專利名稱：測(cè)定皮膚樣本中mc1r變體和線粒體標(biāo)記物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)測(cè)、診斷和監(jiān)測(cè)皮膚狀態(tài)和皮膚疾病的方法。具體地，本發(fā)明涉 及將非創(chuàng)傷性(non-irwasive，非侵入性)皮膚采樣技術(shù)與用于確定線粒體突變和黑皮素1 受體(MClR)變體的測(cè)定相結(jié)合的方法，以用作預(yù)測(cè)和監(jiān)測(cè)疾病、光老化和紫外輻射(UVR) 損傷的綜合性工具。所述方法還可用于評(píng)估治療劑、皮膚護(hù)理產(chǎn)品和治療方案的有效性以 及對(duì)它們的反應(yīng)。
背景技術(shù)：
皮膚病是當(dāng)今世界主要的醫(yī)療難題。隨著美國(guó)每年診斷出超過(guò)一百萬(wàn)例的新增皮 膚癌病例(美國(guó)國(guó)家癌癥研究所(National Cancerlnstitute) ,www, cancer, gov),皮膚病 的預(yù)測(cè)和診斷是其管理(management)的重要方面。目前的診斷方法主要依賴于目視觀察 和組織活檢。然而，依賴于目視觀察的檢測(cè)方法對(duì)皮膚狀態(tài)或疾病的診斷未必有效，并且直 到有臨床表現(xiàn)后才能檢測(cè)到風(fēng)險(xiǎn)或疾病。此外，如組織活檢的創(chuàng)傷性方法不僅會(huì)對(duì)測(cè)試的 受試者造成外傷，而且還提高了感染的機(jī)會(huì)。為了安全實(shí)施，這些方法還必須由醫(yī)師進(jìn)行， 并且通常不提供皮膚表面上的細(xì)胞富集樣本，這些細(xì)胞通常是參與反應(yīng)的細(xì)胞。因此，診斷和監(jiān)測(cè)皮膚狀態(tài)和疾病的非創(chuàng)傷性方法是用于患者管理，以及用于評(píng) 估現(xiàn)有和新型治療劑、皮膚護(hù)理產(chǎn)品和皮膚護(hù)理方案的效力的重要工具。此外，這些方法可 以提供受試者皮膚狀態(tài)潛在的特異遺傳變化以及他們形成皮膚疾病的遺傳傾向性的重要 信息。識(shí)別這些遺傳變化就鑒別了潛在的藥物靶標(biāo)和預(yù)防性措施，并且在確定個(gè)人是否將 實(shí)際上對(duì)特定治療劑、皮膚護(hù)理產(chǎn)品或方案產(chǎn)生反應(yīng)可能是關(guān)鍵的。同樣，檢測(cè)和診斷方法 對(duì)于評(píng)估這樣的療法、產(chǎn)品和措施的安全性是重要的。紫外輻射(UVR)損傷未知或可量化性差的因素經(jīng)常促成了由于紫外輻射(UVR)所造成的皮膚損傷。已 知因素包括皮膚顏色、UVR暴露頻率和嚴(yán)重性、黑色素產(chǎn)生、真黑素與褐黑素的比率以及遮 光劑的使用等。行為因素在UVR對(duì)皮膚所造成損傷的嚴(yán)重性和水平中起很大作用，但是由 于它們依賴于自我報(bào)告的準(zhǔn)確性并且經(jīng)常依賴于對(duì)患者日光生活方式習(xí)慣的錯(cuò)誤認(rèn)識(shí)，因 此很難進(jìn)行臨床評(píng)估。定期使用遮光劑的多個(gè)個(gè)體不正確地使用，不能使用足夠的量或不 能以推薦的間隔再次使用，從而產(chǎn)生了保護(hù)的錯(cuò)覺(jué)并可能導(dǎo)致增加對(duì)UVR的暴露。這些因素尤其需要可用的工具以密切監(jiān)測(cè)建議用于防止皮膚UVR損傷的預(yù)防性 措施和療法的成功性和適當(dāng)性，其后果在從過(guò)早光老化到皮膚癌風(fēng)險(xiǎn)增加的范圍內(nèi)。在努 力全面評(píng)價(jià)個(gè)體皮膚狀態(tài)的過(guò)程中，以及因此它們對(duì)光老化和皮膚癌的風(fēng)險(xiǎn)，向醫(yī)療工作 者提供盡可能多的見(jiàn)解以了解和交流他們患者的風(fēng)險(xiǎn)因素是至關(guān)重要的。因此，將期望評(píng)
4估個(gè)體對(duì)UVR損傷作用的遺傳傾向性以及鑒別與個(gè)體特定日光生活方式習(xí)慣有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn) 因素的診斷方法。這樣的方法可以包括從個(gè)體皮膚的表皮層或真皮層采集DNA樣本，用于定量指示 UVR損傷的線粒體生物標(biāo)記物，以及黑皮素1受體(MClR)基因分型，以鑒別參與控制黑素 生成的變體。通過(guò)考慮患者對(duì)光老化或癌癥的遺傳傾向性以及患者經(jīng)歷紫外輻射暴露的結(jié) 果，兩種測(cè)試的先后結(jié)合使用為醫(yī)療工作者提供了監(jiān)測(cè)、建議和治療患者的綜合性工具。與UVR有關(guān)的線粒體缺失人皮膚組織是高度復(fù)雜的并包含多種細(xì)胞類型。因此，鑒別人皮膚細(xì)胞的生物標(biāo) 記物是特別重要的。為了確定人皮膚中累積性UVR暴露的可靠標(biāo)記物，本發(fā)明人等考察了 使用線粒體DNA (mtDNA)而不是核DNA作為UV誘導(dǎo)的DNA損傷的生物標(biāo)記物的新設(shè)想(Pang et al.,1994 ；Berneburg et al.,1997 ；Birch-Machin et al.,1998 ；Birch-Machin, 2000)。使用mtDNA損傷作為人皮膚中累積性日光暴露的生物標(biāo)記物是相對(duì)較新的研究 領(lǐng)域，而先前的工作簡(jiǎn)單地比較了 mtDNA損傷以區(qū)別日光保護(hù)的和日光暴露的皮膚(Pang et al.，1994 ；Berneburg et al.，1997 ；Birch-Machin et al. ,1998)。由于非黑素瘤皮膚 癌(NMSC)主要在“經(jīng)?！北┞队趹敉馊展獾纳眢w部位(與“偶爾”暴露于日光的部位相對(duì)) 形成，因此這種方法受到了限制(Armstrong，2004)。在本申請(qǐng)人共同未決的具有公開(kāi)號(hào)W0/06/111029的PCT申請(qǐng)中(其內(nèi)容并入本 文作為參考)，將人線粒體DNA(mtDNA)中的3895bp缺失鑒別為UV誘導(dǎo)的DNA損傷的生物 標(biāo)記物。這種缺失在跨核苷酸547-4443的次要弧(minor arc)中鑒別到了。先前這種缺失 與基-塞二氏綜合征(Kearns Sayre Syndrome)以及慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹相關(guān)(Moraes et al. , 1995)。PCT公開(kāi)No. W0/06/111029中的實(shí)施例表明，3895bp mtDNA缺失的出現(xiàn)頻率在“經(jīng) ?！焙汀芭紶枴北┞队谌展獾纳眢w部位之間顯著不同。另外，這些實(shí)施例通過(guò)反復(fù)使用亞致 死劑量的UVA+UVB光源誘導(dǎo)體外3895bp缺失，證實(shí)了 3895bp缺失的病因?qū)W和日光的UVR 構(gòu)成部分之間的關(guān)聯(lián)。重要地，未針對(duì)W0/06/111029中所分析的皮膚樣本評(píng)估個(gè)體對(duì)日光損傷的遺傳 傾向性和皮膚癌風(fēng)險(xiǎn)。另外，這些樣本是通過(guò)本領(lǐng)域先前已知的疼痛性皮膚采集方法獲得 的。黑皮素1受體(MClR)基因分型黑皮素-1受體基因(MClR)編碼對(duì)黑色素合成至關(guān)重要的膜結(jié)合受體蛋白。MClR 的編碼區(qū)為高度多態(tài)的，并且已經(jīng)報(bào)道了變體與毛色表型和黑素瘤以及非黑素瘤皮膚癌 風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)(Rees, Pigment Cell Research, Vol. 13(3), 135-140 (6), June 2000 ； Kanetsky etal. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention Vol. 13,808-819, May 2004)。在皮膚白皙、對(duì)日光敏感的個(gè)體中黑素瘤發(fā)病率最高，表明通過(guò)增加黑色素合成對(duì) UV暴露產(chǎn)生反應(yīng)的能力是黑素瘤防御中的重要因素。家族研究已表明，白皙皮膚和紅色毛 發(fā)的個(gè)體在兩種MClR等位基因中存在功能性顯著變化。對(duì)于紅色毛發(fā)和白皙皮膚來(lái)說(shuō)， 等位基因D84E、R142H、R151C、R160H和D294H具有高外顯率。兩種外顯率較低的等位基因 (V60L和V92M)也是黑素瘤風(fēng)險(xiǎn)中的常見(jiàn)因素。
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因此，MC1R是日光敏感性和皮膚癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素的主要決定因素。評(píng)估黑皮素1 受體(MC1R)基因的DNA或氨基酸序列以鑒別是否存在與日光敏感性、對(duì)DNA損傷的易感性 增加和皮膚癌風(fēng)險(xiǎn)提高有關(guān)的某些變體為鑒別具有更高風(fēng)險(xiǎn)并且需要更主動(dòng)的監(jiān)測(cè)和治 療措施的患者提供了有價(jià)值的工具。只評(píng)價(jià)與日光敏感性有關(guān)的表型特征不能說(shuō)明這種風(fēng) 險(xiǎn)提尚。皮膚采樣目前在疾病(如癌癥)診斷或鑒定中使用的皮膚樣本采集方法包括創(chuàng)傷性或疼痛 性方法，它們可以導(dǎo)致測(cè)試個(gè)體非常不適。目前皮膚樣本采集方法的實(shí)例包括鉆孔活檢、膠 帶提取(tapelift)和外科手術(shù)切除。除了目前皮膚采集方法所造成的不適外，為了安全實(shí) 施，這些方法還必須由醫(yī)師進(jìn)行。這樣的創(chuàng)傷性技術(shù)具有其他缺點(diǎn)，包括感染的風(fēng)險(xiǎn)、樣本采集的不便和所采集樣 本丟失或誤鑒別的可能。在需要頻繁或定期采樣的情況下，將會(huì)放大感染和不便，如在UVR 暴露監(jiān)測(cè)方案和長(zhǎng)期療法評(píng)估中。而且，與這些創(chuàng)傷性試驗(yàn)方法有關(guān)的時(shí)間和成本使其難 以對(duì)大規(guī)模人群進(jìn)行快速基因分型和DNA損傷評(píng)估。