ICRF-187)(Seifert et al.，TheAnnals of Pharmacotherapy，281063-1072(1994))；降脂劑(lipid-loweringagent)和/或抗氧化劑例如丙丁酚(Singal et al.，J.Mol.Cell Cardiol.，271055-1063(1995))；阿米斯丁(氨基硫羥基2-[(3-氨丙基)氨基]乙硫醇-二氫磷酸酯，也稱作WR-2721，及其脫磷酸化的細(xì)胞攝取形式稱作WR-1065)和S-3-(3-甲氨基丙氨基)丙基硫代磷酸(WR-151327)，參見(jiàn)Green et al.，CancerResearch，54738-741(1994)；地高辛(Bristow，M.R.在Bristow MR，編輯.藥物誘導(dǎo)的心臟病.紐約Elsevier 191-215(1980))；β-阻斷劑例如美托洛爾(Hjalmarson et al.，Drugs47Suppl 431-9(1994)；和Shaddy et al.，Am.Heart J.，129197-9(1995))；維生素E；抗壞血酸(維生素C)；自由基清除劑例如石竹素，烏索酸和N-乙酰半胱氨酸(NAC)；自旋捕獲化合物例如α-苯基-叔-丁基硝酮(PBN)；(Paracchini et al.，Anticancer Res.，131607-1612(1993))；硒代有機(jī)化合物例如P251(Elbesen)；等。
“被分離的”核酸分子是從至少一種污染物核酸分子中鑒定和分離出的核酸分子，在該抗體核酸分子的天然來(lái)源中，該分子通常與污染物核酸分子結(jié)合在一起。被分離的核酸分子不再是其在自然界中存在的形式或狀態(tài)。因此，被分離的核酸分子區(qū)別于存在于天然細(xì)胞中的核酸分子。但是，被分離的核酸分子包括被包含在通常表達(dá)抗體的細(xì)胞中的核酸分子，在這樣的細(xì)胞中，例如，核酸分子位于與天然細(xì)胞的染色體位置不同的染色體位置上。
用語(yǔ)“控制序列”是指在特定宿主生物體中表達(dá)被可操作地連接的編碼序列所必需的DNA序列。適合于原核生物的調(diào)控序列，例如包括啟動(dòng)子，任選地操縱子序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子，聚腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。
當(dāng)核酸與另一種核酸序列處于一種功能性關(guān)系中時(shí)，被“可操縱地連接”。例如，如果用作前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA作為參與多肽分泌的蛋白前體被表達(dá)，則被可操縱地連接到表達(dá)多肽的DNA上；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，則被可操作地連接到編碼序列上；或者如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被放置在促進(jìn)翻譯的位置上，則其被可操作地連接到編碼序列上。一般地，“被可操作地連接”是指被連接的DNA序列是連續(xù)的，并且在為分泌前導(dǎo)序列的情況下，是連續(xù)的并且處于閱讀狀態(tài)。但是，增強(qiáng)子不一定非得是連續(xù)的。結(jié)合是在便利的限制性位點(diǎn)上通過(guò)連接實(shí)現(xiàn)。如果不存在這種位點(diǎn)，按照常規(guī)操作，使用合成的寡核苷酸連接物或接頭。
如在此所用，用語(yǔ)“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”互換使用，所有這種命名都包括后代。因此，用語(yǔ)“轉(zhuǎn)化體”和“被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括原代主體(subject)細(xì)胞以及由此產(chǎn)生的不論傳遞多少次的培養(yǎng)物。還應(yīng)當(dāng)理解，由于有意的或無(wú)意的突變，所有的后代在DNA含量上并不是完全相同的。還包括在最初轉(zhuǎn)化細(xì)胞中被篩選的具有相同功能或生物學(xué)活性的突變后代。當(dāng)使用不同的命名時(shí)，其包括哪些內(nèi)容可以很清楚地從上下文中獲知。
鑒定對(duì)用抗HER2的抗體處理有響應(yīng)的腫瘤的方法腫瘤和腫瘤細(xì)胞的來(lái)源腫瘤可以被表征為對(duì)用2C4或者功能性等價(jià)的抗體治療響應(yīng)，功能性等價(jià)的抗體具有抗體2C4的一種或多種生物學(xué)特征，例如，基于作為活化的度量，在細(xì)胞表面上存在EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3異二聚體。通過(guò)本領(lǐng)域知曉的任何方法分析腫瘤樣本中是否存在異二聚體。優(yōu)選地，通過(guò)下文描述的一種或多種方法來(lái)確定是否存在異二聚體。
由于HER2活化是受體異二聚化和磷酸化的結(jié)果，一種特別重要的用于鑒定對(duì)用2C4或功能性等價(jià)抗體治療響應(yīng)的腫瘤的方法是檢測(cè)ErbB受體磷酸化，例如ErbB2(HER2)受體磷酸化，如下文所述。
可被分析的腫瘤細(xì)胞的來(lái)源包括，但是不限于，腫瘤活組織檢查，循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，循環(huán)的血漿蛋白，腹水，異種移植腫瘤以及其他腫瘤模型，原代細(xì)胞培養(yǎng)物或者從腫瘤衍生的或者展示腫瘤樣特性的細(xì)胞系，以及被保存的腫瘤樣本，例如福爾馬林固定、石蠟包埋的腫瘤樣本。本發(fā)明計(jì)劃篩選EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3異二聚體和/或ErbB受體磷酸化的大量不同的腫瘤細(xì)胞類型。對(duì)于與被檢測(cè)為異二聚體和/或ErbB受體如ErbB2(HER2)受體磷酸化陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞相同類型的腫瘤細(xì)胞可用2C4治療。下面描述的腫瘤模型作為實(shí)施例被提供，而不應(yīng)該被解釋為限制本發(fā)明。
在一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)源于正患有一種腫瘤的患者的腫瘤細(xì)胞被分析是否對(duì)用2C4治療響應(yīng)。如果基于存在HER2/HER3和/或HER2/HER1異二聚體或者通過(guò)證實(shí)ErbB受體發(fā)生了磷酸化，確定該細(xì)胞是有響應(yīng)的，那么隨后可以用具有2C4的一種或多種生物學(xué)特征的抗體處理該患者。優(yōu)選地，用rhuMAb 2C4處理該患者。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，分析來(lái)自特定類型的腫瘤的腫瘤細(xì)胞或被認(rèn)為具有特定類型腫瘤的特征的細(xì)胞中是否存在EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3異二聚體，或者ErbB受體是否磷酸化，優(yōu)選ErbB2(HER2)受體。如果檢測(cè)到EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3異二聚體和/或ErbB受體磷酸化，一般認(rèn)為該類型的腫瘤是用具有2C4的一種或多種生物學(xué)特征的抗ErbB2的抗體處理的優(yōu)良的候選。然后可用這種抗體處理患有這種腫瘤的患者。
細(xì)胞系異種移植可以通過(guò)將細(xì)胞直接植入到目的位點(diǎn)上來(lái)將體外繁殖的腫瘤細(xì)胞，例如在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞系，異種移植到小鼠中。這種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。分析細(xì)胞，以鑒定是否存在EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3異二聚體，或者ErbB受體磷酸化，例如ErbB2(HER2)受體磷酸化。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將腫瘤細(xì)胞皮下植入到小鼠中，優(yōu)選無(wú)胸腺的裸鼠。在另一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞被植入到生理相關(guān)的位置上來(lái)建立一個(gè)適當(dāng)?shù)脑荒[瘤模型。例如，來(lái)自乳腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞以不同的濃度被植入到無(wú)胸腺的裸鼠的乳腺脂肪墊中來(lái)更加精確地模擬乳腺癌的生物學(xué)?？梢栽谝浦仓盎蛑螅治瞿[瘤細(xì)胞是否存在EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體，或ErbB受體磷酸化。優(yōu)選地，在被植入的細(xì)胞已經(jīng)發(fā)育為具有預(yù)期大小的腫瘤后再分析腫瘤細(xì)胞。還用2C4或功能性等價(jià)抗體來(lái)治療小鼠，用未被處理的小鼠作為對(duì)照。
還可以給任何類型的腫瘤建立類似的模型，已經(jīng)從這些腫瘤中獲得了被培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞系。腫瘤類型包括，但是不限于，膀胱，腦，乳腺，大腸，食道，腎，白血病，肝，肺，黑素瘤，卵巢，胰腺，前列腺，肉瘤，胃，睪丸和子宮。在一個(gè)實(shí)施方案中，過(guò)度表達(dá)ErbB2的腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系被用于移植，而在另一個(gè)實(shí)施方案，表達(dá)正?；虻陀谡：康腅rbB2的腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系被用于移植。在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，不對(duì)HERCEPTIN響應(yīng)的腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系被用于移植。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，大約2千萬(wàn)個(gè)MDA-175乳腺腫瘤細(xì)胞被植入小鼠的生殖腺的脂肪墊中。例如通過(guò)下述的方法之一，在異種移植的細(xì)胞的表面上檢測(cè)HER2/HER1和/或HER2/HER3二聚體的表達(dá)。還可用0，3mg/kg，10mg/kg，30mg/kg或100mg/kg的2C4處理被這樣移植的小鼠。其他劑量方案可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)確定。
雖然本發(fā)明適合于任何表達(dá)HER2的腫瘤的類型，固體瘤例如乳腺癌，卵巢癌，肺癌，前列腺癌和結(jié)直腸癌尤其適合遵循本發(fā)明來(lái)分析和處理。
腫瘤異種移植可以獲取哺乳動(dòng)物腫瘤樣本，優(yōu)選人腫瘤樣本并植入到小鼠中，優(yōu)選無(wú)胸腺的裸鼠。可以通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的方法來(lái)獲得腫瘤樣本。在一個(gè)實(shí)施方案中，手術(shù)切除腫瘤樣本，例如在活組織檢查中或者在外科手術(shù)中，以從哺乳動(dòng)物摘下腫瘤。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)從哺乳動(dòng)物血液中純化循環(huán)的腫瘤細(xì)胞來(lái)獲得腫瘤樣本。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，將直徑為大約5×5×0.5-1mm的人固體腫瘤切片植入無(wú)胸腺的裸鼠的脅部中，通常為每只小鼠四個(gè)切片。當(dāng)被植入的腫瘤達(dá)到10-15mm的中值直徑時(shí)，通常通過(guò)使用較小的腫瘤碎片進(jìn)行連續(xù)傳代。用于生成和研究人腫瘤異種移植的方法被描述在如下參考文獻(xiàn)中，在此全文引入作為參考Fiebig等，“人腫瘤異種移植新抗癌試劑的可預(yù)測(cè)性、表征和發(fā)現(xiàn)”，投稿于“腫瘤學(xué)用于抗癌藥物開(kāi)發(fā)的腫瘤模型相關(guān)性”，F(xiàn)iebig和Burger編輯(Basel，Karger1999)，vol54，29-50；Berger等，“人腫瘤異種移植在胸腺發(fā)育不全的裸鼠中的建立和表征”，在“腫瘤學(xué)中的免疫缺陷小鼠”中，F(xiàn)iebig和Berger編輯(Basel，Karger 1992)，23-46；Fiebig和Burger，“人腫瘤異種移植和外植體”，在“癌癥研究模型”中，Teicher編輯(Humana Press 2002)113-137。
當(dāng)異種移植以固體瘤生長(zhǎng)，分化，并發(fā)展出基質(zhì)、脈管系統(tǒng)和中央壞死時(shí)，人異種移植被認(rèn)為對(duì)供體患者體內(nèi)的腫瘤行為具有高度預(yù)見(jiàn)性。在大多數(shù)情況下，異種移植物保留剛自患者獲得的腫瘤的大部分分子的、組織學(xué)的和病理生理學(xué)特征。來(lái)自含有最初或者連續(xù)傳代的腫瘤的小鼠的腫瘤細(xì)胞被分析是否存在EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3異二聚體，或ErbB受體是否發(fā)生磷酸化。還用2C4或者功能性等價(jià)抗體來(lái)治療小鼠。
在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)一組新創(chuàng)建或建立的人腫瘤異種移植進(jìn)行篩選，篩選是否存在EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體，或者ErbB受體是否磷酸化。Fiebig和Burger，同上文，描述了從多種常規(guī)癌癥類型中建立的一組300個(gè)以上的人腫瘤異種移植，常規(guī)癌癥類型例如膀胱，腦，乳腺，結(jié)腸，食道，腎，白血病，肝，肺，黑素，卵巢，胰腺，前列腺，肉瘤，胃，睪丸和子宮。在一個(gè)實(shí)施方案中，全組被篩選是否具有異二聚體，或ErbB受體例如ErbB2(HER2)受體是否磷酸化。還可以篩選該組的亞群是否具有異二聚體，或ErbB受體是否磷酸化，其中該亞群是基于例如組織類型，過(guò)度、低或正常表達(dá)ErbB2，或者不對(duì)HERCEPTIN響應(yīng)。以這種方式，基于是否存在異二聚體，或者通過(guò)證實(shí)ErbB受體例如ErbB2(HER2)受體發(fā)生磷酸化，腫瘤可被分類為用2C4治療的候選腫瘤。同樣地，具有如此分類的腫瘤的患者可被更迅速地認(rèn)為適合用2C4或功能性等價(jià)抗體治療。
在移植之前或之后，可分析腫瘤樣本中是否存在EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體，或ErbB受體是否磷酸化。在一個(gè)實(shí)施方案中，大約1g來(lái)自最初和/或被連續(xù)傳代的異種移植的腫瘤被從分子學(xué)上進(jìn)一步表征異二聚體，或者在液氮中迅速冷凍并存儲(chǔ)在-80℃下，用于以后進(jìn)行表征。進(jìn)一步分析異種移植腫瘤還可以采用雙層軟瓊脂分析，也稱作克隆發(fā)生分析，如例如在Fiebig和Burger中，同上文中所描述。人固體腫瘤異種移植通過(guò)機(jī)械的方式和蛋白水解的方式分解為單細(xì)胞懸浮液，該細(xì)胞懸浮液被鋪板到如所述鋪了軟瓊脂的多孔平板中。腫瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)導(dǎo)致集落形成，可以進(jìn)一步分析該集落的分子特征，例如異二聚體，或ErbB受體磷酸化，或其他的組織化學(xué)的和形態(tài)學(xué)的特征。
B.檢測(cè)EGFR-ErbB2和ErbB2-ErbB3異二聚體本領(lǐng)域已知的任何方法可以被用于檢測(cè)腫瘤中的EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體。幾個(gè)優(yōu)選的方法在下面進(jìn)行了描述。這些方法檢測(cè)非共價(jià)的蛋白-蛋白的相互作用或者另外表明目的蛋白之間的接近性。下面描述的方法作為實(shí)施例被提供，而不應(yīng)當(dāng)被解釋為限制本發(fā)明。
共免疫沉淀和免疫印跡以免疫親合為基礎(chǔ)的方法，例如免疫沉淀或ELISA，可以被用于檢測(cè)EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗ErbB2的抗體被用于免疫沉淀包含來(lái)自腫瘤細(xì)胞的ErbB2的復(fù)合物，然后通過(guò)免疫印跡檢測(cè)生成的免疫沉淀物中是否存在EGFR或ErbB3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，EGFR或ErbB3抗體可被用于免疫沉淀步驟，然后用ErbB2抗體檢測(cè)免疫沉淀物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，特異于HER1，HER3，HER2/HER1復(fù)合物或HER2/HER3復(fù)合物的ErbB配基被用于沉淀復(fù)合物，然后檢測(cè)復(fù)合物中是否存在HER2。例如，配基被用于與抗生物素蛋白偶聯(lián)，并在生物素柱上純化復(fù)合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，例如ELISA或抗體“三明治”型分析中，針對(duì)ErbB2抗體被固定在固體支持物上，與腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞裂解物接觸，洗滌，然后暴露于抗EGFR或ErbB3的抗體中。后一種抗體的結(jié)合，該結(jié)合可以直接地或者通過(guò)偶聯(lián)到可檢測(cè)標(biāo)記上的第二種抗體來(lái)檢測(cè)，表明存在異二聚體。在某些實(shí)施方案中，EGFR或ErbB3的抗體被固定，而ErbB2抗體被用于檢測(cè)步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ErbB受體的配體被用于替代或者組合抗ErbB受體的抗體。
用EGFR，ErbB2，或ErbB3抗體進(jìn)行免疫沉淀后，可隨后進(jìn)行異二聚體的功能性分析，作為免疫印跡的替代或補(bǔ)充。在一個(gè)實(shí)施方案中，用ErbB3抗體進(jìn)行免疫沉淀后，分析免疫沉淀物中的受體酪氨酸激酶活性。由于ErbB3不具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性，免疫沉淀物中存在酪氨酸激酶活性表明ErbB3最有可能與ErbB2結(jié)合。Graus-Porta et al.，EMBO J.，161647-55(1997)；Klapper et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，964995-5000(1999)。該結(jié)果可通過(guò)使用ErbB2抗體的免疫印跡來(lái)證實(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用ErbB2抗體進(jìn)行免疫沉淀后，分析EGFR受體酪氨酸激酶活性。在該分析中，免疫沉淀與放射性ATP以及模擬ErbB2被EGFR轉(zhuǎn)磷酸化的體內(nèi)位點(diǎn)的肽底物接觸。肽發(fā)生磷酸化表示共免疫沉淀，從而EGFR與ErbB2發(fā)生異二聚化。受體酪氨酸激酶活性分析在本領(lǐng)域是熟知的，包括檢測(cè)靶點(diǎn)底物的磷酸化的分析，例如，通過(guò)磷酸酪氨酸抗體和活化關(guān)聯(lián)的信號(hào)傳導(dǎo)路徑，例如MAPK路徑。
對(duì)上述方法和分析進(jìn)行的改變對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)和常規(guī)的。
化學(xué)的或UV交聯(lián)可以被用于共價(jià)連接活細(xì)胞表面的異二聚體。Hunteret al.，Biochem.J.，320847-53?；瘜W(xué)交聯(lián)劑的例子包括二硫代雙(琥珀酰亞胺基)丙酸(DSP)和3，3′-二硫代雙(磺基琥珀酰亞胺基)丙酸(DTSSP)。在一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自化學(xué)交聯(lián)的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞提取物通過(guò)SDS-PAGE分析并用EGFR和/或ErbB3的抗體進(jìn)行免疫印跡。由于ErbB2是EGFR和ErbB3的優(yōu)選異二聚化伴侶，合適分子量的超位移條帶最有可能代表EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體。該結(jié)果可通過(guò)隨后用ErbB2抗體進(jìn)行免疫印跡來(lái)證實(shí)。
FRET和以熒光為基礎(chǔ)的方法熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)也被用于檢測(cè)EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體。FRET根據(jù)能量從供體熒光團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體熒光團(tuán)，在體內(nèi)和體外檢測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)型變化和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。Selvin，Nat.Struct.Biol.，7730-34(2000)。能量轉(zhuǎn)移僅在供體熒光團(tuán)與受體熒光團(tuán)足夠相近時(shí)發(fā)生。在典型的FRET實(shí)驗(yàn)中，兩種蛋白或者單一蛋白上的兩個(gè)位點(diǎn)用不同的熒光探針標(biāo)記。探針中的一個(gè)，供體探針，用特定波長(zhǎng)的入射光激發(fā)到較高的能量狀態(tài)。然后供體探針將其能量轉(zhuǎn)移到第二個(gè)探針上，即受體探針，導(dǎo)致供體熒光強(qiáng)度下降和受體熒光發(fā)射增強(qiáng)。為了測(cè)定能量轉(zhuǎn)移的程度，供體在用供體和受體探針標(biāo)記的樣本中的強(qiáng)度與其在僅用供體探針標(biāo)記的樣本中的強(qiáng)度比較。任選地，比較在供體/受體的樣本中和在僅含受體的樣本中的受體強(qiáng)度。合適的探針在本領(lǐng)域是已知的，并包括例如可透過(guò)膜的染料，例如熒光素和羅丹明，有機(jī)染料，例如花青染料，和鑭系原子。Selvin，同上文。用于檢測(cè)和測(cè)量能量轉(zhuǎn)移的方法和儀器在本領(lǐng)域也是已知的。Selvin，同上文。
適合于檢測(cè)和測(cè)量單個(gè)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的以FRET為基礎(chǔ)的技術(shù)在本領(lǐng)域也是已知的。例如，供體光漂白熒光共振能量轉(zhuǎn)移(pbFRET)顯微鏡和熒光壽命成像顯微鏡(FLIM)可以被用于檢測(cè)細(xì)胞表面受體的二聚化。Selvin，同上文；Gadella和Jovin，J.Cell Biol.，1291543-58(1995)。在一個(gè)實(shí)施方案中，pbFRET被在“懸浮液”中或“原位”用在細(xì)胞上來(lái)檢測(cè)和測(cè)量EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體的形成，如被描述在Nagy et al.，Cytometry，32120-131(1998)中。這些技術(shù)測(cè)量由于能量轉(zhuǎn)移造成的供體熒光壽命的縮短。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)Foerster型FRET技術(shù)(FCET)可被用于研究EGFR-ErbB2和ErbB2-ErbB3異二聚化，如在Nagy et al.，同上文，和Brockhoff et al.，Cytometry，44338-48(2001)中所描述。
