一種多環(huán)芳烴完全抗原,多環(huán)芳烴單克隆抗體和分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗多環(huán)芳烴完全抗原，多環(huán)芳烴單克隆抗體和分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其制備方法。本發(fā)明采用活性酯法將半抗原芘丁酸與BSA偶聯(lián)獲得完全抗原PAB-BSA，用完全抗原PAB-BSA免疫小白鼠，達(dá)到理想效價(jià)后進(jìn)行細(xì)胞融合，篩選到特異性較高，穩(wěn)定性較好的單克隆細(xì)胞株并進(jìn)行保藏，該細(xì)胞株可以持續(xù)分泌單克隆抗體，該單克隆抗體可用于多環(huán)芳烴ELISA檢測(cè)試劑盒的研制。
【專利說明】一種多環(huán)芳烴完全抗原，多環(huán)芳烴單克隆抗體和分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本 發(fā)明涉及多環(huán)芳烴的完全抗原包括免疫原和包被原，由免疫原免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制備的雜交瘤細(xì)胞株和該雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗多環(huán)芳烴單克隆抗體。
【背景技術(shù)】
[0002]多環(huán)芳經(jīng)(PolycyclicAromatic Hydrocarbons, PAHs)是一大類廣泛存在于環(huán)境中的有機(jī)污染物，由兩個(gè)或多個(gè)芳香環(huán)構(gòu)成。主要由煤，石油等有機(jī)物的不完全燃燒而產(chǎn)生。許多種類的PAHs及其代謝物可通過呼吸道和皮膚接觸進(jìn)入人體，對(duì)人體產(chǎn)生較強(qiáng)的致
癌作用。
[0003]多環(huán)芳烴的監(jiān)測(cè)和分析技術(shù)主要包括以下幾個(gè)方面:
[0004]1、由于PAHs對(duì)環(huán)境造成的污染及對(duì)人類健康的威脅，一些國(guó)家都通過書面法律和法令規(guī)定了對(duì)多環(huán)芳烴的檢測(cè)限值要求，包括歐盟76/769/EEC，德國(guó)GS認(rèn)證，LFGB。美國(guó)國(guó)家環(huán)保局(USEPA)將16種PAHs (芘、熒蒽、苯并(b、k)熒蒽、芴、苯并芘、萘、菲、二苯并蒽、苯并蒽、苊、苯并茈、蒽、苊烯、屈、茚并芘)列為優(yōu)先控制污染物，對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的監(jiān)管和控制。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB3092-1996、GB16297-1996、GB5749-85、GB4284-84、GB7104-94)中規(guī)定了空氣、食品、飲用水等環(huán)境介質(zhì)中多環(huán)芳烴的濃度限量。
[0005]2、不論是土樣，水樣，還是大氣樣，環(huán)境樣品中PAHs的分析主要包括以下幾個(gè)步驟:樣品采集，PAHs提取，凈化和濃縮，儀器分析。最常用的提取方法包括液液萃取，固液萃取，超臨界萃取等，儀器分析方法主要是氣相色譜法或高效液相色譜法。整個(gè)過程步驟繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，儀器設(shè)備昂貴，不適合對(duì)大量樣品在短時(shí)間的分析和監(jiān)測(cè)，并且在此過程中需要用到甲醇，二氯甲烷，丙酮等有機(jī)溶劑。除以上兩種主要的儀器分析方法外，用于測(cè)定PAHs的方法還有熒光法和酶聯(lián)免疫吸附分析法。與其它方法相比，酶聯(lián)免疫吸附分析法具有特異性好，靈敏度高，操作簡(jiǎn)便快捷，且可同時(shí)處理大批量樣品等憂點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對(duì)目前多環(huán)芳烴檢測(cè)的不足之處，提供一種特異性和親和力高的單克隆抗體與產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。
[0007]本發(fā)明的思路在于采用多環(huán)芳烴完全抗原免疫動(dòng)物，達(dá)到理想效價(jià)后進(jìn)行細(xì)胞融合，從而篩選特異性較高的單克隆細(xì)胞株，該細(xì)胞株可以持續(xù)分泌單克隆抗體，便于進(jìn)行多環(huán)芳烴的檢出，從而為檢測(cè)多環(huán)芳烴的試劑盒研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
[0008]本發(fā)明的目的之一是提供一種特異性分泌多環(huán)芳烴單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，該雜交瘤細(xì)胞株于2013年6月18日保藏在位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所內(nèi)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC N0.7718，分類名為多環(huán)芳烴單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