因此，期望提供非創(chuàng)傷性或微創(chuàng)性皮 膚采樣方法，其可以在家庭、臨床或美容環(huán)境中方便、快速地實(shí)施。出于使申請(qǐng)人認(rèn)為已知的信息與本發(fā)明具有可能相關(guān)性的目的，提供了該背景資 料。不允許將任何之前的信息用于或視為構(gòu)成針對(duì)本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于測(cè)定皮膚樣本中MC1R變體和線粒體標(biāo)記物的方 法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種用于確定受試者的皮膚狀態(tài)和對(duì)UVR損傷的遺傳 傾向性的診斷方法，其包括(a)從受試者采集組織樣本；(b)測(cè)定第一組織樣本的線粒體DNA(mtDNA)變異；(c)測(cè)定第二組織樣本的一種或多種黑皮素1受體(MC1R)變體；和(d)根據(jù)對(duì)皮膚樣本中mtDNA變異和MC1R變體的檢測(cè)，確定受試者的皮膚狀態(tài)和 對(duì)UVR損傷的遺傳傾向性。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了本發(fā)明方法在預(yù)測(cè)光老化、UVR損傷或皮膚病的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了本發(fā)明方法在確定用于防止或改善光老化、UVR損 傷或皮膚癌的預(yù)防性或治療性處理的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于監(jiān)測(cè)光老化、UVR損傷或皮膚病的非創(chuàng)傷 性方法，其包括(a)使用非創(chuàng)傷性皮膚采樣技術(shù)從受試者采集皮膚樣本；(b)在規(guī)定的一段時(shí)間內(nèi)，以固定的時(shí)間間隔測(cè)定皮膚樣本的線粒體DNA (mtDNA) 變異；和(c)確定在規(guī)定的一段時(shí)間內(nèi)所鑒別的mtDNA變異中的任何變化。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于監(jiān)測(cè)受試者對(duì)光老化、UVR損傷或皮膚病 的預(yù)防性和治療性處理的反應(yīng)的方法，其包括
(a)從受試者采集第一皮膚樣本；(b)測(cè)定該第一皮膚樣本的線粒體DNA(mtDNA)變異；(c)測(cè)定該第一皮膚樣本的一種或多種黑皮素1受體(MC1R)變體；(d)根據(jù)該第一皮膚樣本中的mtDNA變異和MC1R變體的檢測(cè)，確定受試者的皮膚 狀態(tài)和對(duì)UVR損傷的遺傳傾向性；(e)提供對(duì)于光老化、UVR損傷或皮膚病的預(yù)防性或治療性處理；(f)從受試者采集第二皮膚樣本；(g)測(cè)定該第二皮膚樣本的線粒體DNA (mtDNA)變異；(h)在規(guī)定的一段時(shí)間內(nèi)，以固定的時(shí)間間隔重復(fù)步驟(f)和(g)；和(i)比較第一皮膚樣本和以固定的時(shí)間間隔獲取的皮膚樣本之間的mtDNA變異水 平，以檢測(cè)mtDNA變異的變化，從而監(jiān)測(cè)該處理的有效性；以及(j)可選地，根據(jù)受試者的遺傳傾向性和在mtDNA變異中所檢測(cè)的變化而調(diào)整該處理。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種篩選用于治療光老化、UVR損傷或皮膚病的有 效治療劑或藥妝劑的方法，其包括(a)從受試者采集第一皮膚樣本；(b)測(cè)定該第一皮膚樣本的線粒體DNA (mtDNA)變異；(c)用該治療劑或藥妝劑治療受試者；(d)在規(guī)定的一段時(shí)間后，從受試者采集第二皮膚樣本；(e)測(cè)定該第二皮膚樣本的線粒體DNA (mtDNA)變異；和(f)比較該第一皮膚樣本和該第二皮膚樣本相對(duì)于對(duì)照的mtDNA變異水平以確定 該治療劑或藥妝劑的有效性。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種確定受試者光損傷水平的方法，其包括(a)從受試者采集皮膚樣本；(b)測(cè)定該皮膚樣本的線粒體DNA (mtDNA)缺失；(c)將該皮膚樣本的mtDNA缺失水平與根據(jù)同齡人所劃分的一組mtDNA缺失相比 較，并為該受試者評(píng)定光老化；和(d)通過(guò)比較受試者的實(shí)足年齡和所評(píng)定的光老化以確定該受試者的光損傷水平。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于確定受試者對(duì)UVR損傷的皮膚狀態(tài)和遺 傳傾向性的診斷試劑盒，其包括(a)用于采集組織樣本的材料；和(b)用于實(shí)施MC1R基因分型和mtDNA變異檢測(cè)的適合引物、探針和試劑。


在以下參考所附附圖的詳細(xì)說(shuō)明中，本發(fā)明的這些和其他特征將變得更加清楚。圖1示出了與使用本發(fā)明方法采自鼻和腳跟的皮膚樣本中的3895bp mtDNA缺失 水平有關(guān)的實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)。圖2示出了與使用本發(fā)明方法采自各個(gè)身體部位的皮膚細(xì)胞中的3895bp mtDNA缺失水平有關(guān)的實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)。圖3示出了與使用本發(fā)明方法采自各個(gè)身體部位的皮膚細(xì)胞中的3895bp mtDNA 缺失水平有關(guān)的實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)。圖4是顯示在通過(guò)各種非創(chuàng)傷性皮膚采集方法所采集的樣本中的擴(kuò)增產(chǎn)物的存 在的凝膠。圖5是顯示在通過(guò)各種非創(chuàng)傷性皮膚采集方法所采集的樣本中的擴(kuò)增產(chǎn)物的存 在的凝膠。圖6至11顯示了對(duì)所測(cè)試受試者的等位基因變體進(jìn)行基因分型的結(jié)果。圖12顯示了提供測(cè)試R160H等位基因變體的測(cè)定結(jié)果的凝膠。圖13顯示了劃分為同齡人的人群的3895bp mtDNA缺失水平。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了預(yù)測(cè)、診斷和監(jiān)測(cè)皮膚狀態(tài)和皮膚疾病的方法。這些方法包括將非 創(chuàng)傷性皮膚采樣技術(shù)與確定線粒體突變和黑皮素1受體(MC1R)變體的測(cè)定相聯(lián)合。在這 點(diǎn)上，這些方法提供了用于評(píng)估遺傳傾向性和與疾病、老化和紫外輻射(UVR)損傷有關(guān)的 風(fēng)險(xiǎn)因素的綜合工具。這些方法還使得能夠評(píng)估患者對(duì)治療劑、皮膚護(hù)理產(chǎn)品和治療方案 的反應(yīng)。定義除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技 術(shù)人員通常理解的含義相同。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“約”指與所說(shuō)明的數(shù)值有近士 10%變化范圍。應(yīng)理解無(wú)論是 否明確指出，這樣的變化范圍始終包含于本文所提供的任何給定數(shù)值中。如本文所用的，“等位基因”是指占據(jù)染色體上特定位置的給定DNA序列的若干種 可替代形式。如本文所使用的，“循環(huán)閾值”(CT)是核酸序列的靶擴(kuò)增升高至背景之上的點(diǎn)，其 是通過(guò)如熒光信號(hào)的信號(hào)進(jìn)行指示的。CT與所研究序列的量負(fù)相關(guān)。如本文所用的，“診斷”是指使用存在或不存在突變或突變組合作為疾病診斷或管 理中的因素。突變的檢測(cè)可以是疾病診斷中的步驟。如本文所用的，“缺失”是指從核酸的連續(xù)序列中去除DNA或mtDNA的一個(gè)區(qū)域。 缺失的大小可以在一個(gè)堿基至數(shù)千個(gè)堿基或更大的范圍。如本文所用的，“線粒體DNA”或“mtDNA”為存在于線粒體中的DNA。如本文所用的，“突變”涵蓋了來(lái)自野生型序列的核酸或線粒體DNA中的任何修 飾或變化，包括但不限于點(diǎn)突變、轉(zhuǎn)換、插入、顛換、易位、缺失、倒轉(zhuǎn)、重復(fù)、重組或它們的組 合。序列的修飾或變化可以從單個(gè)堿基的變化擴(kuò)展到整個(gè)DNA片段的加入或消除。術(shù)語(yǔ)“樣本”指來(lái)源于受試者皮膚的任何制備物。例如，使用本文所述的非創(chuàng)傷性 方法獲得的細(xì)胞樣本可以分離多核苷酸、多肽或線粒體DNA以用于本發(fā)明的方法。用于本 發(fā)明的樣本通常取自皮膚的真皮或表皮。優(yōu)選地，使用本文所討論的非創(chuàng)傷性或微創(chuàng)性皮 膚采樣方法從皮膚表面獲取該樣本。術(shù)語(yǔ)“皮膚”指身體的外部保護(hù)性覆蓋物，由真皮和表皮組成，并應(yīng)理解為包括汗腺和皮脂腺以及毛囊結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該皮膚為哺乳動(dòng)物皮膚，優(yōu)選人類。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“皮膚狀態(tài)”指相對(duì)于由于日光暴露、曬黑床(tanning bed)或 UVR相關(guān)疾病等累積的UVR損傷量而言的皮膚狀況。如本文中互換使用的，術(shù)語(yǔ)“療法”和“治療(或處理)”指意在改善受試者狀況而 進(jìn)行的干預(yù)。改善可以是主觀的或客觀的并且涉及改善皮膚疾病、病癥或狀態(tài)相關(guān)的癥狀、 防止其發(fā)展或改變其病理學(xué)。因此，以最廣泛的含義使用術(shù)語(yǔ)療法和治療(或處理)，并包 括疾病、病癥或狀態(tài)在各個(gè)階段的防止(預(yù)防)、緩和、減輕和治愈。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋了防止受 試者狀況惡化。