一種具有抗腫瘤活性的核桃多肽-鋅螯合物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有抗腫瘤活性的核桃多肽-鋅螯合物的制備方法，該方法包括以下步驟：（1）限制性酶解；（2）超濾膜分離；（3）濃縮、噴霧干燥，得到核桃多肽；（4）在核桃多肽溶液中加入鋅源進行螯合反應(yīng)；（5）將螯合液進行透析；（6）冷凍干燥，得核桃多肽-鋅螯合物。產(chǎn)品在偏酸性條件下溶解為淡黃色液體。本發(fā)明所研制的核桃多肽-鋅螯合物，通過細胞實驗證明該螯合物具有明顯的抗腫瘤生理活性，有望成為治療癌癥尤其是肝癌的高效低毒藥劑。
【專利說明】一種具有抗腫瘤活性的核桃多肽-鋅螯合物的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種化合物的制備方法，具體涉及一種具有抗腫瘤活性的核桃多 肽-鋅螯合物的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 鋅是人體必需的14種微量元素之一，它不但具有重要的生物功能，而且參與多種 酶的合成與組成，與肌體的代謝及某些疾病的發(fā)生有極為密切的關(guān)系。機體缺鋅會導(dǎo)致基 礎(chǔ)代謝下降、蛋白質(zhì)利用率降低、食欲與消化功能低下、影響生長發(fā)育等多方面的負面影 響。
[0003] 第一代補鋅劑即無機鋅鹽，如硫酸鋅。無機鋅鹽易吸潮性、生物利用率低、口感不 適，服用后副作用較多，已被人類淘汰。第二代鋅鹽是以有機弱酸作配體合成的補鋅劑，如 乳酸鋅、葡萄糖酸鋅。但其合成復(fù)雜，產(chǎn)率低，而且含鋅量較低，且不適于糖尿病人的補鋅。 第三代鋅補劑即氨基酸螯合鋅，它化學(xué)穩(wěn)定性好，安全、無毒，且生物利用率高。第四代則是 多肽_Zn 2+配合物。多肽的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和游離氨基酸相比，具有耗能低、轉(zhuǎn)運速度快和不易被 飽和的特點，此外多肽還具有很好的營養(yǎng)作用：提高氨基酸的利用率，促進蛋白質(zhì)的合成和 礦質(zhì)元素的吸收等。
[0004] 核桃柏是核桃榨油后的副產(chǎn)物，含有40%以上的蛋白質(zhì)。核桃蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的 植物蛋白，含有18種氨基酸，且人體所需的8種必需氨基酸含量合理。但目前大部分優(yōu)質(zhì) 核桃柏直接當作飼料和肥料處理掉，浪費了許多優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源。
[0005] 為了解決核桃柏資源的浪費及提供一種高效的補鋅劑等問題，我們采用限制性酶 法改性技術(shù)對核桃柏進行深加工并且和無機鋅源螯合。核桃多肽-鋅螯合物不僅是一種高 效的補鋅劑，其還具有很高的抗腫瘤活性，在用于補鋅劑保健品及藥品的制備的同時，有望 成為治療癌癥的高效低毒藥劑。
[0006] 有關(guān)活性多肽-鋅螯合物的研究目前甚少，且都只是涉及多肽-鋅螯合的制備工 藝，并沒有研究螯合物的抗腫瘤活性。例如：（1)中國專利申請公布號CN 103626867 A中 公開了"一種魚皮膠原蛋白多肽螯合鋅的制備工藝"，該專利中涉及的是對多肽螯合鋅工藝 條件的優(yōu)化。（2)中國專利申請公布號CN 101225102 A中公開了"羅非魚魚皮多肽螯合鋅 鹽的制備方法"，該專利只是提供了一種魚皮多肽螯合鋅鹽的制備方法。（3)中國專利申請 公布號CN 103494214 A中公開了"酪蛋白磷酸肽鋅螯合物"，該專利涉及的是酪蛋白磷酸肽 與鋅螯合制備的工藝技術(shù)。
