專利名稱：鑒定純種波爾山羊的線粒體分子遺傳特征標(biāo)記和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于利用分子生物學(xué)方法檢測(cè)生物物種的技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及波爾山羊線粒體DNA分子特征遺傳標(biāo)記，以及此標(biāo)記為基礎(chǔ)檢測(cè)純種波爾山羊的方法。
背景技術(shù)：
在肉食品的生產(chǎn)結(jié)構(gòu)中，牛羊肉低脂肪、高蛋白，不僅是優(yōu)質(zhì)的肉類產(chǎn)品，同時(shí)還是清真肉制品的主要原料。
波爾山羊(Capra hircus，Boer)是世界上公認(rèn)的優(yōu)秀肉用品種，具有個(gè)體大，初期生長(zhǎng)速度快，適應(yīng)性廣，繁殖性能好，出肉率高等優(yōu)良特性。中國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，畜牧業(yè)在農(nóng)業(yè)中占有極其重要的位置。但與畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家新西蘭、澳大利亞等相比有相當(dāng)大的差距。特別是養(yǎng)羊業(yè)，仍停留在傳統(tǒng)的品種低層次和飼養(yǎng)管理低水平上，品種差，散養(yǎng)多，規(guī)模小，效益低。波爾山羊是重點(diǎn)推廣的良種，成為改良地方山羊、促進(jìn)養(yǎng)羊業(yè)產(chǎn)業(yè)化的當(dāng)家品種。由于前期波爾山羊原種均從國(guó)外引進(jìn)，相對(duì)價(jià)格較昂貴，導(dǎo)致引進(jìn)回國(guó)繁殖選育的原種、純種價(jià)格相對(duì)較高。目前鑒定純種波爾山羊使用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，很不準(zhǔn)確，由此產(chǎn)生不法人員用雜交一代和雜交二代波本雜交羊冒充波爾山羊欺騙顧客的情況。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的能有效鑒定純種波爾羊的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種鑒定純種波爾山羊的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供鑒定純種波爾山羊的遺傳標(biāo)記。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的檢測(cè)純種波爾山羊的遺傳標(biāo)記物，其特征在于，所述遺傳標(biāo)記物含有SEQ ID NO9中第1900-1940所示的線粒體D-環(huán)區(qū)序列，并且其起始核苷酸為SEQ ID NO9中第528-1900位中的一個(gè)核苷酸，終止核苷酸為起始核苷酸為SEQ ID NO9中第1940-3274中的一個(gè)核苷酸，長(zhǎng)度為400-2700bp。
在另一優(yōu)選例中，所述的遺傳標(biāo)記物的長(zhǎng)度600-1800bp。
在另一優(yōu)選例中，所述的遺傳標(biāo)記物的序列如SEQ ID NO1所示。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種PCR引物對(duì)，其長(zhǎng)度為15-35個(gè)核苷酸，其中一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列相同，且另一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第1940-3274位所示的序列互補(bǔ)；或者其中一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列互補(bǔ)，且另一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第1940-3274位所示的序列相同；且所述引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為400-2700bp。
在另一優(yōu)選例中，所述引物的長(zhǎng)度為20-30個(gè)核苷酸。
在另一優(yōu)選例中，所述的引物選自SEQ ID NO3-8。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種檢測(cè)純種波爾山羊的試劑盒，它含有(a)特異性擴(kuò)增純種波爾羊遺傳標(biāo)記物的引物對(duì)，所述的引物長(zhǎng)度為15-35個(gè)核苷酸，其中一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列相同，且另一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第1940-3274位所示的序列互補(bǔ)；或者其中一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列互補(bǔ)，且另一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第1940-3274位所示的序列相同；并所述引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為400-2700bp；(b)TaqI酶。
在另一優(yōu)選例中，在所述的試劑盒中，所述引物對(duì)中的一個(gè)引物選自下組SEQ ID NO3、5、7；另一個(gè)引物選自下組SEQ ID NO4、6、8。