FRET優(yōu)選與標(biāo)準(zhǔn)的免疫組織化學(xué)標(biāo)記技術(shù)聯(lián)合使用。Kenworthy，Methods，24289-96(2001)。例如，與合適的熒光染料偶聯(lián)的抗體可以被用作標(biāo)記兩種不同蛋白質(zhì)的探針。如果蛋白質(zhì)與另一蛋白質(zhì)接近，該熒光染料作為FRET的供體和受體。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)手段來(lái)檢測(cè)能量轉(zhuǎn)移?？梢酝ㄟ^(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)手段或者通過(guò)數(shù)碼顯微鏡系統(tǒng)檢測(cè)能量轉(zhuǎn)移，例如共焦顯微鏡或連接到電荷偶聯(lián)裝置(charge-coupled device)(CCD)照相機(jī)的寬視野熒光顯微鏡。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，ErbB2抗體或者EGFR或ErbB3抗體直接用兩種不同熒光團(tuán)標(biāo)記，例如如在Nagy et al.，同上文中所描述。腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞裂解物與進(jìn)行區(qū)別標(biāo)記的抗體接觸，這些抗體在檢測(cè)是否存在EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體的FRET中作為供體和受體。此外，未被標(biāo)記的抗ErbB2的和或者抗EGFR或者抗ErbB3的抗體與被區(qū)別標(biāo)記來(lái)作為供體和受體的第二抗體一起使用。參見(jiàn)，例如Brockhoffet al.，同上文。如果發(fā)現(xiàn)標(biāo)記非常接近，那么檢測(cè)到能量轉(zhuǎn)移，并確定存在異二聚體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，特異于HER2和或者特異于HER1或者特異于HER3的ErbB受體的配體被熒光標(biāo)記，并用于FRET研究。
在本發(fā)明的還有其他實(shí)施方案中，采用標(biāo)準(zhǔn)的直接或間接免疫熒光技術(shù)和共焦激光掃描顯微鏡，通過(guò)共定位(co-localization)ErbB2與或者EGFR或者ErbB3來(lái)證明在腫瘤細(xì)胞的表面上存在異二聚體。此外，激光掃描成像(LSI)被用于在高通量格式(high-throughput format)例如微孔平板中，檢測(cè)抗體結(jié)合以及ErbB2與或者EGFR或者ErbB3共定位，如被描述在Zuck etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9611122-27(1999)。
在還有一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)鑒定依賴于異二聚體組分的相近性的酶活性來(lái)確定存在EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3異二聚體。ErbB2抗體與一種酶偶聯(lián)，而EGFR或ErbB3抗體與第二種酶偶聯(lián)。加入用于第一種酶的第一種底物，該反應(yīng)產(chǎn)生用于第二種酶的第二種底物。這導(dǎo)致與另一種分子的反應(yīng)來(lái)生成可檢測(cè)的化合物，例如染料。另一個(gè)化學(xué)藥品的存在分解了第二種底物，使得與第二種酶的反應(yīng)被阻斷，除非第一種和第二種酶，因此也就是兩種抗體，十分接近。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，將腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞裂解物與用葡萄糖氧化酶偶聯(lián)的ErbB2抗體，以及用辣根過(guò)氧化酶偶聯(lián)的ErbB3或ErbB1抗體接觸。將葡萄糖以及染料前體，例如DAB，和過(guò)氧化氫酶加入到反應(yīng)中。產(chǎn)生對(duì)DAB染色的顏色確定存在異二聚體。
eTagTM分析系統(tǒng)可以采用基于eTagTM分析系統(tǒng)(Aclara Bio Sciences，Mountain View，CA)的方法檢測(cè)異二聚體，如被描述在例如WO 83502和2001年12月6日公開(kāi)的美國(guó)專利申請(qǐng)2001/0049105中，兩者都清楚地全文引入作為參考。eTagTM或“電泳標(biāo)記”包含可檢測(cè)的報(bào)道分子部分，例如熒光團(tuán)。其還可以包含“遷移率調(diào)節(jié)物”，遷移率調(diào)節(jié)物基本上由具有獨(dú)特的電泳遷移率的部分組成。這些部分使得可以在限定的電泳條件下，例如毛細(xì)管電泳(CE)，從復(fù)雜的混合物中分離和檢測(cè)eTagTM。包含報(bào)道分子部分以及，任選的，遷移率調(diào)節(jié)物的eTagTM的部分通過(guò)可裂解連接基團(tuán)被連接到第一個(gè)靶向結(jié)合部分上，生成第一種結(jié)合化合物。第一個(gè)靶向結(jié)合部分特異地識(shí)別特定的第一個(gè)靶點(diǎn)，例如核酸或蛋白質(zhì)。第一個(gè)靶向結(jié)合部分無(wú)論如何是不被限制的，并且可以是例如多核苷酸或多肽。優(yōu)選地，第一個(gè)靶向結(jié)合部分是一種抗體或抗體片段。另外，第一個(gè)靶向結(jié)合部分可以是ErbB受體的配體或其具有結(jié)合能力的片段。
連接基團(tuán)優(yōu)選包含可裂解部分，例如一種酶底物或在限定條件下可以被裂解的任何化學(xué)鍵。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)靶向結(jié)合部分結(jié)合到其靶點(diǎn)時(shí)，裂解劑被導(dǎo)入和/或激活，而連接基團(tuán)被斷裂，從而釋放包含報(bào)道分子部分和遷移率調(diào)節(jié)物的eTagTM的部分。因此，存在“游離”的eTagTM表示靶向結(jié)合部分結(jié)合到其靶點(diǎn)上。
優(yōu)選地，第二種結(jié)合化合物包含裂解劑和特異地識(shí)別第二個(gè)靶點(diǎn)的第二個(gè)靶向結(jié)合部分。第二個(gè)靶向結(jié)合部分也是無(wú)論如何不是被限制的，并且可以是例如一種抗體或抗體片段或ErbB受體的配體或具有結(jié)合能力的配基片段。如果第一種結(jié)合化合物和第二種結(jié)合化合物十分接近，那么裂解劑將僅斷裂第一種結(jié)合化合物中的連接基團(tuán)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第一種結(jié)合化合物包含eTagTM，在eTagTM中ErbB2抗體作為第一個(gè)靶向結(jié)合部分。第二種結(jié)合化合物包含連接到能夠斷裂eTagTM的連接基團(tuán)的裂解劑上的EGFR或ErbB3的抗體。優(yōu)選地，裂解劑必須被激活以能夠斷裂連接基團(tuán)。腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞裂解物與結(jié)合到ErbB2上的eTagTM接觸，和與結(jié)合到細(xì)胞表面上的EGFR或ErbB3的被修飾的EGFR或ErbB3抗體接觸。優(yōu)選去除未被結(jié)合的結(jié)合復(fù)合物，并在需要時(shí)激活裂解劑。如果存在EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體，由于裂解劑和連接基團(tuán)相鄰近，裂解劑將會(huì)斷裂連接基團(tuán)，并釋放eTagTM。然后通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法，例如毛細(xì)管電泳，檢測(cè)游離的eTagTM。
在一個(gè)實(shí)施方案中，裂解劑是可激活的作用于連接基團(tuán)的化學(xué)藥品種類。例如，可以通過(guò)將樣本暴露于光照下來(lái)激活裂解劑。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，采用EGFR或ErbB3的抗體作為第一個(gè)靶向結(jié)合部分來(lái)構(gòu)建eTagTM，而用ErbB2抗體構(gòu)建第二種結(jié)合化合物。
檢測(cè)ErbB受體的磷酸化存在ErbB受體磷酸化可被用來(lái)證明HER2活化。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)免疫沉淀一種或多種ErbB受體例如ErbB2(HER2)受體，以及蛋白質(zhì)印跡分析來(lái)評(píng)價(jià)ErbB受體磷酸化。例如，采用抗磷酸酪氨酸抗體來(lái)檢測(cè)被免疫沉淀的ErbB受體中的被磷酸化的酪氨酸殘基，在凝膠上存在磷酸-HER2條帶確定為陽(yáng)性?？沽姿崂野彼岬目贵w可以從PanVera(Madison，WI)或Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY)購(gòu)買(mǎi)得到，PanVera(Madison，WI)是Invitrogen，Chemicon InternationalInc.(Temecula，CA)的子公司。缺乏該條帶確定為陰性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，采用磷酸特異性抗HER2的抗體(克隆PN2A；Thor et al.，J.Clin.Oncol.，18(18)3230-3239(2000))，通過(guò)免疫組織化學(xué)評(píng)價(jià)ErbB2(HER2)受體磷酸化。用于檢測(cè)ErbB受體磷酸化的其他方法包括，但是不限于，KIRA ELISA(美國(guó)專利號(hào)5,766,863；5,891,650；5,914,237；6,025,145；和6,287,784)，質(zhì)譜法(比較磷酸化的和未磷酸化的HER2的大小)，和采用抗HER2的抗體進(jìn)行e-tag鄰近性分析(例如采用購(gòu)自AclaraBioSciences(Mountain View，CA)的eTagTM分析試劑盒)。對(duì)于eTagTM分析的詳細(xì)內(nèi)容在上文中描述。
抗體制備下面的說(shuō)明是關(guān)于制備按照本發(fā)明所用的治療性和診斷性抗體的示例性技術(shù)。雖然該說(shuō)明總體上針對(duì)抗ErbB2的抗體的制備，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠很容易地修改本公開(kāi)來(lái)制備針對(duì)任何ErbB受體的抗體。
用于制備抗體的ErbB2抗原可以是，例如含有所需表位的ErbB2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其部分的可溶形式?；蛘撸诩?xì)胞表面表達(dá)ErbB2的細(xì)胞(例如被轉(zhuǎn)化來(lái)過(guò)度表達(dá)ErbB2的NIH-3T3細(xì)胞；或癌細(xì)胞系例如SK-BR-3細(xì)胞，參見(jiàn)Stancovski et al.，PNAS(USA)，888691-8695(1991))可以被用于生產(chǎn)抗體。可用于生產(chǎn)抗體的其他形式的ErbB2對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯然的。
多克隆抗體優(yōu)選地通過(guò)多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑在動(dòng)物中產(chǎn)生多克隆抗體。采用雙功能或衍生化劑，例如馬來(lái)酰亞胺苯甲酰硫代琥珀酰亞胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(通過(guò)半胱氨酸殘基偶聯(lián))，N-羥基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴氨酸殘基偶聯(lián))，戊二醛，琥珀酐，SOCl2，或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基基團(tuán)，將相關(guān)抗原偶聯(lián)到在將被免疫的物種中具有免疫原性的蛋白質(zhì)上是有用的，這些蛋白例如匙孔血藍(lán)蛋白，血清白蛋白，牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。
通過(guò)組合例如100μg或5μg蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別用于兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑，并在多個(gè)部位皮內(nèi)注射該溶液以針對(duì)抗原，免疫原性交聯(lián)物或衍生物來(lái)免疫動(dòng)物，一個(gè)月后，1/5-1/10的最初量的溶解在弗氏完全佐劑中的肽或偶聯(lián)物在多個(gè)部位上進(jìn)行皮下注射來(lái)加強(qiáng)免疫動(dòng)物。7-14天后，給動(dòng)物放血，分析血清中的抗體滴度。加強(qiáng)免疫動(dòng)物直到該滴度達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。優(yōu)選地，用相同抗原但是偶聯(lián)到不同蛋白質(zhì)上和/或通過(guò)不同交聯(lián)劑偶聯(lián)的交聯(lián)物來(lái)加強(qiáng)免疫動(dòng)物。還可以蛋白質(zhì)融合的形式在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中制備偶聯(lián)物。此外，凝集劑例如明礬適合被用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)。
單克隆抗體單克隆抗體是從實(shí)質(zhì)上均一的抗體的群體中獲得，即包含群體的各個(gè)抗體除了可能以最小量存在的可能天然發(fā)生的突變外，是相同的。因此，修飾語(yǔ)“單克隆”表示抗體的特征，即不是無(wú)聯(lián)系的抗體的混合物。
例如，單克隆抗體可以通過(guò)最早在Kohler et al.，Nature，256495(1975)中描述的雜交瘤方法來(lái)制備，或者可通過(guò)重組DNA方法(如美國(guó)專利號(hào)4,816,567)來(lái)制備。
在雜交瘤方法中，小鼠或其他合適的宿主動(dòng)物，例如倉(cāng)鼠如上文所描述進(jìn)行免疫來(lái)引發(fā)生產(chǎn)或能夠生產(chǎn)抗體的淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，該抗體將特異地結(jié)合用于免疫接種的蛋白質(zhì)?；蛘撸隗w外免疫淋巴細(xì)胞。然后，采用合適的融合試劑，例如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，“單克隆抗體原理和實(shí)踐”，59-103(Academic Press，1986))。
如此制備的雜交瘤細(xì)胞被接種并生長(zhǎng)在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中優(yōu)選包含一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏酶次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常將包括次黃嘌呤、氨蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞的生長(zhǎng)。
優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些有效融合，通過(guò)所選擇的生產(chǎn)抗體的細(xì)胞支持穩(wěn)定高水平地生產(chǎn)抗體，并且對(duì)培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基敏感的細(xì)胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，例如那些來(lái)源于從Salk Institute CellDistribution Center，San Diego，California USA獲得的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤的骨髓瘤系，和得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心Rockville，MarylandUSA的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞。人骨髓瘤和小鼠人異骨髓瘤細(xì)胞系也被描述用于制備人單克隆抗體(Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；和Brodeur et al.，“單克隆抗體制備技術(shù)及應(yīng)用”，51-63(Marcel Dekker，Inc.，紐約，1987))。
分析其中生長(zhǎng)了雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中針對(duì)抗原的單克隆抗體的生產(chǎn)。優(yōu)選地，通過(guò)免疫沉淀或通過(guò)體外結(jié)合分析，例如放射免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，確定雜交瘤細(xì)胞制備的單克隆抗體的結(jié)合特異性。
例如，可通過(guò)Munson et al.，Anal.Biochem.，107220(1980)的斯卡查德分析來(lái)確定單克隆抗體的結(jié)合親合力。
在雜交瘤細(xì)胞被鑒定出生產(chǎn)具有所需特異性、親合力和/或活性的抗體后，通過(guò)有限稀釋操作亞克隆該克隆，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)生長(zhǎng)(Goding，“單克隆抗體原理和實(shí)踐”，59-103(Academic Press，1986))。用于該目的的合適培養(yǎng)基包括，例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細(xì)胞可以作為腹水腫瘤在動(dòng)物中體內(nèi)生長(zhǎng)。
亞克隆分泌的單克隆抗體采用傳統(tǒng)的抗體純化操作例如蛋白質(zhì)A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親合層析，從培養(yǎng)基、腹水液或血清中適當(dāng)分離。
采用常規(guī)操作(例如通過(guò)采用能夠特異性地結(jié)合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)容易分離和測(cè)序編碼單克隆抗體的DNA。雜交瘤細(xì)胞作為這種DNA的優(yōu)選來(lái)源。一旦被分離，DNA可被加入到表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，例如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或者不另外生產(chǎn)抗體蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，以獲得單克隆抗體在重組的宿主細(xì)胞中的合成。關(guān)于在細(xì)菌中重組表達(dá)編碼抗體的DNA的綜述文章包括Skerra et al.，Curr.Opinion in Immunol.，5256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.，130151-188(1992)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以采用在McCafferty et al.，Nature，348552-554(1990)中描述的技術(shù)從所生成的抗體噬菌體文庫(kù)中分離單克隆抗體或抗體片段。Clackson et al.，Nature，352624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)分別描述了采用噬菌體文庫(kù)分離鼠和人的抗體。隨后的出版物中描述了通過(guò)鏈改組來(lái)制備高親合性(nM范圍)的人抗體(Marks et al.，Bio/Technology，10779-783(1992))，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大噬菌體文庫(kù)的策略(Waterhouse et al.，Nuc.Acids.Res.，212265-2266(1993))。因此，對(duì)于用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)來(lái)說(shuō)，這些技術(shù)是可行的替代。
DNA還可以被修飾，例如通過(guò)用人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列來(lái)替代同源的鼠序列(美國(guó)專利號(hào)4,816,567；和Morrison，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851(1984))，或者通過(guò)將全部或部分的非免疫球蛋白多肽的編碼序列共價(jià)地連接到免疫球蛋白編碼序列上。
典型地，用這種非免疫球蛋白多肽來(lái)替代抗體的恒定結(jié)構(gòu)域，或者用它們來(lái)替代抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變結(jié)構(gòu)域，以建立包含對(duì)一個(gè)抗原具有特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)以及對(duì)一個(gè)不同抗原具有特異性的另一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的嵌合雙價(jià)抗體。
人源化抗體用于人源化非人類的抗體的方法已經(jīng)在本領(lǐng)域被描述。
優(yōu)選地，人源化的抗體具有從非人來(lái)源被導(dǎo)入其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。這些非人類的氨基酸殘基通常被稱作為“輸入”殘基，其通常來(lái)自“輸入”的可變結(jié)構(gòu)域。人源化基本上可以按照Winter及其同事的方法進(jìn)行(Jones et al.，Nature，321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，2391534-1536(1988))，通過(guò)用高變區(qū)序列取代人抗體的相應(yīng)序列。因此，這種“人源化”的抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利號(hào)4,816,567)，其中比完整的人可變結(jié)構(gòu)域小得多的部分被來(lái)自非人類物種的相應(yīng)序列取代。實(shí)際上，人源化的抗體典型地是人的抗體，其中有些高變區(qū)殘基以及可能有些FR殘基被來(lái)自嚙齒類動(dòng)物抗體的類似位點(diǎn)上的殘基取代。
選擇人的輕鏈和重鏈的可變結(jié)構(gòu)域，以用于制備人源化的抗體對(duì)于降低抗原性是非常重要的。按照所謂的“最佳適配(best-fit)”的方法，用已知的人的可變結(jié)構(gòu)域序列的整個(gè)文庫(kù)篩選嚙齒類動(dòng)物抗體的可變結(jié)構(gòu)域的序列。然后與嚙齒類動(dòng)物最接近的人序列被接受作為人源化抗體的人的骨架區(qū)(FR)(Sims et al.，J.Immunol.，1512296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.，196901(1987))。另一種方法采用來(lái)自特定的輕鏈或重鏈亞群的所有人抗體的共有序列的特定骨架區(qū)。相同的骨架可以被用于幾種不同的人源化抗體(Carteret al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.，1512623(1993))。
被人源化的抗體保留對(duì)抗原的高親合力以及其他有利的生物學(xué)特性也是重要的。為了達(dá)到這個(gè)目的，按照優(yōu)選的方法，通過(guò)采用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種構(gòu)想的人源化產(chǎn)物的過(guò)程來(lái)制備人源化的抗體。三維的免疫球蛋白模型是一般可獲得的，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。計(jì)算機(jī)程序是可獲得的，其闡明和顯示被選擇的候選免疫球蛋白序列的很可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。對(duì)這些顯示的探查可以分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。通過(guò)這種方式，可以從受體和輸入序列中選擇和組合FR殘基，來(lái)獲得期望的抗體特性，例如增強(qiáng)對(duì)目標(biāo)抗原的親合力?？傊咦儏^(qū)的殘基直接地和最實(shí)質(zhì)性地參與影響抗原結(jié)合。
結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配基活化的示例性人源化抗ErbB2的抗體被描述在WO 01/0245，其在此引入作為參考。在此特別感興趣的人源化抗體基本上與鼠單克隆抗體2C4(或其Fab片段)一樣有效地阻斷EGF，TGF-α和/或HRG介導(dǎo)的MAPK的活化，和/或基本上與鼠單克隆抗體2C4(或其Fab片段)一樣有效地結(jié)合ErbB2。人源化抗體在此可以例如，包含被結(jié)合到人可變重鏈結(jié)構(gòu)域的非人的高變區(qū)殘基，并且可能在選自由69H，71H和73H組成的組中的一個(gè)位置上包含骨架區(qū)(FR)取代，采用的是在Kabat et al.，“具有免疫學(xué)意義的蛋白質(zhì)的序列”，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991)中給出的可變結(jié)構(gòu)域編號(hào)系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化的抗體在69H，71H和73H的兩個(gè)或所有位點(diǎn)包含F(xiàn)R取代。
