核桃粕抗氧化肽及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及核桃粕抗氧化肽及其制備方法，本發(fā)明利用核桃粕蛋白，通過酶法水解，得到青養(yǎng)蛋白酶解液，再利用凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜對其進(jìn)行分離純化得到十四種新的抗氧化肽產(chǎn)品，并測定其氨基酸序列。本發(fā)明所制得的抗氧化肽具有很強(qiáng)的抗氧化作用，氧自由基吸收能力都約為粗肽的4倍，而且肽具有分子量小、可被人體直接吸收的特點(diǎn)，因此可以廣泛應(yīng)用于食品、保健品及化妝品等領(lǐng)域。
【專利說明】核桃粕抗氧化肽及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及天然抗氧化肽【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及核桃柏抗氧化肽及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自從英國Harman于1956年提出自由基理論以來,人們逐步認(rèn)識到人體許多慢性疾病如免疫力下降、心血管疾病、神經(jīng)組織退化紊亂、癌癥及衰老都與體內(nèi)氧化產(chǎn)生的自由基有關(guān)，因而抗氧化劑的研究越來越被人們所關(guān)注。傳統(tǒng)使用的抗氧化劑多為化學(xué)合成抗氧化劑，如二叔丁基羥基甲苯(BHT)，叔丁基羥基茴香醚(BHA)，由于價(jià)廉且具有很強(qiáng)的抗氧化能力而被廣泛使用，但是由于其對人體健康存在潛在的危害而被限制使用。因此，尋找和開發(fā)安全、無毒、高效的天然抗氧化劑，已成為當(dāng)今社會的研究熱點(diǎn)。
[0003]天然抗氧化肽是存在于動植物體中具有抗氧化活性的肽類，它具有清除自由基、螯合金屬離子、猝滅單線態(tài)氧、分解過氧化物及抑制脂質(zhì)過氧化等功效，易被人體吸收，無毒副作用，營養(yǎng)和加工特性良好，因此在人類食品和藥品中具有巨大的開發(fā)前景。目前也有很多學(xué)者采用酶解的技術(shù)從植物或者動物組織中制備得到活性很強(qiáng)的抗氧化肽。發(fā)明申請專利(申請?zhí)?01010141974.3)公開了一系列的膠原蛋白抗氧化肽，具有如下之一的氨基酸序列:(I) Hyl-Cys ； (2) Gln-Gly-Ala-Arg ； (3) Leu-Gln-Gly-Met ； (4)Leu-Gln-Gly-Met-Hyp,該產(chǎn)品抗氧化作用很強(qiáng)，不僅可以替代BHT等用作食品的添加劑，而且可以作為活性功能性成分，而且具有分子量小的特點(diǎn)，易被消化道直接吸收。發(fā)明申請專利(申請?zhí)?00510009423.0)公開了通過將蜂王漿用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶進(jìn)行酶處理，可以獲得具有和維生素E同等強(qiáng)度的強(qiáng)抗氧化能力的三種抗氧化肽，氨基酸序列為:
(I)Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu ； (2)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln ； (3)Ser-Leu-Pro-1Ie-Leu-His-Glu-Trp。
[0004]核桃，又名羌桃、胡桃，屬胡桃 科胡桃屬植物，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值都很高的珍貴果木。核桃與扁桃、腰果、榛子并列為世界四大干果。核桃蛋白中蘊(yùn)涵許多具有生物活性的氨基酸序列，用特異的蛋白酶水解有可能釋放出活性的肽段。核桃經(jīng)過浸提出大部分油脂剩下的部分即為核桃柏，含有40%以上的蛋白質(zhì)。核桃蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，含有18種氨基酸，且人體所需的8種必需氨基酸含量合理。