更佳地，所述引物對(duì)含有SEQ ID NO3、5、7和SEQ ID NO4、6、8所示的引物。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒，還具有陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種鑒定山羊是否是純種波爾山羊的方法，它包括步驟(a)抽提山羊的DNA；(b)將抽提的DNA作為模板，用特異性擴(kuò)增純種波爾山羊遺傳標(biāo)記物的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中所述的引物長(zhǎng)度為15-35個(gè)核苷酸，其中一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列相同，且另一個(gè)引物的序列與SEQID NO9中第1940-3274位所示的序列互補(bǔ)；或者其中一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列互補(bǔ)，且另一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第1940-3274位所示的序列相同；并且所述引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為400-2700bp；(c)對(duì)步驟(b)的擴(kuò)增產(chǎn)物用TaqI進(jìn)行酶切，酶切圖譜與陽性對(duì)照相同就表明被鑒定的山羊是純種波爾山羊。
在另一優(yōu)選例中，所述引物對(duì)中的一個(gè)引物選自下組SEQ ID NO3、5、7；另一個(gè)引物選自下組SEQ ID NO4、6、8。


圖1顯示了山羊線粒體中細(xì)胞色素b基因、D-環(huán)區(qū)和12srRNA基因的位置關(guān)系，相應(yīng)的序列示于SEQ ID NO9。
圖2A顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中擴(kuò)增的南非波爾山羊線粒體DNA細(xì)胞色素b基因和12srRNA基因之間的1614bp擴(kuò)增產(chǎn)物(SEQ ID NO1)的TaqI酶切示意圖。
圖2B顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中擴(kuò)增的關(guān)中奶山羊線粒體DNA細(xì)胞色素b基因和12srRNA基因之間的1614bp擴(kuò)增產(chǎn)物(SEQ ID NO2)的TaqI酶切示意圖。
圖3顯示了對(duì)不同山羊的含線粒體D-環(huán)區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切圖譜。其中各泳道是1、2為南非波爾山羊；3、4為澳大利亞波爾山羊；5、6為新西蘭波爾山羊；7為德系波爾山羊(高代雜交羊)；8為山東青山羊；9為關(guān)中奶山羊；10為薩能奶山羊；11為徐淮山羊；12為F1代雜交波爾羊；13為F2代雜交波爾羊。
圖4顯示了對(duì)不同山羊的含線粒體D-環(huán)區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切圖譜。其中各泳道是1為南非波爾山羊；12為薩能奶山羊；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11為山東青山羊。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，首次發(fā)現(xiàn)了純種波爾山羊的特征性的遺傳標(biāo)記物，即純種波爾山羊線粒體DNA D-環(huán)區(qū)(D-Loop區(qū))有特異性限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)(TaqI)區(qū)別于本地山羊。山羊線粒體DNA D-環(huán)區(qū)經(jīng)PCR擴(kuò)增，并用特異的限制性內(nèi)切酶(如TaqI)酶切擴(kuò)增產(chǎn)物后，純種波爾山羊所產(chǎn)生的酶切圖譜區(qū)別于本地山羊。本發(fā)明人在該遺傳標(biāo)記物的基礎(chǔ)上，開發(fā)了特異性擴(kuò)增純種波爾山羊遺傳標(biāo)記物或其片段的引物對(duì)和試劑盒，從而首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)純種波爾山羊的快速準(zhǔn)確鑒定。
高等動(dòng)物線粒體DNA(mtDNA)是一共價(jià)閉合的環(huán)狀雙鏈超螺旋DNA分子，長(zhǎng)約5.5微米，分子量在1×107道爾頓左右，大小約14-19kb，山羊線粒體長(zhǎng)15.8kb。
雖然mtDNA基因組的長(zhǎng)度及組織結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，但一級(jí)結(jié)構(gòu)上的進(jìn)化都很快，是單拷貝核DNA的5-10倍，約1％/106年。哺乳動(dòng)物mtDNA的突變方式主要是堿基置換(substitution)，包括轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transvertion)，很少有基因重排。
同種哺乳動(dòng)物個(gè)體之間的平均核苷酸順序歧異值通常在0.3％到4％之間，最大時(shí)竟達(dá)10％以上。mtDNA核苷酸序列的分歧程度能反映物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，這一特點(diǎn)在種群遺傳學(xué)和進(jìn)化分類學(xué)上得到了應(yīng)用。mtDNA復(fù)制起始區(qū)有一特殊結(jié)構(gòu)稱為D-loop區(qū)，約占線粒體基因組的6％，該區(qū)A-T堿基富集，為非編碼區(qū)，是動(dòng)物線粒體基因組中進(jìn)化速度最快的一段DNA序列(Upholt WB，Dawid I B，″Mapping of mitochondrial DNA of individual sheep and goatsRapidevolution in the D-loop region″，Cell，11571-583，1977；Cronin M A，″RapidCommunicationA unique Sac II restriction fragmentlength polymorphism inmitochondrial DNA of sheep and goats″，Journal of Animal Science，72(3)796，1977；Walberg M W，Clayton D A，.″Sequence and properties of the human KB celland mouse L cell D-loop regions of miochondrial DNA″.NucleicAcidRes，95411～5421，1981；Chang D D，Clayton D A，.“Proming of human mitochondrial DNAreplication occurs at the strand promoter”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82351～355，1985)。