示例性的目的人源化抗體在此包含可變的重鏈結(jié)構(gòu)域互補(bǔ)決定殘基GFTFTDYTMX，其中X優(yōu)選是D或S(SEQ ID NO7)；DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQ ID NO8)；和/或NLGPSFYFDY(SEQ IDNO9)，任選地包含這些CDR殘基的氨基酸修飾，例如，其中修飾基本上保持或改善抗體的親合力。例如，目的抗體變體可在上述的可變重鏈CDR序列中具有從約1個(gè)到約7個(gè)或者約5個(gè)氨基酸取代。這種抗體變體可以通過(guò)親和力成熟(affinity maturation)來(lái)制備，例如如下文所述。最優(yōu)選的人源化抗體包含SEQ ID NO4中的可變的重鏈結(jié)構(gòu)域氨基酸序列(附圖1B)。
例如，除了在前述段落中的那些可變重鏈結(jié)構(gòu)域CDR殘基之外，人源化抗體還可以包含可變的輕鏈結(jié)構(gòu)域互補(bǔ)決定殘基KASQDVSIGVA(SEQID NO10)；SASYX1X2X3，其中X1優(yōu)選為R或L，X2優(yōu)選為Y或E，和X3優(yōu)選為T(mén)或S(SEQ ID NO11)；和/或QQYYIYPYT(SEQ ID NO12)，這種人源化抗體任選地包含上述CDR殘基的氨基酸修飾，例如，其中修飾基本上保持或改善抗體的親合力。例如，目的抗體變體可能在上述的可變輕鏈CDR序列中具有從約1個(gè)到約7個(gè)或者約5個(gè)氨基酸取代。這種抗體變體可以通過(guò)親和力成熟來(lái)制備，例如如下文所述。最優(yōu)選的人源化抗體包含SEQ ID NO3中的可變的輕鏈結(jié)構(gòu)域氨基酸序列(附圖1A)。
本申請(qǐng)還考慮親合力成熟的抗體，其結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配基活化。親本抗體可以是人抗體或人源化抗體，例如包含分別為SEQ ID No3和4的可變輕鏈和/或重鏈序列(即變體574；附圖1A和B)。親合力成熟的抗體優(yōu)選以高于鼠2C4或變體574的親合力結(jié)合到ErbB2受體上(如采用ErbB2細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)ELISA評(píng)價(jià)，例如親合力改善從約2倍或約4倍到約100倍或約1000倍)。示例性的用于取代的可變重鏈CDR殘基包括H28，H30，H34，H35，H64，H96，H99，或者兩個(gè)或多個(gè)的組合(如這些殘基中的2，3，4，5，6或7個(gè))。用于改變的可變輕鏈CDR殘基的例子包括L28，L50，L53，L56，L91，L92，L93，L94，L96，L97或兩個(gè)或多個(gè)的組合(如這些殘基中的2至3、4、5或直到約10個(gè))。
還考慮了各種形式的人源化抗體或親合力成熟的抗體。例如，人源化抗體或親合力成熟的抗體可以是抗體片段，例如Fab，其任選地與一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)來(lái)產(chǎn)生一種免疫偶聯(lián)物。或者，人源化抗體或親合力成熟的抗體可以是完整抗體，例如完整的IgGl抗體。
人抗體作為人源化的替代，可以制備人抗體。例如現(xiàn)在能夠制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)，當(dāng)缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)物時(shí)，該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能夠在免疫后產(chǎn)生人抗體的所有組分。例如，已經(jīng)描述，在嵌合和種系突變小鼠中純合缺失抗體重鏈連接區(qū)(heavy-chain joining region)(JH)基因?qū)е聝?nèi)源抗體生產(chǎn)的完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這種種系突變小鼠，將會(huì)導(dǎo)致在抗原激發(fā)時(shí)產(chǎn)生人抗體。參見(jiàn)，如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362255-258(1993)；Bruggennann et al.，Year in Immuno.，733(1993)；和美國(guó)專利號(hào)5,591,669；5,589,369和5,545,807。
或者，噬菌體展示技術(shù)(McCafferty et al.，Nature，348552-553(1990))可以被用于體外從來(lái)自未被免疫的供體的免疫球蛋白可變(V)結(jié)構(gòu)域基因所有組成中生產(chǎn)人抗體和抗體片段。按照這種技術(shù)，抗體V結(jié)構(gòu)域基因按照讀框被克隆到絲狀噬菌體例如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因中，并以功能性抗體片段展示在噬菌體顆粒的表面上。由于絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于抗體的功能性特性的選擇還會(huì)導(dǎo)致對(duì)編碼展示那些特性的抗體的基因的選擇。因此，噬菌體模擬了B細(xì)胞的一些特性。噬菌體展示可以以各種形式實(shí)現(xiàn)；對(duì)于此的綜述，參見(jiàn)如Johnson，Kevin S.和Chiswell，DavidJ.，Current Opinion in Structural Biology，3564-571(1993)。一些V-基因區(qū)段的來(lái)源可以被用于噬菌體展示。Clackson et al.，Nature，352624-628(1991)從來(lái)源于被免疫小鼠的脾臟的一個(gè)小的隨機(jī)組合V基因文庫(kù)中分離到一系列不同的抗唑酮抗體?；旧习凑誐arks et al.，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)，或Griffith et al.，EMBO J.，12725-734(1993)中描述的技術(shù)可以構(gòu)建來(lái)自未被免疫的人供體的V基因的所有組成成分，并且可以分離抗一系列不同抗原(包括自體抗原)的抗體。還可以參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,565,332和5,573,905。
如上所討論的，還可以通過(guò)體外激活的B細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生人抗體(參見(jiàn)美國(guó)專利5,567,610和5,229,275)。
人抗ErbB2的抗體被描述在1998年6月30日授權(quán)的美國(guó)專利號(hào)5,772,997和1997年1月3日公開(kāi)的WO 97/00271中。
抗體片段各種技術(shù)已經(jīng)被開(kāi)發(fā)來(lái)生產(chǎn)抗體片段。
傳統(tǒng)上，這些片段通過(guò)蛋白質(zhì)水解消化完整的抗體來(lái)獲得(參見(jiàn)，如Morimoto et al.，Journal of Biochemical and Biophysical Methods，24107-117(1992)；和Brennan et al.，Science，22981(1985))。但是，現(xiàn)在可以通過(guò)重組宿主細(xì)胞直接地制備這些片段。例如，可以從上面討論的抗體噬菌體文庫(kù)中分離抗體片段?；蛘撸梢詮拇竽c桿菌中直接回收Fab′-SH片段，并化學(xué)偶聯(lián)，來(lái)形成F(ab′)2片段(Carter et al.，Bio/Technology，10163-167(1992))。按照另一種方法，可以從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中直接分離F(ab′)2片段。用于生產(chǎn)抗體片段的其他技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯然的。在其他實(shí)施方案中，所選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見(jiàn)WO93/16185；美國(guó)專利號(hào)5,571,894；和美國(guó)專利號(hào)5,587,458。抗體片段還可以是線性抗體，如，在美國(guó)專利5,641,870中所描述的。這種線性抗體片段可以是單一特異性的或雙特異性的。
雙特異性抗體雙特異性抗體是對(duì)至少兩個(gè)不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。示例性的雙特異性抗體可能結(jié)合到ErbB2蛋白的兩個(gè)不同的表位上。其他的這種抗體可能組合ErbB2結(jié)合位點(diǎn)與EGFR，ErbB3和/或ErbB4的結(jié)合位點(diǎn)?；蛘撸笶rbB2的臂可能與結(jié)合白細(xì)胞上的觸發(fā)分子例如T細(xì)胞受體分子(如CD2或CD3)，或者IgG的Fc受體(FcγR)，例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂組合，來(lái)將細(xì)胞防御機(jī)制集中在表達(dá)ErbB2的細(xì)胞上。雙特異性抗體還可以被用于將細(xì)胞毒性劑定位在表達(dá)ErbB2的細(xì)胞上。這些抗體具有ErbB2結(jié)合臂，以及結(jié)合細(xì)胞毒性劑(如皂草素，抗干擾素-α，長(zhǎng)春花生物堿，蓖麻毒蛋白A鏈，氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體可以作為全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如F(ab′)2雙特異性抗體)被制備。
WO 96/16673中描述了一種雙特異性抗ErbB2/抗FcγRIII抗體，而美國(guó)專利號(hào)5,837,234公開(kāi)了一種雙特異性的抗ErbB2/抗FcγRI抗體。雙特異性的抗ErbB2/Fcα抗體被示于WO 98/02463中。美國(guó)專利號(hào)5,821,337教導(dǎo)了一種雙特異性的抗ErbB2/抗CD3抗體。
用于制備雙特異性的抗體的方法在本領(lǐng)域是已知的。全長(zhǎng)雙特異性抗體的傳統(tǒng)制備是基于共表達(dá)兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)，其中這兩條鏈具有不同的特異性(Millstein et al.，Nature，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈隨機(jī)分類，這些雜交瘤(“四鏈瘤”quadromas)生成了10種不同抗體分子的可能混合物，其中只有一種抗體分子具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過(guò)親合層析步驟來(lái)純化正確的分子，是非常繁瑣的，并且產(chǎn)量很低。類似的操作被公開(kāi)在WO 93/08829，和Traunecker et al.，EMBO J.，103655-3659(1991)中。
按照不同方法，具有所需結(jié)合特異性的抗體可變結(jié)構(gòu)域(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))被融合到免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)域序列上。優(yōu)選與包含鉸鏈區(qū)、CH2、和CH3區(qū)域的至少一部分的免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域融合。優(yōu)選具有在至少一個(gè)融合體中出現(xiàn)的含有輕鏈結(jié)合必需位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)。編碼免疫球蛋白重鏈融合體以及，如果需要，免疫球蛋白輕鏈的DNA被插入到各自獨(dú)立的表達(dá)載體中，并被共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。當(dāng)構(gòu)建中所用的三種多肽鏈的不相等比例產(chǎn)生最佳產(chǎn)量時(shí)，這給調(diào)整實(shí)施方案中三種多肽片段相互比例提供很大的靈活性。但是，當(dāng)至少兩種多肽鏈以相等比例表達(dá)獲得了高產(chǎn)量時(shí)或者當(dāng)該比例不是特別重要時(shí)，有可能在一個(gè)表達(dá)載體中插入兩種或全部三種多肽鏈的編碼序列。
在這種方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，雙特異性抗體由一個(gè)臂中的具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，以及另一個(gè)臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)組成。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于僅在雙特異性分子的一半中存在免疫球蛋白輕鏈提供了一種便捷的分離途經(jīng)，這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)便于從不期望的免疫球蛋白鏈組合中分離期望的雙特異性化合物。這種方法被公開(kāi)在WO 94/04690中。生產(chǎn)雙特異性抗體的更加詳細(xì)內(nèi)容參見(jiàn)，例如Suresh et al.，Methods in Enzymology，121210(1986)。
按照在美國(guó)專利號(hào)5,731,168中描述的另一方法，可以工程化改造一對(duì)抗體分子之間的界面來(lái)使異二聚體的百分比最大化，該異二聚體從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收。優(yōu)選的界面包含抗體恒定結(jié)構(gòu)域的CH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在這種方法中，來(lái)自第一抗體分子界面的一條或多條小氨基酸側(cè)鏈用較大的側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)替代。通過(guò)用較小的側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)替換大氨基酸側(cè)鏈在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與大側(cè)鏈相同或類似大小的補(bǔ)償“空穴”。這提供一種機(jī)制來(lái)提高異二聚體相對(duì)于其他不需要的終產(chǎn)物，例如同型二聚體的產(chǎn)量。
雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“異偶聯(lián)物”抗體。例如，異偶聯(lián)物中的抗體之一可以被偶聯(lián)到抗生物素蛋白上，另一個(gè)則偶聯(lián)到生物素上。這種抗體被建議用于例如將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不需要的細(xì)胞(美國(guó)專利號(hào)4,676,980)，以及用于治療HIV感染(WO 91/00360，WO 92/200373，和EP 03089)。異偶聯(lián)物抗體可以采用任何方便的交聯(lián)方法來(lái)制備。合適的交聯(lián)劑以及大量交聯(lián)技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，被公開(kāi)在美國(guó)專利號(hào)4,676,980中。
用于從抗體片段生產(chǎn)雙特異性抗體的技術(shù)也在文獻(xiàn)中被描述。例如，雙特異性抗體可以采用化學(xué)連接制備。Brennan et al.，Science，22981(1985)描述了一種操作，其中完整抗體被蛋白質(zhì)水解裂解產(chǎn)生F(ab′)2片段。這些片段在二硫酚絡(luò)合劑亞砷酸鈉的存在下被還原以穩(wěn)定鄰近的二硫酚，并防止分子間二硫化物的形成。生成的Fab′片段然后被轉(zhuǎn)化為硫代硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。然后通過(guò)用巰基乙胺還原，F(xiàn)ab′-TNB衍生物之一被再轉(zhuǎn)化為Fab′-硫羥，與等克分子數(shù)的其他Fab′-TNB衍生物混合來(lái)形成雙特異性抗體。生成的雙特異性抗體可以被用作選擇性固定酶的試劑。
最近的進(jìn)展使得從大腸桿菌中直接回收Fab′-SH片段變得更加容易，這些片段可以被化學(xué)偶聯(lián)來(lái)形成雙特異性抗體。Shalaby et al.，J.Exp.Med.，175217-225(1992)中描述了生產(chǎn)完全人源化的雙特異性抗體F(ab′)2分子。每個(gè)Fab′片段分別從E.coli中分泌，并在體外定向化學(xué)偶聯(lián)來(lái)形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合到過(guò)度表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞和正常的人T細(xì)胞上，并且觸發(fā)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞針對(duì)人乳腺腫瘤靶點(diǎn)的裂解活性。
各種用于直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中制備和分離雙特異性抗體片段的技術(shù)也已經(jīng)被描述。例如已經(jīng)采用亮氨酸拉鏈制備了雙特異性抗體。Kostelnyet al.，J.Immunol.，148(5)1547-1553(1992)。通過(guò)基因融合，來(lái)自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽被連接到兩種不同抗體的Fab′部分上。抗體同型二聚體的鉸鏈區(qū)被還原來(lái)形成單體，然后再次被氧化形成抗體異二聚體。這種方法還可以被用于生產(chǎn)抗體同型二聚體。被描述在Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)中的“微型雙功能”技術(shù)給制備雙特異性抗體片段提供可供選擇的機(jī)制。該片段包含通過(guò)接頭被連接到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)上的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)，該接頭太短，以至同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)。因此，一個(gè)片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域被迫與另一條片段上的互補(bǔ)VL和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)采用單鏈Fv(sFv)二聚體來(lái)制備雙特異性抗體片段的另一策略也已經(jīng)被報(bào)道。參見(jiàn)Gruber et al.，J.Immunol.，1525368(1994)。
還考慮到具有二價(jià)以上的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt et al.，J.Immunol.，14760(1991)。
其他的氨基酸序列修飾還考慮到抗ErbB2的抗體的氨基酸序列修飾。例如，有可能期望改善抗體的結(jié)合親合力和/或其他的生物學(xué)特性。通過(guò)將適當(dāng)?shù)暮塑账岣淖円肟笶rbB2的抗體的核酸中，或者通過(guò)肽合成來(lái)制備抗ErbB2的抗體的氨基酸序列變體。這種修飾包括，例如，缺失和/或插入和/或取代抗ErbB2的抗體的氨基酸序列中的殘基。進(jìn)行缺失、插入和取代的任何組合來(lái)獲得最終的構(gòu)建體，只要最終的構(gòu)建體具有所需的特征。氨基酸改變也可改變抗ErbB2抗體的翻譯后加工，例如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)量或位置。
用于鑒定作為誘變優(yōu)選位置的抗ErbB2抗體的某些殘基或區(qū)域的有用方法稱作為“丙氨酸掃描誘變”，被描述在Cunningham和Wells，Science，2441081-1085(1989)中。在此，鑒定殘基或目標(biāo)殘基組(如帶電荷的殘基，例如精氨酸，天冬氨酸，組氨酸，賴氨酸，和谷氨酸)，并且用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選為丙氨酸或多聚丙氨酸)替換，來(lái)影響該氨基酸與ErbB2抗原的相互作用。那些表明對(duì)取代具有功能性靈敏性的氨基酸位置通過(guò)在或?qū)θ〈稽c(diǎn)引入更多或其他變化來(lái)改善。因此，雖然用于導(dǎo)入氨基酸序列變化的位點(diǎn)被預(yù)先確定，但是不必預(yù)先確定突變本身的性質(zhì)。例如，為了分析在特定位點(diǎn)上突變的進(jìn)行，在目標(biāo)密碼子或區(qū)域上進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，用所需活性篩選被表達(dá)的抗ErbB2抗體變體。
氨基酸序列插入包括長(zhǎng)度在一個(gè)殘基到含有上百或更多殘基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰殘基的抗ErbB2抗體或者融合到細(xì)胞毒性多肽上的抗體?？笶rbB2抗體分子的其他插入變體包括抗ErbB2抗體的N-或C-末端融合到報(bào)道分子，酶(例如ADEPT)或者延長(zhǎng)抗體的血清半衰期的多肽上。
另一種類型的變體是氨基酸取代變體。這些變體在抗ErbB2抗體中具有至少一個(gè)氨基酸殘基被不同殘基取代。對(duì)取代誘變來(lái)說(shuō)最感興趣的位點(diǎn)包括高變區(qū)，但FR改變也被考慮在內(nèi)。保守性取代顯示在表1的“優(yōu)選取代”的標(biāo)題下。如果這種取代導(dǎo)致生物學(xué)活性的變化，那么導(dǎo)入在表1中稱作“示例性取代”或者如下文關(guān)于氨基酸分類中進(jìn)一步描述的更實(shí)質(zhì)性改變，并篩選產(chǎn)物。
表1


抗體生物學(xué)特性的實(shí)質(zhì)性改變是通過(guò)選擇取代來(lái)實(shí)現(xiàn)，這些取代在其保持如下方面的效果上具有顯著區(qū)別(a)取代區(qū)域的多肽主鏈結(jié)構(gòu)，例如折疊或螺旋構(gòu)型，(b)靶位點(diǎn)的分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈體積。基于共同的側(cè)鏈特性，天然存在的殘基被分成幾組(1)疏水的正亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸；(2)中性親水的半胱氨酸；絲氨酸；蘇氨酸；(3)酸性的天冬氨酸，谷氨酸；(4)堿性的天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸；(5)影響側(cè)鏈定向的殘基甘氨酸，脯氨酸；和(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。
非保守取代將要求將這些種類之一的一個(gè)成員換成另一個(gè)種類的。
任何不參與維持抗ErbB2的抗體的正確構(gòu)象的半胱氨酸殘基也可被取代，通常用絲氨酸取代，來(lái)改善該分子的氧化穩(wěn)定性，并防止異常的交聯(lián)。相反，可以在抗體中加入半胱氨酸鍵來(lái)改善其穩(wěn)定性(特別是當(dāng)抗體為抗體片段例如Fv片段時(shí))。
特別優(yōu)選的一類取代變體涉及取代親本抗體的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基(例如人源化的或人抗體)。一般地，被選擇用于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的生成抗體相對(duì)于產(chǎn)生其的親本抗體，將具有改善了的生物學(xué)特性。用于生產(chǎn)這種取代變體的便捷方法涉及采用噬菌體展示的親合力成熟。簡(jiǎn)而言之，幾個(gè)高變區(qū)位點(diǎn)(如6-7個(gè)位點(diǎn))被突變來(lái)在每一位點(diǎn)上產(chǎn)生所有可能的氨基酸取代。如此生產(chǎn)的抗體變體顯示為從作為融合體的絲狀噬菌體顆粒到被包裝在每一顆粒中的M13的基因III產(chǎn)物的單價(jià)形式。然后如在此所公開(kāi)，篩選噬菌體展示的變體的生物學(xué)活性(如結(jié)合親合力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點(diǎn)，可以進(jìn)行丙氨酸掃描誘變來(lái)鑒定對(duì)抗原結(jié)合作出顯著貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基?？蛇x擇地或者額外地，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)來(lái)鑒定抗體和人ErbB2的接觸點(diǎn)是有益的。這種接觸殘基和鄰近殘基是用于按照在此詳述的技術(shù)進(jìn)行的取代的候選。一旦生成這種變體，對(duì)變體群體進(jìn)行如在此所述的篩選，而一個(gè)或多個(gè)相關(guān)分析中具有優(yōu)良特性的抗體可被選擇用于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。