[0007] 綜上所述，目前關(guān)于核桃多肽-鋅螯合物的抗腫瘤活性的報道尚無。本發(fā)明人以 核桃柏為原料，限制性酶解法制備核桃蛋白活性多肽，并與無機鋅源進行螯合，經(jīng)透析，制 備具有抗腫瘤活性的核桃多肽-鋅螯合物。該法制得的產(chǎn)品安全性高，方法簡便可大量生 產(chǎn)，具有極高的抗腫瘤活性，可發(fā)展成為治療癌癥尤其是肝癌的高效低毒藥劑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于通過核桃多肽與無機鋅鹽制備出具有抗腫瘤活性的螯合物，為 相關(guān)抗癌藥物的開發(fā)提供一種基料。
[0009] -種具有抗腫瘤活性的核桃多肽-鋅螯合物的制備方法，包括如下步驟： (1) 限制性酶解：將核桃柏，與水混合，加入占核桃柏蛋白質(zhì)量〇.5~1. 5 %的蛋白酶，在 55飛0°C酶解；沸水中ΚΓ30 min滅酶，離心，取上清液，抽濾，得到核桃柏蛋白多肽； (2) 超濾膜分離：利用超濾膜對核桃柏蛋白多肽進行分離純化； (3) 濃縮、噴霧干燥：收集超濾后的酶解液于55飛5°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，所得產(chǎn)物經(jīng) 噴霧干燥制得核桃多肽； (4) 在鋅溶液中加入核桃多肽進行螯合反應(yīng)：將ZnCl2溶于蒸餾水配成ZnCl2溶液，力口 入多肽溶液后置于漩渦儀混勻，在5(T55°C下震蕩反應(yīng)2(T24 h; (5) 將螯合液進行透析：螯合反應(yīng)結(jié)束后，用透析袋于ΓΙΟ °C對溶液進行透析； (6) 冷凍干燥，得核桃多肽-鋅螯合物：對透析后的螯合液冷凍干燥，得到核桃多肽-鋅 螯合物。
[0010] 上述方法中，步驟（1)所述核桃柏的蛋白質(zhì)含量為4(T45 w/w %。
[0011] 上述方法中，步驟（1)所述核桃柏與水的質(zhì)量比為1:7~1:9;所述蛋白酶為木瓜 蛋白酶；所述酶解的時間為12~16 h。
[0012] 上述方法中，步驟（2)所述超濾膜截留分子量范圍為3 kDa;超濾后收集分子量〈 3kDa的濾過組分。
[0013] 上述方法中，步驟（3)所述核桃柏蛋白酶解液濃縮至固形物20?25 Brix后噴霧 干燥，所得粉末顆粒細度均一。
[0014] 上述方法中，步驟（4)所述ZnCl2溶液的濃度為6. 0 - 8. 0 mg/ml ;加入核桃多肽 后使其在ZnCl2溶液中的濃度達到5.0 - 7.0 mg/ml。
[0015] 上述方法中，步驟（5)所述透析袋的截留分子量為500?1000 Da、透析時間為 20- 24 h。
[0016] 上述方法中，步驟（6)所述冷凍干燥的時間為36~40 h。
[0017] 本發(fā)明所得核桃多肽-鋅螯合物具有抗腫瘤的性能，通過MTT法檢測腫瘤細胞存 活率及用偏光顯微鏡和掃描電鏡觀察處理前后的腫瘤細胞形態(tài)等綜合指標進行判斷的。
[0018] 通過掃描電鏡觀察多肽-鋅螯合物形貌，細胞試驗證實本發(fā)明所得產(chǎn)品的抗腫瘤 效果顯著。
[0019] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點： 1、本發(fā)明公布的抗腫瘤活性核桃多肽-鋅螯合物制備工藝中利用透析已除去未被螯 合的鋅離子，且MTT法檢測結(jié)果顯示與單一核桃多肽相比，核桃多肽-鋅螯合物的抗腫瘤活 性并不是來自單獨的多肽，而是通過兩者相互作用形成的螯合物才具有的。
[0020] 2、本發(fā)明公布的抗腫瘤活性核桃多肽-鋅螯合物能明顯抑制肝癌細胞Η印G2、乳 腺癌腫瘤細胞MCF-7、胃癌細胞SCG-7901、肺癌細胞Α549以及子宮頸癌細胞Hela的增殖， 其中對肝癌細胞ifepG2的抑制作用最為明顯。
[0021] 3、本發(fā)明公布的抗腫瘤活性核桃多肽-鋅螯合物制備工藝簡單，產(chǎn)品安全，可規(guī) ?；a(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1為核桃多肽和核桃多肽-鋅螯合物分別對正常細胞和不同腫瘤細胞增殖的抑 制作用圖。