因此，需要療法/治療的受試者包括那些已經(jīng)患有疾病、病癥或狀態(tài)的人以 及那些有患該疾病、病癥或狀態(tài)傾向或有發(fā)展該疾病、病癥或狀態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的人以及那些要防 止該疾病、病癥或狀態(tài)的人。用于確定皮膚狀態(tài)和評(píng)估對(duì)皮膚疾病的遺傳傾向性的測(cè)定本發(fā)明的方法包括將非創(chuàng)傷性皮膚采樣技術(shù)與在鑒別個(gè)體對(duì)皮膚疾病的遺傳傾 向性以及與UVR暴露有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素中有效的測(cè)定相聯(lián)合。這些測(cè)定可以單獨(dú)進(jìn)行或與另 一個(gè)結(jié)合進(jìn)行。這些測(cè)定的結(jié)合使用提供了同時(shí)評(píng)估遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素和日光生活方式習(xí)慣的 獨(dú)特能力，從而為醫(yī)護(hù)人員提供了用于更好地監(jiān)測(cè)、建議和治療易患或患有光老化、UVR損 傷或皮膚病的患者的診斷工具。用于檢測(cè)線粒體突變的測(cè)定線粒體DNA (mtDNA)動(dòng)力學(xué)是一種重要的診斷工具。mtDNA中的突變經(jīng)常是疾病發(fā) 展的初始指示，并可以用作指示與疾病發(fā)作有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素的生物標(biāo)記物。同樣，由于與核 DNA相比，單位細(xì)胞的線粒體DNA的拷貝數(shù)更高，因此它是依賴于極微量核酸的測(cè)定的更可 靠的靶標(biāo)。因此，本發(fā)明的方法將用于采集皮膚樣本的非創(chuàng)傷性技術(shù)與用于檢測(cè)人線粒體 基因組中突變的測(cè)定相聯(lián)合。如本文所討論的，測(cè)量皮膚樣本中線粒體DNA變異水平可以鑒別相對(duì)于累積性日 光暴露和UVR損傷而言的患者皮膚狀態(tài)。此外，以固定的時(shí)間間隔(如每?jī)芍芑蛎吭?測(cè) 量mtDNA，可以為醫(yī)護(hù)人員提供用于比較治療推薦的實(shí)時(shí)、定量監(jiān)測(cè)工具，以便確定它們?cè)?防止由UVR造成的皮膚損傷中的有效性。因此，本發(fā)明提供了一種用于確定相對(duì)于累積性UVR損傷而言的患者皮膚狀態(tài)的 方法，其包括將非創(chuàng)傷性皮膚采集技術(shù)與檢測(cè)線粒體變異的測(cè)定相結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的一 個(gè)實(shí)施方式，線粒體突變選自由缺失、取代和插入組成的組。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方 式，突變?yōu)閙tDNA缺失。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，突變是PCT申請(qǐng)no. W0/06/111029 中所鑒別的3895bp mtDNA缺失。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，突變是如SEQ ID N0:1中 所示的3895bp缺失。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，mtDNA突變對(duì)應(yīng)于如SEQ IDN0 2中 所示的序列。實(shí)施例部分提供了非創(chuàng)傷性采集皮膚樣本和測(cè)定線粒體突變的示例性方法。使用 任何適當(dāng)?shù)囊阎椒?，可以從樣本中提取mtDNA。提取mtDNA后，對(duì)線粒體基因組的全部或 一個(gè)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，并且可以包括對(duì)線粒體基因組測(cè)序，如在本領(lǐng)域已知的和，例如在“現(xiàn) iV^^^^^^t^^ (Current Protocols in Molecular Biology) "(Ausubel et al., John Wiley & Sons，New York, 2007)中所描述的。同樣地，可以從本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的 適用方法中選擇用于檢測(cè)mtDNA中突變的存在的方法。例如，分析mtDNA可包括mtDNA測(cè)
9序、用PCR擴(kuò)增mtDNA、DNA印跡、RNA印跡、蛋白質(zhì)印跡，DNA-蛋白質(zhì)印跡雜交、變性高效液 體色譜、雜交至微陣列、生物芯片或基因芯片、分子標(biāo)記物分析、生物傳感器、熔融溫度分布 曲線或上述任何的組合。可以使用任何合適的方法對(duì)線粒體DNA測(cè)序。優(yōu)選地，在測(cè)序前通過(guò)PCR擴(kuò)增 mtDNA。在本領(lǐng)域中，PCR的方法是熟知的并且可以如Mullis and Faloona，1987，Methods Enzymol. , 155 335中所述進(jìn)行?？梢灾苯訉?duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序或?qū)⑵淇寺≈凛d體中，然后再將 該載體置于細(xì)菌宿主中。DNA測(cè)序方法的實(shí)例在R. L. Jr and Smith，L. M.，1991，Rapid DNA sequencing by horizontal ultrathin gelelectrophoresis, Nucleic Acids Res. 19 4121—4126 禾口 Luckey，J.A.，et al, 1993, high speed DNA sequencing by capillary gel eletrophoresis, Methods Enzymol. 218 :154_172 中找至lj。在 Hopgood, R. , et al, 1992, Strategies for automated sequencing of human mtDNA directly fromPCR products, Biotechniques 13 :82_92 禾口 Tanaka, M. et al,1996, Automated sequencing of mtDNA, Methods Enzymol. 264 :407_421 中描述了 PCR 和 mtDNA 測(cè)序的結(jié)合使用。黑皮素1受體(MC1R)基因分型黑皮素1受體是黑素生成中的關(guān)鍵控制點(diǎn)并決定了皮膚中色素累積的量。假定皮 膚色素決定了個(gè)體對(duì)致癌UVR的天然保護(hù)的程度，則MC1R基因分型可以確定對(duì)由UVR暴 露所引起的DNA損傷的易感性并評(píng)估與皮膚癌相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素。這樣，評(píng)價(jià)黑皮素1受體 (MC1R)基因的DNA或氨基酸序列以鑒別某些變體是否與日光敏感性和UVR損傷易感性提高 有關(guān)，這為確定患病風(fēng)險(xiǎn)更大并且需要更主動(dòng)的監(jiān)測(cè)和治療措施的個(gè)體提供了有價(jià)值的工 具。本發(fā)明方法將非創(chuàng)傷性皮膚采集技術(shù)與用于MC1R基因分型的測(cè)定相聯(lián)合。從 皮膚樣本中提取的DNA或RNA可以用于鑒別一種或多種MC1R變體等位基因。例如，可以 同時(shí)測(cè)試與黑素瘤風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)的七種等位基因變體D84E、R142H、R151C、R160H、D294H、 V60L和V92M?？商鎿Q地，對(duì)最常見(jiàn)的與皮膚癌風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)的五種等位基因變體，即D84E、 R151C、D294H、V60L和V92M進(jìn)行MC1R基因分型。在SEQ ID NO :3中示出了包含變體的MC1R 基因。另外,在SEQ ID N0:4中示出了 MC1R RNA序列。因此，本發(fā)明提供了一種用于確定個(gè)體對(duì)皮膚損傷或癌癥的遺傳傾向性的方法， 包括將非創(chuàng)傷性皮膚采集技術(shù)與用于鑒別皮膚樣本中一種或多種MC1R變體存在的測(cè)定相 結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，測(cè)試的MC1R變體選自由等位基因變體D84E、R142H、 R151C、R160H、D294H、V60L和V92M組成的組。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，測(cè)試的MC1R 變體選自由D84E、R151C、D294H、V60L和V92M組成的組。實(shí)施例部分提供了用于非創(chuàng)傷性采集皮膚樣本和進(jìn)行MC1R基因分型的示例性方 法。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，與mtDNA突變檢測(cè)不同，其由于UVR暴露方式不同而可能導(dǎo) 致個(gè)體一生中發(fā)生波動(dòng)，MC1R基因分型的結(jié)果在個(gè)體一生中不會(huì)變化。因此，如果需要，在 患者一生中可以僅對(duì)MC1R測(cè)試一次。由于MC1R基因的序列是遺傳的并且在人的一生中不會(huì)變化，因此無(wú)論哪一身體 組織為樣本，基因分型測(cè)定如用于評(píng)價(jià)MC1R變體的那些均將在個(gè)體中產(chǎn)生相同的結(jié)果。本 領(lǐng)域技術(shù)人員將承認(rèn)盡管可以通過(guò)對(duì)皮膚進(jìn)行非創(chuàng)傷性采集方法獲得樣本，但也可以從任 何其他身體組織采集樣本以獲得相同基因型。采集用于本發(fā)明方法的適合組織在本領(lǐng)域中