[0009]本發(fā)明的目的之二是提供一種用于免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的多環(huán)芳烴完全抗原的制備方法，該方法包括如下的步驟:
[0010]1、采用活性酯法將芘丁酸(PBA)分別與牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶聯(lián)，按照1:1:1的比例稱取芘丁酸、NHS、DCC溶解于N，N-二甲基甲酰胺(N，N-Dimethylformamide) DMF 中，室溫放置過夜，12000rpm,離心 15min,取上清液。
[0011]2、4°C攪拌，將上清液緩慢加入8ml BSA溶液(碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液配制成濃度為15mg/ml的BSA溶液)中繼續(xù)攪拌5h，
[0012]3、將溶液裝入透析袋中，用蒸餾水透析2d，后用pH7.40.01mor/L PBS緩沖液繼續(xù)透析，每天更換透析液，直到用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)不到PBA的特征吸收峰為止。
[0013]4、離心分離出上清液即作為免疫原PBA-BSA，用同樣的方法合成PBA-OVA結(jié)合物作為ELISA的包被原。
[0014]本發(fā)明的目的之三是提供一種用于制備抗多環(huán)芳烴單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的方法，該方法包括如下的步驟:
[0015]1、動(dòng)物免疫
[0016]免疫用小鼠為18g左右的BALB/C，7_8周；免疫之前眼眶取陰性血清。取60 μ g免疫原“PBA-BSA”，用生理鹽水稀釋到200 μ 1，再加入等體積弗氏完全佐劑進(jìn)行皮下注射免疫。此后，每隔兩周，進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，免疫量為30yg蛋白/只小鼠。共進(jìn)行四次加強(qiáng)免疫后，眼眶取血，測(cè)定抗血清效價(jià)。選擇效價(jià)較高的小鼠腹腔沖擊免疫，免疫量為50 μ g蛋白/只小鼠。效價(jià)達(dá)到1:10000即可做細(xì)胞融合。
[0017]2、細(xì)胞融合
[0018]取免疫小鼠的脾臟細(xì)胞與狀態(tài)良好的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，采用PEG法進(jìn)行融合。融合后的細(xì)胞用含15%血清的IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0019]3、陽(yáng)性細(xì)胞株篩選
[0020]用包被原“PBA-OVA”包板，對(duì)培養(yǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞采用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法做第一次篩選。得到陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株后，再用“PBA-0VA及BSA”再次包板，采用ELISA方法，做第二次篩選，得到的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行亞類鑒定，選擇IgGl類型的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。最后，對(duì)已篩選的陽(yáng)性克隆采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行復(fù)篩，選擇具有明顯競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)操作。
[0021]4、抗體純化和鑒定，雜交瘤細(xì)胞株的篩選
[0022]進(jìn)一步將步驟3中篩選到的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株接種小鼠BALB/C腹腔，制備腹水，采用protein G進(jìn)行純化，純化后的抗體用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)效價(jià)，選擇親和性較強(qiáng)的抗體進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，最終篩選出產(chǎn)生熱穩(wěn)定性良好，親和性較強(qiáng)抗體的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行保藏。