但目前大部分優(yōu)質(zhì)核桃柏直接當(dāng)做飼料和肥料處理掉，浪費(fèi)了許多優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源。通過酶解得到核桃多肽可以作為食品添加劑或營養(yǎng)多肽，以提高核桃蛋白的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種更安全、高效利用原料，且抗氧化活性很強(qiáng)的抗氧化肽的制備方法，該抗氧化肽的氨基酸序列有來自D2的Tyr-Ser (269.1126), Tyr-Ser-Val-His (505.2281)，Tyr-Lys (310.1367)，Tyr-Thr (283.1281)，Leu-Pro-Cys(331.1644)，Glu-Met(279.1336)和 D3 的 Tyr-Ala (253.1181), Tyr-Gly (239.1025), Ala-His (255.1593), Ala-Cys(192.1384), Asn-Trp(318.3007), Cys-Arg(288.2900), Ser-Gln-Lys(362.3272), Cys-His-Cys(362.3265)。
[0006]本發(fā)明提供一種利用商業(yè)食品級蛋白酶，酶解核桃柏蛋白，并對酶解物進(jìn)行分離純化，得到十四種抗氧化肽。
[0007]核桃柏抗氧化肽的制備方法，具體步驟如下:[0008](I)核桃柏蛋白酶解物的制備:將核桃柏與水按質(zhì)量比1:8~1:10混合，加入占核桃柏蛋白質(zhì)量1%_2%的胰酶，在50-55°C酶解18-22h ;沸水中10_30min滅酶，離心，取上清液，抽濾，得到核桃柏蛋白酶解液，凍干得到核桃柏蛋白多肽粉末；
[0009](2)抗氧化肽的分離純化:將核桃柏蛋白酶解液凍干后，用01.6x100 cm的Sephadex G-15凝膠柱進(jìn)行分離純化,用去離子水以0.5~2.0ml/min的流速進(jìn)行洗脫,檢測波長為214nm，測定各洗脫峰對應(yīng)組分的抗氧化活性，收集活性最高的組分D，冷凍干燥得粉末D ；
[0010](3)將粉末D溶于水后，用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，分別得到活性組分D2和活性組分D3，得到所述抗氧化肽；其中純化條件為:色譜柱為XBr i dgeTMpre C18tt (5 μ m, 10X150mm;WaterS，USA)，流動相為A相-B相，所述A相為已腈，所述B相為
0.l%-0.2%V/V 二氟乙酸水溶液，洗脫程序?yàn)?在0_4min內(nèi)米用的流動相中A、B的體積百分比分別為5%和95% ;在4-8min內(nèi)采用的流動相中A、B的體積百分比分別為15%和85% ;在8-12min內(nèi)采用的流動相中A、B的體積百分比分別為15%和85%，在12_30min內(nèi)采用的流動相中A、B的體積百分比分別為40%和60%，流速為1.5-4mL/min，檢測波長為215nm，測定各洗脫峰對應(yīng)組分的抗氧化活性，收集活性最高的兩個(gè)峰。
[0011]將得到的目標(biāo)肽，用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定肽的分子量及氨基酸序列。
[0012]上述方法得到的抗氧化肽，所述活性組分D2具有Tyr-Ser (269.1126)，Tyr-Ser-Val-His(505.2281)，Tyr-Lys(310.1367)，Tyr-Thr(283.1281)，Leu-Pro-Cys(331.1644)，Glu-Met (279.1336)的氨基酸序列，所述活性組分 D3 具有 Tyr-Ala (253.1181), Tyr-Gly (239.1025)，Ala-His(255.1593)，Ala-Cys(192.1384)，Asn-Trp(318.3007)，Cys-Arg (288.2900)
，Ser-Gln-Lys (362.3272)，Cys-His-Cys (362.3265)的氨基酸序列。
[0013]在本發(fā)明中，米用ORAC(Oxygen radical absorbance capacity,氧自由基吸收能