另一種類型的氨基酸變異改變抗體的原始糖基化模式。所謂改變是指刪除一個(gè)或多個(gè)存在于抗體中的糖類部分，和/或增加一個(gè)或多個(gè)不存在于抗體中的糖基化位點(diǎn)。
抗體的糖基化典型的是N-聯(lián)或0-聯(lián)的。N-聯(lián)是指糖部分附著到天冬氨酸殘基的側(cè)鏈上。三肽序列天冬氨酸-X-絲氨酸和天冬氨酸-X-蘇氨酸，其中X是除了脯氨酸外的任何氨基酸，是糖部分酶催化附著到天冬氨酸側(cè)鏈上的識(shí)別序列。因此，在多肽中這些三肽序列中任何一種的存在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點(diǎn)。0-聯(lián)糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著到羥基氨基酸上，最通常為絲氨酸或蘇氨酸，雖然也可以采用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。
將糖基化位點(diǎn)添加到抗體上方便地是通過(guò)改變氨基酸序列使其含有一個(gè)或多個(gè)上述的三肽序列(用作N-聯(lián)糖基化位點(diǎn))來(lái)實(shí)現(xiàn)。這種改變還可以通過(guò)增加或替換一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基到原始抗體的序列上(作為0-聯(lián)糖基化位點(diǎn))。
編碼抗ErbB2抗體的氨基酸序列變體的核酸分子通過(guò)本領(lǐng)域知曉的各種方法來(lái)制備。這些方法包括，但是不限于，從天然來(lái)源中分離(在為天然存在的氨基酸序列變體的情況下)或者通過(guò)早先制備的變體或非變體形式的抗ErbB2抗體的寡核苷酸介導(dǎo)(或定點(diǎn))誘變，PCR誘變和表達(dá)盒誘變來(lái)制備。
有可能期望在效應(yīng)子功能方面改變本發(fā)明的抗體，例如來(lái)增強(qiáng)抗體的抗原依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)。這可以通過(guò)在抗體的Fc區(qū)導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代來(lái)實(shí)現(xiàn)。作為選擇或者另外地，半胱氨酸殘基可以被導(dǎo)入Fc區(qū)，從而在該區(qū)域形成鏈間二硫鍵。如此生成的同型二聚抗體可能具有改進(jìn)的內(nèi)在化能力和/或提高補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體依賴的細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)。參見(jiàn)Caron et al.，J.ExpMed.，1761191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.，1482918-2922(1992)。具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的同型二聚體抗體還可以采用如在Wolff et al.，Cancer Research，532560-2565(1993)中描述的異型雙功能交聯(lián)劑來(lái)制備?；蛘?，可以改造抗體，使之具有雙Fc區(qū)，從而具有增強(qiáng)的補(bǔ)體溶解和ADCC能力。參見(jiàn)Stevenson et al，Anti-Cancer Drug Design，3219-230(1989)。
為了延長(zhǎng)抗體的血清半衰期，可以如在美國(guó)專利5,739,277中所描述在抗體(特別是抗體片段)中摻入補(bǔ)救受體結(jié)合表位。如在此所用，術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”是指IgG分子(如IgGI，IgG2，IgG3，或IgG4)的Fc區(qū)的表位，該表位負(fù)責(zé)延長(zhǎng)IgG分子的體內(nèi)血清半衰期。
篩選具有期望特性的抗體用于生產(chǎn)抗體的技術(shù)已經(jīng)在上面被描述。如果需要，還可以進(jìn)一步選擇具有某種生物學(xué)特性的抗體。
為了鑒定阻斷ErbB受體的配基活化的抗體，可測(cè)定抗體阻斷ErbB配基結(jié)合到表達(dá)ErbB受體(例如偶聯(lián)到另一種ErbB受體上，該ErbB受體與目的ErbB受體形成ErbB異寡聚物)的細(xì)胞的能力。例如，天然地表達(dá)或者被轉(zhuǎn)染來(lái)表達(dá)ErbB異寡聚物的ErbB受體的細(xì)胞可以與抗體一起孵育，然后暴露給被標(biāo)記的ErbB配基。然后可評(píng)價(jià)抗ErbB2的抗體阻斷配基結(jié)合到ErbB異寡聚物中的ErbB受體上的能力。
例如，通過(guò)抗ErbB2抗體抑制HRG結(jié)合到MCF7乳腺腫瘤細(xì)胞系上，可以基本上如WO 01/00245中所述，使用以在冰上以24孔平板的形式的單層MCF7培養(yǎng)物進(jìn)行。將抗ErbB2的單克隆抗體添加到各個(gè)孔中，并孵育30分鐘。然后可加入125I-標(biāo)記的rHRGβ1177-224(25pm)，繼續(xù)孵育4-16小時(shí)。繪制劑量反應(yīng)曲線，計(jì)算目的抗體的IC50值。在一個(gè)實(shí)施方案中，阻斷ErbB受體的配基活化的抗體在本分析中抑制HRG結(jié)合到MCF7細(xì)胞的IC50為約50nM或更低，更加優(yōu)選為1OnM或更低。當(dāng)抗體是抗體片段，例如Fab片段時(shí)，在本分析中抑制HRG結(jié)合到MCF7細(xì)胞的IC50可以是，例如約100nM或更低，更優(yōu)選為50nM或更低。
可選擇地或另外地，可評(píng)定抗ErbB2抗體阻斷存在于ErbB異寡聚物中的ErbB受體的ErbB配基刺激的酪氨酸磷酸化的能力。例如，內(nèi)源性地表達(dá)或被轉(zhuǎn)染來(lái)表達(dá)ErbB受體的細(xì)胞可以與抗體一起孵育，然后使用抗磷酸酪氨酸單克隆(其任選地與可檢測(cè)的標(biāo)記偶聯(lián))來(lái)分析ErbB配基依賴的酪氨酸磷酸化活性。在美國(guó)專利5,766,863中所描述的激酶受體活化分析也可以用于測(cè)定ErbB受體活化和通過(guò)抗體對(duì)該活性的阻斷。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以基本上如下面實(shí)施例1中所描述篩選抑制HRG刺激MCF7細(xì)胞中的p180酪氨酸磷酸化的抗體。例如，將MCF7細(xì)胞鋪到24孔平板上，并將ErbB2的單克隆抗體加入每個(gè)孔中，在室溫下孵育30分鐘；然后可在每個(gè)孔中加入rHRGβ1177-244到0.2nM的最終濃度，繼續(xù)孵育8分鐘。從每個(gè)孔中吸走培養(yǎng)基，通過(guò)加入100μl SDS樣本緩沖液(5％SDS，25mM DTT和25mM Tris-HCl，pH 6.8)來(lái)終止反應(yīng)?？稍?-12％梯度凝膠(Novex)中對(duì)每一樣本(25μl)進(jìn)行電泳，然后通過(guò)電泳轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上?？蛇M(jìn)行抗磷酸酪氨酸(以1μg/ml)免疫印跡，通過(guò)反射度光密度分析法量化Mr180,000的主要反應(yīng)條帶的強(qiáng)度。在本分析中，被選擇的抗體優(yōu)選顯著地抑制p180酪氨酸磷酸化的HRG刺激至對(duì)照的約0-35％?？衫L制由反射度光密度分析法確定的p180酪氨酸磷酸化的HRG刺激的劑量反應(yīng)曲線，并可計(jì)算目的抗體的IC50。在一個(gè)實(shí)施方案中，阻斷ErbB受體的配基活化的抗體在本分析中抑制p180酪氨酸磷酸化的HRG刺激的IC50為約50nM或更低，更優(yōu)選為1OnM或更低。當(dāng)該抗體為抗體片段例如Fab片段時(shí)，在本分析中抑制p180酪氨酸磷酸化的HRG刺激的IC50為，例如約100nM或更低，更加優(yōu)選為50nM或更低。
還可以評(píng)價(jià)抗體對(duì)MDA-MB-175細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，如基本上如Schaefer et al.，Oncogene，151385-1394(1997)中所述。按照本分析方法，用抗ErbB2單克隆抗體(10μg/mL)處理MDA-MB-175細(xì)胞4天，并用龍膽紫染色。用抗ErbB2的抗體孵育在這一細(xì)胞系上顯示出與使用單克隆抗體2C4類似的生長(zhǎng)抑制作用。在還有一個(gè)實(shí)施方案中，外源的HRG對(duì)這種抑制沒(méi)有顯著的逆轉(zhuǎn)作用。優(yōu)選地，無(wú)論是否存在外源HRG，該抗體抑制MDA-MB-175細(xì)胞的細(xì)胞增殖的程度超過(guò)了單克隆抗體4D5(并且任選地超過(guò)了單克隆抗體7F3)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，目的抗ErbB2的抗體可阻斷MCF7和SK-BR-3細(xì)胞中的heregulin依賴的ErbB2與ErbB3結(jié)合，實(shí)質(zhì)上比單克隆抗體4D5更有效，和優(yōu)選地實(shí)質(zhì)上比單克隆抗體7F3更有效，這通過(guò)例如在實(shí)施例1中所描述的共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中確定。
為了鑒定生長(zhǎng)抑制性抗ErbB2的抗體，可以篩選抑制過(guò)度表達(dá)ErbB2的癌癥細(xì)胞生長(zhǎng)的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，在約0.5-30μg/ml的抗體濃度下，所選擇的生長(zhǎng)抑制抗體能夠抑制細(xì)胞培養(yǎng)物中約20-100％，優(yōu)選約50-100％的SK-BR-3細(xì)胞的生長(zhǎng)。為了鑒定這種抗體，可以實(shí)施在美國(guó)專利號(hào)5,677,171中描述的SK-BR-3分析。按照這種分析，SK-BR-3細(xì)胞在F12和添加了10％胎牛血清、谷氨酰胺和青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基的1∶1混合物中生長(zhǎng)。將20,000個(gè)SK-BR-3細(xì)胞鋪入35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中(2ml/35mm培養(yǎng)皿)。每個(gè)培養(yǎng)皿中加入0.5-30μg/ml抗ErbB2抗體。6天后，用電子COULTETRTM細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，與未被處理的細(xì)胞比較。那些抑制約20-100％或約50-100％的SK-BR-3細(xì)胞生長(zhǎng)的抗體被選擇作為生長(zhǎng)抑制抗體。
為了選擇誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抗體，相對(duì)于對(duì)照可評(píng)價(jià)由例如PI，臺(tái)盼蘭或7AAD攝取指示的膜完整性的喪失。優(yōu)選分析是采用BT474細(xì)胞的PI攝取的分析。按照該分析，BT474細(xì)胞(可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)獲得)被培養(yǎng)在Dulbecco′s Modified Eagle Medium(D-MEM)添加了10％熱滅活的FBS(Hyclone)和2mM L-谷氨酰胺的Ham′s F-12(50∶50)中。(因此，該分析在缺乏補(bǔ)體和免疫效應(yīng)細(xì)胞下進(jìn)行)。BT474細(xì)胞以3×106/皿的濃度被接種到100×20mm培養(yǎng)皿中，附著過(guò)夜。然后去除培養(yǎng)基，只用新鮮培養(yǎng)基或者用含有10μg/ml合適的單克隆抗體的培養(yǎng)液替換。孵育細(xì)胞3天。在每一處理后，用PBS洗滌單細(xì)胞層，用胰蛋白酶消化分離。然后在40℃下以1200rpm離心5min，將沉淀重懸在3ml冰冷的Ca2+結(jié)合緩沖液(10mM Hepes，pH7.4，140mM NaCl，2.5mM CaCl2)中，并等分試樣到35mm的加蓋濾網(wǎng)的12×75試管中(1ml/管，3管/處理組)來(lái)去除細(xì)胞塊。然后在管中加入PI(10μg/ml)。用FACSCANTM流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和FACSCONVERTTMCellQuest軟件(Becton Dickinson)來(lái)分析樣本。通過(guò)PI攝取確定的那些引起統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著水平的細(xì)胞死亡的抗體可被選擇作為誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抗體。
為了選擇誘導(dǎo)凋亡的抗體，可采用使用BT474細(xì)胞的膜聯(lián)蛋白結(jié)合分析。如前面的段落所討論培養(yǎng)BT474細(xì)胞并植入培養(yǎng)皿中。然后去除培養(yǎng)基，只用新鮮培養(yǎng)基或者含有10μg/ml單克隆抗體的培養(yǎng)基替換。在3天的孵育期后，用PBS洗滌單細(xì)胞層，用胰蛋白酶消化分離。然后如上討論離心細(xì)胞，重懸在Ca2+結(jié)合緩沖液中，并等分試樣到試管中用于細(xì)胞死亡分析。然后往試管中加入被標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白(如膜聯(lián)蛋白V-FTIC)(1μg/ml)?？捎肍ACSCANTM流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和FACSCONVERTTMCellQuest軟件(BectonDickinson)來(lái)分析樣本。那些相對(duì)于對(duì)照引起統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著水平的膜聯(lián)蛋白結(jié)合的抗體被選擇作為誘導(dǎo)凋亡的抗體。
除了膜聯(lián)蛋白結(jié)合分析，還可以采用BT474細(xì)胞進(jìn)行DNA染色分析。為了進(jìn)行該分析，已經(jīng)如前面兩段所述用目的抗體處理的BT474細(xì)胞與9μg/ml HOECHST 33342TM在37℃下孵育2小時(shí)，然后用MODFIT LTTM軟件(Verity Software House)在EPIC S ELITETM流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(CoulterCorporation)中進(jìn)行分析。通過(guò)該分析，誘導(dǎo)比未處理細(xì)胞高2倍或更高(優(yōu)選3倍或更高)的凋亡細(xì)胞百分比變化(達(dá)到100％凋亡細(xì)胞)的抗體被選作前凋亡(pro-apoptotic)抗體。
為了篩選結(jié)合到被目的抗體結(jié)合的ErbB2的一個(gè)表位上的抗體，可進(jìn)行常規(guī)的交叉-阻斷分析，例如被描述在“抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold SpringHarbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)”中的分析?？蛇x擇地或另外地，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行表位作圖(參見(jiàn)，如本文的附圖1A和1B)。
免疫偶聯(lián)物(immunoconjugate)本發(fā)明還涉及包含被偶聯(lián)到細(xì)胞毒性劑的抗體的免疫偶聯(lián)物，細(xì)胞毒性劑例如化學(xué)治療劑、毒素(例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的小分子毒素或經(jīng)酶催化后有活性的毒素，包括其片段和/或變體)或放射性同位素(即放射偶聯(lián)物)。
在生產(chǎn)這種免疫偶聯(lián)物中有用的化學(xué)治療劑已經(jīng)在上文被描述。本文還考慮了抗體和一種或多種小分子毒素，例如加利車(chē)霉素，美登素(maytansine)(美國(guó)專利號(hào)5,208,020)，trichothene，和CC1065的偶聯(lián)物。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體被偶聯(lián)到一個(gè)或多個(gè)美登素分子上(例如每個(gè)抗體約1-約10個(gè)美坦納生分子)。美登素可以，例如被轉(zhuǎn)化為May-SS-Me，其被還原為May-SH3，并與被修飾的抗體反應(yīng)(Chari et al.，Cancer Research，52127-131(1992))來(lái)生成美登木素生物堿抗體免疫偶聯(lián)物。
另一種目的免疫偶聯(lián)物包含被偶聯(lián)到一個(gè)或多個(gè)加利車(chē)霉素分子上的抗ErbB2抗體?？股氐募永?chē)霉素家族能夠在亞皮摩爾濃度產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂?？梢员皇褂玫募永?chē)霉素的結(jié)構(gòu)類似物包括，但是不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰-γ1I、PSAG和θI1(Hinman et al.，Cancer Research，533336-3342(1993)和Lode et al.，Cancer Research，582925-2928(1998))。還參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,714,586；5,712,374；5,264,586；和5,773,001，在此特別地引入作為參考。
可以被使用的經(jīng)酶催化有活性的毒素及其片段包括白喉A鏈，白喉毒素的非結(jié)合活性片段，外毒素A鏈(來(lái)自銅綠假單胞菌)，蓖麻蛋白A鏈，相思豆毒蛋白A鏈，莫迪素(modeccin)A鏈，α-八疊球菌，油桐蛋白，dianthin蛋白，垂序商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAP I，PAP II，和PAP-S)，苦瓜抑制劑，瀉果素，巴豆毒素，sapaonaria officinalis抑制劑，gelonin，mitogellin，restrictocin，酚霉素，依諾霉素和tricothecene。參見(jiàn)，例如1993年10月28日公開(kāi)的WO 93/21232。
本發(fā)明還進(jìn)一步考慮在抗體和具有溶核活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸內(nèi)切酶例如脫氧核糖核酸酶；DNase)之間形成的免疫偶聯(lián)物。
各種放射性同位素可以用于制備放射偶聯(lián)的抗ErbB2抗體。例子包括At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32和Lu的放射性同位素。
可以采用各種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來(lái)制備抗體與細(xì)胞毒性劑的偶聯(lián)物，這些偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫酚)丙酸鹽(SPDP)，琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸鹽，亞氨基硫雜環(huán)戊烷(iminothiolane)(IT)，亞氨酸酯的雙功能衍生物(例如dimethyl adipimidateHCL，活性酯(例如二琥珀酰亞胺基辛二酸鹽)，醛(例如戊二醛)，二-疊氮化合物(例如二(p-疊氮苯甲酰)己二胺)，二-重氮衍生物(例如二-(p-重氮鹽苯甲酰)-乙二胺，二異氰酸鹽(例如亞芐基2，6-二異氰酸鹽)，和二-活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻蛋白免疫毒素可以如Vitetta等，Science，2381098(1987)中所述進(jìn)行制備。14碳標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸偶聯(lián)到抗體上的示例性螯合劑。參見(jiàn)WO 94/11026。該接頭可以是便于細(xì)胞毒性藥物在細(xì)胞中釋放的可裂解的接頭。例如，可以采用酸不穩(wěn)定接頭，肽酶敏感的接頭，二甲基接頭或含有二硫化物的接頭(Chari et al.，Cancer Research，52127-131(1992))。
或者，包含抗ErbB2抗體和細(xì)胞毒性劑的融合蛋白可以通過(guò)如重組技術(shù)或肽合成來(lái)制備。
在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體被偶聯(lián)到一個(gè)在腫瘤預(yù)靶向中使用的“受體”(例如鏈霉抗生物素)上，其中抗體-受體偶聯(lián)物被施用給患者，接著使用清除劑從循環(huán)中去除未被結(jié)合的偶聯(lián)物，然后施用偶聯(lián)到細(xì)胞毒性劑(例如放射性核苷酸)上的“配基”(如抗生物素蛋白)。
抗體依賴的酶介導(dǎo)的前體藥物治療(ADEPT)本發(fā)明的抗體還可以被用于ADEPT之中，通過(guò)將抗體偶聯(lián)到激活前體藥物的酶上，該酶將前體藥物(如肽基化療劑，參見(jiàn)WO 81/01145)轉(zhuǎn)化為活性抗癌藥物。參見(jiàn)，例如WO 88/07378和美國(guó)專利號(hào)4,975,278。
可用于ADEPT的免疫偶聯(lián)物的酶組分包括任何能夠以將前體藥物轉(zhuǎn)化為其更有活性、細(xì)胞毒性的形式的形式作用于前體藥物的酶。
可用于本發(fā)明的方法的酶包括，但是不限于，用于將含有磷酸的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的堿性磷酸酶；用于將含有硫酸鹽的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的芳基硫酸酯酶；用于將無(wú)毒性的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為抗癌藥物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；蛋白酶，例如沙雷氏菌屬蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，羧肽酶和組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B和L)，可以用于將含肽前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物；D-丙氨酰羧肽酶，用于轉(zhuǎn)化含有D-氨基酸取代的前體藥物；糖裂解酶例如用于將糖基化的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸苷酶；用于將用β-內(nèi)酰胺衍生化的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的β-內(nèi)酰胺酶；和青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，用于將在氨基氮分別用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生化的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物?；蛘?，具有催化活性的抗體，在本領(lǐng)域也被稱作“抗體酶”(abzyme)，也可以被用于將本發(fā)明的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離的活性藥物(參見(jiàn)，例如Massey，Nature，328457-458(1987))?？贵w-抗體酶偶聯(lián)物可以如在此所描述被制備來(lái)將抗體酶遞送到腫瘤細(xì)胞群體中。
本發(fā)明的酶可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)被共價(jià)結(jié)合到抗ErbB2抗體上，例如使用上面討論的異雙功能交聯(lián)劑?；蛘撸梢圆捎帽绢I(lǐng)域熟知的重組DNA技術(shù)來(lái)構(gòu)建包含被連接到本發(fā)明的酶的至少一個(gè)功能性活性部分的至少本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合區(qū)的融合蛋白(參見(jiàn)，如Neuberger等，Nature，312604-608(1984)。