[0023]更進(jìn)一步的，上述步驟3和4中，所述競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法包括如下步驟: [0024]以PBA-OVA包被酶標(biāo)板，100 μ I/孔，4°C過夜；洗滌2次，用2%脫脂奶粉，37°C封閉2h，200 μ I/孔，加入競(jìng)爭(zhēng)物(按照設(shè)計(jì)比例加入競(jìng)爭(zhēng)物(芘)，50μ1/孔；加入一抗(抗血清純化抗體按照選定比例稀釋后加入)，50μ1/孔，37°C孵育lh。設(shè)置空白對(duì)照和不抑制對(duì)照，洗滌2次。加入已稀釋的羊抗鼠酶標(biāo)二抗，100 μ I/孔，37°C孵育lh，洗滌2次。加入TMB底物顯色液顯色15min，100 μ I/孔。再加入0.5mol硫酸終止顯色，雙波長(zhǎng)(450，630)測(cè)定吸光值，記錄保存數(shù)據(jù)。[0025]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供由上述保藏號(hào)為CGMCC N0.7718的雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體，該抗體具有高度的親和性和特異性，能夠與多環(huán)芳烴進(jìn)行結(jié)合，從而進(jìn)行檢測(cè)。
具體實(shí)施方案
[0026]下面通過具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但不意味著對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。
[0027]下述方案中所述方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)渠道購(gòu)買。
[0028]實(shí)施方案
[0029]實(shí)驗(yàn)I多環(huán)芳烴免疫抗原制備
[0030]1、分別稱取0.0288g PBA,0.0115g NHS,0.0206g DCC，溶解于2mlDMF中，室溫放置過夜，12000rpm,離心15min,分離上清液。
[0031]2、稱取0.15g BSA溶于IOml0.05mol/L, pH9.6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中。
[0032]3、在4°C條件下，將步驟I中制備的上清液緩慢加入8ml步驟2所述溶液中，繼續(xù)攪拌5h
[0033]4、將步驟3中所得的反應(yīng)混合物裝入透析袋中，用蒸餾水透析2d后，用pH7.4，0.01mol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液繼續(xù)透析，每天更換透析液。
[0034]5、每天對(duì)上述透析液進(jìn)行吸收光譜掃描，直到檢測(cè)不到PBA的特征吸收峰為止
[0035]6、離心分離步驟5中的透析液，上清液即為免疫原PBA-BSA
[0036]實(shí)驗(yàn)2多環(huán)芳烴包被抗原制備
[0037]1、分別稱取0.0288g PBA,0.0115g NHS,0.0206g DCC，溶解于2mlDMF中，室溫放置過夜，12000rpm,離心15min,分離上清液。
[0038]2、稱取0.15g OVA溶于IOml0.05mol/L, pH9.6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中。
[0039]3、在4°C條件下，將步驟I中制備的上清液緩慢加入8fl步驟2所述溶液中，繼續(xù)攪拌5h
[0040]4、將步驟3中所得的反應(yīng)混合物裝入透析袋中，用蒸餾水透析2d后，用pH7.4，0.01mol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液繼續(xù)透析，每天更換透析液。
[0041]5、每天對(duì)上述透析液進(jìn)行吸收光譜掃描，直到檢測(cè)不到PBA的特征吸收峰為止
[0042]6、離心分離步驟5中的透析液，上清液即為包被原PBA-OVA
[0043]實(shí)驗(yàn)3保藏號(hào)為C6MCC N0.7718雜交瘤細(xì)胞株及其分泌的單克隆抗體制備
[0044]用實(shí)驗(yàn)I中制備的免疫原PBA-BSA免疫4只BALB/C小鼠，免疫之前眼眶取陰性血清。免疫方法如下:取60μ g免疫原，用生理鹽水稀釋到200μ 1，再加入等體積弗氏佐劑，用混勻儀器將溶液和佐劑混勻，形成油包水。將混勻好的免疫原進(jìn)行皮下注射免疫，打6-8個(gè)點(diǎn)。每隔兩周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，免疫量為30yg蛋白/只小鼠。第四次加強(qiáng)免疫后，ELISA法檢測(cè)效價(jià)，選擇效價(jià)較高的兩只小鼠，免疫劑量為50 μ g蛋白/只小鼠，腹腔沖擊免疫一次。
[0045]最后一次免疫后一周，取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞,采用PEG法進(jìn)行融合；融合后的細(xì)胞用含15%血清的IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。[0046]用包被原“PBA-OVA”包板，對(duì)培養(yǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞采用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法做第一次篩選。得到陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株后，再用“PBA-0VA及BSA”再次包板，采用ELISA方法，做第二次篩選，得到的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行亞類鑒定，選擇IgGl類型的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。最后，對(duì)已篩選的陽(yáng)性克隆采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行復(fù)篩，選擇具有明顯競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)操作。