[0023] 圖2a_圖2d為偏光顯微鏡觀察不同濃度的核桃多肽-鋅螯合物對肝癌細胞Η印G2 的損傷情況圖，其中圖2a為未與桃多肽-鋅螯合物共孵育的細胞，圖2b、圖2c和圖2d分別 為75 μ g/mL、150 μ g/mL和300 μ g/mL的核桃多肽-鋅螯合物對肝癌細胞!fepG2的損傷情 況圖。
[0024] 圖3a_圖3d為掃描電鏡觀察不同培養(yǎng)時間核桃多肽-鋅螯合物對肝癌細胞Η印G2 的損傷情況圖，其中圖3a為未與桃多肽-鋅螯合物共孵育的細胞，圖3b、圖3c和圖3d分別 為12 h、24 h和48h核桃多肽-鋅螯合物對肝癌細胞Η印G2的損傷情況圖。

【具體實施方式】
[0025] 本發(fā)明通過三種方式檢測核桃多肽-鋅螯合物對腫瘤細胞的損傷作用： (1) ΜΤΤ法檢測腫瘤細胞存活率。通過ΜΤΤ法分別檢測核桃多肽和核桃多肽-鋅螯合 物對正常肝細胞L02、肝癌細胞Η印G2、乳腺癌腫瘤細胞MCF-7、胃癌細胞SCG-7901、肺癌細 胞Α549以及子宮頸癌細胞Hela增殖的抑制作用。具體方法如下：用胰蛋白酶消化貼壁細 胞制成單細胞懸液，以5X10 3個細胞/孔接種96孔培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中（37°C，5% C02) 預(yù)培養(yǎng)24 h后，加入核桃多肽或核桃多肽-鋅螯合物的培養(yǎng)基100 μ L/孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。 往培養(yǎng)板加入MTT，37°C孵育4 h后棄上清，加入DMS0,振蕩10 min，紫色結(jié)晶物充分溶解 后，測定各孔(》57(|值。以對照組0057(|為100%，計算藥物處理后各組細胞存活率。細胞存活 率（％) - (OD570 實驗組 / OD570 對照組）X100% (2) 偏光顯微鏡觀察核桃多肽-鋅螯合物對Η印G2細胞的損傷作用。用胰蛋白酶消化 貼壁細胞制成單細胞懸液，以5Χ103個細胞/孔接種6孔培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中（37°C，5% C〇2)預(yù)培養(yǎng)24 h后，加入含有核桃多肽-鋅螯合物的培養(yǎng)基100 μ L/孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。 在200倍偏光顯微鏡下觀察核桃多肽-鋅螯合物對Η印G2細胞的損傷作用。
[0026] (3)掃描電鏡觀察核桃多肽-鋅螯合物對！fepG2細胞的損傷作用。細胞爬片經(jīng)2. 5 %戊二醛固定后按常規(guī)制備樣品，掃描電鏡（Hitachi TM3000)觀察拍照。
[0027] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。
[0028] 實施例1 : (1) 限制性酶解：將核桃柏（其蛋白質(zhì)含量為40%，w/w)與水按質(zhì)量比1 :7混合，加 入占核桃柏蛋白質(zhì)量0.5 %的中性蛋白酶(廣西南寧龐博生物工程有限公司），在55°C酶解 12 h ;沸水浴中滅酶10 min，離心，取上清液，抽濾； (2) 超濾膜分離：利用截留分子量為3 kDa的超濾膜對核桃柏蛋白多肽進行分離純 化，超濾后收集分子量〈3kDa的濾過組分； (3) 濃縮、噴霧干燥：收集超濾后的酶解液于60 °C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至固形物2(Γ 25 Brix，所得產(chǎn)物經(jīng)噴霧干燥制得核桃多肽； (4) 核桃多肽抗腫瘤功效：通過其對腫瘤細胞存活率及腫瘤細胞形態(tài)等指標評價其抗 腫瘤功效。