D-loop區(qū)同時(shí)也是mtDNA的控制區(qū)。D-loop區(qū)特別適合于種內(nèi)群體水平的研究。mtDNA由卵細(xì)胞傳遞后代，屬于典型的母性遺傳。受精過程顯微觀察表明，雖然精子中含有線粒體并通過受精進(jìn)入了卵子，但與卵子中的相比，微不足道。目前普遍認(rèn)為高等動(dòng)物的mtDNA是母系遺傳的，一個(gè)個(gè)體就可以代表一個(gè)母系集團(tuán)，故通過幾只隨機(jī)的動(dòng)物個(gè)體樣本就可以了解一個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)。mtDNA母系遺傳特性同時(shí)為親子鑒定提供了可靠的理論依據(jù)。
動(dòng)物線粒體DNA具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速度快、母性遺傳、無組織特異性及提取方便等特點(diǎn)。正是由于mtDNA具有這些特點(diǎn)，因而它被廣泛用于哺乳動(dòng)物群體遺傳，種內(nèi)及種間親緣關(guān)系，系統(tǒng)發(fā)生，物種起源與分化，分類及育種等方面的研究。由于動(dòng)物線粒體特別是線粒體D-loop區(qū)具有變化快但相對(duì)穩(wěn)定的特點(diǎn)，因此，通過鑒定線粒體是否來自良種動(dòng)物品系可以判定該動(dòng)物個(gè)體是否為純種良種動(dòng)物品系(例外的情況是良種動(dòng)物品系的雌性與非良種動(dòng)物品系的雄性的雜交后代)。
本發(fā)明的理論基礎(chǔ)是，與其他山羊相比，純種波爾山羊線粒體D-環(huán)區(qū)含有一個(gè)額外的TaqI酶切位點(diǎn)(SEQ ID NO9中第1930位，或SEQ ID NO1中第911位)。因此先擴(kuò)增出含該酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物，再利用該酶切位點(diǎn)所產(chǎn)生的酶切圖譜的差異，可以方便、快速、有效地鑒別純種波爾山羊。
如本文所用，術(shù)語“波爾山羊特異性酶切位點(diǎn)”或“特異性酶切位點(diǎn)”指純種波爾山羊線粒體D-環(huán)區(qū)含有一個(gè)額外的TaqI酶切位點(diǎn)(SEQ ID NO9中第1930位，或SEQ ID NO1中第911位)。
參見圖1和SEQ ID NO9，其中顯示了山羊線粒體中細(xì)胞色素b基因、D-環(huán)區(qū)和12srRNA基因的位置關(guān)系。其中第1-1140位為細(xì)胞色素b基因，第1140-1278位為間隔區(qū)，第1279-2491位為D-環(huán)區(qū)，第2492-5173位為12srRNA基因。
雖然理論上只要擴(kuò)增引物對(duì)分別位于線粒體D-環(huán)區(qū)該特異性酶切位點(diǎn)的上下游，就可獲得含特異性酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物，但是由于波爾山羊線粒體D-環(huán)區(qū)與其他山羊相比存在某些核苷酸差異，因此將引物設(shè)計(jì)在D-環(huán)區(qū)容易導(dǎo)致擴(kuò)增反應(yīng)無法有效地獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。
一種優(yōu)選方法是將二個(gè)引物分別設(shè)計(jì)線粒體D-環(huán)區(qū)上游的山羊細(xì)胞色素b基因(Capra hircus mito...[gi17298008])(Kraus F，Miyamoto M M.1990.Rapid cladogenesis among the pecoran ruminantsEvidence frommitochondrial DNA sequences.Syst.Zool.40117～130)和下游的12srRNA基因(Capra hircus Phe-...[gi337103])(Mannen H，Nagata Y，TsujiS.2001.Mitochondrial DNA reveal that domestic goat(Capra hircus)aregenetically affected by two subspecies of bezoar (Capraaegagurus).Biochem Genet.39(5-6)145～154)。由于細(xì)胞色素b基因和12srRNA基因在各種山羊中是高度保守的，因此分別基于這兩個(gè)基因核苷酸序列的引物對(duì)可以有效地從各種山羊中擴(kuò)增出含D-環(huán)區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物，并供隨后的酶切分析使用。
此外，由于波爾羊特有的TaqI酶切位點(diǎn)位于SEQ ID NO9中第1930位，因此只要擴(kuò)增產(chǎn)物含有該位點(diǎn)，即可用于鑒別波爾羊。當(dāng)然，為了便于區(qū)分酶切產(chǎn)物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度宜為長(zhǎng)度為400-2700bp，更佳地為600-1800bp。