力)法來測定抗氧化肽的活性。該方法現(xiàn)已經(jīng)成為美國農(nóng)業(yè)部、美國衛(wèi)生院、FDA評價(jià)食
品抗氧化能力的重要標(biāo)準(zhǔn)。歐洲、日本等國家的食品、功能食品行業(yè)也普遍采用ORAC作為
抗氧化能力的重要評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，是目前評價(jià)體外抗氧化能力最權(quán)威性的方法?；贠RAC反
應(yīng)在75mmol.L-1磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)環(huán)境中進(jìn)行，F(xiàn)L (熒光素鈉鹽)、AAPH (自由基產(chǎn)
生劑)、標(biāo)準(zhǔn)抗氧化物質(zhì)Trolox (水溶性維生素E類似物)以及待測樣品均用該緩沖液溶
解和稀釋。具體測定操作為:在96孔板各微孔中分別加入待測樣品20 μ 1，F(xiàn)L (終濃度為
70nmol.L—1) 120 μ 1，在37°C下預(yù)置15min后，用多道移液器迅速在各孔中加入AAPH (終
濃度為12mmol.171) 60 μ I啟動反應(yīng)，并將微孔板置于熒光分析儀中在37°C下以激發(fā)波長
485nm,發(fā)射波長528nm進(jìn)行連續(xù)測定,每Imin測定一次各孔突光強(qiáng)度,測定120min,突光強(qiáng)
度分別記為fo，f1； f2...f120O將記錄的各微孔不同時(shí)間點(diǎn)的絕對熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)fn與初





120 f
始熒光強(qiáng)度&相比，折算成相對熒光強(qiáng)度，并根據(jù)公式Αυ(>1+Σ.^，統(tǒng)計(jì)熒光熄滅曲線






i=l 1O
下面積(AUCsample)值，然后根據(jù)公式netAUC=AUCsample-AUCblank，分別計(jì)算不同濃度Trolox和樣品的net AUC值，其中AUCblank為沒有抗氧化劑存在時(shí)自由基作用對照的AUC值。
[0014]本發(fā)明的抗氧化肽具有很強(qiáng)的抗氧化作用，經(jīng)液相分離后得到的活性最好的兩個(gè)組分的氧自由基吸收能力是是粗肽的4倍左右。本發(fā)明提供的抗氧化肽具有很強(qiáng)的抗氧化作用，可以作為抗氧化劑應(yīng)用于食品添加劑、保健品、化妝品及護(hù)膚品等。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0016](I)酶解技術(shù)及色譜分離技術(shù)制備出十四種抗氧化肽；
[0017](2)本發(fā)明提供的抗氧化肽活性很強(qiáng)，兩個(gè)抗氧化活性最好的組分D2和D3的氧自由基吸收能力為粗肽的4倍左右，不僅可以用作食品添加劑，也可以作為功能性成分，用于保健品、化妝品及護(hù)膚品中；
[0018](3)本發(fā)明提供的抗氧化肽有二肽、三肽和四肽，分子量小，可被人體直接吸收；
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為Sephadex G_15凝膠過濾色譜分離純化抗氧化肽圖譜，
[0020]圖2為經(jīng)Sephadex G_15凝膠過濾色譜分離出的各組分的抗氧化活性測定圖，
[0021]圖3為半制備型反相高效液相色譜分離純化抗氧化肽圖譜，
[0022]圖4為半制備型反相高效液相色譜分離得出的各組分的抗氧化活性測定圖。
具體實(shí)施方案
[0023]通過下述實(shí)施例將`更詳細(xì)地說明本發(fā)明。
[0024]實(shí)施例1
[0025](I)核桃柏蛋白酶解物的制備:將核桃柏與水按質(zhì)量比1:8混合，加入核桃柏蛋白質(zhì)量1%的胰酶，在55°C酶解18h ;沸水中IOmin滅酶，離心，取上清液，抽濾，得到核桃柏蛋白酶解液，水解度為9.65 ±0.37% ；