[0029] 實施例2 : (1) 限制性酶解：將核桃柏（其蛋白質(zhì)含量為43%，w/w)與水按質(zhì)量比1:7混合，加入 占核桃柏蛋白質(zhì)量〇. 5 %的木瓜蛋白酶(廣西南寧龐博生物工程有限公司），在55°C酶解12 h ;沸水中滅酶10 min,離心，取上清液，抽濾； (2) 超濾膜分離：利用截留分子量為3 kDa的超濾膜對核桃柏蛋白多肽進行分離純 化，超濾后收集分子量〈3kDa的濾過組分； (3) 濃縮、噴霧干燥：收集超濾后的酶解液于60°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至固形物20 Brix ，所得產(chǎn)物經(jīng)噴霧干燥制得核桃多肽； (4) 在鋅溶液中加入核桃多肽進行螯合反應(yīng)：將211(：12溶于蒸餾水配成濃度為6.0 mg/ ml的溶液，加入核桃多肽后使其在終溶液的濃度達到5. 0 mg/ml，置于漩渦儀混勻，在50°C 下震蕩反應(yīng)24 h ; (5) 將螯合液進行透析：螯合反應(yīng)結(jié)束后，用截留分子量為500 Da的透析袋于4 °C對 溶液進行透析20 h ; (6) 冷凍干燥，得核桃多肽-鋅螯合物：對透析后的螯合液冷凍干燥36 h，得到核桃多 肽-鋅螯合物，通過其對腫瘤細胞存活率及腫瘤細胞形態(tài)等指標評價其抗腫瘤功效。
[0030] 實施例3 : (1) 限制性酶解：將核桃柏（其核桃柏蛋白質(zhì)含量為45%，w/w)與水質(zhì)量比1:9混合， 加入占核桃柏蛋白質(zhì)量1.5 %的木瓜蛋白酶(廣西南寧龐博生物工程有限公司），在60°C 酶解16 h ;沸水中滅酶10 min,離心，取上清液，抽濾； (2) 超濾膜分離：利用截留分子量為3 kDa的超濾膜對核桃柏蛋白多肽進行分離純 化，超濾后收集分子量〈3kDa的濾過組分； (3) 濃縮、噴霧干燥：收集超濾后的酶解液于60°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至固形物25 Brix，所得產(chǎn)物經(jīng)噴霧干燥制得核桃多肽； (4) 在鋅溶液中加入核桃多肽進行螯合反應(yīng)：將211(：12溶于蒸餾水配成濃度為8.0 mg/ ml的溶液，加入核桃多肽后使其在終溶液的濃度達到7. 0 mg/ml，置于漩渦儀混勻，在50°C 下震蕩反應(yīng)24 h ; (5) 將螯合液進行透析：螯合反應(yīng)結(jié)束后，用截留分子量為500 Da的透析袋于4 °C對 溶液進行透析24 h ; (6) 冷凍干燥，得核桃多肽-鋅螯合物：對透析后的螯合液冷凍干燥40 h，得到核桃多 肽-鋅螯合物，通過其對腫瘤細胞存活率及腫瘤細胞形態(tài)等指標評價其抗腫瘤功效。
[0031] 由圖1可觀察得到核桃多肽-鋅螯合物的抗腫瘤活性并不是來自單獨的多肽(實 施例1)，而是通過與無機鋅形成螯合物才具有的（實施例2、3)。核桃多肽-鋅螯合物對正 常肝細胞L02、肝癌細胞Η印G2、乳腺癌腫瘤細胞MCF-7、胃癌細胞SCG-7901、肺癌細胞A549 以及子宮頸癌細胞Hela增殖都有抑制作用，其中對Η印G2細胞的抑制作用最為明顯，而對 正常肝細胞影響不大。這表明，該核桃多肽-鋅螯合物不僅對腫瘤細胞和正常細胞間有選 擇性，而且對不同的腫瘤細胞也有一定的選擇性，具有應(yīng)用于腫瘤治療的潛力。此外，實施 例3所得核桃多肽-鋅螯合物的抗腫瘤活性遠高于實施例2,說明不同調(diào)控條件對于所得核 桃多肽-鋅螯合物的活性有重要影響。核桃多肽-鋅螯合物對Η印G2細胞增殖的抑制作用 最為明顯，所以選擇Η印G2細胞繼續(xù)用偏光顯微鏡和掃描電鏡進行觀察。
[0032] 將不同濃度核桃多肽-鋅螯合物（75 μ g/mL (圖2b)、150 μ g/mL (圖2c)及300 μ g/mL(圖2d))與肝癌細胞Η印G2共孵育24 h，其結(jié)果如圖2a-圖2d所示，由圖2a-圖2d 中可觀察得到細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落，最后變成細胞殘片。