其他抗體修飾本文還考慮抗體的其他修飾。例如抗體可以被連接到各種各樣非蛋白聚合物之一上，如聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化烯或者聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。抗體還可以或者可選擇地被連接到一個(gè)和多個(gè)各種各樣的不同部分上，例如熒光標(biāo)記，具有已知電泳遷移率的部分或者能夠裂解特殊接頭分子的部分。
抗體還可以被誘捕到所制備的微囊體中，例如通過(guò)凝聚技術(shù)或者通過(guò)界面聚合(例如，分別為羥甲基纖維素或者明膠微囊體和poly-(methylmethacylate)微囊體)，在膠質(zhì)藥物遞送系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體，白蛋白微球體，微乳狀液，納米顆粒和納米膠囊)，或者在大分子乳液。這種技術(shù)被公開(kāi)在雷明頓藥物科學(xué)(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第16版，Oslo，A.，編輯，(1980)中。
在此公開(kāi)的抗ErbB2抗體還可以被配制成免疫脂質(zhì)體。含有抗體的脂質(zhì)體通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備，例如被描述在Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774030(1980)；美國(guó)專利4,485,045和4,544,545；和1997年10月23日公開(kāi)的WO 97/38731中。循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)的脂質(zhì)體被描述在美國(guó)專利5,013,556中。
特別有用的脂質(zhì)體可以采用包含卵磷脂、膽固醇和PEG-衍生磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物通過(guò)反相蒸發(fā)方法生成?？梢酝ㄟ^(guò)特定孔徑的濾器擠壓來(lái)獲得具有期望直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明的抗體的Fab′片段可以如Martin等，J.Biol.Chem.，257286-288(1982)所描述通過(guò)二硫化物交換反應(yīng)被偶聯(lián)到脂質(zhì)體上?；瘜W(xué)治療劑任選被包含在脂質(zhì)體中。參見(jiàn)Gabizon等，J.National CancerInst.，81(19)1484(1989)。
載體，宿主細(xì)胞和重組方法本發(fā)明還提供編碼抗體包括人源化的抗ErbB2抗體的分離核酸，包含核酸的載體和宿主細(xì)胞，和用于生產(chǎn)抗體的重組技術(shù)。
對(duì)于重組生產(chǎn)抗體，編碼抗體的核酸被分離和插入到可復(fù)制的載體中，用于進(jìn)一步克隆(DNA擴(kuò)增)或用于表達(dá)。采用常規(guī)方法(如通過(guò)采用能夠特異性地結(jié)合到編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因上的寡核苷酸探針)可以很容易分離和測(cè)序編碼單克隆抗體的DNA。許多抗體是可以獲得的。載體組分通常包括，但是不限于，下面的一種或多種信號(hào)序列，復(fù)制起點(diǎn)，一種或多種標(biāo)記基因，增強(qiáng)子元件，啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。
信號(hào)序列組分不僅可以直接地，而且還可以用具有異源多肽的融合多肽形式重組生產(chǎn)抗ErbB2抗體，異源多肽優(yōu)選為信號(hào)序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特定可裂解位點(diǎn)的其他多肽。所選擇的異源信號(hào)序列優(yōu)選是被宿主細(xì)胞識(shí)別和加工(即被信號(hào)肽酶斷裂)的序列。對(duì)于不識(shí)別和加工天然的抗ErbB2抗體的原核宿主細(xì)胞，信號(hào)序列被選自堿性磷酸酶、青霉素酶、1pp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)序列的組的原核信號(hào)序列取代。對(duì)于酵母分泌物，天然信號(hào)序列可以被如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、α因子前導(dǎo)序列(包括酵母和克魯維氏酵母菌屬α因子前導(dǎo)序列)，或者酸性磷酸酶前導(dǎo)序列，白色假絲酵母葡糖淀粉酶前導(dǎo)序列，或者WO 90/13646中描述的信號(hào)序列取代。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，可以獲得哺乳動(dòng)物信號(hào)序列以及病毒性分泌前導(dǎo)序列，例如皰疹單純gD信號(hào)序列。
這種前體區(qū)域的DNA可以讀框的形式被連接到編碼抗ErbB2抗體的DNA上。
復(fù)制起點(diǎn)組分表達(dá)和克隆載體都含有核酸序列，該核酸序列使得載體在一種或多種所選擇的宿主細(xì)胞中是可復(fù)制的。一般地，在克隆載體中，這種序列是使載體能夠獨(dú)立于宿主染色體DNA復(fù)制的序列，包括復(fù)制起點(diǎn)或者自動(dòng)復(fù)制序列。這種序列在各種細(xì)菌、酵母和病毒中是已知的。質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2μ質(zhì)粒起點(diǎn)適合于酵母，而各種病毒起點(diǎn)(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體是有用的。一般地，復(fù)制組分的起點(diǎn)對(duì)于哺乳動(dòng)物表達(dá)載體來(lái)說(shuō)不是必需的(SV40起點(diǎn)僅僅是因?yàn)槠浜性缙趩?dòng)子而通常被使用)。
選擇基因組分表達(dá)和克隆載體可能含有選擇基因，也稱作選擇標(biāo)記。典型的選擇基因編碼蛋白，該蛋白(a)賦予抗生素或其他毒性，例如氨芐青霉素，新霉素，氨甲蝶呤或四環(huán)素，(b)補(bǔ)體營(yíng)養(yǎng)缺陷，或者(c)提供不能從復(fù)合培養(yǎng)基中獲得的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)成分，例如為芽胞桿菌編碼D丙氨酸消旋酶的基因。
選擇方案的一個(gè)例子采用藥物來(lái)阻滯宿主細(xì)胞生長(zhǎng)。那些成功地用異源基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生產(chǎn)賦予藥物抗性的蛋白，從而在選擇方案中存活。這種顯性選擇的例子采用藥物新霉素，霉酚酸和潮霉素。
適合用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)記的另一個(gè)例子是那些能鑒定細(xì)胞的選擇標(biāo)記，這些細(xì)胞具有攝取抗ErbB2抗體核酸，例如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和-II，優(yōu)選為靈長(zhǎng)類金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶等的能力。
例如，用DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞最初通過(guò)在含有氨甲蝶呤(Mtx)、DHFR的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所有轉(zhuǎn)化體來(lái)鑒定。當(dāng)采用野生型DHFR時(shí)，合適的宿主細(xì)胞是缺乏DHFR活性的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。
此外，用編碼抗ErbB2的抗體的DNA序列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(特別是含有內(nèi)源DHFR的野生型宿主)，野生型DHFR蛋白和其他可選擇標(biāo)記，例如氨基糖苷3′-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)，可以通過(guò)在含有選擇試劑的培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)選擇可選擇標(biāo)記，例如氨基糖苷抗生素，例如卡那霉素、新霉素或G418。參見(jiàn)美國(guó)專利4,965,199。
用于酵母中的合適選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，28239(1979))。trp1基因提供一種選擇缺乏在色氨酸中生長(zhǎng)的能力的酵母突變菌株的選擇標(biāo)記，例如，ATCC No.44076或PEP4-1。Jones，Genetics，8512(1977)。在酵母宿主細(xì)胞基因組中存在trp1損傷，提供用于通過(guò)在缺乏色氨酸時(shí)的生長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。類似地，Leu2缺陷的酵母菌株(ATCC 20，622或38，626)用攜帶Leu2基因的已知質(zhì)?；パa(bǔ)。
此外，衍生自1.6μm環(huán)狀質(zhì)粒pKD1的載體可以被用于克魯維氏酵母的轉(zhuǎn)化。可選擇地，用于大規(guī)模生產(chǎn)重組小牛凝乳酶的表達(dá)系統(tǒng)被報(bào)道用于乳克魯維氏酵母(K.lactis)。Van den Berg，Bio/Technology，8135(1990)。用于通過(guò)工業(yè)用克魯維氏酵母菌株分泌成熟重組人血清白蛋白的穩(wěn)定的多拷貝表達(dá)載體也已經(jīng)被公開(kāi)。Fleer等，Bio/Technology，9968-975(1991)。
啟動(dòng)子組分表達(dá)和克隆載體通常含有被宿主生物體識(shí)別的啟動(dòng)子，并且啟動(dòng)子被可操作地連接到抗ErbB2抗體核酸上。適合用于原核宿主的啟動(dòng)子包括phoA啟動(dòng)子、β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動(dòng)子特性和雜合啟動(dòng)子，例如tac啟動(dòng)子。但是，其他已知細(xì)菌啟動(dòng)子也是合適的。用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子也將含有被可操作地連接到編碼抗ErbB2抗體的DNA上核糖體結(jié)合序列(SD序列)。
真核細(xì)胞的啟動(dòng)子序列是已知的。實(shí)際上所有真核基因具有富含AT的區(qū)域，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約25-30個(gè)堿基處。另一種存在于許多基因的轉(zhuǎn)錄起始上游的70-80個(gè)堿基處的序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3′端為AATAAA序列，其可作為將聚腺苷酸尾加到編碼序列的3′端的信號(hào)。所有這些序列被合適地插入到真核表達(dá)載體中。
用于酵母宿主的合適起始序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖分解酶的啟動(dòng)子，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。
其他酵母啟動(dòng)子，其是具有受生長(zhǎng)條件控制的額外轉(zhuǎn)錄優(yōu)勢(shì)的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，是醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動(dòng)子區(qū)。用于酵母表達(dá)的合適載體和啟動(dòng)子進(jìn)一步被描述在EP 73,657中。酵母增強(qiáng)子還有利地與酵母啟動(dòng)子一起使用。
抗ErbB2抗體從哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的載體加以轉(zhuǎn)錄是受例如獲自病毒基因組的啟動(dòng)子控制，這些病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒和最優(yōu)選的猿猴病毒40(SV40)，來(lái)自異源哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子控制，例如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子，來(lái)自熱休克啟動(dòng)子的控制，只要該啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。
SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子方便地作為SV40的限制性片段獲得，該片段還含有SV40病毒的復(fù)制起點(diǎn)。人巨細(xì)胞病毒的即刻早期啟動(dòng)子便利地作為HindIII E限制性片段獲得。采用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動(dòng)物宿主中表達(dá)DNA的系統(tǒng)被公開(kāi)在美國(guó)專利4,419,446中。該系統(tǒng)的改進(jìn)在美國(guó)專利4,601,978中被描述。還可以參見(jiàn)Reyes等，Nature，297598-601(1982)關(guān)于在小鼠細(xì)胞中在來(lái)自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動(dòng)子控制下表達(dá)人β-干擾素cDNA的描述?？蛇x擇地，勞斯肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列可以被用作啟動(dòng)子。
增強(qiáng)子元件組分經(jīng)常通過(guò)將增強(qiáng)子序列插入載體來(lái)提高通過(guò)高等真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄編碼本發(fā)明的抗ErbB2抗體的DNA。目前已經(jīng)知曉許多來(lái)自哺乳動(dòng)物基因的增強(qiáng)子序列(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)。然而，典型地可以使用來(lái)自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。該例子包括位于復(fù)制起點(diǎn)的晚期側(cè)(bp 100-270)的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、位于復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子，和腺病毒增強(qiáng)子。還可以參見(jiàn)Yaniv，Nature，29717-18(1982)關(guān)于激活真核啟動(dòng)子的增強(qiáng)元件的描述。增強(qiáng)子還可以被剪接到載體的抗ErbB2抗體編碼序列的5′或3′位置上，但是優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5′位置上。
轉(zhuǎn)錄終止組分用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲(chóng)、植物、動(dòng)物、人或來(lái)自其他多細(xì)胞生物體的有核細(xì)胞)中的表達(dá)載體也含有轉(zhuǎn)錄終止和穩(wěn)定mRNA所需的序列。這種序列通常從真核或病毒DNA或cDNA的5′端和，偶爾從3′端，非翻譯區(qū)獲得。這些區(qū)域含有在編碼抗ErbB2抗體的mRNA的非翻譯部分作為多聚腺苷酸片段被轉(zhuǎn)錄的核苷酸片段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止組分是牛生長(zhǎng)激素多聚腺苷酸區(qū)域。參見(jiàn)W094/11026以及其中描述的表達(dá)載體。
宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化用于在載體中克隆或表達(dá)DNA的合適宿主細(xì)胞在此是上文描述的原核細(xì)胞、酵母或高等真核細(xì)胞。用于該目的合適原核生物包括真細(xì)菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性生物體，例如腸細(xì)菌屬(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌屬，如大腸桿菌，腸桿菌屬(Enterobacter)，歐文氏桿菌屬(Erwinia)，克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)，變形桿菌屬(Proteus)，沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)，例如，鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌屬(Serratia)，例如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescans)，和志賀菌屬(Shigella)，以及芽胞桿菌(Bacilli)例如枯草芽孢桿菌(B.Subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.Licheniformis)(例如1989年4月12日公開(kāi)在DD 266,710中的地衣芽孢桿菌41P)，假單胞菌(Pseudomonas)例如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)，和鏈霉菌(Streptomyces)。雖然其他菌株例如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31，537)和大腸桿菌W3110(ATCC 27，325)是合適的，優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31，446)。這些例子是說(shuō)明性的，而不是限制性的。
除了原核微生物，真核的微生物例如絲狀真菌或者酵母是抗ErbB2抗體編碼載體的合適克隆或表達(dá)宿主。釀酒酵母或者通常的面包(baker)酵母最普遍地被用于低等真核宿主微生物中。但是，大量其他屬、種和菌株也是通常獲得并在此有用的，例如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維氏酵母(Kluyveromyces)宿主例如乳克魯維氏酵母、脆壁克魯維氏酵母(ATCC 12，424)、保加利亞克魯維氏酵母(ATCC 16，045)、威克曼氏克魯維氏酵母(ATCC24，178)、K.waltii(ATCC 56，500)、果蠅克魯維氏酵母(ATCC 36，906)、耐熱克魯維氏酵母K.thermotolerans和馬克斯克魯維氏酵母；yarrowia(EP 402，226)；巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)(EP183，070)；假絲酵母屬(Candida)；Trichoderma reesia(EP 244，234)；粗糙鏈胞霉(Neurosporacrassa)；許旺氏酵母例如西方許旺氏酵母；和絲狀真菌例如脈胞菌(Neurospora)，青霉菌(Penicillium)，Tolypocladium，和曲霉菌(Aspergillus)宿主例如構(gòu)巢曲霉和黑曲霉(A.niger)。
用于表達(dá)糖基化的抗ErbB2抗體的合適宿主來(lái)自多細(xì)胞生物體。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的例子包括植物和昆蟲(chóng)細(xì)胞。許多來(lái)自例如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛蟲(chóng))、埃及伊蚊(蚊子)、白紋伊蚊(蚊子)、黑腹果蠅(果蠅)和家蠶(Bombyx mori)的桿狀病毒菌株和突變體以及相應(yīng)允許昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞已經(jīng)被確定。各種用于轉(zhuǎn)染的病毒株是公眾可以獲得的，例如苜蓿銀斜紋夜蛾(Autographa califomica)NPV的L-1變體和家蠶NPV的Bm-5株，而且這些病毒可以被用作按照本發(fā)明的病毒，特別地用于草地夜蛾細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。
棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽?；?、西紅柿和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可以被用作宿主。
但是，脊椎動(dòng)物細(xì)胞是最令人感興趣的，在培養(yǎng)物中繁殖脊椎動(dòng)物細(xì)胞(組織培養(yǎng))已經(jīng)是常規(guī)操作。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的例子是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎腎系(293或在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的亞克隆293細(xì)胞，Graham等，J.Gen Virol.，3659(1977))；幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980))；小鼠滋養(yǎng)細(xì)胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23243-251(1980))；猴腎細(xì)胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細(xì)胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝細(xì)胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細(xì)胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細(xì)胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細(xì)胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.，38344-68(1982))；MRC 5細(xì)胞；ES4細(xì)胞；和人肝細(xì)胞瘤系(Hep G2)。
宿主細(xì)胞用上面描述的用于抗ErbB2抗體生產(chǎn)的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化，并且培養(yǎng)在常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基被改進(jìn)以適合誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或者擴(kuò)增編碼期望序列的基因。
培養(yǎng)宿主細(xì)胞用于生產(chǎn)本發(fā)明的抗ErbB2抗體的宿主細(xì)胞可以在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。商業(yè)上可以購(gòu)買(mǎi)得到的培養(yǎng)液例如Ham′s F10(Sigma)、Minimal EssentialMedium((MEM)，(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco′s Modified Eagle′sMedium((DMEM)，Sigma)都適合用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。此外，任何在Ham等，Meth.Enz.，5844(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.，102255(1980)，美國(guó)專利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國(guó)專利Re.30,985中描述的培養(yǎng)基可以被用作宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基。任何這些培養(yǎng)基可以必要地添加激素和/或其他生長(zhǎng)因子(例如胰島素、運(yùn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)、鹽(例如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCIN藥物)、微量元素(定義為通常以微摩爾范圍的最終濃度存在的無(wú)機(jī)化合物)，和葡萄糖或相當(dāng)?shù)哪芰縼?lái)源。還可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的合適濃度的任何其他需要的添加劑。培養(yǎng)條件，例如溫度、pH等是先前用于被選擇來(lái)表達(dá)的宿主的那些條件，并且對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯然的。