10是廣泛了解的并且可以包括這些非限制性實(shí)例，如口腔組織、肌肉組織、神經(jīng)組織等。相同 情況對(duì)于線粒體測(cè)定是不正確的，它是組織特異的體細(xì)胞突變。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí) 施方式，提供了一種包括從受試者采集組織樣本的方法，其中所述組織樣本為不同于皮膚 樣本的樣本。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，提供了一種從受試者采集組織的方法，其中所 述組織為口腔樣本?？梢允褂萌魏芜m合的已知方法從樣本中提取DNA或RNA?？梢允褂萌鏏BI’s a qPCR Taqman SNP基因分型測(cè)定的本領(lǐng)域所承認(rèn)的技術(shù)來(lái)確定特異等位基因的檢測(cè)(https:// products, appliedbiosystems. com/ab/en/US/direct/)。同樣地，制備自定義引物和探針 的方法在本領(lǐng)域中是熟知的(見(jiàn)，例如，Ausubel等人編著的“現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) (Current Protocols inMolecular Biology) ”，John Wiley & Sons，Inc.，NY)?？商鎿Q地，可以根據(jù)對(duì)MC1R基因的氨基酸序列的評(píng)價(jià)來(lái)評(píng)估等位基因變體。用于 進(jìn)行氨基酸分析的技術(shù)在本領(lǐng)域中是熟知的并且可以包括，例如，高效液相色譜法(HPLC)。確定皮膚類型和皮膚癌的風(fēng)險(xiǎn)本發(fā)明所述方法不但可以用于評(píng)估個(gè)體中等位基因變體的存在，而且還可以用于 確定皮膚類型，即個(gè)體的菲茨帕特里克皮膚光型(Fitzpatrick phototype)的近似結(jié)果。 在這方面，MC1R基因分型的結(jié)果還可以將個(gè)體分成以相關(guān)的癌癥風(fēng)險(xiǎn)為特征的特定皮膚類型。將這些皮膚類型定義如下皮膚類型1的特征在于個(gè)體具有與皮膚癌風(fēng)險(xiǎn)最相關(guān)的四種等位基因變體中的 兩種或更多種。皮膚類型2的特征在于個(gè)體具有與皮膚癌風(fēng)險(xiǎn)最相關(guān)的四種等位基因變體中的一種。皮膚類型3或更高的類型的特征在于個(gè)體不具有與皮膚癌風(fēng)險(xiǎn)最相關(guān)的四種等 位基因變體。因此，根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，提供了一種基于MC1R基因分型而鑒別個(gè)體皮膚類型和 皮膚癌風(fēng)險(xiǎn)因素的方法。采集皮膚組織的非創(chuàng)傷性方法本發(fā)明為基因分型或診斷測(cè)試提供采集皮膚樣本的非創(chuàng)傷性或微創(chuàng)性技術(shù)。 在本發(fā)明上下文中，“微創(chuàng)性”是指導(dǎo)致穿透一層或多層皮膚但抽少量血或不抽血的那 些技術(shù)。用于采集皮膚樣本的非創(chuàng)傷性或微創(chuàng)性技術(shù)的非限制性實(shí)例包括，但不限于， 使用手術(shù)膠帶的膠帶提取、用8%扁桃酸濕潤(rùn)的無(wú)菌拭子、用蒸餾水濕潤(rùn)的無(wú)菌拭子、 蠟條、棉簽、使用無(wú)菌外科手術(shù)刀刮下的皮膚碎屑、使用木制刮刀刮下皮膚碎屑、膠粘墊 (CapSure Clean-up Pad, Arcturus)的粘性表面、LCM MacroCap (Arcturus)的薄膜、 LCM MacroCap (Arcturus)的加熱膜和使用小號(hào)針(例如，28號(hào))以采集皮膚組織的微芯 (micro-core)0樣本可以采集自皮膚的真皮層或表皮層，并且可以來(lái)源于如下的身體部位，例如， 腳跟、鼻、內(nèi)臂、耳、口、頭皮、胸部、肩部、臀部、背部、面部、頸背、手和/或頭部。樣本可以如 從來(lái)源所獲得的一樣直接使用，或者經(jīng)過(guò)預(yù)處理改變樣品性質(zhì)后使用。因此，皮膚樣本可以 在使用前進(jìn)行預(yù)處理，例如，用防腐劑、試劑等進(jìn)行預(yù)處理。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解一次可以使用多于一種的采樣技術(shù)。此外，在需要采集過(guò) 程的情況下，例如，隨時(shí)間監(jiān)測(cè)皮膚狀態(tài)時(shí)，在測(cè)試期間可以單獨(dú)或共同使用相同或不同的 技術(shù)。在這點(diǎn)上，可以僅進(jìn)行一次皮膚采集，或以固定的時(shí)間間隔采取，如每?jī)芍芑蛎吭?。技術(shù)人員還將理解，某些采集方法產(chǎn)生極低水平的核酸(約0. lng)，其不能用于 靶向核DNA的測(cè)定；然而，豐度大很多的線粒體DNA靶標(biāo)(約大1000倍)將特別適合于這 樣極低收率的采集方法。以下實(shí)施例表明通過(guò)本發(fā)明的非創(chuàng)傷性方法采集的皮膚細(xì)胞，提 供了與通過(guò)先前使用的皮膚采集方法所獲得的mtDNA相當(dāng)?shù)淖銐蚨嗟膍tDNA。參考本發(fā)明的具體方法，在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種非創(chuàng)傷性采集技術(shù)，其包 括無(wú)菌拭子的使用，如采集口腔細(xì)胞時(shí)使用的那些或棉簽拭子。從其包裝取出無(wú)菌拭子并 用其摩擦所感興趣的皮膚部位。優(yōu)選地，為了確保采集到足夠數(shù)量的皮膚細(xì)胞以用于基因 分型或診斷目的，對(duì)所述部位摩擦約15次。盡管下文參考具體實(shí)施例描述了本發(fā)明，但是 所述方法還可以用于采集皮膚樣本以用于診斷或鑒定疾病、老化或紫外輻射暴露以及鑒別 與此相關(guān)的突變。擦拭皮膚后，將拭子放入無(wú)菌管。為了維持其中所含的遺傳材料(即DNA)的完整 性，可以根據(jù)需要向該管中加入緩沖液。然后，利用本領(lǐng)域熟知的方法提取DNA。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，將使用極小號(hào)針(28或29號(hào))的微創(chuàng)性技術(shù)用于 采集用于遺傳研究目的的皮膚細(xì)胞。在該實(shí)施方式中，通過(guò)刺穿皮膚的帳篷狀層(tented layer)從受試者的真皮和表皮中采集皮膚細(xì)胞從而使得只抽取少量的血或不抽血，但是微 量的真皮和表皮組織粘附在針的內(nèi)芯中。可以使用，例如，手指、鑷子或其他類型的夾子使 皮膚升高而形成帳篷狀。該皮膚材料包含在針內(nèi)直到將其提取出用于進(jìn)一步處理(即DNA 提取)。為了將該皮膚樣本從針中壓出，將磷酸鹽緩沖鹽水加入到針的柱管內(nèi)，然后用活塞 迫使其進(jìn)入無(wú)菌管。利用本領(lǐng)域熟知的方法提取DNA。如以下實(shí)施例所舉例說(shuō)明的，用于采 集皮膚樣本的這種微創(chuàng)性方法得到了足夠用于評(píng)估DNA或mtDNA損傷(例如，由紫外輻射 所引起的)的DNA或mtDNA。如上述的實(shí)施方式，這一獲得皮膚樣本的方法是安全的并且無(wú) 痛的。而且，如以下所舉例說(shuō)明的，允許采集足夠的DNA或mtDNA用于進(jìn)行精確測(cè)定。診斷和監(jiān)測(cè)皮膚狀態(tài)以及檢測(cè)與疾病有關(guān)的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素如本文所述的，本發(fā)明的測(cè)定可以單獨(dú)使用以(例如)評(píng)估皮膚狀態(tài)或遺傳風(fēng)險(xiǎn)， 或結(jié)合使用，以評(píng)估對(duì)皮膚病的遺傳傾向性和鑒別與個(gè)體特定生活方式有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素。 如以下所討論的，對(duì)這些因素的鑒別和監(jiān)測(cè)在確定針對(duì)UVR損傷、光老化和皮膚病的有效 預(yù)防性和治療性措施中是至關(guān)重要的。診斷和監(jiān)測(cè)皮膚狀態(tài)定期使用如遮光劑和防曬霜的皮膚護(hù)理產(chǎn)品的多個(gè)個(gè)體不正確地使用這些產(chǎn)品， 不能使用足夠的量或以推薦的時(shí)間間隔再次使用，產(chǎn)生了保護(hù)的錯(cuò)覺(jué)，從而導(dǎo)致對(duì)UVR暴 露的增加。此外，直到最近，個(gè)體在日光暴露期間定期使用的遮光劑和防曬霜通常防護(hù)UVB 的誘變作用，但沒(méi)有包含針對(duì)UVA輻射有害作用的試劑。這些因素尤其需要可用的工具以確定相對(duì)于UVR損傷的初始皮膚狀態(tài)，并通過(guò)研 究過(guò)程而監(jiān)測(cè)被建議用于防止對(duì)皮膚造成進(jìn)一步UVR損傷的預(yù)防性措施和療法的成功性 和適當(dāng)性。以如每?jī)芍芑蛎吭碌囊?guī)則時(shí)間間隔(或任何其他合適的時(shí)間間隔)，通過(guò)非創(chuàng)傷 性皮膚樣本采集，測(cè)量患者皮膚中線粒體DNA缺失的水平可以為醫(yī)護(hù)人員提供實(shí)時(shí)、定量