[0026](2)抗氧化肽的分離純化:將核桃柏蛋白酶解液凍干后，用Sephadex G_15凝膠柱(01.6x100 cm)進(jìn)行分離純化，用去離子水以0.8ml/min的流速進(jìn)行洗脫，檢測波長為
214nm,測定各洗脫峰對應(yīng)組分的抗氧化活性，收集活性最高的組分D，冷凍干燥得活性最高的粉末D ；
[0027](3)將粉末D溶于水后，用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，分別得到活性組分D2和活性組分D3，其中純化條件為:色譜柱為XBridge? pre C18柱(5 μ m, IOX 150mm; Waters, USA)，流動相為A相(已腈)_B相(0.1%三氟乙酸V/V),洗脫程序?yàn)?在0-4min內(nèi)采用的流動相中A、B的體積百分比分別為5%和95% ;在4_8min內(nèi)采用的流動相中A、B的體積百分比分別為15%和85% ;在8-12min內(nèi)采用的流動相中A、B的體積百分比分別為15%和85%，在12-30min內(nèi)采用的流動相中A、B的體積百分比分別為40%和60%，流速為1.5mL/min，檢測波長為215nm，測定各洗脫峰對應(yīng)組分的抗氧化活性，收集得到活性最高的組分D3和活性次高的組分D2，冷凍干燥，得到目標(biāo)肽；
[0028](4)將步驟(3)得到的目標(biāo)肽，用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行序列分析，經(jīng)二級質(zhì)譜分析，得到 D2 具有 Tyr-Ser (269.1126), Tyr-Ser-Val-His (505.2281), Tyr-Lys (310.1367)，Tyr-Thr (283.1281), Leu-Pro-Cys (331.1644), Glu-Met (279.1336)的氨基酸序列，所述活性組分 D3 具有 Tyr-Ala(253.1181), Tyr-Gly (239.1025), Ala-His (255.1593), Ala-Cys (I92.1384), Asn-Trp(318.3007), Cys-Arg(288.2900), Ser-Gln-Lys(362.3272), Cys-His-Cys (362.3265)的氨基酸序列。
[0029]實(shí)施例2
[0030](I)核桃柏蛋白酶解物的制備:將核桃柏與水按質(zhì)量比1:10混合，加入核桃柏蛋白質(zhì)量2%的胰酶，在50°C酶解20h ;沸水浴30min滅酶，離心，取上清液，抽濾，得到核桃柏蛋白酶解液，水解度為10.03 ±0.46% ；
[0031](2)抗氧化肽的分離純化:將核桃柏蛋白酶解液凍干后，用Sephadex G_15凝膠柱(01.6x100 cm)進(jìn)行分離純化，用去離子水以1.5mL/min的流速進(jìn)行洗脫，檢測波長為214nm,測定各洗脫峰對應(yīng)組分的抗氧化活性，收集活性最高的組分D，然后冷凍干燥得活性最聞的粉末D ；
[0032](3)將粉末D溶于水后，用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，分別得到活性組分D2和活性組分D3，其中純化條件為:色譜柱為XBridge? pre C18柱(5 μ m, IOX 150mm; Waters, USA)，流動相為A相(已腈)_B相(0.1%三氟乙酸V/V),洗脫程序?yàn)?在0-4min內(nèi)采用的流動相中A、B的體積百分比分別為5%和95% ;在4_8min內(nèi)采用的流動相中A、B的體積百分比分別為15%和85% ;在8-12min內(nèi)采用的流動相中A、B的體積百分比分別為15%和85%，在12-30min內(nèi)采用的流動相中A、B的體積百分比分別為40%和60%，流速為2mL/min，檢測波長為215nm，測定各洗脫峰對應(yīng)組分的抗氧化活性，收集得到活性最高的組分D3和活性次高的組分D2，冷凍干燥得到目標(biāo)肽；