抗ErbB2抗體的純化當(dāng)采用重組技術(shù)時(shí)，抗體在細(xì)胞內(nèi)、周質(zhì)間隙中生成，或者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果在細(xì)胞內(nèi)生成抗體，作為第一步，例如，通過(guò)離心或者超濾去除顆粒碎片，宿主細(xì)胞或者裂解碎片。Carter等，Bio/Technology，10163-167(1992)描述用于分離抗體的操作，抗體被分泌到大腸桿菌的周質(zhì)間隙。簡(jiǎn)而言之，在存在醋酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)時(shí)，解凍細(xì)胞糊超過(guò)約30分鐘?？梢酝ㄟ^(guò)離心去除細(xì)胞碎片。當(dāng)抗體被分泌到培養(yǎng)基中時(shí)，通常首先采用商業(yè)上可購(gòu)買(mǎi)得到的蛋白質(zhì)濃縮濾器，例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元，濃縮得自該表達(dá)系統(tǒng)的上清液。在任何先前的步驟中可以包括蛋白酶抑制劑例如PMSF來(lái)抑制蛋白質(zhì)水解，也可以包括抗生素來(lái)防止外來(lái)的污染物的生長(zhǎng)。
制備自細(xì)胞的抗體組合物可以被純化，采用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親合層析，親合層析是優(yōu)選的純化技術(shù)。蛋白A作為親合配基的合適程度取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的種類和同種型。蛋白A可以被用于純化基于人γ1、γ2或γ4重鏈的抗體(Lindmark等，J.Immunol.Meth.，621-13(1983))。蛋白G被推薦用于所有小鼠的同種型和人γ3(Guss等，EMBO J，515671575(1986))。親合配基附著的基質(zhì)最普遍為瓊脂糖，但是也可以使用其他基質(zhì)。機(jī)械上穩(wěn)定的基質(zhì)例如控制孔的玻璃或者多聚(苯乙烯二乙烯)苯，具有比瓊脂糖所能達(dá)到的更高的流速和更短的處理時(shí)間。當(dāng)抗體包含CH3結(jié)構(gòu)域時(shí)，Bakerbond ABXTM樹(shù)脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)被用于純化。根據(jù)回收的抗體，還可以采用其他用于蛋白質(zhì)純化的技術(shù)，例如在離子交換柱上進(jìn)行分餾、乙醇沉淀、反相HPLC、在硅石上進(jìn)行層析，在肝素瓊脂糖上層析，在陰離子或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(例如多聚天冬氨酸柱)上層析，色譜聚焦，SDS-PAGE，以及硫酸胺沉淀。
在初步純化步驟之后，包含目標(biāo)抗體和污染物的混合物進(jìn)行低pH的疏水相互作用層析，采用pH為約2.5-4.5之間的洗脫緩沖液，優(yōu)選在低鹽濃度下進(jìn)行(例如從約0-0.25M鹽)。
藥物制劑用于根據(jù)本發(fā)明的抗體的治療制劑通過(guò)將具有期望純度的抗體與任選的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合被制備來(lái)用于以凍干制劑形式或者水溶液形式進(jìn)行存儲(chǔ)。(雷明頓藥物科學(xué)(Remington′s PharmaceuticalSciences)第16版，Osol，A.編輯(1980))，可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所用的劑量和濃度下對(duì)于受者來(lái)說(shuō)是無(wú)毒的，并且包括緩沖液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苯基氯化銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯胺；芐乙胺；苯酚，丁基或苯甲醇；烷基對(duì)羥基苯甲酸酯例如甲基或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間-甲苯酚)；小分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白，明膠或者免疫球蛋白；親水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑例如EDTA；糖例如蔗糖，甘露糖醇，海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子(salt-forming counter-ions)例如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如Zn蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。優(yōu)選的凍干抗ErbB2抗體制劑被描述在WO 97/04801中，特別地在此引入作為參考。
本文的制劑還可以含有受處理的特定適應(yīng)癥所需的一種以上活性化合物，優(yōu)選是那些具有不會(huì)相互產(chǎn)生不利影響的互補(bǔ)活性的化合物。例如，期望在一個(gè)制劑中還進(jìn)一步提供結(jié)合EGFR，ErbB2(例如結(jié)合到ErbB2的不同表位上的抗體)、ErbB3、ErbB4或血管上皮因子(VEGF)的抗體。可選擇地或另外地，該組合物還進(jìn)一步可以包含化學(xué)治療劑、細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)抑制劑、抗激素劑、EGFR靶向藥物、抗血管生成劑，和/或心臟保護(hù)劑。這種分子適合以有效用于所需目的的含量而結(jié)合存在。
在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)或者在大分子乳劑中，活性成分還可以被包裹在例如通過(guò)凝聚技術(shù)或者通過(guò)界面聚合制備的微囊中，例如分別為羥甲基纖維素或者明膠微囊和poly-(methylmethacylate)微囊。這種技術(shù)被描述在雷明頓藥物科學(xué)第16版，Osol，A.編輯，(1980)中。
可以制備緩釋制備物。緩釋制備物的合適例子包括含有抗體的固體疏水性聚合物的半通透性基質(zhì)，這種基質(zhì)是成形物品的形式，例如，膜或者微囊。緩釋基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如多聚(2-羥基乙基異丁烯酸)或者多聚(乙烯醇))、聚交酯(美國(guó)專利3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基L-谷氨酰胺的共聚物、不可降解的乙烯乙烯基乙酸、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和leuprolide acetate組成的可注射微球)，和多聚D-(-)-3-羥基丁酸。
用于體內(nèi)施用的制劑必須被滅菌。這很容易地通過(guò)滅菌濾膜過(guò)濾來(lái)實(shí)現(xiàn)。
用抗ErbB2的抗體治療可以預(yù)期，按照本發(fā)明，抗ErbB2抗體可以被用于治療各種疾病或紊亂。示例性的癥狀或紊亂包括良性的或惡性的腫瘤；白血病和淋巴惡性腫瘤；其他的紊亂例如神經(jīng)元的、神經(jīng)膠質(zhì)的、星形膠質(zhì)細(xì)胞的、下丘腦的、腺的、巨噬細(xì)胞的、上皮的、基質(zhì)的、囊胚的、炎癥性的、血管生成的和免疫學(xué)的紊亂。優(yōu)選地，抗ErbB2的抗體被用于治療被鑒定為對(duì)用這種抗體通過(guò)本文公開(kāi)的方法治療響應(yīng)的腫瘤。
一般地，將被治療的疾病或紊亂是癌癥。在此將被治療的癌癥的例子包括，但是不限于，癌、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病或者淋巴惡性腫瘤。這種癌癥的更加特別的例子包括鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)，肺癌包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌，腹膜癌，肝細(xì)胞癌，胃的或者胃癌包括胃腸癌，胰腺癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細(xì)胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜或子宮癌，唾液腺癌，腎臟或腎癌，前列腺癌，陰門(mén)癌，甲狀腺癌，肝癌，肛門(mén)癌，陰莖癌，以及頭部和頸部癌。優(yōu)選地，被治療的癌癥被鑒定為對(duì)用抗ErbB2的抗體處理響應(yīng)，該響應(yīng)是基于腫瘤樣本中對(duì)HER2/HER3和/或HER2/HER1異二聚體的鑒定或者ErbB受體的磷酸化。其中HER2/HER3和/或HER2/HER1異二聚體形成和/或ErbB受體磷酸化期望被檢測(cè)的特定的一組癌癥包括，但是不限于肺乳腺癌、肺癌、卵巢癌，包括進(jìn)展的、難治的或者周期性發(fā)生的卵巢癌、前列腺癌，結(jié)腸直腸癌和胰腺癌。
癌通常包含表達(dá)ErbB2的細(xì)胞，使得此處的抗ErbB2抗體能夠結(jié)合到癌上。雖然癌可以被表征為過(guò)度表達(dá)ErbB2受體，本申請(qǐng)進(jìn)一步提供一種用于治療不被認(rèn)為是過(guò)度表達(dá)ErbB2的癌癥的方法。為了確定癌中的ErbB2表達(dá)，可以采用各種診斷的/預(yù)后的分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)IHC分析ErbB2過(guò)度表達(dá)，例如采用HERCEPTEST(Dako)。來(lái)自腫瘤活組織檢查的石蠟包埋的組織切片可以被用于IHC分析，并給予如下的ErbB2蛋白質(zhì)染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)分值0沒(méi)有觀察到染色或者在少于10％的腫瘤細(xì)胞中觀察到膜染色。
分值1+在超過(guò)10％腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到淺的/剛剛可察覺(jué)的膜染色。該細(xì)胞僅部分膜被染色。
分值2+在超過(guò)10％的腫瘤細(xì)胞中觀察到微弱到中度的完整膜染色。
分值3+在超過(guò)10％的腫瘤細(xì)胞中觀察到中度到強(qiáng)烈的完整膜染色。
那些在ErbB2過(guò)度表達(dá)評(píng)價(jià)中具有0或1+分值的腫瘤可被表征為不過(guò)度表達(dá)ErbB2，而那些具有2+或3+分值的腫瘤可被表征為過(guò)度表達(dá)ErbB2。
可選擇地或者另外地，F(xiàn)ISH分析例如INFORMTM(Ventana，Arizona銷售)或PATHVISIONTM(Vysis，Illinois)可以在福爾馬林固定、石蠟包埋的腫瘤組織上進(jìn)行來(lái)確定腫瘤中ErbB2的過(guò)度表達(dá)(如果有)的程度。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該癌癥可以是表達(dá)(可能，但是不是必需，過(guò)度表達(dá))EGFR的癌癥。表達(dá)/過(guò)度表達(dá)EGFR的癌癥的例子包括鱗狀細(xì)胞癌癥(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌癥)，肺癌包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌，腹膜癌，肝細(xì)胞癌，胃的或胃癌包括胃腸癌，胰腺癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細(xì)胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜或子宮癌，唾液腺癌，腎或者腎的癌，前列腺癌，陰門(mén)癌，甲狀腺癌，肝癌，肛門(mén)癌，陰莖癌以及頭部和頸部癌癥。
本發(fā)明特別適合用于鑒定乳腺癌、前列腺癌，例如閹割抗性前列腺癌(CRPC)，以及卵巢癌患者，這些患者可能對(duì)用抗HER2抗體治療產(chǎn)生良好的應(yīng)答，抗HER2抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化，例如單克隆抗體2C4或rhuMAb 2C4。
在此治療的癌癥可以是特征為ErbB受體例如EGFR過(guò)度活化的癌癥。這種過(guò)度活化可能是由于ErbB受體或ErbB配基過(guò)度表達(dá)或者產(chǎn)量升高。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以進(jìn)行診斷的或者預(yù)后的分析來(lái)確定患者的癌癥其特征是否為ErbB受體過(guò)度活化。例如，可以確定癌中ErbB基因擴(kuò)增和/或ErbB受體過(guò)度表達(dá)。用于確定這種擴(kuò)增/過(guò)度表達(dá)的各種分析在本領(lǐng)域是可以獲得的，并且包括上面描述的IHC、FISH和脫落抗原(shedantigen)分析。可選擇地或者另外地，腫瘤中或與腫瘤相關(guān)的ErbB配基的含量，例如TGF-a，可以按照已知的操作來(lái)確定。這種分析可以檢測(cè)被檢測(cè)的樣本中的蛋白質(zhì)和/或編碼蛋白質(zhì)的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以采用免疫組織化學(xué)(IHC)確定腫瘤中的ErbB配基水平；參見(jiàn)例如，Scher等，Clin.Cancer Research，1545-550(1995)?？蛇x擇的或者另外地，可以例如通過(guò)FISH、DNA印跡或PCR技術(shù)評(píng)價(jià)被檢測(cè)的樣本中的ErbB配基編碼核酸的水平。
此外ErbB受體或ErbB配基過(guò)度表達(dá)或者擴(kuò)增可以采用體內(nèi)診斷分析來(lái)評(píng)價(jià)，例如通過(guò)施用結(jié)合到將被檢測(cè)的分子上并且用可檢測(cè)標(biāo)記(例如放射性同位素)標(biāo)引的分子(例如抗體)，并從外部掃描患者來(lái)對(duì)標(biāo)記定位。
當(dāng)被治療的癌癥是不依賴于激素的癌癥時(shí)，腫瘤中激素(例如雄性激素)和/或其相關(guān)受體的表達(dá)可以采用各種可以獲得的分析方法中的任何方法來(lái)評(píng)價(jià)，例如上面所描述的方法。可選擇地或者另外地，患者可能被診斷為患有不依賴激素的癌癥，其中這些癌癥不再對(duì)抗雄性激素的治療有反應(yīng)。
在一些實(shí)施方案中，包含被偶聯(lián)到細(xì)胞毒性劑上的抗ErbB2抗體的免疫偶聯(lián)物被施用給患者。優(yōu)選地，免疫偶聯(lián)物和/或其所結(jié)合的ErbB2蛋白被細(xì)胞內(nèi)化，導(dǎo)致免疫偶聯(lián)物殺死其所結(jié)合的癌細(xì)胞的治療功效被提高。在優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性劑靶向或干擾癌細(xì)胞中的核酸。這種細(xì)胞毒性劑的例子包括美登木素生物堿、加利車(chē)霉素、核糖核酸酶和DNA核酸內(nèi)切酶。
在特定實(shí)施方案中，被施用的抗體是rhuMAb 2C4，或其功能性等價(jià)物。RhuMAb 2C4是基于人IgGl骨架序列的人源化的單克隆抗體，由兩條重鏈(449個(gè)殘基)和兩條輕鏈(214個(gè)殘基)組成。RhuMAb 2C4在輕鏈和重鏈的表位結(jié)合區(qū)域上顯著地區(qū)別于另一抗HER2抗體HERCEPTIN(Trastuzumab)。結(jié)果，rhuMAb 2C4結(jié)合到HER2上的完全不同的表位上。本發(fā)明提供用于檢測(cè)對(duì)用rhuMAb 2C4或其功能性等價(jià)物處理響應(yīng)的癌癥的靈敏的方法。應(yīng)當(dāng)指出，這種對(duì)rhuMAb 2C4處理響應(yīng)的癌癥不要求是過(guò)度表達(dá)HER2。
按照已知的方法，例如靜脈內(nèi)給藥，例如大藥丸或者在一段時(shí)間內(nèi)通過(guò)連續(xù)灌注，通過(guò)肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)(intracerobrospinal)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑液內(nèi)、殼膜內(nèi)、口服、局部或者吸入路徑將抗ErbB2抗體或免疫偶聯(lián)物施用給人類患者。靜脈內(nèi)或皮下施用抗體是優(yōu)選的。
其他的治療方案可以與施用抗ErbB2抗體組合。組合施用包括共施用，采用分離的制劑或者單一的藥物制劑，以及以任何順序的連續(xù)施用，其中優(yōu)選存在一段兩種(或全部)的活性試劑同時(shí)產(chǎn)生其生物學(xué)活性的時(shí)期。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，患者用兩種不同的抗ErbB2抗體治療。例如，患者可以用阻斷ErbB受體的配基活化的第一抗ErbB2抗體或者具有單克隆抗體2C4的生物學(xué)特征的抗體，以及抑制生長(zhǎng)的第二抗ErbB2抗體(例如HERCEPTIN)或誘導(dǎo)過(guò)度表達(dá)ErbB2的細(xì)胞凋亡的抗ErbB2抗體(例如，7C2，7F3或其人源化變體)處理。優(yōu)選地，這種組合治療方法導(dǎo)致協(xié)同的治療作用。例如，可以用HERCEPTIN治療患者，然后用rhuMAb 2C4治療，例如當(dāng)患者對(duì)HERCEPTIN治療沒(méi)有反應(yīng)時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，患者首先用rhuMAb 2C4治療，然后接受HERCEPTIN治療。在還有另一個(gè)實(shí)施方案中，患者可以同時(shí)用rhuMAb 2C4和HERCEPTIN治療。
還期望將施用抗ErbB2抗體或多個(gè)抗體，與施用針對(duì)另一種腫瘤相關(guān)抗原的抗體組合。在這種情況下，其他抗體可以例如結(jié)合EGFR、ErbB3、ErbB4或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。
在一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的處理包括組合施用抗ErbB2抗體(或者多個(gè)抗體)以及一種或多種化療劑或者生長(zhǎng)抑制劑，包括共施用不同化學(xué)治療劑的混合物，優(yōu)選的化療劑包括優(yōu)選的化療劑包括紫杉烷二萜(taxane)(例如泰素和多西他賽)和/或蒽環(huán)霉素抗生素。這種化療劑的制備和劑量方案可以按照生產(chǎn)商推薦或者如通過(guò)熟練技術(shù)人員經(jīng)驗(yàn)性確定來(lái)使用。用于這種化療劑的制備和劑量方案也被描述在Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)中。
抗體可以以這種抗激素化合物的已知?jiǎng)┝颗c抗激素化合物組合；例如抗雌激素化合物如他莫西芬；抗孕酮如奧那斯酮(參見(jiàn)EP 616812)；或抗雄性激素例如氟他胺。當(dāng)被治療的癌癥是不依賴于激素的癌癥時(shí)，患者可以先進(jìn)行抗激素治療，在癌癥變?yōu)榧に夭灰蕾嚭?，給患者施用抗ErbB2抗體(以及任選地在此所描述的其他試劑)。
有時(shí)，給患者共施用心臟保護(hù)劑(來(lái)防止或者降低與治療相關(guān)的心肌功能障礙)或者一種或多種細(xì)胞因子是有益的。還可以共施用EGFR靶向藥物或者抗血管生成劑。除了上述治療方案外，可以對(duì)患者手術(shù)去除癌細(xì)胞和/或放射治療。
在此抗ErbB2抗體還可以與EGFR靶向的藥物組合，這些藥物如在定義部分中討論的會(huì)產(chǎn)生互補(bǔ)的、和潛在的協(xié)同治療作用的那些藥物。
可以與抗體組合的其他藥物的例子包括化療劑，例如卡鉑、紫杉烷二萜(taxane)(例如泰素或多西他賽)、吉西他濱、失碳長(zhǎng)春堿、順鉑、奧沙利鉑，或任何這些藥物的組合例如卡鉑/多西他賽；其他的抗HER2抗體(例如生長(zhǎng)抑制性抗HER2抗體，例如HERCEPTIN，或誘導(dǎo)凋亡的抗HER2抗體，例如7C2或7F3，包括其人源化的或親合成熟的變體)；法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑；抗血管生成劑(例如，抗VEGF抗體)；EGFR靶向藥物(例如，C225或ZD1839)；細(xì)胞因子(例如，IL-2、IL-12、G-CSF或GM-CSF)；或上面這些的組合。
任何上述的共施用的試劑的適合劑量是目前使用的那些，并且由于試劑和和抗ErbB2抗體的組合作用(協(xié)同作用)，可以被降低。
對(duì)于疾病的預(yù)防或治療，適合的抗體劑量將取決于如上所定義的被治療的疾病的類型，無(wú)論抗體被施用以用于預(yù)防或治療目的的疾病的嚴(yán)重程度和進(jìn)程，先前的治療、患者的病史和對(duì)抗體的反應(yīng)，以及主治醫(yī)生的判斷?？贵w被一次或者經(jīng)過(guò)一系列治療被合理地施用給患者。根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重性，約1μg/kg到15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗體是施用給患者的起始候選劑量，無(wú)論是，例如，通過(guò)一次或多次分開(kāi)施用，或者通過(guò)連續(xù)灌注。典型的日劑量可以在1μg/kg到100mg/kg或更高的范圍內(nèi)，取決于上面提及的因素。對(duì)于在數(shù)天或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)重復(fù)施用，根據(jù)癥狀，持續(xù)進(jìn)行治療直到產(chǎn)生期望的對(duì)疾病的抑制。優(yōu)選的抗體劑量將在約0.05mg/kg到約10mg/kg范圍內(nèi)。因此，可以給患者施用一個(gè)或多個(gè)約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的劑量(或者它們的任意組合)。這種劑量可以被間斷地施用，例如每周或每三周(例如，使得患者接受約2個(gè)到約20個(gè)，例如約6個(gè)劑量的抗ErbB2抗體)。施用起始的較高的載入劑量，接著施用一個(gè)或多個(gè)較小的劑量。示例性的劑量方案包括施用約4mg/kg的起始載入劑量，接著約2mg/kg抗ErbB2抗體的每周維持劑量。但是，其他劑量方案也是有用的。這種治療的進(jìn)展很容易通過(guò)常規(guī)技術(shù)和分析方法來(lái)監(jiān)控。
在特定實(shí)施方案中，rhuMAb 2C4以420mg的固定劑量(相當(dāng)于70kg體重的個(gè)體6mg/kg的劑量)被每三周施用。治療以較高的載入劑量開(kāi)始(例如840mg，相當(dāng)于12mg/kg體重)以更加迅速地達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)的血清濃度。特定的劑量方案也被提供在下面的實(shí)施例中。
除了將抗體蛋白施用給患者，本申請(qǐng)還考慮了通過(guò)基因治療來(lái)施用抗體。這種施用編碼抗體的核酸包括在“施用治療有效量的抗體”的表述中。參見(jiàn)，例如1996年3月14日公開(kāi)的WO 96/07321，其涉及使用基因治療來(lái)產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)抗體。
有兩種主要方法來(lái)將核酸(優(yōu)選被含在載體中)體內(nèi)和回體(ex vivo)地導(dǎo)入患者細(xì)胞中；對(duì)于體內(nèi)遞送，核酸被直接注射給患者，通常在需要抗體的部位。對(duì)于回體治療，患者細(xì)胞被取出，將核酸導(dǎo)入到這些被分離的細(xì)胞中，被修飾的細(xì)胞被直接地或者例如被包囊在被植入患者中的多孔膜中，施用給患者，(參見(jiàn)例如，美國(guó)專利4,892,538和5,283,187)。有各種技術(shù)可以用于將核酸導(dǎo)入活細(xì)胞中。根據(jù)核酸被體外轉(zhuǎn)化到培養(yǎng)細(xì)胞或者體內(nèi)轉(zhuǎn)化到預(yù)期宿主的體內(nèi)細(xì)胞中，這些技術(shù)是不同的。適合用于在體外將核酸轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的技術(shù)包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、微注射、細(xì)胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸鈣沉淀方法等。用于基因回體遞送的常用載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