[0047]將以篩選到的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株接種小鼠BALB/C腹腔，制備腹水，采用proteinG進(jìn)行純化，得到抗多環(huán)芳烴單克隆抗體，并用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)各抗體的效價(jià)，選擇親和性較強(qiáng)的抗體進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，最終篩選出產(chǎn)生熱穩(wěn)定性良好，親和性較強(qiáng)抗體的雜交瘤細(xì)胞株P(guān)YR#6-B7進(jìn)行保藏。
[0048]實(shí)驗(yàn)4單克隆抗體性能測(cè)定
[0049]單克隆抗體最低檢測(cè)限值(LOD)和半數(shù)抑制量(IC5tl)的檢測(cè)
利用方陣滴定法確定 前述多環(huán)芳烴單克隆抗體和實(shí)驗(yàn)中制備的包被抗原的最適工作濃度，采用不同濃度的芘標(biāo)準(zhǔn)品作為競(jìng)爭(zhēng)物，其濃度如下:30、10、3.33,0.37,0.12,0.041、
0.014,單位μ g/ml,設(shè)置五組平行。
[0050]間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法:將上述實(shí)驗(yàn)2制備的包被原PBA-OVA用包被液稀釋至2.5 μ g/ml，每孔加100 μ I包被酶標(biāo)板，4°C，過夜；PBS_T洗滌2次，用2%脫脂奶粉，37°C封閉2h，200 μ I/孔；將競(jìng)爭(zhēng)物稀釋液50 μ I/孔和單克隆抗體稀釋溶液50ul/孔混勻后加入酶標(biāo)板孔中，同時(shí)設(shè)置零標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照孔(稀釋液中不加競(jìng)爭(zhēng)物)和空白對(duì)照孔(將抗體溶液換為稀釋液)，37°C孵育Ih ；PBS-T洗滌2次后，加入已稀釋的羊抗鼠酶標(biāo)二抗，100 μ I/孔，37°C孵育Ih ;PBS-T洗滌2次，加入TMB底物顯色液顯色15min，100 μ I/孔。再加入0.5mol硫酸終止顯色，雙波長(zhǎng)(450，630)測(cè)定吸光值，記錄保存數(shù)據(jù)。以吸光度為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)濃度的LOG值為橫坐標(biāo)，繪制半對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0051]根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出最低檢測(cè)限值(LOD)和半數(shù)抑制量(IC5tl)，檢測(cè)靈敏度，抑制率
計(jì)算公式如下
【權(quán)利要求】
1.一種用于免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的多環(huán)芳烴免疫原芘丁酸-牛血清白蛋白偶聯(lián)物(PBA-BSA)和包被原芘丁酸-卵清白蛋白偶聯(lián)物PBA-OVA。
2.權(quán)利要求1所述的免疫原和包被原的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: . 1)采用活性酯法將芘丁酸分別與BSA和OVA偶聯(lián)，按照1:1:1的比例稱取(PBA)、N-羥基琥拍酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide, NHS)、N, N- 二環(huán)己基碳二亞胺(Dicyclohexylcarbodiimide,DCC)、溶解于 N,N- 二甲基甲酸胺(N,N-Dimethylformamide、DMF)中，室溫放置過夜，12000rpm，離心15min，取上清液；. 2)4°C攪拌，將上清液緩慢加入8mlBSA溶液(碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液配制成濃度為.15mg/ml的BSA溶液)中繼續(xù)攪拌5h ； .3)將溶液裝入透析袋中，用蒸餾水透析2d后用pH7.40.01mor/L PBS緩沖液繼續(xù)透析，每天更換透析液，直到用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)不到PBA的特征吸收峰為止； . 4)離心分離出上清液即作為免疫原PBA-BSA，用同樣的方法合成PBA-OVA結(jié)合物作為ELISA的包被原。