在優(yōu)選例中，本發(fā)明的波爾羊特異性遺傳標(biāo)記物的其起始核苷酸為SEQ IDNO9中第528-1900位中的一個(gè)核苷酸，終止核苷酸為起始核苷酸為SEQ ID NO9中第1940-3274中的一個(gè)核苷酸，且其長(zhǎng)度為400-2700bp。
可用于本發(fā)明的擴(kuò)增方法和條件沒有特別限制，可以采用常規(guī)的擴(kuò)增方法和條件?？刹捎靡淮蜳CR擴(kuò)增，也可以采用多次PCR擴(kuò)增(如巢式PCR)，以便進(jìn)一步減少擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶數(shù)，甚至只獲得一種所需的擴(kuò)增產(chǎn)物。
本發(fā)明所述的特異性擴(kuò)增引物可通過常規(guī)的DNA合成方法合成而得(例如可以用商業(yè)化的DNA自動(dòng)合成儀合成)。
用于本發(fā)明的DNA模板可用各種常規(guī)方法制備。優(yōu)選的方法包括(1)取少量山羊耳部組織或血液。耳部組織按常規(guī)方法抽提總DNA(總DNA中含線粒體DNA)，并用TE溶解。
(b)血液加3-10倍體積的蒸餾水后，在沸水中處理10分鐘，離心取上清為模板。
(c)先純化動(dòng)物線粒體，然后通過常規(guī)的基因組DNA提取方法提取純化線粒體DNA。
本發(fā)明方法可鑒別各種波爾山羊，其中包括(但并不限于)南非、澳大利亞和新西蘭的純種波爾山羊。
可用本發(fā)明方法將其他各種非波爾山羊與波爾山羊區(qū)分開，這些山羊包括(但并不限于)徐淮山羊，薩能奶山羊，山東青山羊，大西羊，關(guān)中奶山羊，波本雜交羊。
本發(fā)明方法還可有效將其他各種雜交山羊與波爾山羊區(qū)分開，德系波爾山羊(高代雜交山羊)，和F1代或F2代波本雜交羊包括(但并不限于)F1代波本雜交羊，其父本為純種波爾山羊，母本為徐淮山羊，薩能奶山羊，山東青山羊，大西羊，關(guān)中奶山羊，德系波爾山羊(高代雜交羊)；F2代雜交波爾山羊，其父本為純種波爾山羊，母本為F1代波本雜交山羊。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于
(a)提供了優(yōu)良山羊品系純種波爾山羊的一種分子特征遺傳標(biāo)記。
(b)利用這一分子特征遺傳標(biāo)記可方便準(zhǔn)確地鑒定外性特征與波爾山羊相似的山羊是否為純種波爾山羊。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1山羊細(xì)胞線粒體DNA制備可用以下三種方法分別制備山羊線粒體DNA方法1.
取少量山羊耳部組織或血液。耳部組織按常規(guī)方法抽提總DNA(總DNA中含線粒體DNA)，并用TE溶解。
方法2.
血液加3-10倍體積的蒸餾水后，在沸水中處理10分鐘，離心取上清為模板。
方法3先純化動(dòng)物線粒體，然后通過常規(guī)的基因組DNA提取方法提取純化線粒體DNA。
上述三種方法制備的DNA均可用于擴(kuò)增反應(yīng)。其中方法2最簡(jiǎn)便，但模板DNA質(zhì)量稍差。方法3最煩瑣，但模板DNA最純。
實(shí)施例2山羊細(xì)胞線粒體D-loop區(qū)PCR擴(kuò)增根據(jù)Genebank山羊細(xì)胞色素b基因(Capra hircus mito...[gi17298008])和12srRNA基因(Capra hircus Phe-...[gi337103])分別合成下列3對(duì)PCR引物進(jìn)行三輪巢式PCR擴(kuò)增。
序列(5’-3′)1.Goatmtb528 5′CCG ATT CTT CGC CTT CCA C 3′ (SEQ ID NO3)Goatmt12s783 5′GC CCA TTT CTT CCC ATT CCA3′ (SEQ ID NO4)2.Goatmtb570 5′AGC CCT CGC CAT AGT CCA CCT 3′ (SEQ ID NO5)Goatmt12s699 5′GGT TTG CTG AAG ATG GCG GTA 3′ (SEQ ID NO6)3.Goatmtb10205′ACA GCC AGT CGA ACA TCC CTA C 3′ (SEQ ID NO7)Goatmt12s142 5′TAC TCA CCG GGG CGT GGA TG3′ (SEQ ID NO8)注引物名稱中的b528表示對(duì)應(yīng)于細(xì)胞色素b基因第528位，12s783表示對(duì)應(yīng)于12s rRNA基因的第783位，其余依此類推。
以下PCR擴(kuò)增采用TAKARA公司LATaq酶進(jìn)行擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增效果較使用普通Taq酶好第一輪PCR擴(kuò)增10×LA緩沖液 3μl10mM dNTP1.2μlGoatmtb528 0.6μlGoatmt12s783 0.6μlLA Taq酶 0.3μl(TaKaRa公司)DH2O 23.3μl模板 1μl(總DNA含量100ng左右)反應(yīng)條件94℃預(yù)熱4min，94℃ 1min，68℃ 1min，72℃ 3min，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10min。
第二輪10×LA緩沖液3μl10mM dNTP 1.2μlGoatmtb570 0.6μlGoatmt12s6990.6μlLA Taq酶0.3μlDH2O 23.3μ1模板1μl(第一輪PCR產(chǎn)物)
反應(yīng)條件94℃預(yù)熱4min，94℃ 1min，68℃ 1min，72℃ 3min，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10min。
第三輪10×LA緩沖液 3μl10mM dNTP 1.2μlGoatmtb10200.6μlGoatmt12s143 0.6μlLA Taq酶 0.3μlDH2O 23.3μl模板 1μl(第二輪PCR產(chǎn)物)反應(yīng)條件94℃預(yù)熱4min，94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10min。
取第3次PCR產(chǎn)物(1614bp)用于限制性內(nèi)切酶酶切。