12的監(jiān)測(cè)工具，以比較治療建議，從而確定它們?cè)诜乐褂蒛VR所引起的皮膚損傷中的有效性。 這種采集方法允許在沒(méi)有任何副作用或不適的情況下定期采樣，并且如果期望，可以在家 進(jìn)行。出乎意料地，由于通過(guò)擦拭所提供的極低收率的DNA足夠進(jìn)行這樣的分析，因此皮膚 樣本采集技術(shù)如擦拭特別適合于mtDNA突變的檢測(cè)?，F(xiàn)在介紹實(shí)施例，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法用于采集皮膚細(xì)胞，以定 量與紫外輻射所引起的損傷有關(guān)的生物標(biāo)記物(見(jiàn)實(shí)施例1)。具體地，本發(fā)明的方法用于 采集皮膚樣本以測(cè)試人線粒體基因組中的缺失，即如上所述的3895bp mtDNA缺失。該實(shí)施 例表明通過(guò)本發(fā)明的非創(chuàng)傷性方法所采集的皮膚細(xì)胞提供了與通過(guò)先前皮膚采集方法所 獲得的mtDNA相當(dāng)?shù)挠糜讷@得結(jié)果的足夠mtDNA。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，來(lái)自人皮膚的表皮層或真皮層的用于定量線粒體 DNA靶標(biāo)的DNA樣本的非創(chuàng)傷性采集，為醫(yī)護(hù)工作者提供了以防止這一后果(如光老化和皮 膚癌)為目的而監(jiān)測(cè)防止UVR相關(guān)皮膚和DNA損傷的治療方案和生活方式建議的有效性的 措施。普通技術(shù)人員還將理解，醫(yī)護(hù)工作者在鑒別不良日光習(xí)慣或無(wú)效保護(hù)方法中使用 的mtDNA分析的效用。這種效用在實(shí)施例6中被證實(shí)，其中根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，對(duì) 兩位年齡和膚色相似的個(gè)體分析了遮光劑使用的結(jié)果，以評(píng)估日光保護(hù)方案的有效性。光老化的確定利用微創(chuàng)性采樣程序結(jié)合線粒體標(biāo)記物的鑒別的本發(fā)明的其他診斷方法是光老 化的確定。如實(shí)施例部分所述的，這種方法的目的在于通過(guò)使用微創(chuàng)性皮膚采集技術(shù)在個(gè) 體面部或頭部的皮膚組織上取樣并測(cè)量與UVR損傷有關(guān)的線粒體靶標(biāo)(如mtDNA缺失)的 量來(lái)評(píng)價(jià)個(gè)體的UVR暴露。然后，將這個(gè)結(jié)果與通過(guò)相同方法所得到的結(jié)果的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 比較并基于檢測(cè)的mtDNA缺失水平將個(gè)體劃分成同齡組。為了評(píng)定光老化，將個(gè)體mtDNA 分析的結(jié)果與他們的實(shí)足年齡進(jìn)行比較，以確定他們與同齡組中其他個(gè)體相比是否具有更 高或更低的光致?lián)p傷。因此，通過(guò)利用微創(chuàng)性技術(shù)采集用于線粒體DNA標(biāo)記物分析的皮膚組織微芯，醫(yī) 療工作者可以鑒別個(gè)體的光老化并確定他們的光老化是否與其實(shí)足年齡一致或不一致。光 老化確定由此為醫(yī)護(hù)人員提供了更適當(dāng)?shù)刂贫ǖ挚构饫匣?、UVR損傷或皮膚病的預(yù)防性和 治療性措施的方法。確定對(duì)疾病的遺傳傾向性為了全面評(píng)價(jià)個(gè)體的光老化風(fēng)險(xiǎn)和他們對(duì)皮膚癌的風(fēng)險(xiǎn)，需要為醫(yī)療工作者提供 盡可能多的信息以使他們了解并交流其患者的風(fēng)險(xiǎn)因素。MC1R基因分型的使用不但有助于 個(gè)體對(duì)由UVR暴露所引起的DNA損傷的易感性和發(fā)展皮膚癌的風(fēng)險(xiǎn)，它還提供了有價(jià)值的 工具以鑒別具有更大風(fēng)險(xiǎn)并且可能需要更主動(dòng)的監(jiān)測(cè)和治療措施的患者。因此，本發(fā)明提供了采集用于MC1R基因分型的DNA樣本的非創(chuàng)傷性方法。根據(jù)本 發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，從通過(guò)本發(fā)明方法采集的細(xì)胞中所提取的DNA可以用于鑒別與黑素 瘤風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān)的一種或多種等位基因變體。所述方法可用來(lái)評(píng)估個(gè)體中這些變體的存在 并且可以用于另外確定所述個(gè)體的皮膚類型。因此，MC1R基因分型的結(jié)果使得可以將個(gè)體 分成以相關(guān)癌癥風(fēng)險(xiǎn)為特征的特定皮膚類型。結(jié)合分析(coupled analysis)
通過(guò)考慮遺傳傾向性和他們陽(yáng)光生活方式習(xí)慣的最終結(jié)果，MClR基因分型和 mtDNA分析的結(jié)合使用為醫(yī)療工作者提供了監(jiān)測(cè)、建議并且更好地治療患者的工具。多種測(cè) 定的這一結(jié)合使用提供了同時(shí)評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)因素和后果的獨(dú)特能力。重要地，可以暫時(shí)將MClR 測(cè)試從用于mtDNA測(cè)試的非創(chuàng)傷性采集的重復(fù)測(cè)試中去除，但仍然結(jié)合地使用。正如以上 所討論的，由于從MClR測(cè)試中獲得的信息將在個(gè)體一生中都不會(huì)變化而通過(guò)測(cè)量線粒體 DNA缺失所闡明的DNA損傷水平將根據(jù)UVR暴露類型而波動(dòng)，因此這是可能的。值得注意的是這樣的事實(shí)，即由UVR所引起的皮膚損傷是多因素過(guò)程。因此，不 能假設(shè)具有MClR變體的個(gè)體的損傷將始終比不具有該變體的個(gè)體高，也不能假設(shè)報(bào)告定 期使用遮光劑的個(gè)體的損傷將一定比報(bào)告不使用遮光劑的個(gè)體低。因此，MClR基因分型與 mtDNA分析的結(jié)合為醫(yī)療工作者提供了向他們所護(hù)理的那些患者提供更知情的建議所需的 獨(dú)特見(jiàn)解。治療劑和皮膚護(hù)理產(chǎn)品的評(píng)價(jià)出于醫(yī)學(xué)和美容的目的，本發(fā)明方法也可用于廣泛的皮膚篩選。本發(fā)明方法可以 用于基因分型和/或測(cè)量與皮膚癌(非黑素瘤皮膚癌和黑素瘤)有關(guān)的各種生物標(biāo)記物。 在任何時(shí)間點(diǎn)和從任何外部解剖位置，評(píng)估個(gè)體皮膚中由于紫外輻射所造成的DNA損傷水 平的能力為皮膚健康的獨(dú)特和信息性篩選試驗(yàn)以及對(duì)現(xiàn)有和新型治療劑、皮膚護(hù)理產(chǎn)品和 皮膚護(hù)理方案的安全性和效力的評(píng)估提供了基礎(chǔ)。此外，通過(guò)鑒別受試者皮膚病或狀態(tài)的 潛在特異遺傳變化，可以容易地確定患者是否將對(duì)特定治療劑、皮膚護(hù)理產(chǎn)品或方案產(chǎn)生 反應(yīng)以及其反應(yīng)的程度。試劑盒根據(jù)所期望的應(yīng)用，可以將本發(fā)明方法中所用的采集材料包裝成消費(fèi)試劑盒或在 臨床環(huán)境中使用的醫(yī)療試劑盒。這樣的試劑盒不僅可以包括一種或多種采樣裝置，如無(wú)菌 拭子、棉簽拭子或針，而且還可以包括用于基因分型和/或鑒別mtDNA突變所必需的其他材 料。試劑盒可以可選地包括進(jìn)行診斷測(cè)定所需的試劑，如緩沖液、鹽、檢測(cè)試劑等。其 他組分如用于分離和/或處理測(cè)試樣品的緩沖液和溶液也可以包括在試劑盒內(nèi)。試劑盒的 一種或多種組分可以是凍干的，并且試劑盒還可以包括適合于凍干組分重新溶解的試劑。如果合適，試劑盒還可以容納反應(yīng)容器、混合容器及有利于測(cè)試樣本制備的其他 部件。試劑盒還可以可選地包括使用說(shuō)明書(shū)，其可以以紙質(zhì)形式或以如磁盤、CD、DVD等的 計(jì)算機(jī)可讀形式提供。為了更好地理解本文所述的發(fā)明，提供了以下實(shí)施例。應(yīng)理解這些實(shí)施例旨在說(shuō) 明本發(fā)明的舉例說(shuō)明性實(shí)施方式，而不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1 :3895bp人mtDNA缺失的分析使用本發(fā)明方法分析PCT申請(qǐng)?zhí)朩0/06/111029中所鑒別的3895bp mtDNA缺失。 按照以下所提供的方法進(jìn)行mtDNA的采集和提取。1、通過(guò)用無(wú)菌拭子擦拭皮膚部位約15次來(lái)采集皮膚樣本。皮膚樣本采自腳跟(η =41)、鼻(η = 43)、內(nèi)臂(η = 20)、耳(η = 5)、肩部(η = 5)、臀部(η = 5)和背部(= 5)。
2、根據(jù)生產(chǎn)商的規(guī)程，使用可商購(gòu)的試劑盒(QiaAMP DNAMicro Kit，產(chǎn)品編號(hào) 56304, Qiagen, Maryland USA)提取 mtDNA。3、使用 HS-DNA Quant-it dsDNA HS測(cè)定試劑盒(產(chǎn)品編號(hào) Q32851，Invitrogen， California USA)在 Qubit 熒光計(jì)(產(chǎn)品編號(hào) Q32857，Invitrogen, California USA)上 對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行定量。4、然后，使用 iQ Sybr Green Supermix (產(chǎn)品編號(hào) 170-8882，Bio-Rad, California USA)和下列引物通過(guò)實(shí)時(shí)PCR(rt-PCR)定量3895bp缺失的水平，該引物為正向5，-CTGCTAACCCCATACCCCGAAAATGTTG-3，(SEQ IDNO 5)；反向5，-GAAGGATTATGGATGCGGTTGCTTGCGTGAG-3，(SEQID NO 6)。在該實(shí)施例中，使用一對(duì)擴(kuò)增引物來(lái)擴(kuò)增指示3895bp缺失存在的靶標(biāo)區(qū)。在 3895bp序列缺失發(fā)生后，該正向引物與mtDNA的剪接區(qū)重疊(即在mtDNA基因組的547和 4443之間位置的剪接)。因此，只有在3895bp部分缺失時(shí)才能發(fā)生該重疊引物的延伸，而 產(chǎn)生尺寸正確的擴(kuò)增產(chǎn)物。在定量3895bp缺失的步驟中，RT-PCR反應(yīng)設(shè)置如下12. 5μ 1 的 iQ Sybr Green Supermix ；350nmol 的正向引物(SEQ ID NO 5)；350nmol 的反向引物(SEQ ID NO 6)；5 μ 1 的模板(約 0. 5ng 的 dsDNA)；加水至25μ1;循環(huán)參數(shù)步驟1 :95°C保持3分鐘；步驟2 95 °C保持30秒；步驟3 67. 5°C保持 30 秒；步驟4 72 °C保持30秒；步驟5:讀取板；步驟2-5循環(huán)45次；以1°C的間隔繪制55-110°C的熔化曲線，每3秒讀取一次在10°C保持10分鐘。這些測(cè)定的結(jié)果在圖1至3中示出，并且證實(shí)從很少暴露于日光/UV輻射的區(qū)域 (即腳跟和臀部)取得的皮膚拭子與從經(jīng)常暴露的那些區(qū)域(即鼻和耳)所取得的樣品之 間存在明顯的差別。與通常保護(hù)不受紫外輻射的區(qū)域(如腳跟和臀部)相比，在受到高水 平紫外輻射的區(qū)域(如鼻和肩)中3895bp缺失的水平顯著升高。如圖1和2所示，3895bp缺失的實(shí)時(shí)PCR循環(huán)閾值(CT)表明，與那些很少暴露于 紫外輻射的部位(腳跟或臀部)相比，在經(jīng)常(鼻或耳)或偶而(肩部或背部)暴露于紫 外輻射的皮膚部位中缺失發(fā)生率更高。圖3示出了與從很少暴露于紫外輻射的部位(例如，腳跟或內(nèi)臂)所獲得的皮膚 細(xì)胞中采集的mtDNA相比，從經(jīng)常暴露于紫外輻射的部位(例如，鼻或耳)所獲得的皮膚細(xì) 胞中采集的mtDNA的特征在于3895bp缺失標(biāo)記物水平升高。這些結(jié)果還表明，根據(jù)本發(fā)明的皮膚樣本采集的有效性，以便獲得足夠的mtDNA