[0033] 將桃多肽-鋅螯合物（300 μ g/mL)與肝癌細胞Η印G2分別共孵育12 h(圖3b)、 24 h (圖3c)、48 h (圖3d)，利用掃描電鏡觀察桃多肽-鋅螯合物對Η印G2細胞的損傷作 用。由圖3中可觀察得到細胞出現(xiàn)凋亡特征：細胞縮小，細胞發(fā)生明顯萎縮。
【權(quán)利要求】
1. 一種具有抗腫瘤活性的核桃多肽-鋅螯合物的制備方法，其特征在于包括如下步 驟： (1) 限制性酶解：將核桃柏，與水混合，加入占核桃柏蛋白質(zhì)量〇.5~1. 5 %的蛋白酶，在 55飛0°C酶解；沸水中ΚΓ30 min滅酶，離心，取上清液，抽濾，得到核桃柏蛋白多肽； (2) 超濾膜分離：利用超濾膜對核桃柏蛋白多肽進行分離純化； (3) 濃縮、噴霧干燥：收集超濾后的酶解液于55飛5°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，所得產(chǎn)物經(jīng) 噴霧干燥制得核桃多肽； (4) 在鋅溶液中加入核桃多肽進行螯合反應(yīng)：將ZnCl2溶于蒸餾水配成ZnCl2溶液，力口 入多肽溶液后置于漩渦儀混勻，在5(T55°C下震蕩反應(yīng)2(T24 h; (5) 將螯合液進行透析：螯合反應(yīng)結(jié)束后，用透析袋于ΓΙΟ °C對溶液進行透析； (6) 冷凍干燥，得核桃多肽-鋅螯合物：對透析后的螯合液冷凍干燥，得到核桃多肽-鋅 螯合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤活性的核桃多肽-鋅螯合物的制備方法，其特征 在于，步驟（1)所述核桃柏的蛋白質(zhì)含量為4(T45 w/w %。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤活性的核桃多肽-鋅螯合物的制備方法，其特征 在于，步驟（1)所述核桃柏與水的質(zhì)量比為1:7~1:9 ;所述蛋白酶為木瓜蛋白酶；所述酶解 的時間為12~16 h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤活性的核桃多肽-鋅螯合物的制備方法，其特征 在于，步驟（2)所述超濾膜截留分子量范圍為3 kDa;超濾后收集分子量〈3kDa的濾過組 分。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤活性的核桃多肽-鋅螯合物的制備方法，其特征 在于，步驟（3)所述核桃柏蛋白酶解液濃縮至固形物2(Γ 25 Brix后噴霧干燥，所得粉末 顆粒細度均一。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤活性的核桃多肽-鋅螯合物的制備方法，其特征 在于，步驟（4)所述ZnCl2溶液的濃度為6.0 - 8.0 mg/ml;加入核桃多肽后使其在ZnCl2 溶液中的濃度達到5.0 - 7.0 mg/ml。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤活性的核桃多肽-鋅螯合物的制備方法，其特征 在于，步驟（5)所述透析袋的截留分子量為500?1000 Da、透析時間為20- 24 h。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤活性的核桃多肽-鋅螯合物的制備方法，其特征 在于，步驟（6)所述冷凍干燥的時間為36~40 h。
【文檔編號】C07K1/34GK104152520SQ201410370731
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月30日
【發(fā)明者】任嬌艷, 張榕, 賴婷, 廖文鎮(zhèn), 林澤華 申請人:華南理工大學(xué)