實(shí)施例3山羊細(xì)胞線粒體D-loop區(qū)PCR產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶圖譜采用TaKaRa公司的Taq I限制性內(nèi)切酶，按廠家推薦反應(yīng)條件進(jìn)行，反應(yīng)總體積20μl，直接取第三輪PCR產(chǎn)物消化2-3小時(shí)后加溴酚藍(lán)加樣緩沖液終止反應(yīng)。并在2％的瓊脂糖凝膠中電泳。
結(jié)果和分析純種波爾羊的1614bp擴(kuò)增產(chǎn)物(SEQ ID NO1)中除了在第10位和第1080位含有TaqI位點(diǎn)外，還在第911位含有額外的特異性酶切位點(diǎn)(圖2A)，因此酶切后產(chǎn)生長(zhǎng)度分別為10、170、533、901。
其他山羊的1614bp擴(kuò)增產(chǎn)物(SEQ ID NO2)僅在第10位和第1080位含有TaqI位點(diǎn)(圖2B)，因此酶切后產(chǎn)生長(zhǎng)度分別為10、533、1071。因此，通過比較酶切圖譜就可方便、快速、有效地鑒別純種波爾羊。
鑒定結(jié)果如下表和圖3-4所示。
酶切品種個(gè)體數(shù) 采集地 酶切片段大小位點(diǎn)數(shù)南非波爾山羊21 上海南匯3 10、170、533、901澳大利亞波爾山羊10 上海南匯3 10、170、533、901新西蘭波爾山羊 5 山東3 10、170、533、901德國(guó)波爾山羊8 上海南匯2 10、533、1071關(guān)中奶山羊 5 上海南匯2 10、533、1071薩能奶山羊 5 上海南匯2 10、533、1071徐淮山羊10 江蘇溧水2 10、533、1071大西羊 4 江蘇溧水2 10、533、1071青山羊 7 山東2 10、533、10713 山東3 10、280、533、791F1代雜交波爾山羊35 江蘇溧水2 10、533、1071F2代雜交波爾山羊5 江蘇溧水2 10、533、1071出現(xiàn)10，170，533，901四個(gè)片段者為南非、澳大利亞、新西蘭純種波爾山羊線粒體，出現(xiàn)10，533，1071三個(gè)片段者為本地山羊、關(guān)中奶山羊、薩能奶山羊、徐淮山羊、大西羊、青山羊、F1代波本雜交山羊、F2代波本雜交山羊的線粒體。另外，有三只青山羊表現(xiàn)為三個(gè)酶切位點(diǎn)，形成10，280，533，791四個(gè)片段(圖3和圖4)。
實(shí)施例4山羊細(xì)胞線粒體D-loop區(qū)PCR擴(kuò)增重復(fù)實(shí)施例2和3，不同點(diǎn)僅在于PCR擴(kuò)增時(shí)用引物對(duì)1(SEQ ID NO3和4)和引物對(duì)3(SEQ ID NO7和8)進(jìn)行二步巢式PCR擴(kuò)增。
結(jié)果與實(shí)施例3相同，擴(kuò)增后仍然得到1614bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，且用TaqI酶切后產(chǎn)生相同的可區(qū)別波爾羊和其他山羊的酶切圖譜。
實(shí)施例5山羊細(xì)胞線粒體D-loop區(qū)PCR擴(kuò)增重復(fù)實(shí)施例2和3，不同點(diǎn)僅在于PCR擴(kuò)增時(shí)用引物對(duì)3(SEQ ID NO7和8)進(jìn)行一步PCR擴(kuò)增。
結(jié)果與實(shí)施例3相似，擴(kuò)增后仍然得到1614bp的擴(kuò)增產(chǎn)物(但有部分樣品有一些雜帶，但不影響檢測(cè))，且用TaqI酶切后產(chǎn)生相同的可區(qū)別波爾羊和其他山羊的酶切圖譜。
實(shí)施例6.純種波爾羊快速鑒定試劑盒為了有利于本方法的商品化，特制備方便使用的試劑盒，盒中含有下列試劑和材料1.引物對(duì)1、2、3(SEQ ID NO3，4，5，6，7和8)溶液(各20μmol/L)2.Taq酶或TAKARA LA Taq酶及PCR緩沖液3.TaqI及酶切緩沖液4.使用說明書(一份)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海杰隆生物工程股份有限公司<120>鑒定純種波爾山羊的線粒體分子遺傳特征標(biāo)記和方法<130>031103<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1614<212>DNA<213>山羊(Capra hircus)<400>1acagccagtc gaacatccct acattattat tggacaacta gcatctatca tatatttcct 60catcattcta gtaataatac cagcagctag caccattgaa aacaaccttc taaaatgaag 120acaagtcttt gtagtacaat caatacactg gtcttgtaaa ccagaaaagg agaatagcca 180atctccctaa gactcaagga agaagccata gcctcactat cagcacccaa agctgaaatt 240ctatttaaac tattccctga accactatta accacatcta ttaatatacc cccaaaaata 300ttaagagcct ccccagtatt aaatttacta aaaatttcaa atatacaaca caaacttccc 360actccacaag cttacagaca tgccaacaac ccacacgtat aaaaacatcc caatcctaac 420ccaacttaga tacccacaca aacgccaaca ccacacaatg ttacgcgtat gcaagtacat 480tacaccgctc gcctacacac aaatacattt actaacatcc atataacgcg gacatacagc 540cttcatatag tttactatat atctacccta cacatgtgca gtactaatcc agcataaacg 600taatgtatgt acattacatt ttatgatcta cttcacgtgt acgtacataa tattaatgta 660acaaggacat aatatgtata tagtacatta aacgatcttc cacatgcata ttaagcacgt 720atatcagtat taatgtaata aagacataat atgtatatcg tacattaaac gatctccctc 780atgcatataa gcacgtacaa tgtccttatt agcagtacat ggtacatttt actgtatacc 840cgtacatagc acataaagtc aaatctatcc ttgtcaacat gcgtatcccg tccactagat 900cacgagcttg tcgaccatgc cgcgtgaaac cagcaacccg cttggcaggg atccctcttc 960