15進(jìn)行所述測(cè)定。這樣，本發(fā)明所述的非創(chuàng)傷性皮膚采集方法在獲得用于分析的mtDNA方面 與創(chuàng)傷性方法(例如，申請(qǐng)人的PCT申請(qǐng)?zhí)朩0/06/111029中所使用的方法)的有效性類似。實(shí)施例2 皮膚采集方法的比較為了鑒別哪種方法(如果有)能得到用于分子分析如定量實(shí)時(shí)PCR的足夠數(shù)量和 質(zhì)量的核酸，測(cè)試了五種不同的非創(chuàng)傷性皮膚采集方法。所測(cè)試的五種方法為·使用手術(shù)膠帶的膠帶提??；.Biore 膠粘條； 用8 %扁桃酸濕潤(rùn)的無(wú)菌拭子；·用蒸餾水濕潤(rùn)的無(wú)菌拭子；和 蠟條。用70%的異丙醇對(duì)區(qū)域消毒后，對(duì)該皮膚表面應(yīng)用膠帶提取、Biore條和蠟條。施 加穩(wěn)固的壓力，然后快速除去所述膠帶或條。施加穩(wěn)固的壓力，然后快速除去膠帶或條。首 先將拭子放入在8%的扁桃酸或蒸餾水無(wú)菌溶液中，然后在用70%的異丙醇清潔皮膚后用 力摩擦所感興趣的皮膚部位。從3位個(gè)體采集皮膚細(xì)胞后，將每個(gè)采集媒介放入到200 μ 1磷酸鹽緩沖鹽水溶液 (PBS)中并在56 °C培育過(guò)夜。然后，使用Qiagen公司的QiaAMP DNA微型試劑盒、口腔拭子規(guī)程(產(chǎn)物編號(hào) 51304)對(duì)所有樣本進(jìn)行核酸提取。使用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)對(duì)純化的樣本進(jìn) 行定量以確定提取程序是否成功。表1 從通過(guò)五種非創(chuàng)傷性方法所采集的皮膚中提取的DNA的量的確定 當(dāng)考慮核酸濃度和樣本純度時(shí)，對(duì)于使用水或者扁桃酸作為潤(rùn)濕劑的拭子樣本或 者蠟樣本得到了最一致的結(jié)果。接著，對(duì)所有樣本進(jìn)行PCR以確定是否存在擴(kuò)增抑制劑，或在處理過(guò)程中是否發(fā) 生了顯著的樣本降解。根據(jù)下列條件擴(kuò)增樣本表2 樣本擴(kuò)增的PCR條件 所用引物為線粒體DNA引物，其具有以下提供的序列12s 正向引物序列 5，-CGTTCCAGTGAGTTCACCCTC-3，(SEQID NO 7)12s 反向引物序歹Ij R 5，-CACTCTTTACGCCGGCTTCTATT-3，(SEQ ID NO 8)根據(jù)以下規(guī)程，在DNA Engine Tetrad(Bio-Rad)上循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)1、94°C 保持 2 分鐘2、94°C 保持 30 秒
3、64°C 保持 30 秒4、72°C 保持 30 秒5、將步驟2-4重復(fù)39次6、4°C 保持然后，將擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳并用溴化乙錠染色。圖4中提供了 擴(kuò)增結(jié)果，其中凝膠的上半部分包括泳道 1 :500ng IOObp GeneRuler SM0323 (Fermentas)泳道2 個(gè)體1的Biore泳道3 個(gè)體1的水潤(rùn)濕拭子泳道4 個(gè)體1的扁桃酸潤(rùn)濕拭子泳道5 個(gè)體1的手術(shù)膠帶泳道6:個(gè)體1的蠟泳道7 個(gè)體2的Biore泳道8 個(gè)體2的水潤(rùn)濕拭子
泳道9 個(gè)體2的扁桃酸潤(rùn)濕拭子泳道10 個(gè)體2的手術(shù)膠帶泳道11:個(gè)體2的蠟泳道12:空白泳道13:陰性擴(kuò)增對(duì)照泳道14:陽(yáng)性擴(kuò)增對(duì)照泳道15-18:空白而其中凝膠的下半部分包含泳道1 個(gè)體3的Biore泳道2 個(gè)體3的水潤(rùn)濕拭子
泳道3 個(gè)體3的扁桃酸潤(rùn)濕拭子泳道4 個(gè)體3的手術(shù)膠帶泳道5:個(gè)體3的蠟泳道 6:500ng IOObp GeneRuler SM0323 (Fermentas)泳道7 =Biore提取物陰性對(duì)照泳道8 水潤(rùn)濕拭子提取物的陰性對(duì)照泳道9 扁桃酸潤(rùn)濕拭子提取物的陰性對(duì)照泳道10 手術(shù)膠帶提取物的陰性對(duì)照泳道11 蠟提取物的陰性對(duì)照泳道12:空白泳道13 陰性擴(kuò)增對(duì)照(上述泳道13上樣的重復(fù)加載)泳道14 陽(yáng)性擴(kuò)增對(duì)照(上述泳道14上樣的重復(fù)加載)泳道15-18:空白結(jié)果沒(méi)有mtDNA是從使用Biore條收獲的皮膚細(xì)胞中采集的mtDNA所擴(kuò)增的。盡管水拭子擴(kuò)增的更明顯，但是水和扁桃酸的拭子均有擴(kuò)增。手術(shù)膠帶偶有擴(kuò)增。蠟擴(kuò)增明顯，但 是可能由于非無(wú)菌性質(zhì)或與蠟有關(guān)的處理困難，凝膠下半部分的泳道11中的提取物陰性 對(duì)照被污染了?？紤]到所有因素，本實(shí)施例表明使用無(wú)菌拭子是優(yōu)選的非創(chuàng)傷性皮膚樣本采集方 法。拭子可以是干燥的或用各種液體濕潤(rùn)的以有利于樣本的采集或緩沖。實(shí)施例3 其他皮膚采集方法的比較在本實(shí)施例中，為了鑒別哪種方法(如果有的話)能得到用于分子分析如定量實(shí) 時(shí)PCR的足夠數(shù)量和質(zhì)量的核酸，對(duì)五種其他非創(chuàng)傷性皮膚樣本采集方法進(jìn)行了測(cè)試。使用下列方法，從一位個(gè)體中采集皮膚樣本兩次·使用無(wú)菌外科手術(shù)刀刮皮膚·使用木制刮刀刮皮膚·膠粘墊的粘性表面(CapSure Clean-up Pad, Arcturus)· LCM MacroCap 的薄膜(Arcturus)· LCM MacroCap 的加熱膜(Arcturus)首先通過(guò)用70%異丙醇擦拭進(jìn)行清潔以準(zhǔn)備皮膚。將木制刮刀和外科手術(shù)刀用力 地從皮膚表面通過(guò)以移出皮膚細(xì)胞，然后放入離心管中。無(wú)摩擦地將膠粘墊和膜用力地壓 靠在皮膚上以采集皮膚細(xì)胞。使用兩種不同的核酸提取方法處理多個(gè)采集。使用本領(lǐng)域熟知的蛋白酶K(PK)消 化對(duì)第一組進(jìn)行提取，而使用QiaAMP DNA微型試劑盒(Qiagen 51304)對(duì)第二組進(jìn)行提取。然后，使用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)對(duì)用Qiagen試劑盒處理的樣品進(jìn)行定 量。由于PK消化組中的那些樣本不夠清潔而不能用于這類型的定量，因此未進(jìn)行定量。表3 從通過(guò)其他采集方法所采集的皮膚中提取的DNA的量的確定(Qiagen提取 的 DNA) 根據(jù)實(shí)施例2中提供的規(guī)程對(duì)樣本進(jìn)行擴(kuò)增。然后將擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳并用溴化乙錠染色。圖5中示出了 結(jié)果，其中該凝膠包括泳道1 500ng 的 IOObp GeneRuler(SM0323)
泳道2 陰性擴(kuò)增對(duì)照
泳道3 陽(yáng)性擴(kuò)增對(duì)照
泳道4 PK緩沖液木制刮屑
泳道5 PK緩沖液外科手術(shù)刀刮屑
泳道6 PK緩沖液CapSure墊
泳道7 PK 緩沖液 MacroCap
泳道8 PK緩沖液MacroCap加熱的
泳道9 PK緩沖液木制刮刀刮屑陰性提取對(duì)照
泳道10=PK緩沖液外科手術(shù)刀刮屑陰性提取對(duì)照
泳道11=PK緩沖液CapSure陰性提取對(duì)照
泳道12=PK緩沖液MacroCap陰性提取對(duì)照
泳道13=PK緩沖液MacroCap加熱膜陰性提取對(duì)照
泳道14= QiaAMP外科手術(shù)刀刮屑
泳道15=QiaAMP CapSure 墊
泳道16= QiaAMP木制刮刀刮屑
泳道17= QiaAMP外科手術(shù)刀刮屑陰性提取對(duì)照
泳道18:QiaAMP CapSure墊陰性提取對(duì)照
泳道19= QiaAMP木制刮刀刮屑陰性提取對(duì)照