[0033](4)將步驟(3)得到的目標(biāo)肽，用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行序列分析，經(jīng)二級質(zhì)譜分析，得到 D2 具有 Tyr-Ser (269.1126), Tyr-Ser-Val-His (505.2281), Tyr-Lys (310.1367)，Tyr-Thr (283.1281), Leu-Pro-Cys (331.1644), Glu-Met (279.1336)的氨基酸序列，所述活性組分 D3 具有 Tyr-Ala(253.1181), Tyr-Gly (239.1025), Ala-His (255.1593), Ala-Cys (I92.1384)，Asn-Trp (318.3007)，Cys-Arg(288.2900)，Ser-Gln-Lys(362.3272)，Cys-His-Cys (362.3265)的氨基酸序 列。
[0034]實(shí)施例3
[0035]按照與實(shí)施2同樣的實(shí)施方式進(jìn)行，不同之處是酶解時(shí)間為22h，得到核桃柏蛋白酶解液，水解度提高至11.93±0.12%，半制備液相洗脫流速為3mL/min。
[0036]圖1為S印hadex G-15凝膠過濾色譜分離純化抗氧化肽圖譜，由圖2可以看出峰D的抗氧化活性最高。圖3為半制備型高效液相色譜分離純化抗氧化肽圖譜，由圖4可見，組分D3抗氧化活性最高和D2組分的活性次高，經(jīng)SPSS分析發(fā)現(xiàn)兩組份間無顯著性差異(Ρ>0.05)。
【權(quán)利要求】
1.核桃柏抗氧化肽的制備方法，其特征在于該方法步驟如下: (O核桃柏蛋白酶解物的制備:將核桃柏與水按質(zhì)量比1:8~1:10混合，加入占核桃柏蛋白質(zhì)量1%_2%的胰酶，在50-55 °C酶解18-22h ;沸水中10-30 min滅酶，離心，取上清液，抽濾，得到核桃柏蛋白酶解液，凍干得到核桃柏蛋白多肽粉末； (2)抗氧化肽的分離純化:將核桃柏蛋白酶解液凍干后，用01.6X100 cm的S^hadexG-15凝膠柱進(jìn)行分離純化，用去離子水以0.5~2.0 ml/min的流速進(jìn)行洗脫，檢測波長為214nm,測定各洗脫峰對應(yīng)組分的抗氧化活性，收集活性最高的組分D，冷凍干燥得粉末D ； (3)將粉末D溶于水后，用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，分別得到活性組分D2和活性組分D3，得到所述抗氧化肽；其中純化條件為:色譜柱為XBridge? pre C18柱(5 μ m, 10X 150 mm; Waters, USA)，流動相為A相-B相，所述A相為已腈，所述B相為0.1%_0.2%V/V二氟乙酸水溶液，洗脫程序?yàn)?在0_4min內(nèi)米用的流動相中A、B的體積百分比分別為5%和95% ;在4-8min內(nèi)采用的流動相中A、B的體積百分比分別為15%和85% ;在8_12min內(nèi)采用的流動相中A、B的體積百分比分別為15%和85%，在12-30min內(nèi)采用的流動相中A、B的體積百分比分別為40%和60%，流速為1.5-4mL/min，檢測波長為215nm，測定各洗脫峰對應(yīng)組分的抗氧化活性，收集活性最高的兩個(gè)峰。
2.由權(quán)利要求1所述制備方法得到的核桃柏抗氧化肽，其特征在于，所述活性
組分 D2 具有 Tyr-Ser(269.1126), Tyr-Ser-Val-His(505.2281), Tyr-Lys(310.1367), Tyr-Thr (283.128), Leu-Pro-Cys (331.1644), Glu-Met (279.1336)的氨基酸序列，所述活性組分 D3 具有 Tyr-Ala(253.1181)，Tyr-Gly (239.1025)，Ala-His (255.1593)，Ala-Cys (192.1384)，Asn-Trp(318.3007)，Cys-Arg(288.2900)，Ser-Gln-Lys(362.3272)，Cys-His-Cys (362.3265)的 氨基酸序列。
【文檔編號】C07K5/107GK103497985SQ201310404993
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】任嬌艷, 陳卉平, 趙謀明, 崔春, 顧敏, 蔡孟森 申請人:華南理工大學(xué)