tcgctccggg cccattaacc gtgggggtag ctatttaatg aactttatca gacatctggt1020tctttcttca gggccatctc acctaaaatc gcccactctt tcctcttaaa taagacatct1080cgatggacta atgactaatc agcccatgct cacacataac tgtgctgtca tacatttggt1140attttttaat tttcggggat gcttggactc agctatggcc gtctgaggcc ccgacccgga1200gcataaattg tagctggact taactgcatc ttgagcatcc ccataatggt aggcatgggc1260attacagtta atggtcacag gacatactta ttatgttgca tttcaccatg cattcgctcc1320acctttcccc ccctccttct taaatatata ccaccgtttt aaacacgctc cctcctagat1380attagtgcaa aatttttcta cttccaatac tcaaatcttt actccagcca aggtaaatat1440ataaggtgcc tgggtctttt acatggtaag tggttgatgt agcttaaact taaagcaagg1500cactgaaaat gcctagatga gtgtaccaac tccataaaca cataggtttg gtcccagcct1560tcctgttaac tctcaacaga cttacacatg caagcatcca cgccccggtg agta 1614<210>2<211>1614<212>DNA<213>山羊(Capra hircus)<400>2acagccagtc gaacatccct acattattat tggacaacta gcatctatta tatatttcct60catcattcta gtaataatac cagcagctag caccattgaa aacaaccttc taaaatgaag120acaagtcttt gtagtacaat caatacactg gtcttgtaaa ccagaaaagg agaatagcca180atctccctaa gactcaagga agaagccata gcctcaccat cagcacccaa agctgaaatt240ctatttaaac tattccctga accactatta accacatcta ttaatatacc cccaaaaata300ttaagagcct ccccagtatt aaatttacta aaaatttcaa atatacaaca caaacttccc360actccacaag cctacagaca tgccaacaac ccacacgtat aaaaacatcc caatcctaac420ccaacttaga tacccacaca aacgccaaca ccacacaata ttacgtgtat gcaagtacat480tacaccgctc gcctacacac aaatacattt actaacatcc atataacgcg gacatacagc540cttcatatag tttactgtat atctacccta cacatatgca gtactaatcc agcataaacg600
taatgtatgt acattacatt ttatgatcta cttcatgtgt acgtacataa tattaatgta660acaaggacat agtatgtata tagtacatta aacgattttc cacatgcata ttaagcacgt720acatcagtat taatgtaata aggacatagt atgtatattg tacattaaac gatcttcctc780atgcatataa gcatgtataa tgcttctatc ggtagtacat agtacatctt actgcatatt840cgtacatggc acatagagtc aaatccattc ttgccaacat gcgtatcccg tccactagat900cacgagcttg ttgaccatgc cgcgtgaaac cagcaacccg cttggcaggg atccctcttc960tcgctccggg cccattaacc gtgggggtag ctatttaatg aactttatca gacatctggt1020tctttcttca gggccatctc acctaaaatc gcccactctt ccctcttaaa taagacatct1080cgatggacta atgactaatc agcccatgct cacacataac tgtgctgtca tacatttggt1140attttttaat tttcggggat gcttggactc agctatggcc gtctgaggcc ccgacccgga1200gcataaattg tagctggact taactgcatc ttgagcatcc ccataatggt aggcatgggc1260attgcggtta atggtcacag gacatattta ttatgttgca tttcatcatg catccgctcc1320acctttcccc ccctccttct tagatatata ccaccgtttt aaacacgctc cctcctagat1380attagtgcaa aatttttcta cttccaatac tcaaatcttt actccagcca aggtaaatat1440ataaggtgcc tgggtctttt acatggtaag tggttgatgt agcttaaact taaagcaagg1500cactgaaaat gcctagatga gtgtaccaac tccataaaca cataggtttg gtcccagcct1560tcctgttaac tctcaacaga cttacacatg caagcatcca cgccccggtg agta 1614<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(19)<223>引物<400>3ccgattcttc gccttccac 19