泳道20= QiaAMP試劑陰性對(duì)照使用PK緩沖液對(duì)外科手術(shù)刀刮屑和MacroCap 進(jìn)行擴(kuò)增，而使用QiaAMP 試劑盒 對(duì)CapSure 墊進(jìn)行很好的擴(kuò)增。與皮膚擦拭相比，發(fā)現(xiàn)使用本實(shí)施例中測(cè)試的方法所采集 的mtDNA的量和所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的量沒(méi)有那樣有效。實(shí)施例4 使用針采集皮膚樣本使用針在9位個(gè)體的5個(gè)不同身體部位采集皮膚樣本。所述身體部位包括眉毛、 耳垂、頸背、手和腳跟。如上所述使用針，將皮膚在樣本采集人的手的拇指和食指之間捏起或提起成帳篷 狀。將針穿過(guò)該皮膚，抽取少量的血或不抽血。通過(guò)將磷酸鹽緩沖鹽水加入針的柱管中，然 后把活塞插入無(wú)菌管中將樣品從針中壓出從而將該皮膚樣本從針中提取出來(lái)。然后，使用 Qiagen公司的QiaAMP DNA微型試劑盒(Qiagen產(chǎn)物編號(hào)51304)從含有該皮膚組織的溶 液提取DNA。然后，為了鑒別3895bp mtDNA缺失對(duì)該樣本進(jìn)行擴(kuò)增。本實(shí)施例的反應(yīng)條件和循環(huán)參數(shù)與上述實(shí)施例1中所提供的相同。表3中列出了這些結(jié)果。表4 通過(guò)針?biāo)杉钠つw樣本的結(jié)果 很明顯，通過(guò)該采集方法獲得的材料足夠進(jìn)行分子分析如實(shí)時(shí)PCR。具體地，如表 3所證明的，已經(jīng)對(duì)指示3895bp mtDNA缺失的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了檢測(cè)和定量。因此，通過(guò)針采 集方法采集的皮膚樣本得到了足夠用于這種類型的測(cè)定的DNA。實(shí)施例5 =MClR變體的檢測(cè)從三位受試者采集口腔樣本。每位受試者用自來(lái)水或瓶裝水漱口并將水吐出。從 保護(hù)性包裝中取出棉簽拭子并抓住柄部。握住棉簽拭子柄部的同時(shí)，將棉簽放入受試者口 中并用棉簽?zāi)Σ撩骖a內(nèi)側(cè)30秒。將該拭子放入無(wú)菌管并密封以備其它處理。使用ABI的qPCR Taqman SNP基因分型測(cè)定來(lái)確定特定等位基因的檢測(cè)。對(duì)每位 受試者測(cè)試七種等位基因變體D84E、R142H、R151C、R160H、D294H、V60L和V92M。使用 ABI 的測(cè)定(https://products, appliedbiosystems. com/ab/en/US/ direct/)鑒別了 D84E、R142H、R151C，V60L 禾Π V92M 的基因型，如下V60L-測(cè)定 #0751905410D84E-測(cè)定 #0751905520V92M-測(cè)定 #0203340520R142H-測(cè)定 #02754163410R151C-測(cè)定 #0203340420如下所列出的，使用定制的引物和探針來(lái)檢測(cè)D294H等位基因變體。正向引物MC1R-294 CGCCCTCATCATCTGCAATG SEQ ID NO 9 ；反向引物MC1R-294 GGCTGTGGAAGGCGTAGAT SEQ ID NO 10 ；探針1MC1R-294V1VIC CCATCATCGACCCCCT SEQ ID NO 11 ；探針2MC1R-294M1FAM :CCATCATCCACCCCCT SEQ ID NO: 12。所有測(cè)定使用的反應(yīng)條件與在Custom Taqman SNP基因分型測(cè)定規(guī)程中所概括 的一樣。使用Sac II消化，測(cè)試R160H等位基因變體。使用引物擴(kuò)增MC IR基因中的DNA 的靶標(biāo)區(qū)。然后，對(duì)該擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sac II消化。凝膠的泳道1至4(參見(jiàn)圖12)顯示了 三位測(cè)試受試者和對(duì)照樣本的結(jié)果。所有這四個(gè)樣本均為純合野生型。對(duì)于該等位基因位 點(diǎn)，指示純合野生型的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為436bp，其在用SAC II消化后得到327bp的產(chǎn)物。 在純合變體中未發(fā)生消化，因此所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的尺寸仍為436bp。圖6至12中示出了測(cè)試的結(jié)果。對(duì)每位個(gè)體進(jìn)行兩次測(cè)試，對(duì)照樣本也測(cè)試兩次。 V60L的對(duì)照樣本基因型為雜合體，V92M的為純合型變體，而其余等位基因?yàn)橐吧?。確定 測(cè)試的第一個(gè)體具有類型3皮膚(未發(fā)現(xiàn)MClR變體)。確定測(cè)試的第二個(gè)體具有類型3皮 膚(未發(fā)現(xiàn)MClR變體)。確定測(cè)試的第三個(gè)體為類型2皮膚(對(duì)于變體V60L和R151C為純合體，而對(duì)于R142H為雜合體)。很明顯，通過(guò)這種采集方法獲得的材料足夠進(jìn)行MClR基因分型。具體地，通過(guò)口 腔拭子采集方法采集的DNA樣本得到了足夠用于這種類型的測(cè)定的DNA。實(shí)施例6 遮光劑方案的有效性的分析背景UVB為導(dǎo)致紅斑(曬傷)的UVR光譜，該紅斑是對(duì)紫外線發(fā)生過(guò)度暴露的目視提 示。通常使用紅斑的發(fā)生頻率和嚴(yán)重性作為個(gè)體日光保護(hù)習(xí)慣成功性的量度。然而，目前已 知道UVA會(huì)造成皮膚和DNA損傷，但是直到最近，遮光劑和防曬霜中才包含了針對(duì)阻斷UVA 的作用劑。因此，出現(xiàn)了這種情況，使用遮光劑的個(gè)體保護(hù)自身不受UVB的紅斑誘導(dǎo)作用， 但是卻可能遭受比他們不使用遮光劑時(shí)會(huì)受到的UVA誘變作用更長(zhǎng)時(shí)間的暴露。在這種 情況下，個(gè)體會(huì)自我報(bào)告稱他們使用了遮光劑，而醫(yī)療工作者會(huì)錯(cuò)誤地評(píng)估正用于防止UVR 損傷的措施，而事實(shí)上該患者并未受到對(duì)UVA的保護(hù)，并且最終風(fēng)險(xiǎn)仍會(huì)很高。如實(shí)施例1中所實(shí)施的，對(duì)以固定的時(shí)間間隔(如每?jī)芍芑蛎吭?用棉簽拭子所 采集的表皮中，3895bp線粒體DNA缺失水平的測(cè)量可以為醫(yī)療工作者提供實(shí)時(shí)、定量的監(jiān) 測(cè)工具以比較治療建議從而確定它們?cè)诜乐褂蒛VR所引起的皮膚損傷中的有效性。這種采集方法使得能夠沒(méi)有任何副作用或不適地定期采樣。該拭子得到了極低水 平的核酸(約0. Ing)，這不可用于靶向核DNA的測(cè)定，然而線粒體DNA靶標(biāo)(如3895bp缺 失)的豐度要大得多(約大1000倍)，并且特別適合具有這樣的極低收率的采集方法。研究通過(guò)年齡和膚色類似的兩位個(gè)體的結(jié)果，證明了在鑒別不良日光習(xí)慣或無(wú)效保護(hù) 法中的mtDNA缺失分析的效用?；颊?02完全不使用遮光劑，而患者225有效地使用遮光 劑。他們的損傷水平反映患者202的這一行為具有高約10倍的3895bp缺失的量，表明與患 者225相比，由UVR暴露造成的DNA損傷水平較高(其中3CT的差異相當(dāng)于靶標(biāo)量10倍的 差異)。盡管這兩位個(gè)體的表型表明UVR相關(guān)的皮膚損傷風(fēng)險(xiǎn)將會(huì)是相似的或等同的，但是 大概由于如遮光劑使用的行為差異，結(jié)合非創(chuàng)傷性拭子采集的3895缺失能夠證明患者202 的風(fēng)險(xiǎn)更大。表5 =UVR損傷的患者分布圖和風(fēng)險(xiǎn)因素 實(shí)施例7 分析MClR變體和mtDNA缺失以預(yù)測(cè)日光護(hù)理方案的有效性以下證明了監(jiān)測(cè)DNA損傷和UVR相關(guān)的3895生物標(biāo)記物的結(jié)合使用作為評(píng)估日 光護(hù)理方案有效性以及確定MClR變體狀態(tài)的代表，其中年齡、膚色和遮光劑使用類似的兩 位患者具有不同的DNA損傷水平，這大概是不同MC IR基因型的副產(chǎn)物?；颊?00不具有 與對(duì)UVR對(duì)皮膚損傷作用的易感性提高有關(guān)的變體，而患者303在氨基酸位置92處具有一 個(gè)變體。盡管從表型上說(shuō)這兩位患者非常類似并且在菲茨帕特里克(Fitzpatrick)皮膚光 型分級(jí)(類型3)中得分也相似，但是具有MClR變體的患者與不具有變體的患者相比，DNA損傷水平提高了 3倍，反應(yīng)了易感性的提高(其中ICT的差異為約3倍的靶標(biāo)量差異)。表6 兩位患者中MClR差異和mtDNA缺失的比較分析 如前所討論的，UVR造成的皮膚損傷是多因素過(guò)程，并因此不能假設(shè)具有MClR變 體的個(gè)體將始終比不具有的個(gè)體的損傷高，也不能假設(shè)報(bào)告定期使用遮光劑的個(gè)體將一定 比報(bào)告不使用遮光劑的個(gè)體的損傷低。將這兩種測(cè)試相結(jié)合為醫(yī)療工作者提供了向他們所 護(hù)理的那些患者提供更知情的建議所需的見(jiàn)解。由于在DNA損傷譜中具有變體和不具有變體的個(gè)體通常相等地分布，以下兩個(gè)表 對(duì)這一點(diǎn)進(jìn)行了說(shuō)明。表7A和7B =MClR差異與DNA損傷水平的比較A B 沒(méi)有ν患者無(wú)變體一個(gè)ν患者在v60、v80或v92具有一個(gè)雜合變體兩個(gè)ν患者在v60、v80和/或v92具有兩個(gè)雜合變體或一個(gè)純合變體> Ov患者在v60、v80或v92具有至少一個(gè)變體低低損傷組；C(t)為高于總體平均值的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差平均+高平均及以上損傷組；C(t)為高于總體平均值的少于一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差當(dāng)僅考慮通常與風(fēng)險(xiǎn)表型無(wú)關(guān)的變體時(shí)，在以下兩個(gè)表中觀察到了例外情況。氨 基酸位置60和92處的這些變體在低損傷人群中的人數(shù)不足，可能表明了他們對(duì)由于MClR 變體所造成損傷的易感性與缺少如皮膚白皙或紅色毛發(fā)的目視提示之間的獨(dú)特結(jié)合，并表 明風(fēng)險(xiǎn)增加導(dǎo)致了攜帶者中始終較高的損傷水平。表8 =MClR v60和v92變體與DNA損傷水平的比較僅使用v60和v92的匯合比例測(cè)試 沒(méi)有ν患者無(wú)變體一個(gè)ν 患者在v60、v80或v92具有一個(gè)雜合變體兩個(gè)ν患者在v60、v80和/或v92具有兩個(gè)雜合變體或一個(gè)純合變體> Ov患者在v60、v80或v92具有至少一個(gè)變體低低損傷組；C(t)為高于總體平均值的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差平均+高平均及以上損傷組；C(t)為高于總體平均值的少于一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差實(shí)施例8 用于光老化測(cè)定的針采樣出于評(píng)價(jià)UVR暴露的目的，提供了利用微創(chuàng)性采樣程序結(jié)合線粒體標(biāo)記物的其他 工具，其中通過(guò)用小號(hào)針(28號(hào))采集面部或頭部(如耳垂或接近眉嵴處)的皮膚組織，將 微芯壓出到溶液中，進(jìn)行核酸提取并測(cè)量與UVR損傷有關(guān)的線粒體靶標(biāo)的量，如3895bp缺 失(見(jiàn)實(shí)施例1)。然后，將這個(gè)結(jié)果與結(jié)果的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較并根據(jù)3895bp缺失的水平 將其劃分成同齡組。通過(guò)如下方法產(chǎn)生了該數(shù)據(jù)庫(kù)測(cè)量從0歲至80歲以每隔5歲年齡 間隔的多個(gè)個(gè)體中的3895bp缺失水平，尋找每個(gè)年齡間隔的簇群或方法，除去異常值并將 3895bp缺失水平的范圍與年齡范圍相關(guān)聯(lián)。例如，21. 5-23. 5的CT值可以與45-65歲的年齡范圍相關(guān)聯(lián)。然后，將個(gè)體測(cè)試的結(jié)果與他們的實(shí)足年齡相比以確定他們的光損傷是否 比同齡組的其他個(gè)體更高或更低，并根據(jù)他們的結(jié)果評(píng)定光老化。為了生成該數(shù)據(jù)庫(kù)，從289位個(gè)體的耳垂和眉嵴處采集微芯。如圖13所示，提取 DNA和定量3895bp缺失水平后，如上所述構(gòu)建該數(shù)據(jù)庫(kù)，并將年齡組分為他們之間具有顯 著差異的3個(gè)組(ρ <0.01)。盡管已經(jīng)參考某些具體實(shí)施方式