普遍優(yōu)選的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒載體(例如腺病毒，單純皰疹I(lǐng)病毒或者腺伴隨病毒)轉(zhuǎn)染和以脂質(zhì)為基礎(chǔ)的系統(tǒng)(用于基因的脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移的有用脂質(zhì)是，例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)。在某些情況下，期望用靶向目標(biāo)細(xì)胞的試劑提供核酸來(lái)源，例如特異于細(xì)胞表面膜蛋白或者目標(biāo)細(xì)胞的抗體，目標(biāo)細(xì)胞的受體的配基等。當(dāng)采用脂質(zhì)體時(shí)，結(jié)合到與細(xì)胞內(nèi)吞作用相關(guān)的細(xì)胞表面膜蛋白的蛋白可以被用于靶向和/或方便攝取，例如趨向(tropic)特定細(xì)胞類型的衣殼蛋白或其片段，在循環(huán)中進(jìn)行內(nèi)在化的蛋白質(zhì)的抗體，和靶向細(xì)胞內(nèi)定位和增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)。受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的技術(shù)被描述，例如在Wu等，J.Biol.Chena.，2624429-4432(1987)；和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，873410-3414(1990)中。對(duì)目前已知的基因制備和基因治療方案的評(píng)論參見(jiàn)Anderson等，Science，256808-813(1992)。還可以參見(jiàn)WO 93/25673和其中引用的參考文獻(xiàn)。
制品在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了含有用于治療上面描述的紊亂的材料的制品。
制品包含一個(gè)容器和在容器上或者與容器關(guān)聯(lián)的標(biāo)簽或包裝插入物。合適的容器包括，例如瓶子、小管、注射器等。容器可以由各種材料形成，例如玻璃或塑料。容器中裝有有效治療癥狀的組合物，可能具有無(wú)菌的存取口(access port)(例如該容器是靜脈溶液袋或者具有可以被皮下注射針頭穿過(guò)的塞子的小管)。組合物中至少一種活性試劑是抗ErbB2抗體。標(biāo)簽或包裝插入物指明該組合物是用于治療特定的癥狀，例如癌癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)簽或包裝插入物指明包含結(jié)合ErbB2的抗體的組合物可以被用于治療患有腫瘤的患者，該腫瘤中已經(jīng)鑒定了存在HER2/HER1和/或HER2/HER3和/或HER2/HER4復(fù)合物，和/或已經(jīng)檢測(cè)到ErbB受體的磷酸化。而且，制品可以包含(a)其中含有組合物的第一容器，其中該組合物包含結(jié)合ErbB2并抑制ErbB2過(guò)度表達(dá)的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的第一抗體；和(b)其中含有組合物的第二容器，其中該組合物包含結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配基活化的第二抗體。在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案中，制品可進(jìn)一步包含指明第一和第二抗體組合物可以被用于治療癌癥的包裝插入物，該癌癥的特征在于存在HER2/HER1和/或HER2/HER3和/或HER2/HER4異二聚體，和/或ErbB受體磷酸化。而且包裝插入物可能教導(dǎo)組合物(包含結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配基活化的抗體)的使用者將用抗體治療以及任何在前面部分描述的輔助治療(例如化療劑，EGFR靶向藥物，抗血管生成劑，抗激素化合物，心臟保護(hù)劑和/或細(xì)胞因子)組合?？蛇x擇地或者另外地，制品可進(jìn)一步包含第二個(gè)(第三個(gè))容器，其包含藥學(xué)上可接受的緩沖液，例如用于注射的抑菌水(BWFI)、磷酸緩沖鹽水、林格液和葡萄糖液。還可以進(jìn)一步包括商業(yè)或用戶角度期望的其他物質(zhì)，包括其他的緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。
抗體還可以被用于診斷分析。一般地，抗體如上面的方法所描述被標(biāo)記。為了方便，本發(fā)明的抗體可以在試劑盒中提供，即試劑以預(yù)定的含量與實(shí)施診斷分析的說(shuō)明書(shū)一起包裝組合。當(dāng)抗體用酶標(biāo)記時(shí)，該試劑盒將包括底物和酶所需的輔助因子(例如提供可檢測(cè)的生色團(tuán)或熒光團(tuán)的底物前體)。此外，可以包括其他添加劑，例如穩(wěn)定劑、緩沖液(例如阻斷緩沖液或溶解緩沖液)等。各種試劑的相對(duì)含量可以廣泛地變化來(lái)在試劑液中提供一定濃度，該濃度充分地優(yōu)化分析的靈敏度。特別地，試劑可以以通常是凍干的粉末形式提供，包括溶解后提供具有合適濃度的試劑液的賦形劑。
材料保藏如下的雜交瘤細(xì)胞系已經(jīng)被保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，10801Univevsity Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，美國(guó)(ATCC)

前面所撰寫(xiě)的說(shuō)明書(shū)足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。由于保藏的實(shí)施方案用于說(shuō)明僅僅是發(fā)明的某些方面，并且任何功能相當(dāng)?shù)臉?gòu)建體屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明將不被限制在被保藏的構(gòu)建體的范圍內(nèi)。此處的材料保藏并不是承認(rèn)本文包含的所撰寫(xiě)的說(shuō)明書(shū)不足以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的任何方面，包括其最佳實(shí)施方式，也不被解釋為限制權(quán)利要求的范圍。實(shí)際上，根據(jù)前面的描述，除了本文給出和描述的那些外，本發(fā)明的各種改進(jìn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，并且落入附隨的權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
應(yīng)當(dāng)理解，按照本文包含的教導(dǎo)，將本發(fā)明的教導(dǎo)應(yīng)用于特定問(wèn)題或情形屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的事。
本發(fā)明的更加詳細(xì)內(nèi)容將通過(guò)如下的非限制性實(shí)施例來(lái)闡明。所有在說(shuō)明書(shū)中引用的文獻(xiàn)的公開(kāi)在此特別地被引入作為參考。
實(shí)施例1HRG依賴的ErbB2與ErbB3的結(jié)合被單克隆抗體2C4阻斷WO 01/89566中描述了特異性地結(jié)合ErbB2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的鼠單克隆抗體2C4，該文獻(xiàn)公開(kāi)的內(nèi)容在此特別地全文引入作為參考。
在共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)ErbB3與ErbB2的聯(lián)合能力。1.0×106MCF7或SK-BR-3細(xì)胞被植入含有10％胎牛血清(FBS)和10mM HEPES，pH 7.2的5050 DMEM/Ham′s F12培養(yǎng)基(生長(zhǎng)培養(yǎng)基)的6孔組織培養(yǎng)平板中，并使其附著過(guò)夜。在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，細(xì)胞在無(wú)血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中饑餓2小時(shí)。用磷酸緩沖鹽水(PBS)簡(jiǎn)單地洗滌細(xì)胞，然后與稀釋在0.2％w/v牛血清白蛋白(BSA)、具有10mM HEPES，pH7.2的RPMI培養(yǎng)基(結(jié)合緩沖液)中100nM指定抗體，或者僅與結(jié)合緩沖液(對(duì)照)一起孵育。在室溫下1h后，HRG以5nM終濃度加到半數(shù)孔中(+)。將類似體積的結(jié)合緩沖液加到其他孔中(-)。繼續(xù)孵育約10分鐘。
吸取以去除上清液，在含有0.2mM PMSF、10μg/ml亮抑酶肽和10TU/ml抑酶肽的RPMI，10mM HEPES，pH 7.2，1.0％v/v TRITON X-100TM，1.0％w/v CHAPS(裂解緩沖液)中裂解細(xì)胞。通過(guò)離心來(lái)去除裂解液中的不溶物質(zhì)。
用共價(jià)偶聯(lián)到親合凝膠(Affi-Prep 10，Bio-Rad)上的單克隆抗體免疫沉淀ErbB2。這一抗體(Ab-3，Oncogene Sciences，USA)識(shí)別胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域表位。通過(guò)往每一裂解物中加入10μl的含有約8.5μg固定抗體的凝膠漿液來(lái)進(jìn)行免疫沉淀，樣本在室溫下混合2h。然后通過(guò)離心來(lái)收集凝膠。用裂解緩沖液批量洗滌凝膠三次來(lái)去除未被結(jié)合的物質(zhì)。然后加入SDS樣本緩沖液，在沸騰的水浴中簡(jiǎn)單地加熱樣本。
在4-12％聚丙烯酰胺凝膠上對(duì)上清液進(jìn)行電泳，電印跡到硝化纖維膜上。通過(guò)用抗ErbB3的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域表位的多克隆抗體(c-17，Santa CruzBiotech)探查印跡來(lái)評(píng)價(jià)是否存在ErbB3。用化學(xué)發(fā)光底物(ECL，Amersham)來(lái)觀察印跡。
如在分別對(duì)應(yīng)于MCF7和SK-BR-3細(xì)胞的附圖2A和2B的對(duì)照泳道所示，ErbB3存在于僅當(dāng)細(xì)胞用HRG刺激的細(xì)胞時(shí)的ErbB2沉淀物中。如果細(xì)胞首先用單克隆抗體2C4溫育，ErbB3信號(hào)在MCF7細(xì)胞中消失(附圖5A，泳道2C4+)或在SK-BR-3細(xì)胞中實(shí)質(zhì)性地降低(附圖5B，泳道2C4+)。如在附圖2A-B中所示，在MCF7和SK-BR-3細(xì)胞中，單克隆抗體2C4阻斷heregulin依賴的ErbB3與ErbB2的結(jié)合顯著地比HERCEPTIN有效。用HERCEPTIN預(yù)孵育降低MCF7裂解產(chǎn)物中的ErbB3信號(hào)，但是對(duì)從SK-BR-3裂解產(chǎn)物中共沉淀的ErbB3的量的作用很小，或者不起作用。在任一細(xì)胞系中，用抗EGF受體的抗體(Ab-1，Oncogene Sciences，USA)預(yù)孵育對(duì)ErbB3共免疫沉淀ErbB2的能力沒(méi)有影響。
實(shí)施例2細(xì)胞系和人腫瘤異種移植模型對(duì)2C4的反應(yīng)性大約檢測(cè)了40個(gè)腫瘤模型對(duì)2C4的反應(yīng)性。這些模型代表了主要的癌癥，例如乳腺、肺、前列腺和大腸。50-60％的模型對(duì)2C4處理產(chǎn)生反應(yīng)。下面的表1列舉所選擇的被檢測(cè)對(duì)2C4反應(yīng)性的腫瘤模型。簡(jiǎn)而言之，將約3mm大小的人腫瘤異種移植碎片移植到無(wú)胸腺裸鼠的皮膚下?；蛘?，從培養(yǎng)皿中分離體外生長(zhǎng)的人腫瘤細(xì)胞，重懸在磷酸鹽緩沖鹽水中，并皮下注射到無(wú)免疫應(yīng)答的小鼠的脅部。采用電測(cè)徑器(electric caliper)每2-3天監(jiān)控腫瘤的生長(zhǎng)。
當(dāng)腫瘤達(dá)到大約30-100mm大小時(shí)，動(dòng)物隨機(jī)地分成不同的處理和對(duì)照組。每周一次通過(guò)腹膜內(nèi)注射施用2C4。對(duì)照動(dòng)物按照與處理組相同的方案接受相同體積不含抗體的載體溶液。在約3-6周后，當(dāng)對(duì)照組的腫瘤達(dá)到約1000-1500mm3的大小時(shí)，結(jié)束研究。對(duì)處理有反應(yīng)被定義為腫瘤體積減小≥50％。
表1異種移植模型


該模型代表兩種主要腫瘤模型，即非小細(xì)胞肺癌(NSCLC；模型#1-13)和乳腺癌(模型#14-18)。NSCLC模型中的9種(#1-9)和所有的乳腺癌模型是通過(guò)在免疫缺陷小鼠中連續(xù)體內(nèi)傳代人腫瘤碎片得到。剩下的NSCLC模型(#10-13)是以細(xì)胞為基礎(chǔ)的模型，其中體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)是通過(guò)將體外繁殖的細(xì)胞移植到無(wú)免疫應(yīng)答小鼠中來(lái)誘導(dǎo)。
Berger，D.P.，Winterhalter，B.R.，和Fiebig，H.H.(1992).在胸腺發(fā)育不全裸鼠中人腫瘤異體移植的建立和表征Immunodeficient Mice in Oncology，H.H.Fiebig和D.P.Berger，編輯(BaselKarger)，23-46.
Burger，A.M.，Hartung，G.，Stehle，G.，Sinn，H.，和Fiebig，H.H.(2001).氨甲喋呤-白蛋白偶聯(lián)物(MTX-HSA)在人腫瘤體內(nèi)異體移植中的臨床前評(píng)價(jià)int.J.Cancer，92718-24.
Fiebig，H.H.，和Burger，A.M.(2002).人腫瘤異體移植和外植體.InTumor Models in Cancer Research，B.A.Teicher，編輯(Totowa，New JerseyHumana Press)，113-137.
Fiebig，H.H.，Dengler，W.A.，和Roth，T.(1999).人腫瘤異體移植新抗癌劑的可預(yù)測(cè)性、表征和發(fā)現(xiàn)。投稿于OncologyRelevance of Tumor Modelsfor Anticancer Drug Development，H.H.Fiebig和A.M.Burger，編輯.(BaselKarger)，29-50.
Gridley，D.S.，Andres，M.L.，Garner，C.，Mao，X.W.，和Slater，J.M.(1996).TNF-α對(duì)人肺腺癌模型中放射性效率影響的評(píng)價(jià).Oncol Res.，8485-95.
Stein，R.，Govindan，S.V.，Chen，S.，Reed，L.，Spiegelman，H.，Griffiths，G.L.，Hansen，H.J.，和Goldenberg，D.M.(2001).使用殘量放射性碘標(biāo)記的Mab RS7成功治療人肺癌異體移植Crit.Rev.Oncol.Hemato.，39173-80.
Yamori，T.，Sato，S.，Chikazawa，H.，和Kadota，T.(1997).Paclitaxel針對(duì)人肺癌異種移植的抗腫瘤有效性Jpn.J Cancer Res.，881205-10.
Zou，Y.，Wu，Q.P.，Tansey，W.，Chow，D.，Hung，M.C.，Charnsangavej，C.，Wallace，S.，和Li，C.(2001).在裸乳中水溶性聚(L-谷氨酸)-喜樹(shù)堿偶聯(lián)物針對(duì)難治性人肺癌異種移植的有效性Int.J Oncol.，18331-6.
實(shí)施例3通過(guò)免疫沉淀檢測(cè)2C4響應(yīng)的腫瘤中的異二聚體對(duì)2C4反應(yīng)和不反應(yīng)的腫瘤進(jìn)行抗ErbB2抗體免疫沉淀來(lái)分析是否存在ErbB2-ErbB3和EGFR-ErbB2異二聚體。除非另外說(shuō)明，該方法按照“Maniatis T.等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港，紐約，美國(guó)，冷泉港出版社，1982”來(lái)實(shí)施。
選擇不發(fā)生交叉反應(yīng)的抗HER2、抗HER3和抗HER1的抗體。為了確定抗體是否發(fā)生交叉反應(yīng)，在人胚胎腎(HEK)293細(xì)胞中表達(dá)HER1、HER2、HER3和HER4受體。用含有HEPES緩沖液(pH 7.5)的TritonTMX100(1％w/v)裂解細(xì)胞。大約20μg來(lái)自對(duì)照細(xì)胞和表達(dá)HER1，HER2，HER3和HER4的細(xì)胞的細(xì)胞總蛋白在SDS凝膠上分離，并通過(guò)半干印跡操作被轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。用明膠阻斷后，檢測(cè)各種抗HER1、抗HER2和抗HER3的抗體針對(duì)其他ErbB受體的交叉反應(yīng)性。被選擇用于下面描述的實(shí)驗(yàn)的抗體不表現(xiàn)出任何顯著的交叉反應(yīng)性。
在冰上機(jī)械碾碎新鮮的腫瘤樣本，并在含有50mM HEPES pH 7.5、150mMNaCl、1.5mM MgCl2、1mM EDTA、10％(w/v)甘油、1％(w/v)TritonTMX-100、1mM PMSF、10μg/ml抑酶肽和0.4mM原釩酸鹽的緩沖液中裂解。離心完全裂解的腫瘤數(shù)次，直到上清液完全清澈。通過(guò)在1.5ml Eppendorf反應(yīng)管中，結(jié)合澄清的腫瘤裂解物(5-7mg蛋白/裂解物)、5μg抗ErbB2抗體(ab-3，小鼠單克??；目錄號(hào)OP15，Oncogene Inc.，USA)和50μl蛋白G偶聯(lián)的瓊脂糖來(lái)進(jìn)行免疫沉淀。在加入1-2倍體積的含有0.1％(w/v)TritonTMX-100的50mM HEPES緩沖液，pH 7.5后，在4℃下轉(zhuǎn)動(dòng)試管3-4小時(shí)，接著進(jìn)行離心。用500μl的含有0.1％(w/v)TritonTMX-100的50mM HEPES緩沖液pH7.5洗滌沉淀2-3次。將等量體積的2x Lammli樣本緩沖液加入到被洗滌的免疫沉淀物中，在95℃下加熱樣本5分鐘。通過(guò)SDS-PAGE分離樣本，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。通過(guò)用抗EGFR抗體(抗EGFR的兔多克隆抗體，Upstate Inc.，USA；目錄號(hào)06-847)和抗ErbB3的抗體(抗ErbB3的多克隆抗體；Santa Cruz Inc.，USA；目錄號(hào)SC-285)探測(cè)印跡來(lái)評(píng)價(jià)是否存在EGFR-ErbB2和ErbB2-ErbB3異二聚體。過(guò)氧化物酶(POD)標(biāo)記的抗兔Fc抗體(BioRad Laboratories Inc.USA)被用作第二抗體。采用化學(xué)發(fā)光底物(ECL plus，Amersham)觀察印跡。
附圖3顯示這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。可以看出存在ErbB2-ErbB3和/或EGFR-ErbB2異二聚體。觀察到如表1所示的2C4反應(yīng)性與存在ErbB2-ErbB3和/或EGFR-ErbB2異二聚體之間的關(guān)聯(lián)。
實(shí)施例4對(duì)rhuMAb 2C4的反應(yīng)性與HER2磷酸化之間的關(guān)聯(lián)已經(jīng)在14個(gè)被植入小鼠中的人腫瘤(9個(gè)肺癌和5個(gè)乳腺癌)中研究了rhuMAb 2C4對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。如實(shí)施例2所描述進(jìn)行腫瘤外植和處理。如在實(shí)施例3中所描述檢測(cè)HER2異二聚體。
通過(guò)免疫沉淀HER2和蛋白質(zhì)印跡分析來(lái)評(píng)價(jià)HER2磷酸化。凝膠上存在磷酸HER2條帶確定為陽(yáng)性。不存在該條帶確定為陰性。采用磷酸特異性抗HER2抗體(克隆PN2A，Thor等，J.Clin.Oncol.，183230-9(2000))通過(guò)免疫組織化學(xué)證實(shí)HER2磷酸化。
在被檢測(cè)的腫瘤的5種(3種肺癌和2種乳腺癌)中，觀察到腫瘤生長(zhǎng)被顯著地抑制，這與存在可檢測(cè)的HER2與HER1或HER3的異二聚體，以及在所有情況下強(qiáng)烈的HER2磷酸化相關(guān)。觀察到9種腫瘤中沒(méi)有對(duì)rhuMAb 2C4處理的顯著反應(yīng)，沒(méi)有檢測(cè)到異二聚體，并且不存在HER2磷酸化。在非臨床模型中，存在HER2異二聚體化或者顯著的HER2磷酸化有力地指示對(duì)rhuMAb 2C4處理有反應(yīng)。在由腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的異種移植中也獲得相似的觀察結(jié)果。
實(shí)施例5在對(duì)2C4響應(yīng)的腫瘤中檢測(cè)HER2的磷酸化在9個(gè)已經(jīng)建立的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)異種移植的腫瘤模型(LXFE211，LXFA 289，LXFA 297，LXFE 397，LXFA 526，LXFL 529，LXFA 629，LXFA 1041，LXFL 1071，Oncotest GmbH，F(xiàn)reiburg，Germany)中評(píng)價(jià)rhuMAb2C4的功效。由于患者的腫瘤以固體瘤生長(zhǎng)，產(chǎn)生基質(zhì)、維管結(jié)構(gòu)、中央壞死并且表現(xiàn)為圓頂分化，人腫瘤異種移植被認(rèn)為是作為抗癌藥物開(kāi)發(fā)的最相關(guān)模型。此外，異種移植的腫瘤模型在組織學(xué)和化學(xué)敏感性上與原始腫瘤非常接近。
如實(shí)施例2中所描述評(píng)價(jià)生長(zhǎng)抑制。顯著的生長(zhǎng)抑制活性被定義為相對(duì)于對(duì)照組，抑制處理組的＞50％的生長(zhǎng)。在NSCLC模型中的三個(gè)中(LXFA297，LXFA 629，和LXFL 1072)，觀察到顯著的對(duì)rhuMAb 2C4處理的生長(zhǎng)抑制反應(yīng)。在蛋白質(zhì)水平上還研究了配基活化HER2的多個(gè)特征。如附圖4中所示，可以從9個(gè)NSCLC腫瘤中的8個(gè)的腫瘤提取物中免疫沉淀HER2。為了確定HER2的活化狀態(tài)，然后用抗磷酸酪氨酸(抗PY)抗體探測(cè)這些印跡。如在附圖4的下面組中所示，三個(gè)響應(yīng)腫瘤(LXFA 297，LXFA 629和1072)顯示強(qiáng)烈的HER2活化。
實(shí)施例6通過(guò)檢測(cè)HER2異二聚體來(lái)鑒定用rhuMAb 2C4治療的肺癌患者的臨床研究如果來(lái)自患者的腫瘤被發(fā)現(xiàn)包含HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4復(fù)合物，該患者被鑒定為患有對(duì)用rhuMAb 2C4治療響應(yīng)的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。
通過(guò)活組織檢查或者在手術(shù)切除腫瘤的過(guò)程中獲得腫瘤樣本。然后分析該樣本是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體。
腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞裂解物與特異結(jié)合HER2的eTagTM接觸。該eTagTM包含可檢測(cè)部分和特異于HER2的第一結(jié)合部分?？蓹z測(cè)部分以可裂解接頭被連接到第一結(jié)合部分上。在足夠的結(jié)合時(shí)間后，去除多余的eTagTM。
腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞裂解物與特異結(jié)合HER1或HER3或HER4的第二結(jié)合化合物接觸。通過(guò)洗滌來(lái)去除未被結(jié)合的化合物。然后激活第二結(jié)合化合物。如果第一結(jié)合化合物和第二結(jié)合化合物十分接近，被激活的第二結(jié)合化合物斷裂eTagTM中的可裂解接頭來(lái)產(chǎn)生游離的可檢測(cè)部分。鑒定樣本中的游離部分指示該腫瘤包含HER2/HER1或HER2/HER3或HER2/HER4異二聚體。
在確定患者患有包含HER2/HER1和/或HER2/HER3和/或HER2/HER4異二聚體的腫瘤時(shí)，每周或者每3周分別靜脈內(nèi)(IV)施用2或4mg/kgrhuMAb 2C4，直到疾病進(jìn)展?？贵w以多劑量液體制劑形式(以20mg/mL或更高濃度裝滿20mL)被提供。主要的功效終點(diǎn)包括反應(yīng)率和安全性。次要功效終點(diǎn)包括總存活率、疾病進(jìn)展時(shí)間、生活質(zhì)量和/或反應(yīng)持續(xù)時(shí)間。