<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物<400>4accttaccct tctttacccg20<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>5agccctcgcc atagtccacc t 21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>6atggcggtag aagtcgtttg g 21<210>7<211>22
<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(22)<223>引物<400>7acagccagtc gaacatccct ac 22<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物<400>8gtaggtgcgg ggccactcat20<210>9<211>5173<212>DNA<213>山羊(Capra hircus)<400>9atgaccaaca tccgaaagac ccacccatta ataaaaattg taaacaacgc atttattgac60ctcccaaccc catcaaacat ctcatcatga tgaaactttg gatccctcct aggaatttgc120ctaatcttac aaatcctgac aggcctattc ctagcaatac actatacatc cgacacaata180acagcatttt cctctgtaac tcacatttgt cgagatgtaa attatggctg aatcatccga240tacatacacg caaacggagc atcaatattc tttatctgcc tattcataca tatcggacga300ggtctatact atggatcata tacctttcta gaaacatgaa acattggagt aatcctcctg360ctcgcgacaa tggccacagc attcataggc tatgttttac catgaggaca aatatcattt420tgaggggcaa cagtcatcac taatcttctt tcagcaatcc catatattgg cacaaaccta480
gtcgaatgaa tctgaggggg attctcagta gacaaagcca ctctcacccg attcttcgcc540ttccacttta tcctcccatt catcatcaca gccctcgcca tagtccacct gcttttcctc600cacgaaacag gatcgaacaa ccccacagga attccatcag acgcagataa aatcccattt660cacccttact acaccattaa agatatctta ggcgccatgc tactaattct tgttctaata720ttactagtac tattcacacc cgacctactc ggagacccag acaactatat cccagcaaat780ccactcaata caccccctca cattaaacct gagtggtatt tcctatttgc atacgcaatc840ctacgatcaa ttcccaacaa actaggagga gtcctagccc tagtcctctc aatcctaatc900ttagtacttg tacccttcct ccacacatct aaacaacgaa gcataatatt ccgcccaatc960agccaatgca tattctgaat cctggtagca gatctattaa cactcacatg aattggagga1020cagccagtcg aacatcccta cattattatt ggacaactag catctatcat atatttcctc1080atcattctag taataatacc agcagctagc accattgaaa acaaccttct aaaatgaaga1140caagtctttg tagtacaatc aatacactgg tcttgtaaac cagaaaagga gaatagccaa1200tctccctaag actcaaggaa gaagccatag cctcactatc agcacccaaa gctgaaattc1260tatttaaact attccctgaa ccactattaa ccacatctat taatataccc ccaaaaatat1320taagagcctc cccagtatta aatttactaa aaatttcaaa tatacaacac aaacttccca1380ctccacaagc ttacagacat gccaacaacc cacacgtata aaaacatccc aatcctaacc1440caacttagat acccacacaa acgccaacac cacacaatgt tacgcgtatg caagtacatt1500acaccgctcg cctacacaca aatacattta ctaacatcca tataacgcgg acatacagcc1560ttcatatagt ttactatata tctaccctac acatgtgcag tactaatcca gcataaacgt1620aatgtatgta cattacattt tatgatctac ttcacgtgta cgtacataat attaatgtaa1680caaggacata atatgtatat agtacattaa acgatcttcc acatgcatat taagcacgta1740tatcagtatt aatgtaataa agacataata tgtatatcgt acattaaacg atctccctca1800tgcatataag cacgtacaat gtccttatta gcagtacatg gtacatttta ctgtataccc1860gtacatagca cataaagtca aatctatcct tgtcaacatg cgtatcccgt ccactagatc1920