描述了本發(fā)明，但在不背離本發(fā)明的精神和范圍 的前提下，其各種變形對(duì)于本領(lǐng)域那些技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人 員顯而易見(jiàn)的是，所有這些變形均包含在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種確定受試者的皮膚狀態(tài)和對(duì)UVR損傷的遺傳傾向性的診斷方法，包括(a)從受試者采集組織樣本；(b)測(cè)定第一皮膚樣本的線粒體DNA(mtDNA)變異；(c)測(cè)定第二皮膚樣本的一種或多種黑皮素1受體(MC1R)變體；以及(d)根據(jù)對(duì)所述皮膚樣本中的mtDNA變異和MC1R變體的檢測(cè)，確定所述受試者的皮膚狀態(tài)和對(duì)UVR損傷的遺傳傾向性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述變異選自由缺失、取代和插入組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述變異是mtDNA缺失。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述缺失是所述mtDNA基因組的核酸546至4444 之間的3895bp mtDNA缺失。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述一種或多種MClR變體選自由D84E、R142H、 R151C、R160H、D294H、V60L、和 V92M 組成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，至少所述第一組織樣本為使用非創(chuàng) 傷性或微創(chuàng)性皮膚采集技術(shù)獲得的皮膚樣本。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述皮膚樣本是使用采集皮膚組織的微芯的無(wú) 菌拭子、棉簽拭子、小號(hào)針或它們的組合采集的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述皮膚采集自所述受試者的真皮層或表皮層。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述皮膚樣本來(lái)源于腳跟、鼻子、內(nèi)臂、耳、口、頭 皮、胸部、肩部、臀部、背部、面部、頸背、手、頭部、或它們的組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法在預(yù)測(cè)光老化、UVR損傷或皮膚疾病中的應(yīng)用。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法在確定防止或改善光老化、UVR損傷或皮膚癌的預(yù)防性 或治療性處理中的應(yīng)用。
12.一種用于監(jiān)測(cè)光老化、UVR損傷或皮膚病的非創(chuàng)傷性方法，包括(a)使用非創(chuàng)傷性皮膚采樣技術(shù)從受試者采集皮膚樣本；(b)在規(guī)定的一段時(shí)間內(nèi)，以固定的時(shí)間間隔測(cè)定所述皮膚樣本的線粒體DNA(mtDNA) 變異；以及(c)確定在所述規(guī)定的一段時(shí)間內(nèi)鑒別的mtDNA變異中的任何變化。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述非創(chuàng)傷性皮膚采集技術(shù)產(chǎn)生超低水平的DNA。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述超低水平的DNA為約0.Ing的核酸。
15.一種用于監(jiān)測(cè)受試者對(duì)光老化、UVR損傷或皮膚病的預(yù)防性和治療性處理的反應(yīng) 的方法，包括(a)從受試者采集第一皮膚樣本；(b)測(cè)定所述第一皮膚樣本的線粒體DNA(mtDNA)變異；(c)測(cè)定所述第一皮膚樣本的一種或多種黑皮素1受體(MClR)變體；(d)根據(jù)對(duì)所述第一皮膚樣本中的mtDNA變異和MClR變體的檢測(cè)，確定所述受試者的 皮膚狀態(tài)和對(duì)UVR損傷的遺傳傾向性；(e)對(duì)光老化、UVR損傷或皮膚病提供預(yù)防性或治療性處理；(f)從受試者采集第二皮膚樣本；(g)測(cè)定所述第二皮膚樣本的線粒體DNA(mtDNA)變異；(h)在規(guī)定的一段時(shí)間內(nèi)，以固定的時(shí)間間隔重復(fù)步驟(f)和(g)；和(i)比較在所述第一皮膚樣本與所述以固定的時(shí)間間隔取得的皮膚樣本之間的mtDNA 變異水平以檢測(cè)mtDNA變異的變化，由此監(jiān)測(cè)所述處理的有效性；以及(j)可選地，根據(jù)所述受試者的遺傳傾向性和所檢測(cè)到的mtDNA變異的變化而調(diào)整所 述處理。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，使用非創(chuàng)傷性或微創(chuàng)性皮膚采集技術(shù)，獲得所 述第一皮膚樣本、第二皮膚樣本和以固定的時(shí)間間隔取得的皮膚樣本。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，用于采集所述第二皮膚樣本和以固定的時(shí)間 間隔取得的樣本的所述非創(chuàng)傷性或微創(chuàng)性皮膚采集技術(shù)產(chǎn)生超低水平的DNA。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述超低水平的DNA為約0.Ing的核酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述固定的時(shí)間間隔為每?jī)芍芑蛎吭隆?br> 20.一種篩選處理光老化、UVR損傷或皮膚病的有效治療劑或藥妝劑的方法，包括(a)從受試者采集第一皮膚樣本；(b)測(cè)定所述第一皮膚樣本的線粒體DNA(mtDNA)變異；(c)用所述治療劑或所述藥妝劑處理受試者；(d)在規(guī)定的一段時(shí)間后，從所述受試者采集第二皮膚樣本；(e)測(cè)定所述第二皮膚樣本的線粒體DNA(mtDNA)變異；以及(f)相對(duì)于對(duì)照，比較在所述第一皮膚樣本和所述第二皮膚樣本之間的mtDNA變異水 平以確定所述治療劑或藥妝劑的有效性。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，使用非創(chuàng)傷性或微創(chuàng)性皮膚采集技術(shù)獲得所 述第一皮膚樣本和第二皮膚樣本。
22.一種用于確定受試者的光損傷水平的方法，包括(a)從受試者采集皮膚樣本；(b)測(cè)定所述皮膚樣本的線粒體DNA(mtDNA)缺失；(c)將所述皮膚樣本的mtDNA缺失水平與根據(jù)年齡組所劃分的一組mtDNA缺失比較，并 評(píng)定所述受試者的光老化；和(d)通過(guò)比較所述受試者的實(shí)足年齡與所述評(píng)定的光老化，確定所述受試者的光損傷 水平。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述線粒體DNA缺失是3895bp缺失。
24.一種用于確定受試者的皮膚狀態(tài)和對(duì)UVR損傷的遺傳傾向性的診斷試劑盒，包括(a)用于采集組織樣本的材料；和(b)用于進(jìn)行MClR基因分型和檢測(cè)mtDNA變異的合適引物、探針和試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)測(cè)、診斷和監(jiān)測(cè)皮膚狀態(tài)和皮膚疾病的方法。這些方法將非創(chuàng)傷性皮膚采集技術(shù)的使用與用于確定線粒體DNA(mtDNA)變異和黑皮素1受體(MC1R)變體的一種或多種測(cè)定相結(jié)合，從而提供了用于鑒別、預(yù)測(cè)和/或監(jiān)測(cè)光老化、紫外輻射(UVR)損傷或皮膚病的綜合性工具。本發(fā)明的方法還可以在篩選新型治療劑、皮膚護(hù)理產(chǎn)品和治療方案中有效，并且還可以用于監(jiān)測(cè)受試者對(duì)預(yù)防性或治療性處理的反應(yīng)。
文檔編號(hào)C07K14/72GK101896622SQ200880119849
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2008年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月11日
發(fā)明者凱麗·魯濱遜, 加布里埃爾·達(dá)庫(kù)波, 卡特里娜·馬基, 安德烈亞·馬格格拉, 安德魯·哈博特爾, 布賴恩·賴古伊, 珍妮弗·克里德, 瑞安·帕爾, 羅伯特·塞耶, 馬克·伯奇-梅欽 申請(qǐng)人:起源基因組學(xué)公司