3.—種分泌抗多環(huán)芳烴單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，該雜交瘤細(xì)胞株的保藏號(hào)為 CGMCC N0.7718。
4.權(quán)利要求3所述的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: . 1)動(dòng)物免疫 .2)取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞，采用PEG法進(jìn)行融合 . 3)陽(yáng)性細(xì)胞株篩選. 4)抗體純化和鑒定，雜交瘤細(xì)胞株的篩選與保藏。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，其特征在于，所描述的方法包括如下步驟: 1)動(dòng)物免疫 免疫用小鼠為18g左右的BALB/C，7-8周；免疫之前眼眶取陰性血清。取60 μ g免疫原“PBA-BSA”，用生理鹽水稀釋到200 μ 1，再加入等體積弗氏完全佐劑進(jìn)行皮下注射免疫。此后，每隔兩周，進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，免疫量為30yg蛋白/只小鼠。共進(jìn)行四次加強(qiáng)免疫后，眼眶取血，測(cè)定抗血清效價(jià)。選擇效價(jià)較高的小鼠腹腔沖擊免疫，免疫量為50μ g蛋白/只小鼠。效價(jià)達(dá)到1:10000即可做細(xì)胞融合； . 2)細(xì)胞融合 取免疫小鼠的脾臟細(xì)胞與狀態(tài)良好的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0,采用PEG法進(jìn)行融合。融合后的細(xì)胞用含15%血清的MDM培養(yǎng)基培養(yǎng)； .3)陽(yáng)性細(xì)胞株篩選 用包被原“PBA-0VA”包板，對(duì)培養(yǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞采用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法做第一次篩選。得到陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株后，再用“PBA-0VA及BSA”再次包板，采用ELISA方法，做第二次篩選，得到的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行亞類鑒定，選擇IgGl類型的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。最后，對(duì)已篩選的陽(yáng)性克隆采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行復(fù)篩，選擇具有明顯競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)操作； . 4 )抗體純化和鑒定，雜交瘤細(xì)胞株的篩選將步驟3)中篩選到的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株接種小鼠BALB/C腹腔，制備腹水，采用protein G進(jìn)行純化，純化后的抗體用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)效價(jià)，選擇親和性較強(qiáng)的抗體進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，最終篩選出產(chǎn)生熱穩(wěn)定性良好，親和性較強(qiáng)抗體的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行保藏。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，其特征在于，步驟3)和4)中，所述競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法包括如下步驟: 以PBA-OVA包被酶標(biāo)板，IOOul/孔，4°C過夜；洗滌2次，用2%脫脂奶粉，37°C封閉2h，200ul/孔，加入競(jìng)爭(zhēng)物(按照設(shè)計(jì)比例加入競(jìng)爭(zhēng)物(芘)，50ul/孔；加入一抗(抗血清純化抗體按照選定比例稀釋后加入)，50ul/孔，37°C孵育lh。設(shè)置空白對(duì)照和不抑制對(duì)照，洗滌2次。加入已稀釋的羊抗鼠酶標(biāo)二抗，100 μ I/孔，37°C孵育lh，洗滌2次。加入TMB底物顯色液顯色15min，100 μ I/孔。再加入0.5mol硫酸終止顯色，雙波長(zhǎng)(450，630)測(cè)定吸光值，記錄保存數(shù)據(jù)。
7.權(quán)利要求3所述的雜交瘤細(xì)胞株所分泌的抗多環(huán)芳烴單克隆抗體。
【文檔編號(hào)】C07K16/18GK103965349SQ201310413841
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】許麗, 趙魯, 程言君 申請(qǐng)人:輕工業(yè)環(huán)境保護(hù)研究所