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1.一種分離的檢測(cè)純種波爾山羊的遺傳標(biāo)記物，其特征在于，所述遺傳標(biāo)記物含有SEQ ID NO9中第1900-1940所示的線粒體D-環(huán)區(qū)序列，并且其起始核苷酸為SEQ ID NO9中第528-1900位中的一個(gè)核苷酸，終止核苷酸為起始核苷酸為SEQ ID NO9中第1940-3274中的一個(gè)核苷酸，長(zhǎng)度為400-2700bp。
2.如權(quán)利要求1所述的遺傳標(biāo)記物，其特征在于，其序列如SEQ ID NO1所示。
3.一種PCR引物對(duì)，其特征在于，其長(zhǎng)度為15-35個(gè)核苷酸，其中一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列相同，且另一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第1940-3274位所示的序列互補(bǔ)；或者其中一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列互補(bǔ)，且另一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第1940-3274位所示的序列相同；且所述引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為400-2700bp。
4.如權(quán)利要求3所述的引物，其特征在于，其長(zhǎng)度為20-30個(gè)核苷酸。
5.如權(quán)利要求3所述的引物，其特征在于，引物選自SEQ ID NO3-8。
6.一種檢測(cè)純種波爾山羊的試劑盒，其特征在于，它含有(a)特異性擴(kuò)增純種波爾羊遺傳標(biāo)記物的引物對(duì)，所述的引物長(zhǎng)度為15-35個(gè)核苷酸，其中一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列相同，且另一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第1940-3274位所示的序列互補(bǔ)；或者其中一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列互補(bǔ)，且另一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第1940-3274位所示的序列相同；并所述引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為400-2700bp；(b)TaqI酶。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述引物對(duì)中的一個(gè)引物選自下組SEQ ID NO3、5、7；另一個(gè)引物選自下組SEQ ID NO4、6、8。
8.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還具有陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。
9.一種鑒定山羊是否是純種波爾山羊的方法，其特征在于，它包括步驟(a)抽提山羊的DNA；(b)將抽提的DNA作為模板，用特異性擴(kuò)增純種波爾山羊遺傳標(biāo)記物的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中所述的引物長(zhǎng)度為15-35個(gè)核苷酸，其中一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列相同，且另一個(gè)引物的序列與SEQID NO9中第1940-3274位所示的序列互補(bǔ)；或者其中一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第528-1900位所示的序列互補(bǔ)，且另一個(gè)引物的序列與SEQ ID NO9中第1940-3274位所示的序列相同；并且所述引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為400-2700bp；(c)對(duì)步驟(b)的擴(kuò)增產(chǎn)物用TaqI進(jìn)行酶切，酶切圖譜與陽性對(duì)照相同就表明被鑒定的山羊是純種波爾山羊。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述引物對(duì)中的一個(gè)引物選自下組SEQ ID NO3、5、7；另一個(gè)引物選自下組SEQ ID NO4、6、8。
全文摘要
本發(fā)明提供了鑒定純種波爾山羊的遺傳標(biāo)記和方法。具體地，本發(fā)明提供了純種波爾山羊線粒體DNA D環(huán)區(qū)的核苷酸序列，以及以該序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物。本發(fā)明證明了線粒體D－環(huán)區(qū)中額外的TaqI酶切位點(diǎn)是純種波爾山羊特有的。本發(fā)明還提供了鑒定純種波爾山羊的方法。利用本發(fā)明可方便、快速、準(zhǔn)確地鑒定純種波爾羊。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1566363SQ03141519
公開日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2003年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月10日
發(fā)明者成國(guó)祥, 趙建陽, 彭進(jìn), 蔡引鳳, 王述宇, 張鎖林 申請(qǐng)人:上海杰隆生物工程股份有限公司