實(shí)施例7鑒定用rhuMAb 2C4治療的癌癥患者的臨床研究包含癌細(xì)胞的生物樣本從用于治療的候選者中獲得，例如通過(guò)腫瘤組織的活細(xì)胞檢查，從腹水中抽吸腫瘤細(xì)胞或者臨床實(shí)踐中知曉的任何其他方法。通過(guò)上面描述的任何技術(shù)分析生物樣本中的HER2磷酸化例如通過(guò)免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡分析，和/或是否存在HER2/HER3、HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體。生物樣本中HER2磷酸化陽(yáng)性和/或存在HER2/HER3，HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體的個(gè)體對(duì)用rhuMAb2C4處理可能比腫瘤樣本中不顯示HER2磷酸化或沒(méi)有檢測(cè)到異二聚體的患者有更好的反應(yīng)。
例如，被診斷具有卵巢癌的個(gè)體將進(jìn)行腫瘤組織的活組織檢查，或者從腹水液中抽吸腫瘤細(xì)胞。通過(guò)免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡分析來(lái)分析組織中HER2的磷酸化。這需要最少約250mg腫瘤組織。
一旦確定患者患有為HER2磷酸化陽(yáng)性的腫瘤(例如，閹割抗性的前列腺癌CRPC或卵巢癌)，在循環(huán)1(第一個(gè)21天的治療階段)的第一天，該患者將接受840mg載入劑量的rhuMAb 2C4，接著在每個(gè)后續(xù)的21天循環(huán)的第一天以持續(xù)的靜脈灌注的形式接受420mg對(duì)于不表現(xiàn)疾病進(jìn)展跡象的患者，通過(guò)每3周的靜脈灌注繼續(xù)治療，直到1年(17個(gè)循環(huán))。根據(jù)醫(yī)生的判斷，治療可以在任何較早時(shí)期由于缺乏反應(yīng)、副作用或者其他原因被停止。
在本公開(kāi)中引用的全部參考文獻(xiàn)，以及其中引用的參考文獻(xiàn)在此特別地引入作為參考。
雖然本發(fā)明以某些實(shí)施方案被描述，本發(fā)明不是如此被限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，各種改進(jìn)是可能的，而不從實(shí)質(zhì)上改變本發(fā)明。不需要過(guò)度的實(shí)驗(yàn)而進(jìn)行的所有這些改進(jìn)被包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
序列表<110>健泰科生物技術(shù)公司(Genentech，Inc.)(F.HOFFMANN-LA ROCHE AG)Koll，HansBossenmaier，BirgitMuller，Hans-JoachimSliwkowski，MarkKelsey，Stephen<120>鑒定對(duì)用抗ErbB2抗體處理響應(yīng)的腫瘤的方法<130>39766-0114PC<150>US 60/396,290<151>2002-07-15<150>US 60/480,043<151>2003-06-20<160>6<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>107<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Ile Met Ser Thr Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly20 25 30Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala65 70 75 80Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>2<211>119<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30Thr Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Arg Ile Val Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser115<210>3<211>107<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly20 25 30Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>4<211>119<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>5<211>107<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Leu Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>6<211>119<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>6Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser11權(quán)利要求
1.鑒定對(duì)用抗HER2抗體處理響應(yīng)的腫瘤的方法，包含a)檢測(cè)所述腫瘤的樣本中HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在；c)當(dāng)檢測(cè)到復(fù)合物時(shí)，則將腫瘤鑒定為對(duì)用抗HER2抗體處理響應(yīng)的腫瘤。
2.權(quán)利要求1的方法，其中抗HER2抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。
3.權(quán)利要求1的方法，其中抗HER2抗體是單克隆抗體2C4。
4.權(quán)利要求1的方法，其中抗HER2抗體是rhuMAb 2C4。
5.權(quán)利要求1的方法，其中HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在通過(guò)如下步驟檢測(cè)a)用抗HER2抗體免疫沉淀任何包含HER2的蛋白質(zhì)復(fù)合物；b)用選自由抗HER3抗體和抗HER1抗體組成的組中的抗體與被免疫沉淀的復(fù)合物接觸；和c)確定抗HER3和/或抗HER1抗體是否與被免疫沉淀的復(fù)合物結(jié)合，其中如果確定抗HER3和/或抗HER1抗體與被免疫沉淀的復(fù)合物結(jié)合，則檢測(cè)到HER2/HER3和/或HER2/HER1復(fù)合物。
6.權(quán)利要求1的方法，其中HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在通過(guò)如下步驟檢測(cè)a)將腫瘤樣本與包含熒光團(tuán)的抗HER2抗體接觸；b)將腫瘤樣本與選自由抗HER3和抗HER1抗體組成的組中的抗體接觸，其中所述抗體包含第二熒光團(tuán)；c)通過(guò)測(cè)量熒光共振能量轉(zhuǎn)移確定第一熒光團(tuán)和第二熒光團(tuán)是否十分接近，其中如果第一和第二熒光團(tuán)被確定十分接近，則檢測(cè)到HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。
7.權(quán)利要求1的方法，其中HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在是通過(guò)如下步驟檢測(cè)的a)將腫瘤樣本與第一結(jié)合化合物接觸，其中所述第一結(jié)合化合物包含特異結(jié)合HER2的第一靶向結(jié)合部分，并且還進(jìn)一步包含通過(guò)可裂解接頭連接到第一靶向結(jié)合部分的可檢測(cè)部分；b)將腫瘤樣本與第二結(jié)合化合物接觸，其中該第二結(jié)合化合物包含特異結(jié)合HER3或HER1的第二靶向結(jié)合部分和可活化的裂解劑；c)激活裂解劑，使得如果第一結(jié)合化合物和第二結(jié)合化合物十分接近，第二結(jié)合化合物斷裂第一結(jié)合化合物中的可裂解接頭來(lái)產(chǎn)生游離的可檢測(cè)部分；和d)鑒定游離的可檢測(cè)部分的存在，其中當(dāng)鑒定到游離的可檢測(cè)部分時(shí)，檢測(cè)到HER2/HER3或HER2/HER1蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。
8.權(quán)利要求7的方法，其中第一靶向結(jié)合部分包含抗HER2抗體或者抗體片段。
9.權(quán)利要求7的方法，其中第一靶向結(jié)合部分包含HER2受體的配體。
10.權(quán)利要求7的方法，其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HER3抗體或者抗體片段。
11.權(quán)利要求7的方法，其中第二靶向結(jié)合部分包含HER3受體的配體。
12.權(quán)利要求7的方法，其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HER1抗體或者抗體片段。
13.權(quán)利要求7的方法，其中第二靶向結(jié)合部分包含HER1受體的配體。
14.權(quán)利要求7的方法，其中樣本從患有該腫瘤的患者中獲得。
15.權(quán)利要求14的方法，其中樣本通過(guò)腫瘤的活組織檢查獲得。
16.權(quán)利要求14的方法，其中樣本通過(guò)純化來(lái)自患者血液的循環(huán)的腫瘤細(xì)胞來(lái)獲得。
17.權(quán)利要求14的方法，其中樣本是在手術(shù)從患者中去除腫瘤的過(guò)程中獲得。
18.權(quán)利要求1的方法，其中腫瘤樣本從小鼠中獲得。
19.權(quán)利要求18的方法，其中腫瘤是異種移植的腫瘤。
20.權(quán)利要求19的方法，其中異種移植的腫瘤是通過(guò)將人腫瘤碎片移植到小鼠中來(lái)制備。
21.權(quán)利要求1的方法，其中腫瘤是肺腫瘤。
22.權(quán)利要求1的方法，其中腫瘤是乳腺腫瘤。
23.鑒定對(duì)用抑制HER2與ErbB受體家族的另一成員結(jié)合的抗體處理響應(yīng)的腫瘤細(xì)胞的方法，包含a)提供包含HER2陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)樣本；和b)檢測(cè)在所述生物學(xué)樣本中的ErbB受體的磷酸化，其中所述磷酸化指示所述腫瘤細(xì)胞對(duì)用所述抗體處理響應(yīng)。
24.權(quán)利要求23的方法，其中ErbB2(HER2)受體磷酸化被檢測(cè)。
25.權(quán)利要求23的方法，其中其他成員選自由HER3、HER1和HER4組成的組。
26.權(quán)利要求23的方法，其中抗體結(jié)合HER2。
27.權(quán)利要求26的方法，其中抗HER2抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。
28.權(quán)利要求27的方法，其中抗體是rhuMAb 2C4。
29.權(quán)利要求25的方法，其中抗體結(jié)合HER3。
30.權(quán)利要求25的方法，其中抗體結(jié)合HER1。
31.權(quán)利要求25的方法，其中抗體結(jié)合HER4。
32.權(quán)利要求23的方法，另外還包含檢測(cè)樣本中至少一種選自由HER2/HER3、HER2/HER1和HER2/HER4組成的組中的蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。
33.權(quán)利要求32的方法，其中通過(guò)如下來(lái)檢測(cè)所述蛋白質(zhì)復(fù)合物或多個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在a)用抗HER2抗體免疫沉淀任何包含HER2的蛋白質(zhì)復(fù)合物；b)將被免疫沉淀的復(fù)合物與選自由抗HER3、抗HER1和抗HER4抗體組成的組中的至少一種抗體接觸；和c)確定所述抗HER3和/或抗HER1和/或抗HER4抗體是否與被免疫沉淀的復(fù)合物結(jié)合，其中如果確定抗HER3和/或抗HER1和/或抗HER4抗體與被免疫沉淀的復(fù)合物結(jié)合，則檢測(cè)到HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4復(fù)合物。
34.權(quán)利要求32的方法，其中通過(guò)如下檢測(cè)所述蛋白質(zhì)復(fù)合物或多個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在a)將腫瘤樣本與包含熒光團(tuán)的抗HER2抗體接觸；b)將腫瘤樣本與選自由抗HER3、抗HER1和抗HER4抗體組成的組中的抗體接觸，其中所述抗體包含第二熒光團(tuán)；c)通過(guò)測(cè)量熒光共振能量轉(zhuǎn)移確定第一熒光團(tuán)與第二熒光團(tuán)是否十分接近，其中如果第一與第二熒光團(tuán)被確定十分接近，則檢測(cè)到存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物。
35.權(quán)利要求32的方法，其中通過(guò)如下檢測(cè)所述蛋白質(zhì)復(fù)合物或多個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在a)將腫瘤樣本與第一結(jié)合化合物接觸，其中所述第一結(jié)合化合物包含特異結(jié)合HER2的第一靶向結(jié)合部分，還進(jìn)一步包含通過(guò)可裂解接頭被連接到第一靶向結(jié)合部分的可檢測(cè)部分；b)將腫瘤樣本與第二結(jié)合化合物接觸，其中第二結(jié)合化合物包含特異結(jié)合HER3或HER1或HER4的第二靶向結(jié)合部分和可活化的裂解劑；c)激活裂解劑，使得如果第一結(jié)合化合物和第二結(jié)合化合物十分接近，則第二結(jié)合化合物斷裂第一結(jié)合化合物的可裂解接頭來(lái)產(chǎn)生游離的可檢測(cè)部分；和d)鑒定游離的可檢測(cè)部分的存在，其中當(dāng)游離的可檢測(cè)部分被鑒定時(shí)，檢測(cè)到HER2/HER3或HER2/HER1或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。
36.權(quán)利要求35的方法，其中第一靶向結(jié)合部分包含抗HER2抗體或抗體片段，或HER2受體的配體。
37.權(quán)利要求35的方法，其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HER3抗體或抗體片段，或HER3受體的配體。
38.權(quán)利要求35的方法，其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HER1抗體或抗體片段，或HER1受體的配體。
39.權(quán)利要求35的方法，其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HER4抗體或抗體片段，或HER4受體的配體。
40.權(quán)利要求23的方法，其中生物學(xué)樣本是從腫瘤活組織檢查中獲得的組織。
41.權(quán)利要求23的方法，其中生物學(xué)樣本是包含循環(huán)的腫瘤細(xì)胞和/或循環(huán)的血漿蛋白的生物學(xué)液體。
42.權(quán)利要求23的方法，其中該腫瘤選自由乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌和卵巢癌組成的組。
43.權(quán)利要求23的方法，其中ErbB受體磷酸化通過(guò)ErbB受體的免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡分析來(lái)確定。
44.權(quán)利要求43的方法，其中ErbB受體磷酸化通過(guò)凝膠上的磷酸ErbB受體條帶的存在來(lái)指示。
45.權(quán)利要求43的方法，還進(jìn)一步包含用磷酸特異的抗ErbB受體抗體通過(guò)免疫組織化學(xué)來(lái)證實(shí)ErbB受體磷酸化的步驟。
46.權(quán)利要求23的方法，其中通過(guò)免疫組織化學(xué)確定ErbB受體磷酸化。
47.用于預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)用抑制HER2與ErbB受體家族的另一成員聯(lián)合的抗體處理的反應(yīng)的方法，所述個(gè)體被診斷患有HER2陽(yáng)性腫瘤，該方法包含a)提供從所述個(gè)體獲得的生物學(xué)樣本，包含HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞；和b)檢測(cè)所述生物學(xué)樣本中的ErbB受體的磷酸化，其中所述磷酸化指示所述患者可能對(duì)用所述抗體處理有反應(yīng)。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述ErbB受體是ErbB2(HER2)。
49.權(quán)利要求47的方法，其中其他成員選自由HER3、HER1和HER4組成的組。
50.權(quán)利要求47的方法，其中抗體結(jié)合HER2。
51.權(quán)利要求50的方法，其中抗HER2抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。
52.權(quán)利要求51的方法，其中抗體是rhuMAb 2C4。
53.權(quán)利要求49的方法，其中抗體結(jié)合HER3。
54.權(quán)利要求49的方法，其中抗體結(jié)合HER1。
55.權(quán)利要求49的方法，其中抗體結(jié)合HER4。
56.權(quán)利要求47的方法，另外還包含檢測(cè)在樣本中至少一種選自由HER2/HER3、HER2/HER1和HER2/HER4組成的組中的蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。
57.權(quán)利要求56的方法，其中通過(guò)如下檢測(cè)所述蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在a)用抗HER2抗體免疫沉淀任何包含HER2的蛋白質(zhì)復(fù)合物；b)將被免疫沉淀的復(fù)合物與選自由抗HER3、抗HER1和抗HER4抗體組成的組中的抗體接觸；和c)確定抗HER3和/或抗HER1和/或抗HER4抗體是否與被免疫沉淀的復(fù)合物結(jié)合，其中如果確定抗HER3和/或抗HER1和/或抗HER4抗體與被免疫沉淀的復(fù)合物結(jié)合，則檢測(cè)到HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4復(fù)合物。
58.權(quán)利要求56的方法，其中通過(guò)如下檢測(cè)HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在a)將腫瘤樣本與包含熒光團(tuán)的抗HER2抗體接觸；b)將腫瘤樣本與選自由抗HER3、抗HER1和抗HER4抗體組成的組中的抗體接觸，其中所述抗體包含第二熒光團(tuán)；c)通過(guò)測(cè)量熒光共振能量轉(zhuǎn)移確定第一熒光團(tuán)與第二熒光團(tuán)是否十分接近，其中如果第一熒光團(tuán)和第二熒光團(tuán)被確定十分接近，則檢測(cè)到HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。
59.權(quán)利要求56的方法，其通過(guò)如下檢測(cè)HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在a)將腫瘤樣本與第一結(jié)合化合物接觸，其中所述第一結(jié)合化合物包含特異結(jié)合HER2的第一靶向結(jié)合部分，還進(jìn)一步包含通過(guò)可裂解接頭連接到第一靶向結(jié)合部分的可檢測(cè)部分；b)將腫瘤樣本與第二結(jié)合化合物接觸，其中第二結(jié)合化合物包含特異結(jié)合HER3、HER1或HER4的第二靶向結(jié)合部分和可活化的裂解劑；c)激活裂解劑使得如果第一結(jié)合化合物與第二結(jié)合化合物十分接近，第二結(jié)合化合物斷裂第一結(jié)合化合物中的可裂解接頭來(lái)產(chǎn)生游離的可檢測(cè)部分；和d)鑒定游離的可檢測(cè)部分的存在，其中當(dāng)鑒定到游離的可檢測(cè)部分時(shí)，則檢測(cè)到HER2/HER3或HER2/HER1或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。
60.權(quán)利要求59的方法，其中第一靶向結(jié)合部分包含抗HER2抗體或抗體片段，或HER2受體的配體。
61.權(quán)利要求59的方法，其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HER3抗體或抗體片段，或HER3受體的配體。
62.權(quán)利要求59的方法，其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HER1抗體或抗體片段，或HER1受體的配體。
63.權(quán)利要求59的方法，其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HER4抗體或抗體片段，或HER4受體的配體。
64.權(quán)利要求47的方法，其中生物學(xué)樣本是從腫瘤活組織檢查中獲得的組織。
65.權(quán)利要求47的方法，其中生物學(xué)樣本是包含循環(huán)的腫瘤細(xì)胞和/或循環(huán)的血漿蛋白的生物學(xué)液體。
66.權(quán)利要求47的方法，其中腫瘤選自由乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌和卵巢癌組成的組。
67.權(quán)利要求47的方法，其中ErbB受體磷酸化通過(guò)ErbB受體的免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡分析來(lái)確定。
68.權(quán)利要求67的方法，其中ErbB受體磷酸化通過(guò)凝膠上存在磷酸ErbB受體條帶來(lái)指示。
69.權(quán)利要求67的方法，還進(jìn)一步包含采用磷酸特異性抗ErbB受體抗體通過(guò)免疫組織化學(xué)來(lái)證實(shí)ErbB受體磷酸化的步驟。
70.權(quán)利要求47的方法，其中ErbB受體磷酸化通過(guò)免疫組織化學(xué)確定。
71.用于鑒定對(duì)用抗HER2抗體處理響應(yīng)的個(gè)體的方法，包含a)檢測(cè)所述個(gè)體的循環(huán)的腫瘤細(xì)胞中的ErbB受體磷酸化，和b)如果檢測(cè)到所述磷酸化，則確定所述個(gè)體可能對(duì)用抗HER2抗體處理有反應(yīng)。
72.權(quán)利要求71的方法，其中ErbB2(HER2)磷酸化被檢測(cè)。
73.權(quán)利要求72，其中所述個(gè)體是人。
74.權(quán)利要求73的方法，還進(jìn)一步包含用抗HER2抗體處理所述個(gè)體。
75.權(quán)利要求74的方法，其中所述抗HER2抗體是rhuMAb 2C4。
76.一種治療患者的方法，包含給患者施用治療有效量的結(jié)合HER2的抗體，其中該患者患有已被確定包含HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體的腫瘤。
77.權(quán)利要求76的方法，其中抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。
78.權(quán)利要求77的方法，其中抗體是單克隆抗體2C4。
79.權(quán)利要求77的方法，其中抗體是rhuMAb 2C4。
80.一種制品，包含含有結(jié)合HER2的抗體的容器和用于施用抗體給患有腫瘤的患者的說(shuō)明書(shū)，其中腫瘤已被確定包含HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體。
81.權(quán)利要求80的制品，其中抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。
82.權(quán)利要求81的制品，其中容器包含單克隆抗體2C4。
83.權(quán)利要求81的制品，其中容器包含rhuMAb 2C4。
84.治療患者的方法，包含給患者施用治療有效量的結(jié)合HER2的抗體，其中患者患有已被確定具有磷酸化ErbB受體的腫瘤。
85.權(quán)利要求84的方法，其中ErbB受體是HER2。
86.權(quán)利要求84的方法，其中抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。
87.權(quán)利要求84方法，其中抗體是單克隆抗體2C4。
88.權(quán)利要求87的方法，其中抗體是rhuMAb 2C4。
全文摘要
通過(guò)在腫瘤細(xì)胞樣品中檢測(cè)HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白質(zhì)復(fù)合物或者HER2磷酸化的存在來(lái)鑒定對(duì)用抗HER2抗體處理響應(yīng)的腫瘤。用抗HER2抗體，例如rhuMAb 2C4治療患有包含HER/2/HER1和/或HER2/HER3異二聚體和/或HER2磷酸化的腫瘤的患者。
文檔編號(hào)G01N33/48GK1835768SQ03821625
公開(kāi)日2006年9月20日 申請(qǐng)日期2003年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月15日
發(fā)明者漢斯·科爾, 伯吉特·博森梅爾, 漢斯-喬基姆·米勒, 馬克·X·斯利科夫斯基, 斯蒂芬·M·凱爾西 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司, 霍夫曼-拉羅奇有限公司